DE69722039T2

DE69722039T2 - Methode zum fixieren und einbetten von geweben für histologische präperate

Info

Publication number: DE69722039T2
Application number: DE69722039T
Authority: DE
Inventors: Bernard 6953 Mormont Pajak
Original assignee: Pajak Bernard Mormont
Current assignee: Pajak Bernard Mormont
Priority date: 1997-07-15
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: WO1999004240A1; EP1000335A1; AU3615297A; ATE240514T1; EP1000335B1; DE69722039D1; US6379921B1

Description

EINSATZGEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fixierung und zum Einbetten von Geweben, die für histologische Präparate bestimmt sind.
STAND DER TECHNIK
Zur Zeit setzt man auf diesem Gebiet im wesentlichen zwei Typen von Verfahren ein, und zwar

1. Gefrierschnitte
2. Schnitte von fixierten und eingebetteten Geweben

Die Gefrierschnitte
Das Gefrieren erfüllt den zweifachen Zweck, die Geweben in dem Zustand zu fixieren, in dem sie sich befinden, und sie zu verfestigen, um den Schnitt zu gestatten.
Die Gefrierschnitte liefern ein histologisches Material,

– das im wesentlichen keine molekulare Denaturierung aufweist, und daher gute Bestimmungen bezüglich der Art der vorhandenen Moleküle ermöglicht;
– das der Nachteil hat, sich in Form von dicken Schnitten zu präsentieren, welche also eine mikroskopische Untersuchung mit starker Vergrößerung nicht gestatten, und eine morphologische Struktur des Gewebes aufweisen, die durch das Gefrieren stark abgebaut ist;
– so dass, es wohl möglich ist, die Moleküle gut zu markieren, es aber nicht möglich ist, die auf diese Weise markierten Moleküle in der morphologischen Struktur des Gewebes auf zuversichtliche Weise zu lokalisieren.

Schließlich werden die aus dem gefrorenen Gewebe realisierten Schnitte danach präpariert und bei Raumtemperatur untersucht, so dass eine chemische Fixierung noch nach dem Schneiden erforderlich ist.
Die Schnitte von fixierten und eingebetteten Geweben
Bei dieser Art von Verfahren wird das Gewebe (1) zunächst fixiert, dann (2) einem Schritt der Entwässerung unterworfen und schließlich (3) einem Schritt des Einbettens unterworfen, um das Gewebe zu festigen und das Schneiden zu ermöglichen, wobei danach (4) das Gewebe in dünne Lamellen, im allgemeinen mit dem Mikrotom, geschnitten wird, diese Lamellen auf Objektträger gelegt werden, und (5) diese Präparate von dem zum Einbetten benutzten Produkt endlich befreit und vor der histochemischen Behandlung rehydratisiert werden.
Der Zweck des Schritts der Fixierung (1) besteht darin, jegliche physikalisch-chemische Beeinträchtigung des Gewebes im wesentlichen zu blockieren, um es in dem ursprünglichen Zustand zu erhalten, in dem es entnommen wurde, und um somit Bestimmungen, insbesondere immunologischer Art, zu gestatten.
Der Zweck des Schritts (3) der Infiltrierung/des Einbettens besteht darin, das Gewebe zu festigen, um die Durchführung von Schnitten zu ermöglichen, die so fein wie möglich sind und eine vertiefte Untersuchung ermöglichen.
Der Schritt (2) der Entwässerung ist ein Zwischenschritt, dessen Zweck es ist, das in den Geweben vorhandene Wasser durch eine Zusammensetzung zu ersetzen, die selbst – eventuell unter Einsatz von Lösungsmitteln – durch das für die Infiltration/das Einbetten benutzte Mittel ersetzt werden kann.
Der Schritt (4) liefert die Schnitte aus eingebettetem und daher gefestigten Gewebe, und der Schritt (5) versetzt schließlich im wesentlichen das Gewebe in ihren ursprünglichen Zustand zurück, wobei er die angestrebten Bestimmungen ermöglicht.
Zur Durchführung des Schritts der Fixierung (1) kennt man verschiedene Fixierflüssigkeiten, wie Verbindungen auf der Grundlage von löslichen Zinksalzen, verschiedene organische Verbindungen (siehe zum Beispiel EP-A-0562877), wie Aceton (siehe zum Beispiel US-A-5 104 640. Für den Schritt der Entwässerung (2) kennt man verschiedene Verbindungen, wie zum Beispiel Ethanol, Methanol, Isopropanol und Aceton (siehe zum Beispiel den an weiterer Stelle zitierten Artikel von Beckstead).
Für den Schritt (3) der Infiltration/des Einbettens setzt man zur Zeit, auf traditionelle Weise, Paraffin ein, das den Nachteil hat, wenig löslich zu sein und daher später nur unter Einsatz von starken Lösungsmitteln eliminiert werden zu können und nur bei Temperaturen von 58–60°C, also deutlich höher als die physiologische Temperatur der Geweben und folglich diese denaturierend, schmilzt.
In The Journal of Histochemistry & Cryochemistry („A Simple Technique for Preservation of Fixation-sensitive Antigens in Paraffin-embedded Tissues" vol 42 No. 6 pp 1227–1134, 1994) beschreibt Jay H. Beckstead ein Verfahren zur Fixierung/zum Einbetten, bei dem eine Fixierung mittels Zinksalz, verbunden mit einem Einbetten in Paraffin, eingesetzt wird, und vergleicht es einerseits mit bekannten Verfahren zum Einbetten mit Paraffin, bei denen andere Fixiermittel eingesetzt werden, und andererseits mit dem Gefrierverfahren.
Dieses Verfahren besteht darin

