CN109496704A - 一种拟南芥快速生长培育的方法 - Google Patents
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Abstract
针对目前拟南芥土培法或者移栽法后期，由于难以保持土壤湿度和土壤pH，经常出现失水过快导致植株枯死，或浇水过多后蛭石变得黏重，通透性降低，真菌和藻类的大量繁殖造成烂根和根系生长活力降低的原因，造成拟南芥成活率不高且植株弱小，影响到后期的开花结果的问题，本发明提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，在混合土培养拟南芥的基础上对培养装置进行改造，建立了一种能保持土壤一定温度和湿度的技术方法，使得培养出的拟南芥生长状态良好，显著提高拟南芥的生长发育速度，植株高，莲座叶片大，荚果数量多，具有广泛的应用推广价值。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明属于一种拟南芥快速生长培育的技术领域。
背景技术：
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是双子叶模式植物，属于十字花科拟南芥属，具有自花授粉，形态特征较为分明，植株个体小而生育期短，基因组小等特征，是第一个完成全部基因组序列测定的高等植物，成为各研究领域普遍认可的模式植物，一般拟南芥90-120d能完成整个生命周期。拟南芥幼苗弱小，易受损伤，营养成分、光照、温度、水分和空气湿度对拟南芥生长的影响比较大，由于国内许多单位缺少拟南芥培养的条件，对拟南芥的正常培养带来了一定的困难。目前广泛应用的拟南芥室内培养方法有两种，一种是混合营养介质和营养液培养，混合营养介质常见的是移栽法，是拟南芥种子消毒后播种于MS(Murashige and Skoog)固体培养基上培养7-15d后移栽到土壤中；第二种方法是土壤培养法，即直接把拟南芥种子种在土壤中。
我国实验室通常用土壤培养法，但难以保持土壤湿度和土壤pH，经常出现失水过快导致植株枯死或浇水过多后蛭石变得黏重，通透性降低，容易滋生菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和白粉病菌(Erysiphae cichoracearum)等，真菌和藻类的大量繁殖造成烂根和根系生长活力降低，造成拟南芥成活率不高且植株弱小，影响到后期的开花结果。目前已报道一些改良土壤培养法的方法，比如用不同的基质培养拟南芥，土壤培养法不仅需要改进土壤营养成分而且还需要改进土壤结构，保持土壤中一定的水分和温度等指标是影响拟南芥生长的重要因素。虽然现有技术“一种有效防止绿藻产生的拟南芥水培方法，CN 102696463”披露了使用锡箔纸封住液体培养装置，用来为防止绿藻污染，但是本申请提供的培养方法为通过锡箔纸覆盖的培养方式，解决了土培法或者移栽法后期的土壤温度和湿度难以控制的问题，提高拟南芥植株生长发育。
由于常规方法培养拟南芥叶片小，生长缓慢，荚果数量少，生长周期长，昆虫的危害等问题困扰着研究者，目前针对与用不同材质的覆盖物来提高拟南芥室内生长发育的相关研究较少，因此迫切需要一种适用于覆盖拟南芥土培花盆的材料及培养方法，来调节拟南芥生长发育所需的土壤的温度、水分和pH值、光照等指标，提高拟南芥的生长速率，为植物遗传学和分子生物学研究提供良好的实验材料。
发明内容：
