DE69736167T2

DE69736167T2 - Verfahren zur Bewertung der Schäden, die durch UV-A in der Haut hervorgerufen werden

Info

Publication number: DE69736167T2
Application number: DE69736167T
Authority: DE
Inventors: Francoise Bernerd; Daniel Asselineau
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1996-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2017-12-25
Also published as: FR2757635B1; EP0851227B1; DE69736167D1; EP0851227A1; US6079415A; FR2757635A1; ES2267126T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewertung der Schäden, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A in der Haut und/oder der Dermis hervorgerufen werden.
Die Sonnenstrahlung umfasst unter anderem Ultraviolettstrahlung vom Typ A mit Wellenlängen, die im Bereich von 320 bis 400 nm liegen (UV-A), und Ultraviolettstrahlung vom Typ B mit Wellenlängen, die im Bereich von 280 bis 320 nm liegen (UV-B).
UV-B-Strahlung ist sehr energiereich und dringt nur wenig ein, ist im Sonnenlicht nur in geringem Anteil vorhanden in Abhängigkeit von klimatischen Schwankungen (bewölktes Wetter, bedeckter Himmel etc.), und ihr Vorhandensein variiert in Abhängigkeit von der Tageszeit (Begriff des Tagesmaximums (Zenit))
UV-A-Strahlung ist weniger energiereich als UV-B-Strahlung, dringt aber tiefer ein, ist in einem großen Anteil im Sonnenlicht vorhanden (mindestens 100-mal mehr UV-A-Strahlung als UV-B-Strahlung), der nur wenig von klimatischen Schwankungen abhängt und der unabhängig von der Tageszeit vorhanden ist.
Es ist bekannt, dass die Sonnenstrahlung für günstige Wirkungen auf die Haut verantwortlich ist, wie zum Beispiel die Bräunung, dass sie aber auch imstande ist, Schädigungen der Haut hervorzurufen, insbesondere im Fall einer Haut, die als "empfindlich" bezeichnet wird, oder im Fall einer andauernd dem Licht ausgesetzten Haut.
Zu den positiven Wirkungen der Braunfärbung, die allgemein auch als Bräunung bezeichnet wird, gehört, dass sie ein wesentlicher Bestandteil des Abwehrsystems der Haut ist. Als Reaktion auf Ultravio lettstrahlung synthetisieren die Melanozyten der oberen Schicht der Epidermis Melanin, das, sobald es in die Keratinozyten eingebracht ist, ein auf der Hautoberfläche gelegenes Filter bildet, das die Ultraviolettstrahlung absorbiert. Hiermit ist das Ziel verbunden, die Menge an Ultraviolettstrahlung zu verringern, die die Hautschichten durchdringt, um das Vordringen dieser Strahlung bis zu den tieferen Schichten und dort das Verursachen von nachteiligen Schädigungen der Haut zu verhindern.
Hinsichtlich der schädlichen Auswirkungen ist bekannt, dass eine übermäßige Bestrahlung der Haut mit Ultraviolettstrahlung, insbesondere mit Sonnenstrahlung, zu einer Änderung der Hautelastizität und zu einer Änderung ihres Gehalts an bestimmten Verbindungen führen kann und so eine Beschleunigung des natürlichen Alterungsprozesses der Haut fördern kann. Dieser beschleunigte oder vorzeitige Alterungsprozess, der durch UV-Strahlung verursacht wird, wird im Allgemeinen als lichtbedingte Alterung oder aktinische Alterung oder als Heliodermatitis bezeichnet.
Die lichtbedingte Alterung wird demnach durch die Einwirkung äußerer Faktoren auf die Haut, darunter die Sonnenstrahlung und insbesondere die UV-Strahlung, verursacht.
Die lichtbedingte Alterung ist demnach die Folge der Wiederholung definierter Ereignisse, die durch diese äußeren Faktoren hervorgerufen werden, insbesondere durch die Sonnenstrahlung, definierter Ereignisse, die bis heute vermutet jedoch niemals nachgewiesen wurden.
Unter definierten Ereignissen wird jedes einzelne und punktuelle Ereignis verstanden, das aus einer Bestrahlung mit UV-Strahlung resultiert.
Beim Menschen führt die lichtbedingte Alterung dazu, dass die Haut ein raues, trockenes klinisches Aussehen in Kombination mit einem Elastizitätsverlust sowie deutlichen Falten zeigt.
Die histologischen Zeichen der lichtbedingten Alterung (zusammengefasst in: Gilchrest B.A. Skin and Aging processes, 1989, CRC Press) im Bereich der Epidermis sind: die Änderung der Dicke der Epidermis (Atrophie oder Hyperplasie in Abhängigkeit von den beobachteten Bereichen, eine Zellatypie (Kligman L.M. and Kligman A.M., Photodermatol. 1986, 3: 215–227), ein Verlust der Zellpolarität, eine Unregelmäßigkeit der Hornschicht, eine Abnahme der Zahl der Langerhans-Zellen (Lavker R.M. et col., J. Invest. Dermatol. 1987, 88: 44s–51s), eine Pigmentierung, die durch ein mosaikartiges Aussehen mit Bereichen mit einer Hypo- oder einer Hyperpigmentierung gekennzeichnet ist, eine Einebnung des Verbindungsbereichs zwischen Dermis und Epidermis (Lavker R.M., J. Invest. Dermatol. 1979, 73: 59-).
Die Veränderungen der Epidermis fallen im Vergleich mit den Veränderungen der Dermis, die die offenkundigsten und bedeutendsten Veränderungen sind, relativ geringfügig aus (Kligman L. M. and Kligman a.M., Photodermatol. 1986, 3: 215–227).
Tatsächlich werden die Hauptauswirkungen im Bereich der extrazellulären Matrix beobachtet. Die Fibroblasten sind hyperaktiv (Kligman L.M. and Kligman A.M., Photodermatol. 1986, 3: 215–227). Die Kollagenmenge nimmt ab (Oikarinen A. et col., Photodermatol. 1985, 2: 15–26, Warren R. et col., J. Am. Acad. Dermatol. 1991, 25: 751–760). Die Löslichkeit der Fasern nimmt ab (Oikarinen A. and Kallioinen M., Photodermatol. 1989. 1989, 6: 24–31), und man beobachtet eine basophile Entartung.
Die ultrastrukturellen Veränderungen des Kollagens äußern sich in einer Abnahme der Zahl der Fibrillen, einer Verringerung der elektronischen Dichte, einer Abnahme der Querstreifung (Mitchell R.E., J. Invest. Dermatol. 1967, 48: 203–220).
