CN110275001B - 一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置与方法，其装置包括容器及将其分为两个腔的疏水隔板，疏水隔板防止根基线虫串腔，并且在疏水隔板上端面设置有将植株根系进行分离的压根环，能有效地让根从横向进入不同的腔中，且非常方便地能对根进行分离让进入不同腔的根数量相同；其方法能够较好地区分药剂对线虫的抑制作用、药剂诱导植物抗线虫能力的作用和兼具杀线虫与诱导植株抗线虫的作用。本发明达到的有益效果是：不仅能解决抑制线虫药剂室内评价的局限性，便于室内活性良好的药剂在田间效果的进一步验证及使用浓度范围摸索，更重要的是有助于杀线虫产品的开发、药效评价、相关机理研究和构建抑制根结线虫的整体解决方案。

Description

一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置与方法

技术领域

本发明涉及用于抑制根结线虫的药剂药效评价技术领域，特别是一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置与方法。

背景技术

根结线虫是在植物根系内定殖的专性内寄生病原物，因其分布范围广和寄主种类多的特点，给许多国家的农林产业造成巨大损失，已成为世界上威胁农业生产的主要病原物之一。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。随着我国设施栽培的大面积推广和单一重茬栽培，作物根结线虫病害日趋严重，一般减产10％～20％，严重时达30％～40％，甚至绝产。统计分类显示，花生根结线虫(M.arenria)、爪哇根结线虫(M.javanica)(主要在热带地区发病)、南方根结线虫(M.incognita)和北方根结线虫(M.halpa)(主要在温带地区发病)，这4种根结线虫覆盖全球绝大多数农业产区，被认为是危害最严重的四种线虫。因此，药剂的筛选应主要针对以上4种线虫进行。

目前，已经对防治植物寄生线虫病害做了大量的工作，包括化学杀线剂、线虫趋避剂，生物农药和诱导植物抗性的制剂等。但是，大部分药剂的筛选局限于室内生物活性测定，即采用温室人工繁殖的根结线虫卵，孵化后用平板或96孔板进行生物测定。但土壤环境复杂，室内活性良好的药剂在田间的效果还需进一步试验，需要进一步摸索有效的使用浓度范围。因此，测定及评价药剂对根结线虫药效的盆栽及田间试验方法尤为重要，是保证药剂效果的重要措施，对药剂质量的评价具有重要作用。

目前，国内关于治线虫的实验准则仅有农业部编制的《农药田间药效实验准则(一)》中公开了“杀线虫剂防治根线虫药效试验准则”，在实际使用中，该准则存在以下问题：1.对小区面积做了限定，……，而线虫虫体微小，且具有可运动性，小区设置处理不能较真实反映线虫标的药剂的效果；2.对土壤或根系中活线虫进行分离计数，需要配备显微镜等精密设备；同时线虫分离与培养技术性强，对操作人员技术水平要求高，操作较费时费力；3.线虫分离与培养技术性强，对操作人员技术水平要求高，操作较费时费力；4.显微镜观察范围有限，线虫计数误差大；5.目前，关于治线虫主要有杀死线虫和诱导植株抵抗线虫浸染两种方式，按照农业部的准则，以统计介质或根际环境中线虫数量来评价药剂的治线虫效果，只能用来评价以杀死线虫为治线方式的药剂效果，而对于以诱导植株浸染为治线方式的药剂，却不能真实评价药剂的治线效果，该准则的局限性是显而易见的。