针对目前拟南芥土培法或者移栽法后期，由于难以保持土壤湿度和土壤温度，经常出现失水过快导致植株枯死，或浇水过多后蛭石变得黏重，通透性降低，真菌和藻类的大量繁殖造成烂根和根系生长活力降低的原因，造成拟南芥成活率不高且植株弱小，影响到后期的开花结果的问题，本发明提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，在混合土培养拟南芥的基础上对培养装置的创造性地进行改造，建立了一种能保持土壤一定温度和湿度，有效防治真菌、绿藻生长的技术方法，使得培养出的拟南芥生长状态良好，显著提高拟南芥的生长发育速度，植株高，莲座叶片大，荚果数量多，具有广泛的应用推广价值。
本发明提供上述方案的技术方法，具体采用以下技术步骤：
(1)种子的预处理：将拟南芥种子用10％的次氯酸钠处理5min，期间不断地晃动；吸出次氯酸钠后，用无水乙醇洗涤3-5次。在超净工作台中挥发干净种子中的乙醇后即可用于后续的实验；
(2)MS固体培养基种植：将种子点在不含抗生素的MS固体培养基中，4℃春化2-3d，光照6h后，黑暗培养1-2d后，置于光照14:8h，22℃±1℃的拟南芥培养室培养15d；
(3)移栽定植处理：将混合营养土装入育苗盆中，将锡箔纸平展覆盖在育苗盆上，打孔，将步骤(2)制备的拟南芥幼苗移栽至混合营养土中培养，每盆定植一株，育苗盆全部放置于塑料托盘中，托盘内加入适量清水，保持培养土表面湿润；
(4)培养移栽定植后的拟南芥苗在植株抽苔后剪苔一次，确保试验植株均处于同一生长状态，此后正常培养直到种子成熟。
本发明中，育苗盆为直径11cm，高12cm的育苗盆。
本发明中，混合营养土，按照重量份数计，珍珠岩:蛭石:花土＝1:1:3。
本发明中，锡箔纸厚度为0.1mm。
本发明中，锡箔纸上打孔的孔径为0.5cm。
本发明中，10％的次氯酸钠为100μL次氯酸钠加入900μL无水乙醇中。
本发明中，采用的“4℃春化2-3d”技术环节中，所谓“春化”即拟南芥培养中需要低温条件，才能促进器官发育，这一过程叫做春化阶段，简称“春化”，这种低温诱导拟南芥生长发育的效应叫做春化作用。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
(1)本发明中，提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，在混合土培养拟南芥的基础上对培养装置的创造性地进行改造，建立了一种能保持土壤一定温度和湿度，有效防治真菌、绿藻生长的技术方法，使得培养出的拟南芥生长状态良好，显著提高拟南芥的生长发育速度，植株高，莲座叶片大，荚果数量多，具有广泛的应用推广价值。
(2)本发明中，提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，通过本申请的培养方法进行实验，结果表明，锡箔纸覆盖法方式培养组拟南芥的叶片大小、荚果大小和数量、株高、株重等生长指标明显高于常规土培组培养的拟南芥。与公开的锡箔纸覆盖水培法相比，本申请的培养方法培养的拟南芥生长发育指标显著优于锡箔纸覆盖水培法培养的拟南芥。
(3)本发明中，提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，其锡箔纸不但能保持土壤湿度，还能反光，为拟南芥提供更多的光照，使叶片中的光合碳固定支持蔗糖合成和输出到植物的其余部分以支持代谢、储存和生长。此方法不仅可以控制土壤温度避免升高太多，而且拟南芥生长状态旺盛，叶片大而整齐，始花期提前，苔子强壮而侧芽和荚果数量多。