Umgekehrt erleidet das elastische Gewebe eine Hyperplasie (Kligman A.M. J.A.M.A. 1969, 210: 2377–2380, Warnen R. et col., J. Am. Acad. Dermatol. 1991, 25: 751–760). Die mittlere Dermis ist durch eine Umgruppierung der Fasern gekennzeichnet, wodurch ein Oberflächenbereich gebildet wird, der als "Grenzzone" bezeichnet wird, Fasern, die im Stratum papillare fehlen. Im tiefsten Teil der Dermis ist das elastische Gewebe anomal und desorganisiert (Chen V.L. et col., J. Invest. Dermatol. 1986, 87: 334–337), es ist aber vor allem in beträchtlicher Menge vorhanden, was sich histologisch in einer Anhäufung von elastischem Gewebe äußert. Dieses Phänomen trägt den Namen "aktinische Elastose" (Braverman I.M. and Fonferko E., J. Invest. Dermatol. 1982, 78: 434–443; Matsuoka L. Y. and Uitto J., Aging and the skin, Balin A.K. and Kligman A.M. Hrsg., Raven Press N. Y. 1989, 7, 141–151). Das Elastin weist ein körniges Aussehen (elastotisches Material) und im Elektronenmikroskop Einschlüsse auf (Braverman I.M. and Fonferko E., J. Invest. Dermatol. 1982, 78: 434–443). Die Glucosaminglykane und die Proteoglykane sind erhöht (Smith J.G. et col, J. Invest. Dermatol. 1962, 39: 347–350, Sams W.M. and Smith J.G., J. Invest. Dermatol. 1961, 37: 447–452).
Häufig wurde das Vorhandensein eines Infiltrats in der Dermis festgestellt, das aus Mastozyten, Lymphozyten und Histiozyten besteht (Lavker R.M. and Kligman A.M., J. Invest. Dermatol. 1988, 90: 325–330). Die Blutgefäße sind ebenfalls verändert (Braverman I.M. and Fonferko E., J. Invest. Dermatol., 1982, 78: 444–448). Insbesondere ist ihre Zahl verringert, die Endothelialzellen sind vergrößert, und die Wand der Gefäße ist verdickt, und man beobachtet eine plattenförmige Ausbildung der Basalmembran der Endothelialzellen.
Auch wenn die klinischen und histologischen Anzeichen einer lichtgealterten Haut gut untersucht worden sind, bleiben die Prozesse, die zu diesen Anzeichen führen, bis heute jedoch unbekannt. Insbesondere ist die jeweilige Bedeutung von UV-A- und UV-B-Strahlung für diese Prozesse nicht aufgezeigt worden.
Dies geht größtenteils auf die Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Untersuchungsmodells zurück.
Im Stand der Technik sind Tiermodelle bekannt, die mit dem Ziel der Reproduktion von Schäden, die durch UV-Strahlung verursacht werden, und mit dem pharmakologischen Ziel der Prüfung von "alterungsverhindernden" Molekülen entwickelt worden sind (Sams W. M. et col., J. Invest. Dermatol., 1964, 43: 467–471; Kligman L.H., Yearly review, the hairless mouse and photoaging; Photochem. Photobiol., 54(6), 1109–1118).
Diese Modelle erfordern jedoch die Verwendung von Labortieren, was nicht ohne ethische Probleme ist.
Außerdem muss man, um ein Bild der lichtinduzierten Alterung nahe der Realität zu erhalten, mit diesen Modellen regelmäßige Bestrahlungen über mehrere Wochen durchführen, was den Einsatz dieser Modelle erschwert.
Die in diesen Modellen verwendeten Tiere sind im Allgemeinen Mäuse, deren Zellen in zahlreichen Punkten verschieden von menschlichen Zellen sind.
Außerdem ist die Haut der Maus wesentlich feiner als die menschliche Haut, und dieser Parameter muss berücksichtigt werden, wenn es um die Auswirkungen von UV-Strahlung geht, denn diese Auswirkungen hängen vom Eindringen der Strahlung ab.
Die Dermis der Maus ist verschieden von menschlicher Dermis (Stratum papillare und Stratum reticulare sind bei der Maus nicht vorhanden) und kann je nach der in dem Modell verwendeten Art zahlreiche entartete Haarfollikelreste enthalten.
Schließlich geben diese Modelle keine genauen Hinweise auf die frühen Ereignisse, die zum histologischen Bild der lichtbedingten Alterung führen.
Es sind außerdem Untersuchungsmodelle beim Menschen bekannt (Scharffetter K. et col., Arch. Dermatol. Res. 1991, 283: 506–511; Korwin-Zmijowska C. et col., Nouv. Dermatol. 1993, 12: 487), es versteht sich jedoch ohne weiteres, dass ihre Durchführung schwierig ist. Das Arbeiten mit freiwillig teilnehmenden Menschen bringt Schwierigkeiten in ethischer Hinsicht mit sich und verursacht unvermeidbar Einschränkungen für die Versuchspersonen.
Außerdem ist die Unterschiedlichkeit der einzelnen Personen (Lichttyp der Haut, Alter der Versuchspersonen, Vorgeschichte, laufende Behandlungen, ...) so, dass eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse illusorisch ist.
Schließlich sind in vitro-Modelle bekannt. Einige dieser Modelle setzen Zellkulturen ein, in denen die Auswirkungen von UV-Bestrahlungen auf einen oder mehrere Marker der kultivierten Zellen untersucht werden.
Auf diese Weise wurden die Auswirkungen von UV-A-Strahlung auf Keratinozyten (Epidermiszellen), Fibroblasten (Dermiszellen), Langerhans-Zellen (immunkompetente Epidermiszellen) oder Melanozyten (Pigmentzellen) untersucht (Gilchrest B.A., J. Gerontol. 1980, 35: 537–541; Scharffetter K. et col., Arch. Dermatol. Res. 1991, 283: 506–511; Petersen M.J. et col., J. Invest. Dermatol. 1992, 99: 440–444; Nascimento A. et col., Nucleic Acids Res., 1993, 21(5), 1103–1109).
Es ist leicht zu verstehen, dass derartige Modelle aus dem einfachen Grund, das es sich um Zellkulturen in Monolage handelt, was sehr verschieden vom Begriff eines Gewebes und seinem dreidimensionalen Aussehen ist, die Wirklichkeit nicht wiedergeben können. In den meisten Fällen werden die Kulturen aus einer einzigen Zellpopulation erzeugt, was die Wirklichkeit ebenfalls nicht wiedergibt.
So können der Einfluss der Dicke der Schichten, die von der Strahlung durchdrungen werden, und die Bedeutung des Eindringens der UV-Strahlung in die Haut, die selbstverständlich von der Dicke der durchdrungenen Zellschichten abhängt, in derartigen Modellen nicht untersucht werden.
