DE102011121982B3

DE102011121982B3 - Mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe (ADSC) zur Rekonstruktion von Haut und Weichteilgewebe

Info

Publication number: DE102011121982B3
Application number: DE201110121982
Authority: DE
Inventors: Eva Köllensperger; Günter Germann
Original assignee: Dietmar Hopp Stiftung GmbH; Ethianum Betr Sgmbh & Co KG; Ethianum Betriebsgesellschaft Mbh & Co KG
Current assignee: ETHIANUM BETRIEBSGESELLSCHAFT MBH & CO. KG, DE; HOPP STIFTUNG GMBH, DE
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2031-12-23

Abstract

Es werden humane autologe oder allogene Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) bereitgestellt zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts zwecks Rekonstruktion und/oder Korrektur der Form und/oder Struktur von Haut und Weichteilgewebe, insbesondere Hautstraffung und Volumenvergrößerung der Dermis und des subkutanen Gewebes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Rekonstruktion (d. h. insbesondere Regeneration und/oder Reparatur) und/oder die Korrektur der Form und/oder Struktur von Haut und Weichteilgewebe, insbesondere Hautstraffung und Volumenvergrößerung der Dermis und des subkutanen Gewebes mit Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC).
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) zur Herstellung eines Mittels (einer kosmetischen Zusammensetzung/kosmetischen Zubereitung) für die Verwendung in einem kosmetischen Verfahren zur kosmetischen und gegebenenfalls rekonstruktiven Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung von ADSC zur Herstellung eines Mittels für die Verwendung in einem chirurgischen Verfahren zur kosmetischen und gegebenenfalls rekonstruktiven Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts
Gegenstand der Erfindung sind ferner humane autologe oder allogene ADSC, die für solche Verwendungen geeignet sind, Kits für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von Hautdefekten eines Subjekts, Zubereitungen für die kosmetische oder therapeutische Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts, ein Verfahren zur Herstellung, Zubereitung für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts und Verfahren zur kosmetischen Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts
Im Stand der Technik werden bzw. wurden bisher Hautfalten in erster Linie durch die Injektion von Füllmaterialien (Filler), wie z. B. Hyaluronsäure oder Collagen, unterspritzt und damit aufgepolstert, zum einen durch ihr Eigenvolumen, zum anderen, v. a. bei der Hyaluronsäure, aber auch durch Bindung von Wasser im Gewebe. Die resorbierbaren Filler müssen regelmäßig nachgespritzt werden, da sie im Körper abgebaut werden. Sie können trotz ihrer insgesamt besseren Verträglichkeit als die nicht resorbierbaren Filler, Nebenwirkungen hervorrufen, z. B. allergische Reaktionen auf der Basis von durch Bakteriengifte gebildeten Verunreinigungen im Herstellungsprozess. Auch wenn mit den nicht resorbierbaren Fillern an sich ein dauerhaftes Resultat erzielt werden kann, verursachen sie sehr häufig Komplikationen, insbesondere Fremdkörperabwehrreaktionen des Körpers wie Entzündungen, Verkapselungen, tastbare Verhärtungen und sichtbare Knoten- und Strangbildungen. Sie gelten heute deshalb als obsolet.
Auch schälende Maßnahmen mit chemischen Substanzen, sogenannte Peelings, oder die Abtragung der oberflächlichen Hautschichten mittels LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) werden angewendet. Hierbei werden die obersten Hautschichten, z. T. bis in die tiefe Dermis, durch Chemikalien oder Hitze abgetragen und dadurch ein Heilprozess aktiviert, der zur Bildung von neuer Haut und Bindegewebefasern führt. Diese neue Haut wirkt faltenfreier, straffer und glatter. Die genannten Maßnahmen sind jedoch sehr aggressiv und teilweise mit schweren Nebenwirkungen verbunden, z. B. Verbrennungen, Narbenbildung, dauerhafte Fehlpigmentierungen, generalisierte Herpesinfektion und starke Schmerzen. Außerdem müssen sich die Patienten mehrere Wochen bis Monate vor UV-Strahlung einschließlich Sonnenstrahlung schützen, da es sonst gehäuft zu Fehlpigmentierungen kommt.