在倡导绿水青山的时代背景下，进行线虫抑制药剂研发和效果评估时大多只考察植物根系根结数，不需要调查统计土壤中活线虫数量。因为，线虫存在本身具有一定生态学意义，用环境友好药剂不必将线虫完全杀死，只是在特定时期抑制其线虫活力的防控方式。不仅如此，一些生物农药和植物生理活性物质还可诱导植物对线虫的抗性。因此，区分药剂的杀线虫活性和诱导植物抗性功能、亦或是二者兼有，对于产品的开发、相关机理研究和构建抑制根结线虫的整体解决方案具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置与方法，不仅能解决抑制线虫药剂室内评价的局限性，便于室内活性良好的药剂在田间效果的进一步验证及使用浓度范围摸索，更重要的是有助于杀线虫产品的开发、药效评价、相关机理研究和构建抑制根结线虫的整体解决方案。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置，所述装置包括容器，疏水隔板，疏水隔板上的压根扣和固定支柱组成；所述容器与疏水隔板平行的两侧可拆卸，易于后期去掉土壤，保持根系完整；所述疏水隔板表明为疏水材料以防止线虫通过疏水隔板进行移动；所述压扣作用是利于根系进入疏水隔板两侧土壤，固定支柱作用在于前期幼苗移栽时植株固定；所述装置在进行土壤中杀线虫药剂的有效使用浓度摸索时，可增加容器的面积，并增加疏水隔板的数量。

一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，操作流程为：S1、育苗；S2、介质处理；S3、移栽和药剂处理；S4、药效评价四个方面。

所述的育苗，其步骤为：

S11、对种子进行消毒，并在无菌基质中生长，确保幼苗不含根结线虫；

S12、剪掉幼苗的主根，采用化控技术诱导大量侧根生长。

所述的介质处理中，采用含有根结线虫的介质对育苗后的植株进行培育，这些根结线虫具有侵染能力，培育后的植株被根结线虫侵染。

所述的移栽和药剂处理中，其步骤为：

S31、将容器中疏水隔板一侧的腔中的土壤用药剂拌土或灌根处理，另一侧腔的土壤用清水或基质处理；

S32、将药剂拌土或灌根处理后的土壤中，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为阳性对照，简称CK+；将清水处理或基质处理后的土壤中，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为阴性对照，简称CK-；在疏水隔板的上端面处，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为实验组T，实验组T中，伸入阳性对照土壤的根用R+表示，伸入阴性对照土壤的根用R-表示。

所述的药效评价中：

若CK+植物根结数比CK-少，且处理T植物R+的根结数显著少于R-根结数，则表明药剂对根结线虫具有抑制作用；

若CK+植物根结数比CK-少，且处理T植物R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂诱导植物对根结线虫的抗性；

若CK+植物根结数比CK-少，处理T植物根结数显著少于CK-，且R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂对根结线虫具有抑制且能够诱导植物对根结线虫的抗性；

若CK+植物根结数比CK-相比无显著差异，且处理T植物R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂对根结线虫无抑制作用，对植物也无诱导根结线虫抗性的作用。

本发明具有以下优点：

(1)本发明申请所设计装置及评价方案操作简单，易于掌握，不需要显微镜等精密仪器，更不需要线虫分离等技术性较强的操作，特别适合于生产第一线普通技术人员掌握和使用；

(2)本发明申请所设计装置及技术方案，在室内室外均可进行，受外界气候条件影响小，可有效确保生长介质、光、温、水、气等生长环境易于调控，避免因植物生长诸多影响因素对评价效果的影响，避免线虫移动对实验的影响；

(3)本发明申请技术方案解决了因植株生长发育个体差异对评价结果的影响问题，大大减少了评价样本数量和人工种植成本，缩短评价时间，显著提高了药效评价的准确性；

(4)本发明申请所设计装置及技术方案仅考察植物根系根结数，不需要调查统计土壤中活线虫数量，减少了线虫分离，培养、计数等操作环节，大大提高了评价的准确性。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为疏水隔板侧面的结构示意图；

图3为疏水隔板纵向侧面的结构示意图；

图中：1-容器，2-疏水隔板，3-压根扣，4-固定支柱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

如图1～图3所示，一种测定及评价药剂对根结线虫药效的装置，包括容器1，容器1内设置有将其分为两个腔的疏水隔板2，两个腔内均装有土壤，土壤将疏水隔板2的上端面掩埋。疏水隔板2的设置能防止一个腔中根结线虫进入另一个腔中。同时，为了便于将土壤移除，将容器1的侧板设计成可拆卸状。