Das Fehlen des Matrixzusammenhangs, insbesondere hinsichtlich der Fibroblasten der Dermis, für die bekannt ist, dass der Matrixzusammenhang für ihre metabolische Aktivität wesentlich ist, verfälscht die Interpretation der erhaltenen Ergebnisse; es ist schwierig, die Daten eines künstlichen Modells auf eine reale in vivo-Situation beim Menschen zu extrapolieren.
Mit diesem Typ von Modellen ist es unmöglich, die Anwendung von Produkten auf topischem Wege durchzuführen.
Schließlich verwenden einige dieser Modelle Zelllinien, d.h. genetisch veränderte Zellen, die die physiologische Wirklichkeit normaler Zellen nicht wiedergeben können.
Es sind auch Modelle bekannt, die Äquivalente der Epidermis oder der Haut verwenden. Was die Modelle betrifft, die Epidermisäquivalente verwenden, rührt deren wesentlicher Nachteil daher, dass sie auf Grund des Fehlens einer Dermis oder eines Dermisäquivalents die Wirklichkeit nicht wiedergeben (Noel-Hudson M. S. et col., Nouv. Dermatol., 1993, 12: 493). Man kann ferner in dieser gedanklichen Reihenfolge die Bräunungsversuche angeben, die mit Epidermisäquivalenten durchgeführt wurden, die Melanozyten enthalten (FR 2 689 904).
Andere Untersuchungen verwenden Hautäquivalente (Mammone et col., J. Invest. Dermatol. 1992, 98, (4), 655; Ridge J.M. et col., Clin. Res., 1992, 40(2): 543A; Reece B. et col., J. Soc. Cosmet. Chem., 1992, 43: 307–312; Pelle E. et col, J. Invest. Dermatol., 1993, 100, (4), 595; Nelson D. et col., Photochem. Photobiol. 1993, 57 (5): 830–837); Haake and Polakowska, Cell death and differentiation, 1995, Bd. 2, 183–193).
Unabhängig von den verwendeten Modellen, die manchmal ziemlich entfernt von einer normalen Haut sind, sind diese Untersuchungen in den meisten Fällen sehr summarisch geblieben und haben in keinem Fall den spezifischen Einfluss von UV-A-Strahlung auf Marker untersucht, die mit der lichtinduzierten Alterung korreliert sind.
So hat es bis heute kein Untersuchungsmodell ermöglicht, die Ereignisse zu untersuchen und zu verstehen, deren Wiederholung zu den klinischen und histologischen Anzeichen der lichtinduzierten Alterung führt.
Die menschliche Haut besteht aus zwei Kompartimenten, nämlich einem Oberflächenkompartiment, der Epidermis, und einem tieferliegenden Kompartiment, der Dermis.
Die natürliche menschliche Epidermis besteht im wesentlichen aus drei Typen von Zellen, bei denen es sich um die ganz überwiegend vorhandenen Keratinozyten, die Melanozyten und die Langerhans-Zellen handelt. Jeder dieser Zelltypen trägt durch seine eigenen Funktionen zur wesentlichen Rolle bei, die die Haut im Organismus spielt.
Die Dermis bildet einen festen Träger für die Epidermis. Sie stellt ebenfalls deren Element für die Versorgung mit Nährstoffen dar. Sie besteht im wesentlichen aus Fibroblasten und einer extrazellulären Matrix, die selbst wiederum im wesentlichen aus Kollagen, Elastin und einer Substanz zusammengesetzt ist, die als Grundsubstanz bezeichnet wird, deren Bestandteile durch die Fibroblasten synthetisiert werden. Man findet hier auch Leukozyten, Mastozyten oder auch Gewebsmakrophagen. Sie besteht außerdem aus Blutgefäßen und Nervenfasern. In einer normalen Haut, d.h. in einer weder erkrankten noch in der Wundheilung befindlichen Haut, befinden sich die Fibroblasten im Ruhezustand, d.h. im nicht vermehrenden, in metabolischer Hinsicht wenig aktiven und nicht mobilen Zustand.
Die Epidermis ist das erste Ziel, das von der Sonnenstrahlung, insbesondere der UV-Strahlung, erreicht wird.
Die wenig tief eindringende UV-B-Strahlung erreicht im wesentlichen die Epidermis. Die Rolle der UV-B-Strahlung beim Auslösen von UV-induzierten Hautkrebstypen wurde eindeutig nachgewiesen. Sie hat als Hauptchromophor die Nucleinsäuren, insbesondere die Desoxyri bonucleinsäure, in der sie Schäden und/oder Mutationen auslöst (Eller M.S., 1995, in Photodamage. 26–56, Blackwell Hrsg.).
Im Gegensatz hierzu ist die Rolle von UV-A-Strahlung beim Auslösen definierter Ereignisse, deren Wiederholung zum Phänotyp der lichtinduzierten Alterung führt, nicht bekannt, auch wenn ihr starkes Eindringvermögen vermuten lässt, dass sie die Dermis erreicht, in der sie ihre schädlichen Auswirkungen entfaltet.
Die Anmelderin, die sich seit sehr langer Zeit für die Haut und insbesondere die Wechselwirkungen von Sonnenlicht mit der Haut interessiert, hat nach langwierigen Arbeiten nun bestimmte spezifische Auswirkungen von UV-Strahlung vom Typ A in der Haut, insbesondere in der Dermis, ermittelt.
Die Anmelderin konnte zeigen, dass eine Bestrahlung mit UV-A-Strahlung in der Dermis Schäden hervorruft, die spezifisch für die Wellenlängen von UV-A-Strahlung sind. Sie hat so zeigen können, dass UV-A-Strahlung die Erzeugung der Kollagenase vom Typ I durch die Fibroblasten induziert, dass die Zahl dieser Fibroblasten infolge der Bestrahlung dramatisch abnimmt bis zu einem vollständigen Verschwinden in den 48 Stunden, die auf die Bestrahlung folgen, zumindest in einer Schichtdicke der Dermis, die von den Parametern der Bestrahlung abhängt, und dass der Teil der Dermis, aus dem die Fibroblasten verschwunden sind, mit darunter liegenden Fibroblasten neu besiedelt wird, die nicht von der Strahlung erreicht wurden. Diese drei Ereignisse sind unmittelbar mit der Bestrahlung mit UV-A-Strahlung verbunden.
Es ist leicht zu verstehen, dass die Erzeugung von Kollagenase (Enzym, das Kollagen abbaut) in einer Struktur, in der Kollagen einen wesentlichen Bestandteil bildet, nur zu dramatische Auswirkungen auf die Haut führen kann.