– die Geweben mittels löslicher Zinksalze in einem Puffer zu fixieren,
– die auf diese Weise fixierten Geweben durch zunehmende Ethanol/Isopropanol-Konzentrationen zu entwässern,
– das Ethanol/Isopropanol mit Xylol zu eliminieren,
– in Paraffin bei 58–60°C zu infiltrieren/ einzubetten,
– Schnitte durchzuführen,
– das Paraffin mit drei Xylol-Bädern, denen drei Isopropanol-Bädern folgen, zu eliminieren, und zu rehydratisieren.

Das Aceton – das ebenfalls als Entwässerungsmittel wirkt ist dafür bekannt, dass es eine deutliche morphologische Denaturierung der Geweben hervorruft. Aus diesem Grund betrachten es die Erfindern als ungeeignet für die Fixierung, wenn man morphologische Bestimmungen durchführen will, was im Allgemeinen bei präparierten histologischen Schnitten der Fall ist, die Beobachtungen unter dem Mikroskop dienen sollen.
Die Alkohole (Ethanol, Methanol, Isopropanaol, zum Beispiel) sind dafür bekannt, dass sie die morphologische Struktur nicht merklich abbauen, wenn sie mit Sorgfalt verwendet werden, und sie werden daher heute sehr generell bei der Entwässerung von Geweben eingesetzt. Dagegen üben sie eine ausgeprägte Abbau-Wirkung auf die molekularen Strukturen (durch Koagulation) aus, und sie weisen daher Nachteile auf, wenn es darauf ankommt, sowohl die molekularen als auch die morphologischen Strukturen zu erhalten, wie es bei immunologischen Studien in situ und ex vivo in der Immunohistochemie der Fall ist.
Andererseits weisen sie eine sehr starke Entwässerungswirkung auf und, um eine Alteration der morphologischen Struktur zu vermeiden, ist es notwendig, die Entwässerung in aufeinander folgenden Schritten mit zunehmender Alkohol-Konzentration durchzuführen, was die Prozedur wesentlich erschwert.
Da das Paraffin im Allgemeinen wenig löslich ist, muss zwischen dem Schritt der Entwässerung und dem Schritt des Einbettens ein Zwischenschritt zur Eliminierung des Entwässerungsmittels mit Lösungsmitteln, wie das Toluol, das Xylol, das Benzol oder ähnlichen Mitteln vorgesehen werden, was Probleme Hinsichtlich der Denaturierung der Geweben und der Toxizität stellt und der Verfahrensweise noch einen Schritt hinzufügt.
Schließlich erfordert die Imprägnierung mittels Paraffin Temperaturen von ±60°C, also höher als die physiologische Temperatur, und übt somit eine denaturierende Wirkung (thermische Koagulation) auf die molekularen Strukturen aus.
Zudem muss der Vorgang der Eliminierung des Paraffins und der Rehydratisierung der Geweben ebenfalls mit starken Lösungsmitteln, die nicht ohne Nachteile sind, durchgeführt werden.
Man kennt ebenfalls („Immunofluorescence Detection of Factin on Low Melting Point Wax Sections from Plant Tissues" von Stanislav Vitha et al, in The Journal of Histochemistry & Cryochemistry, vol 45 (1): 89–95, 1997) ein Verfahren, dass darin besteht

– die Geweben sukzessiv in Lösungen aus Formaldehyd und Zinkchlorid zu fixieren, wobei der letzte Schritt bei 60°C durchgeführt wird,
– die Geweben durch zunehmende Ethanol-Konzentrationen zu entwässern,
– in mehreren Schritten die Geweben mit einem aus 90 Polyethylen glycol 400 Distearat (auch Polyoxyethylen bis(Stearat) genannt) und 10% 1-Hexadecanol bestehenden Harz bei 35–37°C zu infiltrieren/ einzubetten,
– Schnitte durchzuführen und
– das Harz mit Ethanol technischer Qualität zu eliminieren und die Präparate zu rehydratisieren.

