CN104012537B - 一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用。该化合物可以明显的迅速提高植物抵抗病原菌侵染的能力，活性氧信号提早出现，减少植物被病原菌侵染造成的细胞死亡，病原菌在植物体内的生长受到明显抑制保护植物不受病原菌伤害,并且不会抑制植物根部和幼苗的生长，反而对植物有略微的刺激生长作用，能够促进植物的侧根的生长发育，对环境也不会产生农药的二次污染，具有广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物农药领域，具体涉及一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用。
背景技术
近年来，化学农药造成的环境污染，农药残留及抗药性问题越来越严重，一些已经被禁止使用。利用诱导剂诱导植物自身产生系统获得抗病性（Systemic AcquiredResistance,SAR）逐渐成为植物病害防治的发展方向。
自然界中，植物在整个生长发育的过程中一直受到外界病原微生物的侵染。早在1861年，人们就已经意识到自然界中的某些病原微生物能够对植物产生侵染而造成植物的发病(Schlaich,2011)。自然界中的植物病原微生物主要分为细菌、真菌、病毒、线虫以及卵菌等(Durrant and Dong,2004)。植物对病原菌的感知拥有相当敏感的机制，当植物感知外源的病原菌的存在时，便会启动下游的信号通路，诱导出相应的抗性反应。植物除了直接的感知病原菌的病原分子相关模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）或者无毒的因子（avirulence factors）而诱导下游抗性外，也能通过一些间接的因素诱导植物的抗病反应。植物细胞壁在病原菌入侵植物时起到了最初的屏障作用，从而阻止病原菌的进一步侵入。
已有研究表明，多种植物激活剂可以诱导植物产生抗性以抵抗病原菌的入侵。例如BTH（苯并噻二唑）、噻菌灵（PBZ）、糖精（saccharide，BIT）、2，6-二氯异烟酸（INA）、β-氨基丁酸（BABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）等，其能诱导植物内的防御机制，起到抗病防病的作用。这种诱导剂本身无毒或者低毒性，对环境也没有损害，所以是非常有前景的新型农药。然而，传统的植物激活剂（例如BTH）存在水溶性差、影响植物生长等问题。
新型化合物5-(环丙烷甲基)-6-甲基-2-(2-吡啶基)嘧啶-4-醇（5-(cyclopropylmethyl)-6-methyl-2-(2-pyridyl)pyrimidin-4-ol）由英国Maybridge（http://www.maybridge.com/）公司合成，为白色粉末晶体状，易溶于水，ACD编号为MFCD00179427。该新型化合物由不同化学基团组合而成，但人们对该化合物的功能作用、作用对象、靶点位置等却并不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种新型的植物激活剂，能够迅速提高植物抵抗病原菌侵染的能力，同时不会抑制根和幼苗的生长，而且能够促进植物的侧根的生长发育，而且对环境也不会产生农药的二次污染。
本发明的另一个目的是提供一种上述新型植物激活剂的组合物。
本发明的再一个目的是提供上述组合物在植物诱导抗性中的应用。
本发明的又一个目的是提供使用上述新型植物激活剂的诱导植物抗性的方法。
为此，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了式（I）的吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用：
术语“植物”，是指在各种情况下市售可得的或使用中的各个植物品种，这些植物品种可以是野生型的，或经过人工驯化的作物品种。根据本发明，可用本发明的式（I）化合物对植物进行处理，也可用含有式（I）化合物作为活性化合物的混合物质对植物进行处理，以诱导植物抗病基因的表达。
本发明的化合物以适合于应用形式的常规方式施用。
本发明还提供了一种组合物，该组合物包含所述式（I）化合物作为活性化合物。
根据本发明提供的组合物，优选地，该组合物包括所述式（I）化合物和溶剂。