(4)本发明中，提供了一种拟南芥快速生长培育的技术方法，箔纸覆盖方式培养中只留下拟南芥根部穿透的小孔，蚜虫等害虫无法快速隐藏到土里而直接暴露在外界，可以人工或用农药快速杀死害虫，极大减少害虫对拟南芥的危害。用此方式培养拟南芥能够有效防治昆虫危害，同时能够得到生长状态良好，植株健壮，莲坐叶片大而有序，开花提前，结种子量大，是总体生长状态比较好的拟南芥培养方法。
附图说明
图1显示为不同覆盖方式培养的拟南芥第56天表型差异图，其中，CK为常规法培养的拟南芥表型图，Bar＝1cm，PF为保鲜膜覆盖方式培养的拟南芥表型图，AF为锡箔纸覆盖方式培养的拟南芥表型图。
图2显示为不同覆盖方式培养对拟南芥株高的影响图，其中，A为三种培养方式拟南芥生长56d的株高对比图，B为不同覆盖方式培养对拟南芥株高统计分析图，数据为平均值±标准误，n>3，**为差异极显著，P<0.01。
图3显示为不同覆盖方式培养拟南芥莲座叶大小的比较图，Bar＝1cm。
图4显示为不同覆盖方式培养对拟南芥荚果大小的观察和比较图，其中，A为荚果大小观察图，Bar＝1cm，B为荚果数量统计分析图，数据为平均值±标准误，n>3，*为差异显著，P<0.05。
图5显示为不同覆盖方式培养的拟南芥植株鲜重和干重的统计学分析图，其中，A为拟南芥鲜重的统计图，B为拟南芥干重的统计图，数据为平均值±标准误，n>3，**表示差异极显著，P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明不限于下述实施例。
本发明中所用的实验材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana)采用Columbia生态型Col-0种子、锡箔纸(Aluminum foil，AF)厚度为0.1mm、塑料薄膜(Plastic film，PF)厚度为0.1mm。
本发明中所用的实验设备为电子天平，瑞士METTLER TOLEDO，AL104，分度值为0.0001g。
本发明中所用的培养基为MS固体培养基，30g蔗糖，7g琼脂，1.0L蒸馏水，pH 5.8。
另外，在下述的实施例中，如无特别说明，本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：拟南芥快速生长培育方法
(1)种子的预处理：将拟南芥种子用10％的次氯酸钠(900μL无水乙醇+100μL次氯酸钠)处理5min，期间不断地晃动；吸出次氯酸钠后，用无水乙醇洗涤3-5次。在超净工作台中挥发干净种子中的乙醇后即可用于后续的实验；
(2)MS固体培养基种植：将种子点在不含抗生素的MS固体培养基中，4℃春化2-3d，光照6h后，黑暗培养1-2d后，置于光照14:8h，22℃±1℃的拟南芥培养室培养15d；
(3)移栽定植处理：将混合营养土装入育苗盆中，将锡箔纸平展覆盖在育苗盆上，打孔，将步骤(2)制备的拟南芥幼苗移栽至混合营养土中培养，每盆定植一株，育苗盆全部放置于塑料托盘中，托盘内加入适量清水，保持培养土表面湿润；
(4)培养移栽定植后的拟南芥苗在植株抽苔后剪苔一次，确保试验植株均处于同一生长状态，此后正常培养直到种子成熟。
本发明中，育苗盆为直径11cm，高12cm的育苗盆。
本发明中，混合营养土，按照重量份数计，珍珠岩:蛭石:花土＝1:1:3。
本发明中，在锡箔纸厚度为0.1mm。
本发明中，在锡箔纸上打孔的孔径为0.5cm。
本发明中，10％的次氯酸钠为100μL次氯酸钠加入900μL无水乙醇中。
实施例二：不同覆盖材料对拟南芥生长的影响
1、方法
(1)种子处理将拟南芥种子用10％的次氯酸钠(900μL无水乙醇+100μL次氯酸钠)处理5min，期间不断地晃动；吸出次氯酸钠后，用无水乙醇洗涤3-5次。在超净工作台中挥发干净种子中的乙醇后即可用于后续的实验