Es ist ebenfalls verständlich, dass das durch UV-A-Strahlung ausgelöste Verschwinden der Fibroblasten, die einen Hauptbestandteil der Dermis und deren regenerierende Elemente bilden, ebenfalls nur zu dramatische Auswirkungen auf die Haut führen kann.
Schließlich findet die Neubesiedlung nur statt, wenn mindestens ein Teil der Fibroblasten der Dermis von der Strahlung nicht erreicht wurde. Diese spontane Reparatur des Schadens, der durch die Strahlung hervorgerufen wurde, bleibt, auch wenn sie eine vorteilhafte Eigenschaft in dem Sinne darstellt, dass sie die schädlichen Auswirkungen der UV-Strahlung korrigiert, nichtsdestotrotz eine der Ursachen des Phänotyps der lichtinduzierten Alterung. Die Fibroblasten müssen nämlich ihren Ruhezustand verlassen, um die Fähigkeit zu erlangen, das Dermisgewebe neu zu besiedeln. Dies schließt mit ein, dass sie sich vermehren, dass ihr Metabolismus in Gang gesetzt wird und dass sie demnach damit beginnen, die Bestandteile der extrazellulären Matrix zu synthetisieren, deren übermäßige Anhäufung schädlich für die Haut sein kann.
Eine Haut, die den wiederholten aggressiven Einflüssen des Sonnenlichts und vor allem ihres UV-A-Bestandteils ausgesetzt ist, die demnach eine Schädigung ihrer Dermis erleidet, ist eine Haut, die vorzeitig zu altern scheint. Die Wiederholung dieser Phänomene führt dazu, dass die Haut die Merkmale einer lichtgealterten Haut zeigt.
Die Ermittlung dieser spezifischen Marker für die Wirkung von UV-A-Strahlung auf die Haut, insbesondere auf die Dermis, hat es der Anmelderin ermöglicht, ein Untersuchungsmodell zu entwickeln, das die Bewertung von Produkten ermöglicht, die imstande sind, die Schäden zu modulieren und/oder zu korrigieren, die in der Haut und insbesondere in der Dermis durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bewertung der Schäden, die in der Haut durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hautäquivalent, das in vitro erhalten wird, das ein Dermisäquivalent umfasst, dessen Dicke im Bereich von 0,2 bis 1,5 mm liegt, mindestens einer Ultraviolettstrahlung vom Typ A über einen ausreichenden Zeitraum ausgesetzt wird, dass die Änderung eines Markers gemessen wird, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Dermis durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, und dass die Ergebnisse dieser Messung, bezogen auf einen Vergleich, bewertet werden, wobei der Marker unter der Konzentration der Kollagenase vom Typ I, die von den Fibroblasten erzeugt wird, und dem Ausmaß der Neubesiedlung der Dermis mit darunter liegenden Fibroblasten ausgewählt wird.
Erfindungsgemäß ist jedes Hautäquivalent verwendbar, das ein Äquivalent für lebende Dermis darstellt, dessen Dicke im Bereich von 0,2 bis 1,5 mm liegt. Unter Äquivalent für lebende Dermis wird jedes Dermisäquivalent verstanden, das lebende Fibroblasten enthält. Hierfür werden beispielsweise die Hautäquivalente angegeben, die in den Patenten oder den Patentanmeldungen EP 0 285 471 , EP 0 285 474 , EP 0 418 035 , WO-A-90/02796, WO-A-91/16010, EP 0 197 090 , EP 020 753 , CA 2 119 064 beschrieben werden.
Die Erfindung weist zahlreiche Vorteile auf, die mit dem dreidimensionalen Aussehen eines Hautäquivalents, dem Vorhandensein von zwei Geweben (Epidermisäquivalent und Dermisäquivalent), das die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den beiden Geweben und der Rolle jedes Zelltyps bei der Antwort auf die Strahlung ermöglicht, der Beschaffenheit und der Herkunft der verwendeten Fibroblasten, der Zusammensetzung der Ausgangsmatrix, der Möglichkeit, die Dicke des Dermisäquivalents zu variieren, der variablen Zelldichte des Dermisäquivalents, der möglichen Modifizierung des Kulturmediums, das für den Erhalt des Hautäquivalents verwendet wird, der Möglichkeit, die Beschaffenheit, die Qualität, die Menge der verwendeten Strahlung zu variieren, zusammenhängen.
Das erfindungsgemäß verwendete Dermisäquivalent kann beispielsweise aus gemischten Kollagen/Fibroblasten-Gittern, aus subkutanen Substituten auf der Basis von Kollagen, die Fibroblasten enthalten, oder aus jedem sonstigen Träger bestehen, der mit der Lebensfähigkeit von Zellen kompatibel ist, in den Fibroblasten eingeschlossen werden könnten.
Das Dermisäquivalent besteht vorzugsweise aus gemischten Kollagen/Fibroblasten-Gittern.
Die verwendeten Fibroblasten können von jeder Spezies (Mensch, Maus, etc.) und aus jedem Gewebe (Haut, Lunge, etc.) stammen.
Die verwendeten Fibroblasten können von gesunden oder kranken Geweben stammen.
Es werden vorzugsweise die Fibroblasten aus normaler menschlicher Haut verwendet.
Es kann jedoch in Betracht gezogen werden, dass der Träger außerdem andere Zelltypen und/oder andere Proteintypen enthält. Es werden beispielsweise die Glucosaminglykane und die Elastinfasern angegeben.
Die verwendete Zelldichte entspricht im Allgemeinen der Zelldichte, die im Stand der Technik bezüglich der in vitro erhaltenen Hautäquivalente beschrieben wird. Es ist jedoch möglich, diese Dichte in jedem Verhältnis zu variieren, für das geschätzt wird, dass es für die den Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens bildende Bewertung nützlich ist.
Die Dicke des erfindungsgemäß verwendeten Dermisäquivalents liegt im Bereich von 0,20 bis 1,5 mm.
Es kann sich als interessant erweisen, diese Dicke in jedem Verhältnis zu variieren, für das geschätzt wird, dass es für die den Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens bildende Bewertung nützlich ist. Der Fachmann ist imstande, die Menge des Kollagen/Zellen-Gemischs anzupassen, die er für den Erhalt des Dermisäquivalents mit der gewünschten Dicke verwendet.
Erfindungsgemäß wird das behandelte Hautäquivalent einer Ultraviolettstrahlung vom Typ A über einen ausreichenden Zeitraum ausgesetzt. Unter einer Ultraviolettstrahlung vom Typ A wird jede Strahlung verstanden, die mindestens die Eigenschaften der Ultraviolettstrahlung vom Typ A aufweist, d.h. die mindestens eine Wellenlänge hat, die im Bereich von 320 bis 400 nm liegt.
