CN105021431A - 荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法及碱性溶液的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤：(1)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品；(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12。本发明提供的方法，能适用于各种体积的生物组织样本，荧光强度强，成像效果好，样品兼具优良的切削性能。

Description

荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法及碱性溶液的应用

技术领域

本发明属于荧光显微成像领域，更具体地，涉及一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法及碱性溶液的应用。

背景技术

树脂包埋样品具有优越的切削性能，是制备电镜超薄组织切片以及电镜或光学断层显微成像用样品的标准方法。但是由于树脂包埋过程中脱水以及有机相处理的过程严重淬灭绿色荧光蛋白及其衍生物，使得树脂包埋技术无法与基于现代分子生物学的荧光标记技术兼容。

现有的树脂包埋技术，主要有两种：基于物理固定手段的包埋方法，对于体积较小(厚度不超过0.6毫米)的样本，可使用基于超低温冰冻,冰冻置换和低温聚合的树脂包埋方法使得探测和分析培养细胞和微小组织中的GFP荧光能够顺利进行。但是,除了仍然有荧光淬灭外,这种技术几乎不能移植到宏观体积样品的包埋中,因为冰冻置换无法在厚度超过0.6毫米的样品上均匀的实现，并且同时,基于紫外聚合的低温聚合技术也无法在宏观组织上使用，因为短波长的紫外光无法穿透厚组织，从而无法保证组织内部成功聚合。基于化学固定手段的包埋方法：主要通过将醛类等物质渗透入生物组织，与组织内的蛋白发生反应，相互交联，实现组织的固定；然后通过乙醇等有机溶剂的渗透置换实现脱水，再通过包埋剂单体渗透置换掉脱水剂，使用常规的热聚合实现包埋。但是这种方法不能避免荧光淬灭现象，荧光亮度低，成像效果差。

目前的树脂包埋技术，荧光淬灭现象普遍，成像效果不理想，尤其是对于体积较大的生物样本。而且，由于缺乏对树脂包埋过程中荧光蛋白淬灭原理的了解，荧光淬灭现象是不可控的。无论是物理固定手段的包埋技术还是化学固定手段的包埋技术都是经验性的，其可移植性受到严重限制，一种方法往往只适用于特定的组织和荧光蛋白。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法及碱性溶液的应用，其目的在于通过在聚合完成后调节树脂包埋样品的pH值，使得荧光蛋白去质子化，从而恢复活性，由此解决荧光成像领域荧光淬灭且淬灭不可控的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；

(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；

(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；

(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品；

(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12之间。

优选地，所述的树脂包埋方法，其碱性溶液的pH在8至12之间，优选pH在10至12之间，更优选pH值为11.2。

优选地，所述的树脂包埋方法，其碱性溶液的弱碱溶液或碱性缓冲液。

优选地，所述的树脂包埋方法，其弱碱溶液，为碳酸钠溶液、有机胺溶液和氨水中的一种或多种。

优选地，所述的树脂包埋方法，其荧光蛋白标记的生物组织为绿色荧光蛋白或其衍生物标记的生物组织。

优选地，所述的树脂包埋方法，所述包埋剂为丙烯酸树脂。

优选地，所述的树脂包埋方法，其步骤(3)所述包埋剂为热聚合包埋剂时，所述步骤(4)聚合反应温度在50℃至60℃之间。

优选地，所述的树脂包埋方法，其步骤(4)聚合反应前，将所述包埋剂填充的荧光蛋白标记的生物组织，置于真空干燥环境，除去包埋剂中的气体。

按照本发明的另一方面，提供了一种弱碱性溶液应用于恢复荧光蛋白被淬灭的荧光,是通过使荧光蛋白处于pH值8至12的环境实现的。

优选地，所述弱碱性溶液的pH值在8至12之间。

优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物，如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明通过碱液激活，使得树脂包埋后质子化的GFP及其衍生物去质子化，从而恢复淬灭的荧光，大幅提高荧光强度，获得高质量的成像效果；