本方案中，在竖直隔板2的上端面位置间隔设置有多个压根扣3，在移栽植株时，通过压根扣3将植株的根压好，使得根沿横向伸入不同腔的土壤中，并且伸入左右腔的土壤的根的数量是一样的。在疏水隔板2的上端面处还设置有固定立柱4，在移栽植株时，将植株绑在固定立柱4上进行固定。

进一步地，在对土壤中杀线虫药剂的有效使用浓度进行研究时，可增加容器1的面积，并且增加疏水隔板2的数量，也可以在疏水隔板2一侧区域增加与疏水隔板2垂直的小疏水隔板，划分更多的区域。

本发明还公开了一种测定及评价药剂对根结线虫药剂的方法，包括以下几个实施例。

【实施例一】微生物制剂哈茨木霉+枯草芽孢杆菌对线虫抑制作用的效果评价

实验材料：番茄种子、哈茨木霉+枯草芽孢杆菌复合微生物制剂(有效活菌数200亿，哈茨木霉与枯草芽孢杆菌各100亿/g)

种子消毒：番茄种子，70％乙醇消毒5分钟，4％次氯酸钠15分钟，种子消毒后无菌水催芽；

育苗：种子萌芽后，放入盛有无菌基质(珍珠岩+蛭石)的营养钵，薄膜覆盖后保持水分，置于生化培养箱中进行育苗，期间用无菌的霍格兰营养液浇灌；待第三片真叶长出后，剪掉幼苗主根，用含0.5mg/kg吲哚丁酸+0.5mg/L萘乙酸钠的生根液蘸根后继续置于基质中培养，以诱导大量侧根生长；幼苗生长过程中，喷雾20mg/kg的矮壮素，避免其在生化培养箱中旺长；随着侧根生长，去掉表面基质，使茎基部侧根暴露，促进木质化，便于后续移栽处理；

土壤处理：将上茬作物感染线虫严重的土壤装与本发明装置中，隔板一侧按每亩5kg用量将哈茨木霉+枯草芽孢杆菌制剂与土壤均匀混合，隔板另一侧为菌剂灭菌后的基质与土壤均匀混合；

幼苗移栽处理：将番茄幼苗移栽到菌剂处理土壤中(CK+)、无菌基质处理土壤中(CK-)，以及将番茄幼苗固定在隔板固定柱4上，根系均分2份，分别进入隔板两侧土壤，进入菌剂处理土壤的根系为(R+)，进入无菌基质处理土壤的根系为(R-)；移栽完成后按照常规施肥浇水管理，并定期测定株高、长势和产量；

效果评价：番茄采摘结束后，打开容器1中与中间疏水隔板2平行的挡板，浇水使土壤保持松软，便于拔出根系时保持完好，统计不同处理根结数，结果见表一。

表一：不同处理及实验设置下番茄长势、产量及根结数量

结果表明：哈茨木霉+枯草芽孢杆菌制剂对根结线虫无抑制作用，但能够诱导番茄对线虫的抗性。

【实施例二】阿维菌素对线虫抑制作用的效果及使用浓度

实验材料：芹菜种子、5％阿维菌素

种子消毒：芹菜种子，70％乙醇消毒5分钟，4％次氯酸钠5分钟，种子消毒后无菌水催芽；

育苗：种子萌芽后，放入盛有无菌基质(珍珠岩+蛭石)的营养钵，薄膜覆盖后保持水分，置于生化培养箱中进行育苗，期间用无菌的霍格兰营养液浇灌；待第三片真叶长出后，剪掉主根根尖，用2mg/kg的吲哚乙酸灌根，诱导侧根大量生长，培养至适合移栽大小；