Bei dieser Strahlung kann es sich um das Sonnenlicht oder jedes künstlich reproduzierte Äquivalent handeln.
Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine künstlich reproduzierte Strahlung verwendet, die mindestens eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich von 320 bis 400 nm liegt, und vorteilhaft eine Strahlung, die Wellenlängen aufweist, die ausschließlich im Bereich von 320 bis 400 nm liegen. Die Geräte, die diese Art von Strahlung reproduzieren, sind wohlbekannt. Man kann beispielhaft den Sonnenlichtsimulator IDEM 3000 der Marke ARQUANTIEL oder auch den Sonnenlichtsimulator der Marke ORIEL angeben. Unabhängig davon, welcher Apparat ausgewählt wird, muss dieser mit Filtern SCHOTT WG 335 3 mm ausgerüstet sein, die die Wellenlängen unter 320 nm zurückhalten. Man kann ferner Geräte vom Typ der Bräunungslampen verwendeten, wie z.B. die UVASUN 3000, die ein Spektrum mit Wellenlängen oberhalb von 340 nm liefern.
Die Erfindung weist daher den Vorteil auf, die Bewertung der genauen Beschaffenheit der Strahlung zu ermöglichen, die von einem Material emittiert wird, das die Sonnenstrahlung reproduziert, wie z.B. von Bräunungslampen. Es ist bekannt, dass es bei einem derartigen Material wichtig ist, dass bestimmte Wellenlängen nicht emittiert werden, um die Haut vor den schädlichen Auswirkungen zu schützen, die diese Wellenlängen verursachen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann es ermöglichen, die emittierte Strahlung durch die Bewertung der durch ein derartiges Material verursachten Schäden vollkommen zu charakterisieren.
Ganz allgemein wird der Zeitraum, über den das behandelte in vitro erhaltene Hautäquivalent der Strahlung vom Typ UV-A ausgesetzt wird, gleichzeitig durch die Parameter der Strahlung, die man verwenden möchte, wie durch die Auswirkung, die man erhalten möchte, bedingt. Dieser Zeitraum ist mindestens der Zeitraum, der erforderlich ist, um eine Modifizierung des Ausmaßes der Expression des Markers beobachten zu können, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Dermis durch die Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden.
Dieser Zeitraum der Einwirkung der Strahlung kann im Bereich von 1 min bis einigen Stunden liegen. Der Zeitraum der Bestrahlung liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 120 min.
Erfindungsgemäß wird die Änderung eines Markers gemessen, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Haut, genauer in der Dermis, durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, und die Ergebnisse dieser Messung werden bezogen auf einen Vergleich ausgewertet.
Unter Marker, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Haut, genauer in der Dermis, durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, wird erfindungsgemäß jedes Element verstanden, dessen Vorhandensein, Fehlen, Modifizierung der Expression oder Modifizierung der Verteilung als Antwort auf die Einwirkung der Strahlung vom Typ A gemessen werden kann.
Erfindungsgemäß ist der Marker, der spezifisch für die Schäden ist, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, vor allem in der Dermis lokalisiert.
Wie man zuvor gesehen hat, konnte die Anmelderin zeigen, dass eine Bestrahlung mit UV-A in der Dermis Schäden hervorruft, die spezifisch für Wellenlängen im UV-A-Bereich sind. So konnte sie zeigen, dass UV-A-Strahlung die Erzeugung von Kollagenase vom Typ I durch die Fibroblasten auslöst, was sich in der Zunahme der Konzentration dieser Kollagenase in dem Medium äußert. Sie hat ferner gezeigt, dass die Zahl dieser Fibroblasten infolge der Bestrahlung in den 48 Stunden nach der Bestrahlung dramatisch abnimmt, gegebenenfalls bis zu einem vollständigen Verschwinden der Fibroblasten, zumindest in einer Dicke der Dermis, die von den Bestrahlungsparametern abhängt. Sie hat schließlich gezeigt, dass der Teil der Der mis, aus dem die Fibroblasten verschwinden, durch darunter liegende Fibroblasten neu besiedelt wird, die von der Strahlung nicht erreicht werden.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Marker, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Dermis durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, um die Menge an Kollagenase vom Typ I, die durch die Fibroblasten erzeugt wird, und/oder das Ausmaß der Neubesiedlung der Dermis mit darunter liegenden Fibroblasten.
Unter Ausmaß der Neubesiedlung wird die Zahl der Fibroblasten verstanden, die den Teil der Dermis neubesiedelt hat, aus dem die Fibroblasten nach der Bestrahlung verschwunden sind, und zwar diejenigen nach Ablauf eines gewählten Zeitraums. Dieser Zeitraum kann im Bereich von 10 bis 20 Tagen, vorzugsweise 12 bis 15 Tagen, liegen.
Die Schäden, die in der Dermis durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, werden somit durch die Änderung des Markers wiedergegeben, der spezifisch für die hervorgerufenen Schäden ist, dessen quantitative Bestimmung ausgewählt wird.
Unter Änderung wird jede Modifizierung der Menge, der Konzentration, der Verteilung des Markers verstanden, der quantitativ bestimmt wird.
Hierfür umfasst das Verfahren, das wie in den Ansprüchen definiert ist, einen Schritt der quantitativen Bestimmung des Markers, der für die hervorgerufenen Schäden spezifisch ist.
Selbstverständlich kann unabhängig von der Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jedes dem Fachmann bekannte Verfahren zur quantitativen Bestimmung verwendet werden Es können beispielhaft und ohne Einschränkung die Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Proteinen oder Nucleinsäuren durch Kolorimetrie, Elektrophorese, reverse Transkription und/oder Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion, Massenspektroskopie, Chromatographie (Gaschromatographie oder Schichtchromatographie), die immunologischen Verfahren oder auch die Lichtmikroskopie oder die Elektronenmikroskopie und alle histologischen, histochemischen und/oder immunhistochemischen Techniken angegeben werden.
Im Fall der Messung der Erzeugung von Kollagenase vom Typ I durch die Fibroblasten können beispielsweise die herkömmlichen biochemischen Techniken, die den Nachweis der Kollagenase vom Typ I ermöglichen, oder die molekularbiologischen Techniken oder auch die immunhistochemischen Techniken, die Antikörper verwenden, die gegen die Kollagenase vom Typ I gerichtet sind, verwendet werden. Diesbezüglich können die ELISA-Kits angegeben werden, die von AMERSHAM im Handel erhältlich sind.