进一步，所述溶剂优选为水。
本发明还提供了所述组合物在植物诱导抗性中的应用。用该组合物对植物进行处理，以诱导植物抗病基因的表达，并以适合于应用形式的常规方式施用。
此外，本发明还提供了应用所述式（I）化合物诱导植物抗性的方法，该方法中，将所述式（I）化合物溶于水后，施用于植物的叶面或根部。本发明的化合物以适合于应用形式的常规方式施用。优选地，施用的方式为喷施。
更优选地，上述方法包括如下步骤：将所述式（I）化合物溶于水后，喷施于植物的叶面。施用的浓度优选为2～10ppm。值得注意的是，施用浓度随植物生长状态差异，种类差异等而有所不同。本发明一个优选实施例中，以10ppm为例对拟南芥幼苗进行处理，然而，本领域技术人员能够理解并确定的是，随植物生长状态及种类差异，施用浓度可进行适当的调整，以实现最优效果。
研究结果充分表明,式（I）的化合物可以明显的迅速提高植物抵抗病原菌侵染的能力，活性氧信号提早出现，减少植物被病原菌侵染造成的细胞死亡，病原菌在植物体内的生长受到明显抑制保护植物不受病原菌伤害,并且不会抑制植物根部和幼苗的生长，反而对植物有略微的刺激生长作用，能够促进植物的侧根的生长发育，对环境也不会产生农药的二次污染，具有广阔的应用价值。
附图说明
图1是不同浓度的植物激活剂RJF对拟南芥幼苗生长的影响。
图2是植物激活剂对拟南芥小苗、根和水稻小苗的影响及统计结果。
图3是植物激活剂单独处理对假单胞细菌生长和灰霉菌孢子萌发的影响比较，右图为灰霉菌孢子萌发结果。
图4是假单胞细菌侵染拟南芥叶片的结果，其中，A：预先喷施植物激活剂后，假单胞细菌侵染拟南芥叶片的结果比较，B：假单胞细菌生长曲线。
图5是喷施植物激活剂后拟南芥抗病基因PR1和PR5的表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述。但本发明并不限于以下实施例。在以下实施例中，式（I）化合物以简称RJF指代。
实施例1实验材料与方法
1、植物材料与菌种
植物材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Columbia，Col）；水稻（OryzaSativa）。
菌种：灰霉菌（Botrytis cinerea），NJ－09株系由中国农业大学提供，假单胞细菌（Pseudomonas syringe.DG3），以上菌种由美国芝加哥大学Jean实验室提供。
2、主要实验试剂
台盼蓝、DAB药品购自广州威佳科技有限公司（Sigma进口分装）；植物激活剂BTH购自日本wako公司；植物激活剂RJF购自英国Maybridge公司；常用试剂均为广州化学试剂厂分析纯试剂。
3、实验中所使用的营养液以及重要试剂的配制
3.1、B5营养液的配方
Solution A(100×)
300mg H3BO3
100mg MnSO4·H2O
200mg ZnSO4·7H2O定容至1L，储存于4℃
Solution B(1000×)
Solution E(200×)
4.21g FeNaEDTA·3H2O或者3.67g FeNaEDTA定容至0.5L，储存于4℃
B5stock solution(10×)
3.2、MS营养液配方
大量元素：mg/L
微量元素：
铁盐：
注：1/2MS溶液即大量元素浓度减半，其余成分浓度不变
3.3、马铃薯琼脂平板培养基配方（PDA培养基）
马铃薯：300克蒸馏水：1000ml葡萄糖：20克琼脂：15克
3.4、植物激活剂BTH和RJF的配制方法
(1).BTH的配制：称取一定量的BTH固体粉末，加入丙酮溶解至浓度为100mM，保存于eppendorf管中，保存于2－10℃的环境中。
(2).RJF的配制：称取一定量的固体，加水搅拌溶解，配成200ppm（mg/L）的母液，直至全部固体溶解，4度保存。
4、实验方法
4.1、植物种植方法
4.1.1拟南芥种植方法
(1).土壤提前一天铺土，加入蛭石，以保证土壤的透气性，铺完土之后在底盘中加入大量的水，隔夜渗透，以保证土壤潮湿。种子用0.05％的Agar悬浮，放在4度冰箱。
(2).第二天点种之前，先在土壤表面用喷壶喷洒少许的水，将种子稀释到一定的浓度后用滴管逐粒拨入土壤中，每个位置拨1－2颗种子，接菌植物每格子中拨4×4颗种子为最佳。
(3).播种完毕后，用透明盖盖上，以保证较高的湿度保证种子的萌发，按照16h光照,8h黑暗的光周期，温度控制在22－25℃.