(2)本发明提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，兼容现有的树脂包埋方法，不影响现有的树脂包埋剂使用，能保证包埋后样品的硬度，所述方法包埋后的生物组织样品具有优良的切削性能；

(3)本发明提供的树脂包埋方法，不限制生物组织样品大小，对于体积较大的生物组织样品，仍能取得较好的包埋效果，荧光强度和成像质量好。

附图说明

图1是本发明提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法流程图；

图2是实施例1碱液激活前后荧光强度对比图；图2(a)为实施例1碱液激活前荧光强度；图2(b)为实施例1碱液激活后荧光强度；

图3是实施例2碱液激活前后荧光强度对比图；图3(a)为实施例2碱液激活前荧光强度；图3(b)为实施例2碱液激活后荧光强度；

图4是实施例3碱液激活前后荧光强度对比图；图4(a)为实施例3碱液激活前荧光强度；图4(b)为实施例3碱液激活后荧光强度；

图5是实施例4碱液激活前后荧光强度对比图；图5(a)为实施例4碱液激活前荧光强度；图5(b)为实施例4碱液激活后荧光强度；

图6是实施例5碱液激活前后荧光强度对比图；图6(a)为实施例5碱液激活前荧光强度；图6(b)为实施例5碱液激活后荧光强度；

图7(a)是EGFP分别在蒸馏水、pH＝5的乙酸溶液、GMA单体、GMA树脂聚合物以及碱液激活的GMA聚合物中的吸收光谱曲线图；图7(b)是树脂包埋和碱液激活过程中生色团动力学示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，如图1所示，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织。所述荧光蛋白标记的生物组织，优选为绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物(GFP衍生物)标记的生物组织。化学固定手段，主要指使用固定剂将浸泡所述生物组织，使得生物组织形态保持不变，优选的固定剂有：多聚甲醛溶液(PFA溶液)、甲醛溶液等。一般使用化学固定手段固定后，宜用PBS溶液(磷酸盐缓冲液生理盐水)漂洗。

(2)样本脱水。

将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶液置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织。有机溶液置换的具体步骤为：将所述生物组织，依次通过梯度乙醇溶液进行脱水，脱水的程度按照相应包埋剂使用的一般要求。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织。其具体步骤为：将所述生物组织依次通过梯度包埋剂溶液进行渗透置换，溶液的浓度梯度按照相应包埋剂的一般浓度处理。

所述包埋剂为丙烯酸树脂，可为低温聚合包埋剂或热聚合包埋剂等。低温聚合包埋剂如GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)树脂Technovit8100、MMA(甲基丙烯酸甲酯)树脂Technovit9100。热聚合包埋剂如伦敦白胶(LRwhite)等。

(4)包埋剂聚合。

使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品。聚合反应前，树脂包埋样品可进行真空处理，使得包埋效果更好，具体方法为：将所述树脂包埋样品置于真空干燥箱一段时间，直至去除包埋剂中的气体，如空气气泡、溶解的氧气等。避光条件下，使包埋剂发生聚合反应，反应时间5小时至72小时。反应时间根据具体使用的包埋剂确定：如果使用低温聚合包埋剂，聚合反应时间12小时至72小时；如果使用热聚合包埋剂，则聚合温度不超过60摄氏度，优选为50℃至60℃，更优选为55℃，聚合时间不能超过24小时，以5至8小时为宜。

在聚合前，将所述包埋剂填充的荧光蛋白标记的生物组织进行真空处理，不仅能使树脂包埋样品表面避免空气中的氧，同时能降低氧气在树脂包埋样品中溶解的量，因此能降低有氧条件对聚合效果的影响，避免聚合不充分，树脂包埋样品硬度降低等问题。优选的真空条件为低于0.01个大气压。较高聚合反应温度能加快聚合速度，但过高的反应温度，会使荧光蛋白热变性，导致不可逆的失活，影响荧光亮度。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节其pH值在8至12之间。所述碱液优选为惰性碱液，同时弱碱的碱性溶液，由于水解和电离平衡，能维持pH值稳定，因此更适合用来进行碱液激活处理，另外碱性缓冲液的效果也类似。