Im Fall der Messung der Zahl der Fibroblasten sind die lichtmikroskopischen und/oder elektronenmikroskopischen Techniken, wie die Techniken, die in Ganter und Jolles, "Histochimie normale et pathologique", Gauthier-Villars Hrsg., Paris, 1969, beschrieben werden, besonders gut geeignet. Diese Techniken werden gemäß den herkömmlichsten Protokollen angewendet, die in diesen Büchern beschrieben werden. Es können beispielsweise die histologische Hämalaun-Phloxin-Färbung und die Techniken der Immunmarkierung mit Hilfe von Antikörpern angegeben werden, die den Nachweis der Fibroblasten ermöglichen.
Das Ergebnis der quantitativen Bestimmung, das die Änderung des Markers wiedergibt, der spezifisch für die hervorgerufenen Schäden ist, kann selbst nicht unmittelbar verwertet werden. Es gewinnt nur in dem Maß an Bedeutung, wie es mit einem Vergleich verglichen wird. Dieser Vergleich besteht aus dem Ergebnis der gleichen quantitativen Bestimmung, die unter den selben Bedingungen, jedoch in Abwesenheit von jeglicher Bestrahlung oder in Gegenwart einer Bestrahlung mit einer Strahlung, die andere Eigenschaften hat, durchgeführt wurde.
Der Fachmann bestimmt ohne Schwierigkeiten auf Grund seines Fachwissens die Art des Vergleichs, der für die Durchführung des Verfahrens erforderlich ist.
Der Vergleich entspricht vorzugsweise einem Hautäquivalent, das keiner Bestrahlung unterzogen wurde.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann so die Bewertung der Schäden ermöglichen, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A in der Haut hervorgerufen werden. Dies ist unter dem Gesichtspunkt der Kenntnisse über die Folgen einer Bestrahlung der Haut mit diesem Strahlungstyp und der Mechanismen, durch die die Haut reagiert und die Auswirkungen einer derartigen Strahlung moduliert oder korrigiert, von großem Interesse.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Hautäquivalent eingesetzt, das einen perfekt handzuhabenden Gegenstand darstellt. Aus dem Stands der Technik ist bekannt, dass das Hautäquivalent in einem Kulturmedium an der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wird. Es kann demnach in Betracht gezogen werden, eine beliebige Substanz zu dem Kulturmedium zu geben, deren Einfluss auf die Auswirkungen von Ultraviolettstrahlung vom Typ A untersucht werden soll. Hierdurch wird demnach eine systemische Anwendung der Substanz nachgeahmt.
Soweit das Hautäquivalent eine aus dem Medium herausragende Epidermisoberfläche aufweist, kann außerdem in Betracht gezogen werden, eine beliebige Substanz auf diese Oberfläche aufzutragen, deren Einfluss auf die Auswirkungen von Ultraviolettstrahlung vom Typ A bewertet werden soll. Hierdurch wird demnach eine topische Anwendung der Substanz nachgeahmt.
Im übrigen war zu sehen, dass die Anmelderin zeigen konnte, dass die Zahl der Fibroblasten in der Dermis in den 48 Stunden nach der Bestrahlung dramatisch abnimmt, gegebenenfalls bis zu einem vollständigen Verschwinden der Fibroblasten, zumindest über eine Dicke der Dermis, die von den Bestrahlungsparametern abhängt. Ferner war zu sehen, dass die Anmelderin nachgewiesen hat, dass der Teil der Dermis, aus dem die Fibroblasten verschwunden sind, mit darunter liegenden Fibroblasten, die von der Strahlung nicht erreicht wurden, neu besiedelt wird. Auch wenn diese spontane Neubesiedlung die Haut schädigen kann, folgt daraus nichts weniger als dass es unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein kann, diese Reparatur zu fördern oder sogar zu stimulieren, indem Produkte und/oder Zusammensetzungen, die für diesen Typ von Eigenschaft ausgewählt sind, angewendet werden. Es ist demnach erforderlich, in dieser Hinsicht von einem einfachen und schnellen Untersuchungsmodell zur Bewertung derartiger Produkte und/oder Zusammensetzungen zu profitieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann demnach außerdem die Bewertung von Substanzen ermöglichen, die gegebenenfalls imstande sind, die Schäden zu modulieren, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A in der Haut und/oder der Dermis hervorgerufen werden. Demnach umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen ergänzenden Schritt der Behandlung des in vitro erhaltenen Hautäquivalents mit einem derartigen zu prüfenden Produkt.
Dieser Schritt der Behandlung mit einem Produkt kann vor oder nach dem Schritt der Bestrahlung des Hautäquivalents durchgeführt werden.
Der Vergleich kann in diesem Fall aus einem Hautäquivalent, das zuvor mit einer anderen Menge der zu prüfenden Substanz behandelt wurde, oder aus einem Hautäquivalent bestehen, das nicht mit der zu prüfenden Substanz behandelt wurde.
Der Vergleich besteht vorzugsweise aus einem Hautäquivalent, das nicht mit der zu prüfenden Substanz behandelt wurde.
Ganz allgemein wird der Zeitraum, über den das in vitro erhaltene Hautäquivalent mit einem zu prüfenden Produkt behandelt wird, durch den Zeitraum bedingt, den das Äquivalent benötigt, um auf die Substanz zu reagieren, d.h. durch den Zeitraum, der benötigt wird, bis es seine Wirkungen entfaltet.
Dieser Behandlungszeitraum kann im Bereich von einigen Sekunden bis mehreren Tagen liegen. Nur als Hinweis liegt dieser Behandlungszeitraum im Allgemeinen im Bereich von 5 min bis 15 Tagen.
Unter Behandlung des in vitro erhaltenen Hautäquivalents wird ein Inkontaktbringen des in vitro erhaltenen Hautäquivalents mit der Substanz verstanden, die gegebenenfalls imstande ist, die Schäden zu modulieren, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden.
Das Modulieren des Schadens, der durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen wird, kann einer Verringerung oder sogar einer Unterdrückung dieses Schadens entsprechen. Sie kann auch einer Hemmung dieses Schadens entsprechen. Anders ausgedrückt können diese Substanzen vorbeugend oder heilend verwendet werden.
Die zu prüfende Substanz kann in jeder vorstellbaren Form vorliegen, wie beispielsweise in Form einer gegebenenfalls wirksamen reinen Verbindung oder einer gegebenenfalls wirksamen Zusammensetzung oder einer Zusammensetzung, die eine gegebenenfalls wirksame Verbindung enthält.
Hierzu können beispielsweise die Sonnenschutzfilter und/oder die Zusammensetzungen, die derartige Filter enthalten, angegeben werden. In diesem Fall ist es bevorzugt, das Hautäquivalent durch einfaches Auftragen auf die Oberfläche des Hautäquivalents zu behandeln.