土壤处理：本发明装置在疏水隔板2一侧区域增加与隔板2垂直的3个小疏水隔板，平均划分成4个区域。将上茬作物感染线虫严重的土壤装与本发明装置中，在隔板2一侧的4个区域中用5％阿维菌素兑水按1kg、2kg、3kg、4kg每亩的用量灌土，与土壤混匀，隔板2另一侧用等量清水浇灌，平衡3天。

幼苗移栽处理：将芹菜幼苗移栽到阿维菌素处理土壤中(CK+)的4个区域、清水处理土壤中(CK-)，以及将芹菜幼苗固定在隔板固定柱4上，根系均分2份，分别进入隔板两侧土壤，进入阿维菌素4个浓度处理土壤的根系为(R+)，进入清水处理土壤的根系为(R-)；移栽完成后按照常规施肥浇水管理；

效果评价：到芹菜收获期，浇水使土壤保持松软，便于拔出根系时保持完好，统计不同处理根结数，并测定株高和单株重量，结果见表二。

表二：不同处理及实验设置下芹菜株高、产量及根结数平均值

注：表头中1、2、3、4分别表示阿维菌素亩用量为1kg、2kg、3kg、4kg，T1表示根系分别进入阿维菌素亩用量1kg处理土壤和对照土壤，其余类推。

结果：阿维菌素对根结线虫有抑制作用，但无诱导芹菜对线虫抗性的能力，结合经济效益及环境友好原则，推荐5％阿维菌素使用量为2kg每亩。

【实施例三】微生物制剂淡紫拟青霉对线虫抑制作用的效果评价

实验材料：茄子种子、淡紫拟青霉制剂(有效活菌数200亿/g)

种子消毒：茄子种子，70％乙醇消毒5分钟，4％次氯酸钠5分钟，种子消毒后无菌水催芽；

育苗：种子萌芽后，放入盛有无菌基质(珍珠岩+蛭石)的营养钵，薄膜覆盖后保持水分，置于生化培养箱中进行育苗，期间用无菌的霍格兰营养液浇灌；待第三片真叶长出后，剪掉主根根尖，用1mg/kg的吲哚乙酸+0.5mg/kg的萘乙酸钠溶液灌根，诱导侧根大量生长，培养至适合移栽大小；

土壤处理：将上茬作物感染线虫严重的土壤装与本发明装置中，隔板一侧按每亩5kg用量将淡紫拟青霉制剂与土壤均匀混合，隔板另一侧为菌剂灭菌后的基质与土壤均匀混合；

幼苗移栽处理：将茄子幼苗移栽到菌剂处理土壤中(CK+)、无菌基质处理土壤中(CK-)，以及将茄子幼苗固定在隔板固定柱4上，根系均分2份，分别进入隔板两侧土壤，进入菌剂处理土壤的根系为(R+)，进入无菌基质处理土壤的根系为(R-)；移栽完成后按照常规施肥浇水管理；

效果评价：统计不同处理根结数，并测定株高和茄子产量，结果见表三。

表三：不同处理及实验设置下茄子株高、产量及根结数量

结果：淡紫拟青霉制剂不仅对根结线虫有抑制作用，而且能够诱导茄子产生对线虫抗性的作用。

【实施例四】土壤改良剂对线虫抑制作用的效果评价

土壤改良剂成分及含量：CaO>35％

作物及种子消毒：作物为苦瓜，将苦瓜种子用70％乙醇消毒5分钟，4％次氯酸钠消毒10分钟，种子消毒后无菌水催芽；

育苗：种子萌芽后，放入盛有无菌基质(珍珠岩+蛭石)的营养钵，薄膜覆盖后保持水分，置于生化培养箱中进行育苗，期间用无菌的霍格兰营养液浇灌；待第三片真叶长出后，剪掉主根根尖，用1mg/kg的吲哚乙酸+0.5mg/kg的萘乙酸钠溶液灌根，诱导侧根大量生长，培养至适合移栽大小；