(4).一周左右揭去透明盖，介苗，保证每个位置只生长一棵植株。
(5).每天观察植物生长状况，每隔3－4d浇一次水，并且需要补充B5营养液，以保证植物足够的营养生长。
(6).生长18－21d即可用于实验处理。
4.1.2水稻种植方法
水稻种子用70%酒精表面消毒半个小时，同时配制含有不同浓度植物激活剂的0.07%的琼脂，灭菌后倒入植物塑料培养瓶中，在超净台内将水稻种子轻轻放在琼脂表面，然后拿到水稻生长房间生长10天到14天，观察水稻生长情况。
4.2、病原菌接种拟南芥方法
4.2.1灰霉菌（Botrytis cinerea）接种拟南芥的方法
用30ml的小喷壶将培养分离得到的灰霉菌孢子按107个孢子/mL的浓度喷洒到拟南芥叶片上。要尽量喷施均匀。且处理组与对照组喷施孢子悬液的量需基本一致。然后在培养盆上加盖透明打孔的塑料盖，置于光照培养箱内培养，前24h温度23℃，黑暗培养，以保证较高湿度以及有利于菌的生长和侵染的黑暗环境。之后按温度23℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度（4800-5100lux），相对湿度75－80的条件培养。对照组植物需同处理组植物保持一致，在相同的环境中生长。
4.2.2假单胞细菌接种方法：
从-80°冰箱里划菌至双抗KB平板上，28°生长两天后从平板上挑取单菌落。过夜在液体KB培养基内摇，第二天再吸取10uL菌液，1:100稀释继续摇，约四个小时候生长至OD=0.5，离心去上清，用10mM MgSo4重悬菌液至OD=0.001。用不带针头的1ml注射器注射到叶片内。
4.3假单胞细菌生长曲线：收集每个时间点注射菌液或对照的叶片，用打孔器相同面积叶片，放入1.5ml离心管内磨碎，加入200ulMgSo4，再梯度稀释，每个梯度吸取10ul点到KB平板上，28°生长一天后观察菌落计数。
植物激活剂单独对假单胞细菌生长的影响的实验方法：同接菌方法类似，第二次摇菌时加入植物激活剂，按照时间点测定对照和处理的OD600值。
4.4、植物激活剂对孢子萌发影响的实验方法
配制1%的琼脂，加热溶解琼脂粉，待琼脂温度下降将近室温时，加入植物激活剂的母液，使得最终琼脂中含有的BTH或RJF浓度分别为300μM，10ppm。用载玻片在液体琼脂中快速捞起，置于桌面，冷却凝固。实验设三组，对照组Control，含有BTH的琼脂载玻片，含有RJF的琼脂载玻片，每组设三个重复。分别在三组载玻片上均匀的喷洒已经分离好的107个孢子/mL的灰霉菌孢子。将载玻片放入预先湿润的培养皿中，黑暗，23℃培养，12h后显微镜下观察孢子的萌发状况，统计，并且计算出孢子萌发率。
4.5、拟南芥根生长实验方法
选择同一批次，萌发较好的种子进行实验，方法如下：
(1).种子的灭菌：取一定量的种子倒入灭菌的10mL离心管中，加入75%的乙醇灭菌，上下反复摇晃，时间为5分钟；弃去乙醇，加入灭菌水清洗种子，洗去种子表面的乙醇，反复三至四次；用0.05%的灭菌琼脂，重悬种子。
(2).量取等量的1/2MS培养基倒入方形培养皿中，待培养基凝固后，在每个培养皿中点入相近数量的拟南芥种子。
(3).将方形培养皿用封口膜封口，放入4℃冰箱进行春化，时间为一天。
(4).将春化好的种子转移至植物培养房进行萌发、生长，要求每个培养皿接收的光照均一，光照强度相近。生长时间为四天。
(5).挑选根相近的幼苗，将幼苗转移至含有植物激活剂的1/2MS培养基上，将培养皿转移至植物培养房，继续培养，五天后对根长和侧根数目进行统计。
4.6、拟南芥幼苗平板生长实验方法
(1).种子的灭菌：种子灭菌方法同拟南芥根生长方法中描述。
(2).将植物激活剂的母液加入即将冷却的1/2MS培养基中，稀释至最终所需的浓度。
(3).将灭菌的种子点入已经凝固的1/2MS培养基上，培养皿的盖子需干净、透明以利于植物接收光照，并用封口膜封口。
(4).将培养皿放入植物房进行培养，温度23℃，光周期为16h光照/8h黑暗，点种后12d左右观察现象，统计幼苗的生长状况。
4.7荧光定量PCR
选择18天到22天拟南芥植物，喷施植物激活剂后提取RNA，反转录，运用荧光定量PCR SYBR Green（Takara）试剂，使用Stepone plus荧光定量PCR仪得出实验结果。
实施例2本发明的新型植物激活剂在拟南芥和病原菌互作中的作用
1.不同浓度RJF对拟南芥幼苗生长发育的影响
将拟南芥野生型（Col）的种子均匀的播散在含有植物激活剂的1/2MS培养基表面，放入植物房进行培养，观察现象。
如图1，在不同浓度下生长的拟南芥，均没有出现抑制生长的现象。
2、BTH和RJF单独处理拟南芥幼苗其根部生长发育的影响