Gemäß der Erfindung wird ein weder die molekulare noch die morphologische Struktur der Geweben wesentlich abbauendes Verfahren zur Fixierung/zum Einbetten, vorgeschlagen, um Bestimmungen zu gestatten, die so zuverlässig und präzise wie möglich sind. Dies ist wichtig, insbesondere bei immnunologischen Bestimmungen in situ und ex vivo, bei denen man versucht, immunologische Bestimmungen und Analysen zu realisieren, nicht nur mit biologischen Molekülen, die aus ihrer Zellen- und/oder Gewebeumgebung extrahiert sind, sondern wohl in dieser Umgebung.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher, ein Verfahren anzubieten, das es ermöglicht, Gewebeschnitte zu erhalten, die nicht wesentlich denaturiert sind, weder aus der molekularen Sicht, um quantitative immunologische Bestimmungen zu gestatten, noch aus der morphologischen Sicht, um diese Bestimmungen in der ursprünglichen Zellen- und/oder Gewebeumgebung realisieren zu können. Mit den in der Technik bekannten Verfahren ist es nicht möglich, dieses Ziel zu erreichen, insofern sie entweder die molekulare Struktur oder die morphologische Struktur, oder auch beide denaturieren.
Gemäß der Erfindung wird dieses Ziel mittels eines Verfahrens zur Fixierung und zum Einbetten von Geweben für histologische Präparate erreicht, das in etwa bei der physiologischen Temperatur eingesetzt werden kann, welches im wesentlichen Schritte umfaßt, die darin bestehen:

– das Gewebe in einem flüssigen Fixiermittel zu fixieren, das mindestens ein lösliches Zinksalz, in einem wäßrigen Puffer enthält,
– das auf diese Weise fixierte Gewebe in einer im wesentlichen aus Aceton bestehenden Flüssigkeit zu entwässern,
– das fixierte und entwässerte Gewebe mit einem im wesentlichen in jedem Verhältnis in dem Aceton löslichen Harz einzubetten und zu infiltrieren.