Mit den 1 und 2 kann die Erfindung besser veranschaulicht werden, ohne jedoch ihren Gegenstand einzuschränken.
In 1 zeigen die Fotos die Untersuchung von Schnitten von Hautäquivalenten durch herkömmliche Histologie (Fotos 1 und 3) oder durch Immunfluoreszenz (Fotos 2 und 4). Die Fotos 1 und 2 betreffen ein nicht bestrahltes Hautäquivalent, die Fotos 3 und 4 betreffen das Hautäquivalent, das einer Bestrahlung unterzogen wurde. Der Pfeil macht die Fibroblasten in dem Dermisäquivalent sichtbar.
In 2 zeigen die Fotos die Untersuchung von Schnitten von Hautäquivalenten durch herkömmliche Histologie (Fotos 3 und 4) oder durch Immunfluoreszenz (Fotos 1 und 2).
Die Fotos 1 und 3 betreffen ein Hautäquivalent, das vorab ausschließlich mit einem Träger behandelt wurde und dann bestrahlt wurde. Die Fotos 2 und 4 betreffen ein Hautäquivalent, das vorab mit dem gleichen Träger behandelt wurde, der ein Filter in einer Konzentration von 5 % enthält, und dann bestrahlt wurde.
Der Pfeil macht die Fibroblasten in dem Dermisäquivalent sichtbar.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bewertung der Beschaffenheit der Strahlung, die von einem Material emittiert wird, das das Sonnenlicht reproduziert, wie von Bräunungslampen, und/oder der Schäden, die durch ein derartiges Material verursacht werden.
Im Folgenden werden zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung Beispiele für die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.
Beispiel 1:
Auswirkung von UV-Strahlung vom Typ A auf die Erzeugung von Kollagenase I:
Protokoll:
Hautäquivalent: Die Proben von Hautäquivalenten werden wie von Asselineau et col. in Exp. Cell. Res., 1985, 159, 536–539; Models in Dermatology, 1987, Bd. 3, S. 1–7 beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden die Dermisäquivalente wie beschrieben mit bovinem Kollagen vom Typ I, Fibroblasten, die aus normaler erwachsener menschlicher Haut stammen, in einer Menge von 106 Zellen für ein Gel von 7 ml, das in eine Schale mit einem Durchmesser von 60 mm gegossen wird, hergestellt. So hergestellt weist das Gel nach 3-tägiger Kontraktion eine Dicke von 0,240 mm auf. Die Keratinozyten (50000), die auf dieses Dermisäquivalent geimpft werden, stammen von einer plastischen Brustchirurgie einer Frau weißer Rasse mit einem Alter von 35 Jahren. Die Kultivierung im eingetauchten Zustand dauert 7 Tage, und die Kultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche dauert ebenfalls 7 Tage. Das verwendete Kulturmedium enthält kein Phenolrot. Die rekonstruierten Häute wurden in diesem Stadium verwendet.
Bestrahlung: Die verwendete Quelle ist ein Sonnenlichtsimulator der Marke Arquantiel, Modell IDEM 3000, ausgerüstet mit einer 1000-Watt-Xenonlampe. Ein Schott-Filter UG 11/1 mm und ein Schott-Filter WG 335 von 3 mm entfernen die Wellenlängen unter 320 nm. Das so erhaltene Spektrum beginnt bei 320 nm und überdeckt den gesamten Bereich der Strahlung vom Typ UV-A.
Die mit Hilfe eines OSRAM-UV-Meters, das mit einem UV-A-Sensor ausgerüstet ist, gemessene Strahlungsintensität beträgt 20 mW/cm².
Die abgegebene Dosis liegt im Bereich von 20 bis 30 J/cm².
Die rekonstruierten Häute werden in Abwesenheit des Kulturmediums bestrahlt, anschließend werden die rekonstruierten Häute nach der für die Bestrahlung erforderlichen Zeit wieder in die Kultur gegeben, im aufgetauchten Zustand während 48 h.
Der Vergleich besteht aus einem identischen Epidermisäquivalent, das keiner Bestrahlung ausgesetzt wurde (abgegebene Dosis = 0 J/cm²).
Quantitative Bestimmung der interstitiellen Kollagenase (Typ I oder MMP1) 48 h nach der Bestrahlung wird das Kulturmedium entnommen, und die interstitielle Kollagenase wird mit Hilfe eines Kits "Biotrack MMP-1 human ELISA system" der Marke Amersham (Bezugsnummer N°RPN 2610) gemäß dem vom Lieferanten empfohlenen Protokoll quantitativ bestimmt.
Das Ablesen der Ergebnisse erfolgt mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts von LabSystems, das mit einem 450-nm-Filter ausgestattet ist.
Die Menge der Kollagenase I wird berechnet, bezogen auf eine Eichskala, die mit einem Standard erzeugt wird, der mit dem Kit geliefert wird, und in ng/ml ausgedrückt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung:
Die folgende Tabelle zeigt, dass durch eine UV-A-Bestrahlung von 20 J/cm² oder 30 J/cm² die Menge an interstitieller Kollagenase, die in dem Medium 48 h nach der Bestrahlung quantitativ bestimmt wird, verglichen mit einer nicht bestrahlten Vergleichsprobe, zunimmt.
Beispiel 2:
Auswirkung von UV-Strahlung vom Typ A auf die Zahl der Fibroblasten der Dermis:
Ein Hautäquivalent, das identisch mit dem Hautäquivalent aus Beispiel 1 ist, wird einer Bestrahlung mit der selben Strahlungsquelle wie in Beispiel 1 in einer Dosis von 25 J/cm² unterzogen.
48 h nach der Bestrahlung wird das Hautäquivalent in zwei Stücke zerschnitten.
Eine Hälfte wird gemäß den herkömmlichen Histologietechniken (Ganter und Jolles) präpariert. Die erhaltenen Schnitte werden mit Hämalaun, Phloxin, Safran (HPS) gefärbt und mit Hilfe eines aufrechten Mikroskops in weißem Licht betrachtet.
Die andere Hälfte wird in tissu-Tek (Miles USA) eingeschlossen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Es werden Gefrierschnitte erzeugt, wonach Immunmarkierungen (gemäß dem Protokoll Bernerd et col, J. Invest. Dermatol, 1992, 98, 902–910) mit Hilfe eines anti-Vimentin-Antikörpers (Monosan, mouse monoclonal antibody anti human vimetin) durchgeführt werden. Vimentin ist ein Intermediärfilament des Zytoskeletts der mesenchymalen Zellen, zu denen die Fibroblasten gehören (Traub P; 1985, in: intermediate filaments; A review Springer-Verlag, Berlin). Der Nachweis erfolgt mit Hilfe eines zweiten, gegen IG gerichteten Antikörpers der Maus, der mit Fluoreszein gekoppelt ist. Die Beobachtung erfolgt mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops.