Filler und abtragende Maßnahmen werden auch zur Verschönerung von Narben eingesetzt. Diese können durch Filler angehoben werden, falls sie eingezogen sind, oder durch Peelings oder LASER im Niveau an die umgebende Haut angeglichen werden, falls sie erhaben sind. Eine Verbesserung der Narbenqualität selbst entsteht dadurch jedoch nicht.
Die Nachteile der vorgenannten Maßnahmen führten schon in den neunziger Jahren zu Versuchen, bei denen lebendes Fettgewebe aus einem Subjekt gewonnen und anschließend an den gewünschten Stellen der Haut transplantiert oder injiziert wurde, um so die darunter liegende Dermis und das angrenzende Weichteilgewebe zu vermehren (im Volumen zu vergrößern). In der EP 08456 963 B1 wird auf Vorveröffentlichungen hingewiesen, wonach zwar im Fall von großen Defekten gute Rekonstruktions-Resultate erhalten werden konnten, wenn das zuvor chirurgisch gewonnene Fettgewebe reimplantiert wurde, im Fall von Defekten, die das Einbringen des Fettgewebes mittels Injektion voraussetzten, jedoch nur unbefriedigende Ergebnisse erhaltenen wurden. Häufig auftretende unerwünschte Folgen der Fettgewebe-Injizierung waren Beulenbildung und extreme über Wochen anhaltende Schwellung.
Die EP 08456 963 B1 schlägt vor, anstelle des Fettgewebes autologe dermale Fibroblasten zu verwenden, wobei die Fibroblasten vorzugsweise aus einer dem Subjekt zuvor entnommenen Biopsie-Probe isoliert werden. Für eine Applikation per Injektion werden die isolierten Fibroblasten zunächst in Kulturmedium expandiert und passagiert, und für die Applikation von solchen Proteinen weitgehend befreit, die aus dem Kulturmedium, insbesondere aus dessen Anteil an fetalem Rinderserum abgeleitet sind, und die nach der Injektion in das humane Subjekt allergische oder sonstige Reaktionen hervorrufen könnten.
In jüngere Zeit wurde von Claudio-da-Silva et al. ((2009) die Verwendung von autologen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe in Kombination mit Hyaluronsäure zur Glättung von tiefen Nasolabialfalten beschrieben. Die Stammzellen wurden aus infraumbilikalem Fettgewebe mittels Liposuktion gewonnen. Bei der Liposuktion wurde eine Adrenalin-haltige Tumeszenzlösung verwendet. Es ist bekannt, dass Adrenalin Effekte auf isolierte ADSC haben kann bzw. hat. Das Liposuktionsmaterial (50 ml) wurde vor der Weiterverarbeitung für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einen Dekanter gestellt und mit 10 ml antibiotischer Lösung versetzt. Damit gehen die Nachteile eines erhöhten Kontaminationsrisikos und einer mangelhaften Nährstoffversorgung der Zellen einher. Die gewonnenen Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM) mit einem Gehalt an fötalem Kälberserum (FCS) von 10% und einem Gehalt an Penicillin und Streptomycin von jeweils 100 U/ml bei 37°C und 5% CO₂ mehrere Tage kultiviert. Zwei Tage vor der beabsichtigten Injektion wurden die Zellen mit Kochsalzlösung gewaschen und danach in autologem, nicht näher definiertem Plasma aufbewahrt, um internalisiertes fatales Kälberprotein zu eliminieren. Damit geht wieder der eklatante Nachteil eines erhöhten Kontaminationsrisikos und einer mangelhaften Nährstoffversorgung der Zellen einher. Kurz vor der geplanten Injektion werden die Zellen mit EDTA-Trypsin-Lösung dissoziiert und in Salzlösung mit einem Gehalt an Hyaluronsäure resuspendiert. Eine Charakterisierung der erhaltenen Zellen oder ein Test zur Überprüfung, ob die erhaltenen Zellen tatsächlich mesenchymale Stammzellen sind, ist in dieser Publikation nicht erwähnt. Ebenso fehlen jegliche Angaben zu einer Vitalitätsüberprüfung der applizierten Zellen. Signifikante Mengenanteile toter Zellen in der applizierten Lösung können jedoch zu Entzündungs- und Abräumreaktionen im Gewebe führen und die gewünschte positive Wirkung der applizierten vitalen Zellen reduzieren oder gar aufheben.