Nach einem anderen Merkmal der Erfindung schmilzt das Harz bei einer Temperatur, die nicht höher als 37–40°C liegt.
Nach einem zusätzlichen Merkmal besteht das Harz aus Polyoxyethylen bis(Stearat).
Nach einem weiterem zusätzlichen Merkmal enthält das Harz, auf der Grundlage von 100% in Gewicht der Endzusammensetzung, 0 bis 20% in Gewicht einer festigenden Verbindung, die Hexadekanol und/oder Diethylenglykoldistearat enthält, um es bei Raumtemperatur fester zu machen.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Kit zum Präparieren von histologischen Schnitten bei Anwendung des Verfahrens, das im wesentlichen ein Fläschchen wäßriger Lösung, die mit einem oder mehreren Zinksalzen gepuffert ist, ein Fläschchen Aceton und eine gewisse Menge von Harzverbindungen aus Polyoxyethylen bis(Stearat) mit Zusätzen von Hexadekanol und/oder Diethylenglykoldistearat entsprechend der gewünschten Einsatztemperatur, umfaßt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist anwendbar auf allen Gebieten der Histologie und der Histochemie, und dessen Einsatz ist äußerst einfach. Es kann bei einer Temperatur von 37–40°C, d. h. im wesentlichen bei der physiologische Temperatur von lebenden Geweben durchgeführt werden.
Das Polyoxyethylen-Harz ist schon durch den Artikel von S. Vitha et al bekannt.
Dieses Harz, dessen Schmelzpunkt bei 37°C liegt, bietet die Möglichkeit, Schnitte unter guten Bedingungen bis zu Temperaturen von 10–12°C durchzuführen. Das Ziel des Hexadekanolzusatzes ist, es bei Raumtemperatur fester zu machen, um die Schnitte bei der Labortemperatur durchzuführen.
Gemäß der Erfindung hat man noch festgestellt, dass das Hexadekanol ebenfalls ganz oder teilweise durch das Diethylenglykoldistearat ersetzt werden kann, das im wesentlichen die gleichen Eigenschaften (im wesentlichen träge gegenüber Geweben und das Harz härtend) aufweist. Ein wichtiges Merkmal des Verfahren gemäß der Erfindung, abgesehen von dem Einbetten bei „normaler" Temperatur, ist die Assoziation eines Fixiermittels auf der Grundlage von Zinksalzen mit Aceton als Entwässerungsmittel.
Im Allgemeinen wird das Aceton nicht in den Histologie-Abhandlungen (MARTOJA R. & MARTOJA M., 1967, „Initiation aux Techniques de 1'Histologie Animale", Verlag MASSON et Cie.) als Fixiermittel angeführt. Dieses wird durch die geringe Geschwindigkeit, mit der es in die Geweben eindringt und durch die morphologischen Beeinträchtigungen, die es dort bewirkt, begründet. Es wird jedoch als Fixiermittel in einigen Fällen zitiert, in denen man versucht, dort eine enzymatische Aktivität in situ zu bewahren.
POLLARD et al (J. Histochem. Cytochem., 1987, 35 (11): 1329) weisen darauf hin, dass Moleküle wie CD4 und D8, Marker von T-Lymphozyten, auf Schnitten aus mit Aceton fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben nicht mehr evident gemacht werden können, während sie auf Gefrierschnitten, die mindestens 30 Minuten mit Aceton behandelt wurden, nachweisbar bleiben. Dieses Ergebnis zeigt anscheinend, dass das Aceton an sich selbst nicht denaturierend ist, dass es aber in Verbindung mit einem Einbetten in Paraffin die Entdeckung dieser beiden Marker unmöglich macht.
Gemäß den Forschungen des Erfinders verbessert der Einsatz von Aceton als Fixiermittel und Entwässerungsmittel und von Polyoxyethylen bis(stearat)-Harz als Einbettenmilieu die Leistungen dieses verfahrens zur Fixierung und zum Einbetten, indem er die Verwendung einer größeren Anzahl von Antikörpern gestattet und die Realisierung von dünnen Schnitten erleichtert. Trotz dieser Verbesserung gestattet dieses Verfahren noch nicht den Nachweis von Molekülen, wie CD3, CD4 und CD8 (siehe Tabelle 2), womit die Ergebnisse von POLLARD et al bestätigt werden. Zudem beobachtet man eine gewisse Anzahl von durch das Aceton induzierten morphologischen Deformationen: Dehnungen der Geweben, Erscheinen von künstlich entstandenen zellulären Zwischenräumen.
Das erfindungsgemäße Kombinieren einer vorläufigen Fixierung der Geweben mittels einer mit einem Zinksalz gepufferten wäßrigen Lösung und einer Entwässerung mit Aceton, gefolgt von einer Infiltration/einem Einbetten mit einem Harz wie das mit dem Aceton völlig mischbare Polyoxyethylen bis(Stearat) unterbindet diese Fehler.
In der Tat nicht nur die Bewahrung der molekularen Geweben erscheint vollkommen, sondern scheint die Fixierung mit den Zinksalzen den Geweben eine solche morphologische Stabilität zu verleihen, dass sie dadurch widerstandsfähig gegenüber den durch das Azeton induzierten Verformungen gemacht werden.
Das nachträgliche Einbetten mittels eines mit dem Aceton völlig mischbaren Harzes macht andererseits den Einsatz von Zwischenlösungsmitteln zur Eliminierung des Acetons unnötig; dieser gleiche Vorteil kommt ebenfalls später wieder vor, wenn das Harz eliminiert und das Geweben rehydratisiert werden müssen.
Für den Fachmann, der das Verfahren nach S. Vitha et al sowie die Eigenschaften des Acetons kennt und der bei normaler Temperatur unter maximaler Vereinfachung des Verfahrens arbeiten möchte, würde daher ein normaler Schritt daraus bestehen, das Aceton als Fixier- und Entwässerungsmittel zu verwenden, wobei man auf diese Weise ein Verfahren erhalten würde, das aus morphologischer Sicht deutlich denaturierend wäre.
Erstaunlicherweise haben die Forscher entdeckt, dass die Assoziation einer Fixierung mit Zinksalzen, gefolgt von einer Entwässerung mit Aceton die normalerweise durch das Aceton verursachte molekulare Denaturierung nicht nach sich ziehen würde.
Ohne in irgendeiner Weise diese Erklärung als erschöpfend betrachten zu wollen, scheint es, dass die durch die Zinksalze hervorgerufene physikalisch-chemische Fixierung derartig ist, dass sie einer späteren deutlichen Änderung durch das Aceton entgegenwirkt.
Ein anderer beachtlicher durch das Aceton herbeigeführter Vorteil besteht darin, dass das Aceton andererseits in jedem Verhältnis in dem Polyoxyethylen bis(Stearat)-Harz mischbar ist, so dass es nicht nötig ist starke Lösungsmittel, wie zum Beispiel Benzol, Toluol oder Xylol einzusetzen, um den Übergang des Aceton in das Harz zu ermöglichen, wodurch die Denaturierung noch reduziert, die Gesamtheit des Verfahrens durch Verringerung der Anzahl seiner Schritte vereinfacht und ebenfalls die eventuell mit den oben genannten Lösungsmitteln verbundenen Umwelt- oder Toxizitätsprobleme vermieden werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung gewährleistet somit eine perfekte Synergie zwischen den verschiedenen Operationsstadien der Präparation der histologischen Schnitte, um das gewünschte Ergebnis, das heißt eine minimale molekulare und morphologische Denaturierung, zu erzielen, und zwar mittels eines Verfahrens, das gegenüber der früheren Technik bemerkenswert vereinfacht ist.
Er wird breite Anwendungsgebiete bei der Präparation von histologischen Schnitten zwecks immunologischer Bestimmungen in situ und ex vivo entdecken, was auf die dadurch ermöglichte Qualität der Schnitte zurückzuführen ist.
Ein bevorzugtes Einsatzgebiet des Verfahrens gemäß der Erfindung ist die Immunohistochemie. Auf den mit dem Verfahren erhaltenen Schnitten ist es tatsächlich möglich, zahlreiche Moleküle nachzuweisen, wie die für die zellulären Stämme kennzeichnenden Membranmarker; die den Zustand der Zellen widerspiegelnden Marker; die zytoplasmatischen Proteine, unter ihnen die Zytokine bzw. die antiapoptotischen Proteine; die Glykosidrückstände, die mit Lektinen nachgewiesen werden, die Fragmente von Nukleinsäuren, die durch die Hybridation in situ oder durch die TUNEL-Reaktion sichtbar gemacht werden, welche die Apoptose kennzeichnen; wobei diese Liste in keiner Weise erschöpfend ist und nur zur Erläuterung dienen soll.
Ein anderes Einsatzgebiet des Verfahrens gemäß der Erfindung ist das Ersetzen der herkömmlichen Verfahren zur Präparation von histologischen Schnitten für die Untersuchung unter dem Mikroskop durch die globale Vereinfachung und die Zuverläßlichkeit, die es ermöglicht.
Beispiel eines Berichtes über die Präparation der schnitte
Man verfolge den nachfolgenden Bericht:

1. Entnahme des Gewebes
2. Fixierung: kleine Gewebefragmente (5 mm Seitenlänge) werden in eine Zinksalze enthaltene Fixierflüssigkeit (einige ml), welche vorher auf 4°C abgekühlt wurde, getaucht und während 1 bis 7 Tage bei 4°C darin liegen gelassen. Die Fixierung erfolgt in kleinen Fläschchen aus Glas vom Typ Pillenbehälter. Um den Niederschlag der Zinksalze zu vermeiden, wird die Fixierflüssigkeit durch Auflösen von 5% Zinksalze (Acetat und Chlorid, in gleichen Anteilen) in destilliertem Wasser erhalten. Diese Lösung wird dann einem auf pH 7,4 eingestellten, 0,1% Kalziumactetat enthaltenen Tris-HCl-Puffer zugefügt (1 vol. Zinksalzlösung für 9 Vol. Tris-HCl), um auf diese Weise eine gepufferte zinksalzhaltige Lösung zu 5% zu erhalten;
3. Entwässerung: die Fixierflüssigkeit wird eliminiert und sofort durch reines Aceton (analytischer Qualität) ersetzt; darin lässt man die Fragmente während 6 bis 24 Stunden bei 4°C liegen.
4. Imprägnierung und Einbetten: Die Fragmente werden in auf 37°C gehaltenes, flüssiges Harz enthaltene Fläschchen transferiert. Um eine gute Imprägnierung zu gewährleisten, wird das Harzbad dreimal gewechselt, wobei jedes Bad um 10 bis 30 Minuten verlängert wird. Nach dem dritten Bad werden die Fragmente in eine Form angepaßter Größe (1 bis 3 cm³) gelegt, die vorher mit flüssigem Harz gefüllt wurde. Nachdem sie in dem flüssige Harz eingetaucht sind, können die Fragmente darin entsprechend den nachträglichen Erfordernissen orientiert werden; wenn nötig wird das Harz während dieser Operation flüssig gehalten, indem ein metallischer, auf einer Flamme erwärmter Spachtel darin eingetaucht wird. Nachdem das Fragment korrekt orientiert ist, läßt man abkühlen und dadurch das Harz bei Raumtemperatur in einem trockenen Raum fester werden. Nach einer Nacht bis 2 Tagen, kann der gefestigte Harzblock aus der Form entnommen und präpariert werden, um in dünne Schnitte geteilt werden.
5. Die dünnen Schnitte (3 bis 5 μm) werden mit dem Schlittenmikrotom bzw. dem Drehmikrotom bei Raumtemperatur realisiert. Auf Grund der niedrigen Schmelztemperatur des Herzes kann es bei Temperaturen über 22°C schwierig werden, es zu schneiden.
6. Man breitet die schnitte auf Okjektträgerblättern aus, die vorher mit Gelatine versehen oder mit Polylysin behandelt wurden. Da das Harz hygroskopisch ist, wird davon abgeraten, es auf Wasserbad auszubreiten. Es wird bevorzugt auf einem albuminisierten, direkt auf dem Blatt befindlichen Wassertropfen ausgebreitet; die Ausbreitung wird bei Raumtemperatur fortgeführt bis zur völligen Trocknung des Blattes.
7. Die auf diese Weise erhaltenen Blätter können unbegrenzt bis zur histochemischen Behandlung aufbewahrt werden.