土壤处理：将上茬作物感染线虫严重的土壤装与本发明装置中，隔板一侧按每亩15kg用量将土壤改良剂与土壤均匀混合，隔板另一侧为空白对照；

幼苗移栽处理：将苦瓜幼苗移栽到土壤改良剂处理土壤中(CK+)、无任何处理土壤中(CK-)，以及将苦瓜幼苗固定在隔板固定柱4上，根系均分2份，分别进入隔板两侧土壤，进入土壤改良剂处理土壤的根系为(R+)，进入空白对照土壤的根系为(R-)；移栽完成后按照常规施肥浇水管理；

效果评价：统计不同处理根结数和苦瓜茄子产量，结果见表四。

表四：不同处理及实验设置下苦瓜产量及根结数量

结果：以氧化钙为主要成分的土壤改良剂仅对根结线虫无抑制作用，也不能诱导苦瓜产生根结线虫抗性。

Claims (5)

1.一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，其特征在于：该方法是基于测定及评价药剂对根结线虫药效的装置进行评价的，所述装置包括容器（1）及将其分

呈两个腔的疏水隔板（2）；所述容器（1）的腔中用于装有土壤，且其侧板可拆卸，用于取出土壤，保持根系完整；所述疏水隔板（2）的上端面处设置有压根扣（3）和固定支柱（4）；所述压根扣（3）数量有多个，间隔设置，用于让根系进入疏水隔板（2）两侧的土壤中；所述固定支柱（4）的设置在压根扣（3）上侧，用于幼苗前期移栽时植株固定；

所述方法的步骤为：S1、育苗；S2、介质处理；S3、移栽和药剂处理；S4、药效评价四个方面；所述的移栽和药剂处理中，其步骤为：S31、将容器（1）中疏水隔板（2）一侧的腔中的土壤用药剂拌土或灌根处理，另一侧腔的土壤用清水或基质处理；

S32、将药剂拌土或灌根处理后的土壤中，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为阳性对照，简称CK+；将清水处理或基质处理后的土壤中，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为阴性对照，简称CK-；在疏水隔板（2）的上端面处，移栽步骤S2中侵染后的植株，作为实验组T，实验组T中，伸入阳性对照土壤的根用R+表示，伸入阴性对照土壤的根用R-表示；所述的药效评价中：若CK+植物根结数比CK-少，且处理T植物R+的根结数显著少于R-根结数，则表明药剂对根结线虫具有抑制作用；若CK+植物根结数比CK-少，且处理T植物R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂诱导植物对根结线虫的抗性；若CK+植物根结数比CK-少，处理T植物根结数显著少于CK-，且R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂对根结线虫具有抑制且能够诱导植物对根结线虫的抗性；若CK+植物根结数比CK-相比无显著差异，且处理T植物R+的根结数与R-无显著差异，则表明药剂对根结线虫无抑制作用，对植物也无诱导根结线虫抗性的作用。

2.根据权利要求1所述的一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，其特征在于：所述的容器（1）内，根据土壤中杀线虫药剂的浓度的梯度，选择对应数量的疏水隔板（2）。

3.根据权利要求2所述的一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，其特征在于：所述的容器（1）平行于疏水隔板（2）的侧板可拆卸。

4.根据权利要求1所述的一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，其特征在于：所述的育苗，其步骤为：

S11、对种子进行消毒，并在无菌基质中生长，确保幼苗不含根结线虫；

S12、剪掉幼苗的主根，采用化控技术诱导大量侧根生长。

5.根据权利要求4所述的一种测定及评价药剂对根结线虫药效的方法，其特征在于：所述的介质处理中，采用含有根结线虫的介质对育苗后的植株进行培育，这些根结线虫具有侵染能力，培育后的植株被根结线虫侵染。

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