(2)MS固体培养基培养将种子点在不含抗生素的MS固体培养基中，4℃春化2-3d，光照6h后，黑暗培养1-2d后，置于光照14:8h，22℃±1℃的拟南芥培养室培养15d。
(3)移栽定植处理拟南芥幼苗在MS固体培养基中培养15d后，将幼苗移至珍珠岩：蛭石：花土体积比1:1:3的混合基质中培养待用。实验设置0.1mm厚保鲜膜、0.1mm厚锡箔纸两种覆盖处理，以常规土培无覆盖为对照。试验处理前，将事先混合好的营养土装入直径11cm，高12cm的育苗盆中，将不同覆盖材料平展覆盖在育苗盆上，打孔(孔径为0.5cm)，选择大小相同的拟南芥苗移栽定植，每盆定植一株。全部放置于塑料托盘中，托盘内加入适量清水，保持培养土表面湿润。
(4)培养移栽定植后的拟南芥苗在植株抽苔后剪苔一次，确保试验植株均处于同一生长状态，此后正常培养直到种子成熟。
从幼苗到种子成熟，全程观察和测量拟南芥各生长发育指标，检测指标为：植株成活率、抽苔期、始花期、株高、莲座叶大小、荚果大小和数量、株重、干重。
2、结果与分析
拟南芥在第56d不同材质覆盖对拟南芥生长状态差异最明显，不同材质覆盖培养方式：常规土培方式组(CK组)，锡箔纸覆盖方式培养组(AF组)，保鲜膜覆盖方式培养组(PF组)之间能观察到锡箔纸覆盖方式培养的拟南芥生长状态明显比其他两种培养方式好，植株粗壮，如附图1所示。后期的观察结果发现AF组比其他两组拟南芥叶片和荚果大小，拟南芥株高，鲜重，荚果数量等生长指标上有明显差异。
(1)不同材质覆盖物对拟南芥存活率和营养生长周期的影响
将相同大小的拟南芥苗移栽定植到混合土壤基质中培养，每天观察拟南芥植株存活情况，直到拟南芥正常生长抽苔为止，共设三个处理组，分别为常规法培养组(CK组)，保鲜膜覆盖方式培养组(PF组)和锡箔纸覆盖方式培养组(AF组)，每个处理组用10株拟南芥苗。通过长期观察，三组的拟南芥存活率都100％，但拟南芥的生育期到来时间差异非常明显，其中以锡箔纸覆盖培养的AF组比PF组和CK组的拟南芥抽苔时间和始花期都大幅度提前，如附表1所示。
表1：三种覆盖处理的拟南芥营养生长周期的影响
| 生长指标 | 常规法(CK) | 保鲜膜覆盖法(PF) | 锡箔纸覆盖法(AF) |
| 抽苔时间 | 6-9周 | 5-8周 | 4-8周 |
| 开始花时间 | 7-10周 | 6-9周 | 5-8周 |
(2)不同材质覆盖物对拟南芥株高的影响
拟南芥生长到56d的时候用卡尺测定拟南芥株高，每个处理5株，统计分析常规法培养组(CK组)，保鲜膜覆盖方式培养组(PF组)和锡箔纸覆盖方式培养组(AF组)拟南芥株高(cm)差异，并用相机拍照不同拟南芥株高和生长状态的差异。结果显示，三种覆盖方式培养的拟南芥苗的营养部分的生长状态有显著的差异，AF覆盖组比其他两组叶片大而整齐，植株健壮；AF组比CK组拟南芥株高高于64.7％，比PF组拟南芥高52.3％，AF比CK组和PF组拟南芥株高有极显著差异(P<0.01)，如附图2所示。
(3)不同覆盖方式对拟南芥莲座叶片和荚果的影响
不同覆盖方式培养拟南芥的影响主要体现在叶片面积大小和荚果数量上，拟南芥培养到第70d时，三种培养方式下培养的拟南芥中每一组随机抽取一株拟南芥，剪下叶片用相机拍照，比较不同培养方式下培养的拟南芥叶片大小，从附图3中可以看出AF组拟南芥莲坐叶明显大于其他两组。
拟南芥生长到第70d时，统计三种培养方式下培养的拟南芥荚果数量(每个处理5株)，随机取一株拟南芥剪取20个荚果，拍照做对照。结果显示AF组拟南芥荚果数量是CK组拟南芥荚果数量的2.43倍，是PF组拟南芥的2.38倍。统计分析结果显示AF组拟南芥荚果数量显著高于其他两组，P<0.05，如附图4所示。