Ergebnisse und Schlussfolgerund: Die herkömmliche Histologie ( 1, Fotos 1 und 3) oder die Immunfluoreszenz (1, Fotos 2 und 4) zeigt, dass 48 h nach der UV-A-Bestrahlung (25 J/cm²) die Fibroblasten, die in dem nicht bestrahlten Dermisäquivalent vorhanden sind (Pfeil, 1, Fotos 2 und 4) auf Grund der Bestrahlung aus dem Oberflächenbereich des Dermisäquivalents verschwunden sind (1, Fotos 1 und 3).
Beispiel 3:
Bewertung der Wirksamkeit der Anwendung von Sonnenschutzfiltern auf der Haut:
Rekonstruierte Häute: wie in Beispiel 1
Ein Hautäquivalent, das identisch mit dem Hautäquivalent von Beispiel 1 ist und das zuvor behandelt wurde, wird einer Bestrahlung aus der gleichen Quelle wie in Beispiel 1 in einer Dosis von 0 J/cm² bzw. 25 J/cm² unterzogen.
Es wird ein Träger (Öl/Wasser-Emulsion) hergestellt, der ein Gemisch aus Cetylstearylalkohol (80 %)/ethoxyliertem Cetylstearylalkohol (33 EO) und Glycerinmonodistearat (7 %), Mineralöl (15 %), Glycerin (20 %) und Wasser (qsp) enthält. Aus diesem Träger wird eine Zusammensetzung hergestellt, die einen Sonnenschutzfilter, Mexoryl SX (Patent FR 82-10425), in einer Konzentration von 5 % enthält. Der Träger oder die Zusammensetzung, die das Filter in dem Träger enthält, wird in einer Menge von 2 mg/cm² auf die Oberfläche des Hautäquivalents aufgetragen. Die Proben werden anschließend wie in Beispiel 1 bestrahlt, anschließend wird das Produkt dreimal mit sterilem Phosphatpuffer (Seromed L 1825) gespült, und die Hautäquivalente werden wieder kultiviert, an der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche über 48 h.
Sichtbarmachen des Verschwindens von Fibroblasten aus dem Dermisäquivalent: Wie in Beispiel 2 beschrieben.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: 48 h nach der Bestrahlung (UV-A 25 J/cm²) sind die Fibroblasten, die in dem Dermisäquivalent enthalten sind, in dem Fall des Hautäquivalents, das zuvor mit dem Träger behandelt wurde, aus dem Oberflächenbereich der Dermis verschwunden, was den Auswirkungen entspricht, die durch UV-A- Strahlung hervorgerufen werden, die in Beispiel 2 (2, Fotos 1 und 3) veranschaulicht werden. Im Vergleich hierzu verschwinden die Fibroblasten nicht aus dem Hautäquivalent, das zuvor mit der Zusammensetzung behandelt wurde, die das Filter in einer Konzentration von 5 % enthält (2, Fotos 2 und 4) (Pfeil), was einen Schutz belegt, für den das Filter in Bezug auf die Schäden sorgt, die durch UV-A-Strahlung hervorgerufen werden.

Claims

Verfahren zur Bewertung der Schäden, die in der Haut durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro erhaltenes Hautäquivalent, das ein Dermisäquivalent umfasst, dessen Dicke im Bereich von 0,2 bis 1,5 mm liegt, mindestens einer Ultraviolettstrahlung vom Typ A über einen ausreichenden Zeitraum ausgesetzt wird, dass die Änderung eines Markers gemessen wird, der spezifisch für die Schäden ist, die in der Haut durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A in der Dermis hervorgerufen werden, wobei der Marker unter der Konzentration der Kollagenase vom Typ I, die von den Fibroblasten erzeugt wird, und dem Ausmaß der Neubesiedlung der Dermis mit darunter liegenden Fibroblasten ausgewählt wird, und dass die Ergebnisse dieser Messung, bezogen auf einen Vergleich, bewertet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Hautäquivalent aus einem lebenden Epidermisäquivalent und einem lebenden Dermisäquivalent besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraviolettstrahlung vom Typ A mindestens eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich von 320 bis 400 nm liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit der Ultraviolettstrah lung vom Typ A über einen Zeitraum durchgeführt wird, der im Bereich von einer Minute bis mehreren Stunden liegt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit der Ultraviolettstrahlung vom Typ A über einen Zeitraum durchgeführt wird, der im Bereich von 5 bis 120 min liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker, der für die Schäden spezifisch ist, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, eine Zelle oder eine Zellpopulation, eine Nucleinsäure, ein Protein oder eine Gruppe von zusammenhängenden oder nicht zusammenhängenden Proteinen, ein zelluläres organisches Ion, ein Lipid oder ein Polysaccharid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich aus dem Ergebnis der gleichen quantitativen Bestimmung besteht, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, jedoch in Abwesenheit jeglicher Bestrahlung oder in Gegenwart einer Bestrahlung mit einer Strahlung, die andere Eigenschaften hat.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich aus einem Hautäquivalent besteht, das keiner Bestrahlung unterzogen wurde.
Verfahren zur Bewertung einer Substanz, die eventuell die Schäden modulieren kann, die in der Haut durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 8 ein Hautäquivalent vor oder nach der Bestrahlung des Hautäquivalents mit Ultravio lettstrahlung vom Typ A über einen ausreichenden Zeitraum mit der Substanz behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich aus einem Hautäquivalent, das vorab mit einer anderen Menge der zu prüfenden Substanz behandelt wurde, oder aus einem Hautäquivalent, das nicht mit der zu prüfenden Substanz behandelt wurde, besteht.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich aus einem Hautäquivalent besteht, das nicht mit der zu prüfenden Substanz behandelt wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Hautäquivalent über einen Zeitraum behandelt wird, der im Bereich von einigen Sekunden bis mehreren Tagen liegt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Hautäquivalent über einen Zeitraum behandelt wird, der im Bereich von 5 min bis 15 Tagen liegt.
Verfahren zum Charakterisieren der Strahlung vom Typ UV-A, die von einem Material emittiert wird, dass die Sonnenstrahlung reproduziert, und/oder der Schäden, die durch eine derartige Strahlung verursacht werden, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro erhaltenes Hautäquivalent der Strahlung ausgesetzt wird und dass durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bewertet wird, ob die in diesem Hautäquivalent hervorgerufenen Schäden die Schäden sind, die durch Ultraviolettstrahlung vom Typ A hervorgerufen werden.