Beispiel einer immunohistochemische Behandlung

– Eliminierung des Harzes in einem Acetonbad während 10 Minuten
– Rehydratisierung der Schnitte in einem PBS-Bad (Puffer aus salzhaltigem Phosphat mit einem pH von 7.4) während einige Sekunden (kann bis zu mehreren zig Minuten verlängert werden, wenn nötig)
– Inhibition der endogenen Pseudoperoxidasen (fakultativer Schritt, wenn das enzymatische Entwicklungsverfahren unter Einsatz eines anderen Enzyms als Peroxidase erfolgt: Inkubation der Schnitte in H₂O₂ zu 1 bis 3% während 10 bis 30 Minuten. Dieser Schritt muss zwangsläufig allen anderen vorangehen, um wirksam zu sein.
– Sättigung der nicht spezifischen Fixierungsstellen mit dem „Blocking reagent" der Firma Boehringer (Katalognummer 1 096 176), dass in einem PBS mit einem pH von 7,4 aufgelöst wurde; man kann ebenfalls das BSA (Bovine Serum Albumin) zu 1% im PBS verwenden.
– Spülung in PBS
– Inkubation der Blätter mit dem spezifischen Biotin-Antikörper der in der oben genannten Sättigungsmittellösung verdünnt ist. Die Bedingungen, unter denen die Inkubation des Antikörpers stattfindet, hängen von dem jeweiligen Antikörper ab; beispielsweise gibt eine Antikörperkonzentration von 10 μg/ml gute Ergebnisse nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur.
– Spülung in PBS
– Inkubation der schnitte mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC); der Komplex kommt in drei verschiedenen Formen vor, welche als Enzym entweder die Peroxidase oder die alkalische Phosphatase oder auch die Glukose Oxidase umfassen; die Wahl des Enzyms wird dem Benutzer überlassen; die besten Ergebnisse werden mit den durch die Firma VECTOR vertriebenen Komplexen erzielt.
– Spülung in PBS
– Entwicklung der enzymatischen Aktivität mit Hilfe der spezifischen Substrate, die bei der Firma VECTOR erhältlich sind
– Spülung mit dem herkömmlichen Wasser der Stadtwerke
– Gegenfärbung (je nach den eingesetzten Substraten) und Montage der Präparate.

Die Hauptvorteile der Erfindung sind:

1. Die extreme Vereinfachung der Methode der Fixierung und des Einbettens;
2. Die gleichzeitige Bewahrung der morphologischen und der molekularen Strukturen des behandelten Gewebes.