所述碱性溶液，优选为碳酸钠溶液、有机胺溶液、氨水或其混合物。调节pH值太低，则荧光蛋白激活效果不好；调节pH值太高，则会使荧光蛋白变性，导致荧光不可逆淬灭，优选的碱性溶液pH值在10至12之间，更优选的碱性溶液pH值为11.2。

按照本发明的另一个方面，提供了弱碱性溶液应用于恢复荧光蛋白活性，是通过使荧光蛋白处于pH值8至12的环境实现的。荧光蛋白在包埋过程中受到包埋剂的影响，导致荧光淬灭，现有的荧光蛋白标记的生物组织包埋方法，由于不清楚荧光淬灭原理，因此没有办法恢复荧光，且包埋的组织样本，荧光效果不可控。本发明提供了弱碱溶液用于对树脂包埋的荧光蛋白标记的组织样本中荧光蛋白处于pH值8至12之间，所述荧光蛋白实现去质子化，使得淬灭的荧光恢复，从而获取更高质量的生物组织样本成像。

所述弱碱性溶液的pH值在8至12之间；所述荧光蛋白优选为GFP或者GFP衍生物。

以下为实施例：

实施例1

thy1-YFPH小鼠全脑的树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将GFP衍生物，增强型黄色荧光蛋白(EYFP)标记的小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的EYFP标记的生物组织。

具体步骤如下：

在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。

(2)样本脱水。

将固定的EYFP标记的小鼠全脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EYFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将固定的EYFP标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的EYFP标记的小鼠全脑进行LR white(伦敦白胶)包埋剂渗透处理，获得LR white包埋剂单体填充的EYFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将脱水后的EYFP标记的小鼠全脑依次通过梯度LR white的乙醇溶液10ml以上，进行包埋剂渗透。LR white的乙醇溶液梯度为LRwhite按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，前四个梯度每个梯度浸泡2小时，最后一组浸泡48小时。

(4)包埋剂聚合。

使所述LR white包埋剂发生聚合反应，获得EYFP标记的生物组织的树脂包埋样品。

具体步骤为：

将1.1mL的LR white包埋剂注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将LR white包埋剂单体填充的EYFP标记的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置。然后再在避光，0.01个大气压以下的真空干燥箱中放置10min后，盖上胶囊盖子，移入55摄氏度烘箱中聚合8小时即可。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为12的碳酸钠溶液中，调节pH值为11。

碱液激活处理后和碱液激活处理前，荧光亮度如图2所示。

实施例2

thy1-GFPM小鼠全脑的树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将GFP衍生物，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的EGFP标记的生物组织。

具体步骤如下：

在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经福尔马林溶液浸泡约12小时，福尔马林溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。

(2)样本脱水。

将固定的EGFP标记的小鼠全脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EGFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将固定的EGFP标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的EGFP标记的小鼠全脑进行LR white(伦敦白胶)包埋剂渗透处理，获得LR white包埋剂单体填充的EGFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将脱水后的EGFP标记的小鼠全脑依次通过梯度LR white的乙醇溶液10ml以上，进行包埋剂渗透。LR white的乙醇溶液梯度为LRwhite按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，前四个梯度每个梯度浸泡2小时，最后一组浸泡48小时。

(4)包埋剂聚合。

使所述LR white包埋剂发生聚合反应，获得EGFP标记的生物组织的树脂包埋样品。

具体步骤为：

将1.1mL的LR white包埋剂注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将LR white包埋剂单体填充的EGFP标记的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置。然后再在避光，0.01个大气压以下的真空干燥箱内放置10min后，盖上胶囊盖子，移入50摄氏度烘箱中聚合24小时即可。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为8的氨水中，调节pH值为8。为达到理想pH值，可多次更换氨水。