如图2A，从拟南芥平板生长实验中，可以看出在12天BTH处理组中，拟南芥的生长受到抑制，幼苗植株矮小；而在12天RJF的处理组中，幼苗的生长并未受到抑制，12天幼苗的细节图可以看出，RJF能够促进幼苗的生长，植株比对照组略大，但是叶片略微变黄，发黄的叶片多集中在植株第三、四两片子叶，随着时间的推移，至处理20天时，发黄叶片没有发生死亡现象，并且后长出的新叶仍然保持绿色。同时，RJF处理过的幼苗生长速度比BTH和对照组都要快，差异比较明显，说明RJF有促进植物生长的作用，这是之前已有的植物激活剂所不具备的性质。相比之下，喷施BTH后可诱导植物拟南芥和白菜，烟草抗病基因表达，接种病原菌后病原菌生长受到明显抑制，植物表现为发病滞后或者明显不发病，但是同时生长发育受到明显抑制。
观察根生长和发育，比较新型的植物激活剂RJF和传统的植物激活剂BTH之间的差异。
将拟南芥野生型（Col）的种子均匀分散的点在1/2MS培养基上，竖直生长四天之后，挑选长度相近的幼苗根转移至含有植物激活剂的1/2MS培养基上，同时设立不加植物激活剂的1/2MS作为空白对照和SA+1/2MS的阳性对照，移苗后培养样五天观察根生长的情况。
结果如图2D所示，各组植物激活剂处理拟南芥根部后，拟南芥根部的差异变化比较明显。图2D所示，SA处理后根部生长明显收到抑制，根生长缓慢，说明SA的积累对根部的生长发育起到抑制作用；用SA的类似物BTH处理的根部生长状况较SA处理的略有缓和，但是相比较于对照来说，根部的生长受到抑制，并且侧生根的生长也受到一定的抑制；但是新型的植物激活剂RJF处理后的根生长状况则完全不同于SA和BTH，图2E，F的统计结果表明，RJF处理后的拟南芥主根长度略小于对照组中的主根长，但是其侧根数比对照组中多，并且呈现显著性差异。根生长的实验说明了RJF除了在植物抗病过程中起着重要作用，对植物的根部的生长发育起着促进作用。
3.不同浓度RJF对水稻幼苗生长的影响
图2B，从左到右处理方式分别是BTH100um，RJF10ppm，1ppm，0.2ppm，0.01%丙酮，水，由图可见，BTH处理后水稻幼苗生长受到抑制，而RJF处理组生长并没有受到抑制，图2C统计结果显示BTH处理后水稻幼苗生长高度显著低于RJF处理组和对照组。
4.BTH和RJF单独处理对病原菌萌发和生长的分析
选定BTH的喷施浓度为300μM，RJF的喷施浓度为10ppm。将定量的孢子接种在含有两种植物激活剂的琼脂表面，同时设立对照组，12h后观察孢子萌发状况。用合适浓度的植物激活剂处理孢子12小时后，在显微镜下统计孢子的萌发率。值＝平均数±标准误。实验至少重复两次且结果相同。hpi：接种灰霉菌后的若干小时，dpi：接种灰霉菌后的若干天。实验结果如右图所示，12h后对照组和处理组的孢子萌发率均达到80%左右，并且三组结果之间并未出现显著性差异，相似的，选定BTH喷施浓度100μM，RJF浓度10ppm，在假单胞细菌第二次摇之前加入植物激活剂，每两个小时测定OD600数值记录，三个重复，实验结果如左图，24小时后对照组和处理组菌液的OD均达到了2.5左右，说明了该浓度下的两种植物激活剂均对该浓度下的灰霉菌孢子萌发并没有影响。
5.预先喷施植物激活剂（10ppm）的拟南芥接种假单胞细菌后的表型及假单胞细菌生长曲线
图4中可见，对照组在接菌后4天，已经发黄，正在走向死亡，但是两个处理组（BTH或RJF）的叶片显示出比较正常的颜色和表型，图B对叶片中的假单胞细菌做生长曲线显示喷施了植物激活剂后，处理组内的细菌生长相比对照组有了显著性的减少。可见，喷施植物激活剂RJF对比BTH也可以有效提高植物抗性，进而抑制假单胞细菌在植物体内的生长，降低假单胞细菌对植物的侵染和伤害作用，使植物相对于对照组晚于发病或者不发病。
6.喷施植物激活剂后拟南芥抗病基因表达
图5中可见，喷施BTH3天或RJF2day后，运用荧光定量PCR技术检测拟南芥抗病基因PR1和PR5表达，发现喷施植物激活剂后植物的两个抗病基因的表达都有显著性提高。
可见，本发明的新型植物诱导剂可诱导植物抗病基因的表达，提高植物抗性以抵御病原菌的侵染，并促进植物根部和幼苗的生长。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。
Claims (1)
1.式（I）的吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性同时促进植物根部生长中的应用：
。
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