Anhand von Vergleichsbeispielen werden die Vorteile von Punkt 2 erläutert.
Die zur Zeit bekannten Verfahren: Gefrieren und Fixierung /Einbetten sind denaturierend sei es für die Morphologie der Geweben (Gefrierverfahren) sei es für die molekulare Struktur (Fixier-/Einbettenverfahren), wobei sie die Wiedererkennung der Moleküle durch spezifische Antikörper verhindern, obwohl bestimmte Verfahren zur Fixierung/ zum Einbetten, bei denen insbesondere Formaldehyd als Fixiermittel eingesetzt wird, die Möglichkeit bieten, denaturierte Proteine mittels einer begrenzten Anzahl von zur Erkennung von denaturierten Proteine fahigen Antikörpern (Antiaktin, Antivimentin ...) zu erkennen. Die den Verfahren zur Fixierung/zum Einbetten anhaftenden Begrenzungen ergeben sich einerseits aus chemischen Denaturierungen, die durch die Fixiermittel, durch die Entwässerungsmitteln sowie durch die organischen mit dem Paraffin mischbaren Lösungsmittel induziert werden; andererseits aus thermischen Denaturierungen, die bei der Einschließung in dem flüssigen Paraffin bei 60°C entstehen.
Durch die Verwendung eines Harzes mit einem niedrigen Schmelzpunkt (37o C) werden die Probleme der thermischen Denaturierung vermieden.
Eine Lösung zur Minimierung der chemischen Denaturierungen besteht darin, die Anzahl von denaturierenden Substanzen (Alkohole, Lösungsmittel, ...) maximal zu verringern, und daher für die vor dem Einbetten durchzuführenden Schritte Zusammensetzungen zu verwenden, die mit dem zum Einbetten eingesetzten Harz völlig mischbar sind.
In der nachfolgenden Tabelle 1 werden die denaturierenden Eigenschaften von bekannten Verfahren mit dem Verfahren gemäß der Erfindung verglichen.
Tabelle 1: Vergleich der denaturierenden Eigenschaften verschiedener Verfahren
Beispiele von Denaturierungen
Die beigefügten Abbildungen dienen dazu, die Qualität der nach Behandlung entsprechend dem Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführten Bestimmungen durch Vergleich mit anderen Techniken zu veranschaulichen.
Die 1A bis 1C stellen Schnitte dar, welche aus dem Milzgewebe einer Maus durch Gefrieren erhalten wurden, mit immunohistorischen Markierung mittels eines monoklonalen Antikörpers Anti-B7.2 (GL1) biotinyle, mit Entwicklung mit alkalischer Phosphatase.
Die 2A und 2B sind ähnliche Ansichten, nach Behandlung gemäß der Erfindung.
Die durch das Gefrierverfahren induzierten Denaturationen sind mechanischer Art: Quetschungen, Dehnung und Riß des Gewebes (1A und 1B). Komplizierter wird es durch das Hinzukommen der Schwierigkeit, Schnitte zu realisieren, die genügend dünn sind, um die durch die immunohistorische Behandlung erhaltenen Markierungen mit Genauigkeit zu lokalisieren (1C).
Insbesondere
Stellt die 1A eine Ansicht mit geringer Vergrößerung (4X) dar; die positiven Zellen für den Marker B7.2 erscheinen dunkler;
die 1B ist eine Ansicht mit mittlerer Vergrößerung (25X), wobei aus einem bei dem Schnitt entstandenen Riß resultierende „Löcher" sichtbar gemacht werden;
die 1C ist eine Ansicht mit starker Vergrößerung (100X), welche zeigt, dass es nicht möglich ist das Markieren mit einer präzisen Struktur zu verbinden.
Wie vorher erwähnt wurde, weist das Verfahren zur Fixierung mit Aceton und zum Einbetten mit Harz noch Nachteile bezüglich der morphologische und chemische Bewahrung auf. Die 2 und 3 veranschaulichen die morphologischen Beeinträchtigungen und vergleichen sie mit den Ergebnissen, welche mit dem Verfahren, das die Fixierung mit Zinksalzen einbezieht, erzielt werden.
Insbesondere
stellt die 2A eine Ansicht mit mittlerer Vergrößerung (40X) dar; man bemerkt große künstlich entstandene Leerräume zwischen den Zellen, welche durch die Dehnung des Gewebes bei der Fixierung hervorgerufen wurden;
die 2B ist eine Ansicht mit starker Vergrößerung (100X); man bemerkt die dunkler dargestellten Kerne der Zellen, aber man erkennt kaum die roten Blutkörperchen;
die 3A und 3C veranschaulichen perfekt die Möglichkeiten, die die Technik gemäß der Erfindung bieten. Diese Ergebnisse könnten weder mit dem Gefrierverfahren (1) noch mit dem Verfahren zur Fixierung/Entwässerung mit Aceton (2) erzielt werden.
Insbesondere
stellt die 3A eine Ansicht mit geringer Vergrößerung (4X) dar; man beobachtet (die dunkelsten Teile) die spezifische Markierung der denditrischen Zellen (Markierung mit einem monoklonalen Antikörper N418, Entwicklung mit alkalischer Phosphatase). Eine Gegenfärbung mit Methylgrün gestattet es, die morphologischen Strukturen zu lokalisieren, dadurch dass die Knötchen aus weißer Pulpa heller und die rote Pulpa dunkler erscheinen;
die 3B stellt eine Ansicht mit einer mittleren Vergrößerung (40X) der denditrischen Zellen (die dunkelsten) in der weißen Pulpa im Kontakt mit den Lymphozyten, deren Kerne heller erscheinen, dar. Man bemerkt das Fehlen von morphologischen Deformationen sowie die Möglichkeit jede Zelle visualisieren zu können;
die 3C stellt eine Ansicht mit starker Vergrößerung (100X) der roten Pulpa dar. Abgesehen von den denditrischen Zellen (auf der Figur dunklere Halos) sieht man deutlich: links und auf halber Höhe eine riesige Zelle vom Typ Megakaryozyt; in der Mitte, im unteren Teil, einen venösen Sinus, in dem man rote Blutkörperchen und überall auf dem Klischee die Kerne aller kernhaltigen Zellen entdeckt.
Außer dem Vorteil einer perfekten Bewahrung der morphologischen Strukturen, bietet das Verfahren zur Fixierung/Entwässerung mit Zinksalzen/Aceton, verbunden mit dem Einbetten bei der physiologsichen Temperatur von ± 37°C, die Möglichkeit, eine größere Anzahl von Molekülen auf Schnitten mittels monoklonalen Antikörpern zu endecken,. Die Tabelle II gibt einen Überblick dieser Möglichkeiten durch Vergleich mit anderen Verfahren.
Tabelle II: Vergleich der immunnohistorischen Ergebnisse, die mit den verschiedenen Verfahren erzielt wurden
Anmerkung: NT = Nicht getestet
In dem, was vorangegangen ist, versteht man unter Polyoxyethylen bis(stearat) eine Zusammensetzung, welche diese Verbindung enthält, der man eventuell die gewünschte Menge (von 0 bis 20% in Gewicht gesamt, auf der Grundlage von 100% in Gewicht der Zusammensetzung) Hexadekanol und/oder Diethylenglykol zugefügt hat, um sie fester bei Raumtemperatur zu machen. Wie erwähnt, ist das Polyoxyethylen bis(stearat) allein jedoch nicht ausreichend fest bei einer Temperatur von 10–12°C, um die gewünschten dünnen Schnitte zu gestatten.
Ebenso, obwohl die Erfindung mit diesem einzigen Harz beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass es durch irgendwelches Harz ersetzt werden kann, das ähnliche Eigenschaften aufweist, nämlich eine völlige Mischbarkeit mit dem Aceton, eine Schmelztemperatur, die 37 bis 40°C nicht überschreitet und eine Festigkeit bei normaler Temperatur, welche ausreichend ist, um dünne Gewebeschnitte unter Laborbedingungen erhalten zu können. Die Erfindung betrifft schließlich ein Kit zum Präparieren von histologischen Schnitten, um die Letztgenannte bei Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung realisieren zu können.