碱液激活处理后和碱液激活处理前，荧光亮度如图3所示

实施例3

GFP标记鼠脑树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的GFP标记的生物组织。

具体步骤如下：

在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。

(2)样本脱水。

将固定的GFP标记的小鼠全脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的GFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将固定的GFP标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的GFP标记的小鼠全脑进行LR white(伦敦白胶)包埋剂渗透处理，获得LR white包埋剂单体填充的GFP标记的小鼠全脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将脱水后的GFP标记的小鼠全脑依次通过梯度LR white的乙醇溶液10ml以上，进行包埋剂渗透。LR white的乙醇溶液梯度为LRwhite按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，前四个梯度每个梯度浸泡2小时，最后一组浸泡48小时。

(4)包埋剂聚合。

使所述LR white包埋剂发生聚合反应，获得GFP标记的生物组织的树脂包埋样品。

具体步骤为：

将1.1mL的LR white包埋剂注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将LR white包埋剂单体填充的GFP标记的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置。然后再在避光，0.01个大气压以下的真空条件下处理15min后，盖上胶囊盖子，移入60摄氏度烘箱中聚合5小时即可。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为10的有机胺中，调节pH值为9。

碱液激活处理后和碱液激活处理前，荧光亮度如图4所示

实施例4

EGFP标记的鼠脑树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将EGFP标记的鼠脑用化学方法固定，得到固定的EGFP标记的生物组织。

具体步骤如下：

在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。

(2)样本脱水。

将固定的EGFP标记的鼠脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EGFP标记的鼠脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将固定的EGFP标记的鼠脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，分别浸泡1小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，95％。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的EGFP标记的鼠脑进行GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)树脂Technovit8100树脂包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的EGFP标记的鼠脑。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将脱水后的EGFP标记的小鼠全脑依次通过梯度GMA的乙醇溶液10ml以上，进行包埋剂渗透。GMA的乙醇溶液梯度为GMA按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，前四个梯度每个梯度浸泡2小时，最后一组浸泡48小时。

(4)包埋剂聚合。

使所述GMA树脂包埋剂发生聚合反应，获得EGFP标记的生物组织的树脂包埋样品。

具体步骤为：

将1.1mL的GMA树脂包埋剂注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将GMA树脂包埋剂单体填充的EGFP标记的鼠脑放入胶囊中，调整好位置。然后再在避光，0.01个大气压以下的真空干燥箱内放置10min后，盖上胶囊盖子，移入干燥，避光4摄氏度冰箱中聚合12小时即可。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋鼠脑样品浸泡在pH值为12的氨水和有机胺的混合溶液中，调节pH值为12。为达到理想pH值，可多次更换氨水和有机胺的混合溶液。

碱液激活处理后和碱液激活处理前，荧光亮度如图5所示

实施例5

EGFP标记的果蝇树脂包埋与荧光激活，包括以下步骤：

(1)样本固定。

将EGFP标记的果蝇用化学固定手段固定，得到固定的EGFP标记的生物组织。

具体步骤如下：

在4摄氏度下，将乙醚麻醉的果蝇直接在质量分数为4％的PFA溶液浸泡进行固定，10min后用毛笔小心取出。

(2)样本脱水。

将固定的EGFP标记的果蝇用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EGFP标记的果蝇。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将固定的EGFP标记的果蝇依次通过梯度乙醇双蒸水溶液10ml，分别浸泡30分钟，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％。

(3)包埋剂渗透处理。

将脱水后的EGFP标记的果蝇进行MMA(甲基丙烯酸甲酯)树脂Technovit9100(EMS)包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的EGFP标记的果蝇。

具体步骤为：

在4摄氏度下，将脱水后的EGFP标记的果蝇依次移入两份100％二甲苯中各30min进行置换，获得透明的EGFP标记的果蝇。再按照甲基丙烯酸甲酯(MMA)，树脂Technovit9100(EMS)产品说明书上的渗透溶液和梯度进行渗透，前面每个梯度浸泡30分钟，最后一组浸泡48小时。