(4)不同覆盖方式的拟南芥植株干重和鲜重的差异
拟南芥生长到第70d时，分别取三种培养方式下的拟南芥整株(每个处理5株)用清水洗去根部，滤纸吸干水分，用锡箔纸包裹并用分析天平测量单株拟南芥鲜重(mg)，去除锡箔纸重量，测完鲜重后置于80℃烘箱中烘干3天，再次称重记录为干重(mg)。结果显示，AF组拟南芥鲜重比CK组拟南芥鲜重多于62.7％，比PF组拟南芥多于78.9％，AF组拟南芥鲜重显著高于其他两组，P<0.01，而CK组跟PF组之间拟南芥鲜重差异不显著；三种不同培养方式拟南芥干重之间差异不显著，结果如附图5所示。
拟南芥在生长过程中容易受到多种因素的影响，不同的生长条件对拟南芥表型的影响很大，土壤、光照、温度作为植物生长和发育的主要因素，不同覆盖方式对土壤水分和温度保持能力有差别，对拟南芥的生长产生不同的影响，常规土壤培养的不足之处是水分从土壤表面丢失速度快，土壤表面变硬，藻类容易繁殖。保鲜膜覆盖方式虽然能够保持土壤一定水分，但土壤温度会上升，拟南芥作为比较喜欢偏低的温度，这对拟南芥正常生长带来负面影响，因为保鲜膜透明而底下湿度高藻类容易繁殖且拟南芥生长状况不够理想。锡箔纸不但能保持土壤湿度，还能反光，这样不仅对拟南芥提供更多的光照下，叶片中的光合碳固定支持蔗糖合成和输出到植物的其余部分以支持代谢，储存和生长。此方法不但不会让土壤温度升高太多，而且拟南芥生长状态旺盛，叶片大而整齐，开花提前，苔子强壮而侧芽和荚果数量多。
有文献报道常规土培不同形态型拟南芥(哥伦比亚和新疆生态型)发现抽苔时间都在4-6周，开花期在5-8周，哥伦比亚生态型拟南芥开花时的株高正常在5-10cm，本研究中锡箔纸覆盖方式培养的拟南芥抽苔时间比其他种组相比有提前现象，跟文献报道的拟南芥常规培养数据相符合，开花时的株高明显高于文献报道的株高。
常规培养方法中蚜虫等害虫的危害经常发生，是由于昆虫受到外界刺激后快速衰落而隐藏在土壤在内层，而锡箔纸覆盖方式培养中只留下拟南芥根部穿透的小孔，蚜虫等害虫无法快速隐藏到土里而直接暴露在外界，可以人工或用农药快速杀死害虫，有研究报道锡箔纸反射光也能达到排斥辣椒上蚜虫等昆虫的效果，用此方式培养拟南芥能够有效防治昆虫危害，同时能够得到生长状态良好，植株健壮，莲坐叶片大而有序，开花提前，结种子量大，是总体生长状态比较好的拟南芥培养方法。
实施例三：锡箔纸用于不同的培养方式对拟南芥生长的影响
1、方法
设置4个处理组，分别为常规土培法、本申请提供的锡箔纸覆盖法、常规水培法和锡箔纸覆盖水培法。
(1)种子处理
将拟南芥种子用10％的次氯酸钠(900μL无水乙醇+100μL次氯酸钠)处理5min，期间不断地晃动；吸出次氯酸钠后，用无水乙醇洗涤3-5次，在超净工作台中挥发干净种子中的乙醇后即可用于后续的实验，将种子点在不含抗生素的MS固体培养基中，4℃春化2-3d。
(2)种植
①常规土培法种植：将珍珠岩:蛭石:花土体积比1:1:3混合均匀，在高压灭菌锅进行高温高压灭菌，室温冷却后分装在花盆中，将春化处理后的拟南芥种子均匀播种在上述花盆表面，放置在光照培养箱培养。
②本申请提供的锡箔纸覆盖法：按照实施例一提供的方法培养。
③常规水培法种植：用湿牙签蘸取拟南芥种子，点播在水培装置孔盖上表面的缝隙中，然后将水培装置放进培养间培养；所述培养间的培养条件是：光照周期16h光照/8h黑暗，温度为22-25℃左右，相对湿度为50-80％，每隔5天更换一次营养液。
④锡箔纸覆盖水培法种植：按照按照发明专利CN102696463提供的方法培养。将消毒、春化的种子播种于1/2MS固体培养基上，培养12-18天后，将幼苗转移至KT板上，驯化5-7天，连同KT板移入培养盘中，用锡箔纸封住，培养幼苗。