Claims

Methode zum Fixieren und Einbetten von Geweben für histologische Präparate, bei dem ein Gewebe mittels eines flüssigen Fixiermittel fixiert, mittels eines flüssigen Entwässerungsmittels entwässert, und in eine Verbindung im geschmolzenen Zustand, deren Schmelztemperatur höher als die Raumtemperatur ist, infiltriert/eingebettet wird, dadurch gekennzeichnet, dass sie im wesentlichen Schritte umfaßt, die daraus bestehen: – das Gewebe in einem flüssigen Fixiermittel zu fixieren, das mindestens ein lösliches Zinksalz, in einem wäßrigen Puffer enthält, – das auf diese Weise fixierte Gewebe in einer im wesentlichen aus Aceton bestehenden Flüssigkeit zu entwässern, – das fixierte und entwässerte Gewebe mit einem im wesentlichen in jedem Verhältnis in dem Aceton löslichen Harz einzubetten und zu infiltrieren.
Methode nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Harz bei einer Temperatur schmilzt, die nicht höher als 37–40°C liegt.
Methode nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Harz aus Polyoxyethylen bis (Stearat) besteht.
Methode nach dem Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Harz, auf der Grundlage von 100% in Gewicht der Endzusammensetzung, 0 bis 20% in Gewicht einer festigenden Verbindung enthält, die Hexadekanol und/ oder Diethylenglykoldistearat enthält, um es bei Raumtemperatur fester zu machen.
Kit zum Präparieren von histologischen Schnitten bei Anwendung des Verfahrens nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen ein Fläschchen wäßriger Lösung, die mit einem oder mehreren Zinksalzen gepuffert ist, ein Fläschchen Aceton und eine gewisse Menge von Harzzusammensetzungen aus Polyoxyethylen bis (Stearat) mit Zusätzen von Hexadekanol und/oder Diethylenglykoldistearat entsprechend der gewünschten Einsatztemperatur, umfaßt.