(4)包埋剂聚合。

使所述MMA树脂Technovit9100(EMS)包埋剂发生聚合反应，获得EGFP标记的生物组织的树脂包埋样品。

具体步骤为：

将1.1mL的MMA树脂Technovit9100(EMS)包埋剂注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将MMA树脂Technovit9100(EMS)包埋剂单体填充的EGFP标记的果蝇放入胶囊中，用干净的小镊子拨动果蝇没入聚合液中。然后再在避光，0.01个大气压以下的真空条件下处理10min后，盖上胶囊盖子，移入干燥，避光-10摄氏度冰箱中聚合72小时即可。

(5)碱液激活处理。

将所述树脂包埋果蝇样品浸泡在pH值为11.2的碳酸钠溶液中，调节pH值为8。

碱液激活处理后和碱液激活处理前，荧光亮度如图6所示。经测量荧光强度有8.3倍的提升

实施例6

使用分光光度计测量了EGFP(增强型绿色荧光蛋白)分别在蒸馏水、乙酸溶液(PH＝5)、GMA单体、GMA树脂聚合物以及碱液(pH＝11的碳酸钠溶液)激活的GMA聚合物中的吸收光谱，可得图7(a)所示的曲线图。

模拟包埋过程EGFP所处的环境，即EGFP在蒸馏水，GMA单体、GMA树脂聚合物及碱液激活的GMA聚合物中，检测EGFP的吸光值，结果如图7(a)所示。图7(a)显示在390nm和488nm处有吸收峰的正常EGFP吸收光谱，而在384nm和448nm处没有检测到吸收肩峰，表明EGFP并没有变性或降解。

在PH＝5的乙酸溶液、GMA单体和GMA树脂聚合物中，390nm吸收峰增长，488nm吸收峰大大衰减，检验表明大部分EGFP生色团转化成中性(质子化)苯酚状态，不发荧光。即在树脂包埋过程，EGFP因质子化引起荧光强度减弱。

而使用pH为11碱液，调节其pH值在8以上后，吸收光谱恢复到与EGFP在蒸馏水时一样，仅在488nm处探测到吸收峰，表明包埋过程中转化的中性苯酚色团能被化学激活成发荧光的阴离子酚盐，即去质子化状态，荧光强度得到恢复。图7(b)展示了树脂包埋和化学激活过程的发色团动力学，加氢质子化荧光淬灭，加碱恢复荧光。

当pH值超过12，EGFP会发生变性，导致荧光不可逆减弱。GFP及GFP的其他衍生物，均存在类似的荧光淬灭现象，原理相同，因此碱液激活法亦可应用于GFP及GFP其他衍生物。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤：

(1)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；

(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；

(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；

(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品；

其特征在于，还包括以下步骤：

(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12之间。

2.如权利要求1所述的树脂包埋方法，其特征在于，所述碱性溶液的pH在8至12之间，优选pH在10至12之间，更优选pH值为11.2。

3.如权利要求1所述的树脂包埋方法，其特征在于，所述碱性溶液的弱碱溶液或碱性缓冲液。

4.如权利要求2所述的树脂包埋方法，其特征在于，所述弱碱溶液，为碳酸钠溶液、有机胺溶液和氨水中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的树脂包埋方法，其特征在于，所述荧光蛋白标记的生物组织为绿色荧光蛋白或其衍生物标记的生物组织。

6.如权利要求1所述的树脂包埋方法，其特征在于，所述包埋剂为丙烯酸树脂。

7.如权利要求1所述的树脂包埋方法，其特征在于，步骤(3)所述包埋剂为热聚合包埋剂时，所述步骤(4)聚合反应温度在50℃至60℃之间。

8.如权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述步骤(4)聚合反应前，将所述包埋剂填充的荧光蛋白标记的生物组织，置于真空干燥环境，除去包埋剂中的气体。

9.弱碱性溶液应用于恢复荧光蛋白被淬灭的荧光，是通过使荧光蛋白处于pH值8至12的环境实现的。

10.如权利要求9所述的弱碱性溶液的应用，其特征在于，所述弱碱性溶液的pH值在8至12之间。