2、生理指标的测定
拟南芥苗在植株抽苔后剪苔一次，确保试验植株均处于同一生长状态，此后正常培养直到种子成熟，全程观察和测量拟南芥各生长发育指标检测指标为：植株成活率、抽苔期、始花期、株高、荚果数量。
植株成活率：观察拟南芥植株存活情况，直到拟南芥正常生长抽苔为止。共设三个处理组，每个处理组用10株拟南芥苗。
生活周期(抽苔期、始花期)：不同培养方式的拟南芥幼苗前期营养生长期观察苗的抽苔，开花时期并记录。
拟南芥株高的测定：拟南芥生长到56d的时候用卡尺测定拟南芥株高(每个处理5株)，统计分析不同方式培养的拟南芥株高(cm)差异。
荚果数量：拟南芥生长到第70d时，统计不同培养方式下拟南芥荚果数量(每个处理5株)。
3、结果与分析
表2：锡箔纸用于不同的培养方式对拟南芥生长的影响
如表2所示，4个处理组在成活率、抽苔时间、始花期、株高和荚果数量这5个指标上均存在明显差异。以本申请锡箔纸覆盖法培养的拟南芥抽苔时间和始花期均大幅度提前，统计不同培养方式的拟南芥株高中，本申请锡箔纸覆盖法培养的拟南芥株高高于锡箔纸覆盖水培法，也比常规土培法和常规水培法培养的拟南芥株高高百分之五十左右，存在极显著差异。统计各组拟南芥荚果数量，每个处理5株，结果显示本申请锡箔纸覆盖法培养的拟南芥荚果数量是常规土培法培养拟南芥荚果数量的4倍，是常规水培法培养拟南芥荚果数量的4.6倍，是锡箔纸覆盖水培法培养拟南芥荚果数量的1.8倍。统计分析结果显示本申请锡箔纸覆盖法培养的拟南芥在抽苔时间、始花期、株高和荚果数量这4个指标上显著高于其他处理组。说明本申请的培养方法培养的拟南芥生长发育指标显著优于常规土培法、常规水培法和锡箔纸覆盖水培法的拟南芥。
综合比较上述指标，由于常规方法培养拟南芥叶片小，生长缓慢，荚果数量少，生长周期长，昆虫的危害等问题困扰着研究者，因此本申请的方法在混合土培养拟南芥的基础上对培养装置的进行改造，建立了一种能保持土壤一定温度和湿度，能有效防治真菌、绿藻生长的拟南芥培养技术方法。
上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种拟南芥快速生长培育的方法，其特征在于，具体采用以下技术步骤：
（1）种子的预处理：将拟南芥种子用10%的次氯酸钠处理5min，期间不断地晃动；吸出次氯酸钠后，用无水乙醇洗涤3-5次，在超净工作台中挥发干净种子中的乙醇后即可用于后续的实验；
（2）MS固体培养基种植：将种子点在不含抗生素的MS固体培养基中，4℃春化2-3d，光照6h后，黑暗培养1-2d后，置于光照14:8h，22℃±1℃的拟南芥培养室培养15d；
（3）移栽定植处理：将混合营养土装入育苗盆中，将锡箔纸平展覆盖在育苗盆上，打孔，将步骤（2）制备的拟南芥幼苗移栽至混合营养土中培养，每盆定植一株，育苗盆全部放置于塑料托盘中，托盘内加入适量清水，保持培养土表面湿润；
（4）培养移栽定植后的拟南芥苗在植株抽苔后剪苔一次，确保试验植株均处于同一生长状态，此后正常培养直到种子成熟。
2.如权利要求1所述的一种拟南芥快速生长培育的方法，其特征在于，所述的混合营养土，按照重量份数计，珍珠岩:蛭石:花土=1:1:3。
3.如权利要求1所述的一种拟南芥快速生长培育的方法，其特征在于，所述的锡箔纸厚度为0.1mm。
4.如权利要求1所述的一种拟南芥快速生长培育的方法，其特征在于，所述的打孔的孔径为0.5cm。
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