Die Resultate der intradermalen Injektions-Behandlung wurden ein Jahr lang monatlich überprüft und protokolliert, ebenso die Resultate von parallel durchgeführten Kontroll-Behandlungen, bei denen die Injektionssuspension entweder aus dissoziierten Zellen in reiner Salzlösung ohne einen Gehalt an Hyaluronsäure bestand, oder reine Hyaluronsäure war. Die Autoren schreiben, dass erste Effekt zwei Monate nach der Behandlung beobachtet wurden, und dass die besten Ergebnisse, nämlich eine nachhaltige, auch nach 2 Jahren noch bestehende effektive Glättung oder zumindest Abschwächung der nasolabialen Hautfalten mit der Injektionsmischung aus Zellen in Kombination mit Hyaluronsäure erhalten wurde. Nach Injektion von Zellen ohne Hyaluronsäure wurde dagegen nur eine schwache Glättung der Hautfalten erhalten während tiefe Falten bestehen blieben, und der Effekt hielt nur 10 Monate an. Die Autoren beschreiben allerdings keine histologische Analyse der injizierten Areale und keine quantifizierte Auswertung der Effekte, sondern lediglich die Ergebnisse ihrer makroskopischen Beurteilung anhand von Fotos. Es fehlen Negativkontrollen und Nachweise einer statistischen Signifikanz.
Eine eindeutige Identifizierung von ADSC erfordert gemäß einem Vorschlag der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie den Nachweis des Vorhandenseins, d. h. der Expression der immunphänotypischen Oberflächenmoleküle CD73, CD90 und CD 105 und des Fehlens (Nichtvorhandenseins) der Oberflächenmoleküle CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79a oder CD19 und HLA-DR (ISCT Dominici et al. 2006). Außerdem sollte zusätzlich das Differenzierungspotential der Zellen in mindestens zwei Bindegewebszellrichtungen (Adipozyten, Osteoblasten oder Chondrozyten) nachgewiesen worden (nachweisbar) sein (Schäffler et al. 2007).
Eine solche Identifizierung der verwendeten Zellen ist bei Claudio-da-Silva et al. (2009) weder explizit noch implizit beschrieben.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die im Stand der Technik bekannten Mittel, Verfahren und Verwendungen derart weiter zu entwickeln, dass die erwähnten Nachteile behoben sind und eine Rekonstruktion (Reparatur bzw. Restauration) von. Haut- und/oder Weichteilgewebedefekten oder eine Veränderung bzw. Modulation von Haut- und/oder Weichteilgewebe, insbesondere Glättung oder Straffung von Hautfalten und Narbengewebe, jederzeit, praktisch frei von unerwünschten Nebenwirkungen und Risiken einer gesundheitlichen Beeinträchtigung, und mit vorhersagbarem lang anhaltendem Erfolg durchführbar ist.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Angabe der Verwendung von Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) zur Herstellung eines Mittels (einer kosmetischen Zusammensetzung/kosmetischen Zubereitung) für die Verwendung in einem kosmetischen Verfahren zur kosmetischen Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen primär isolierte (d. h. unmittelbar zuvor aus dem Fettgewebe isolierte und nicht-expandierte) oder expandierte oder expandierte und passagierte, humane, autologe oder allogene ADSC sind, die die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen (so dass sie mit monoklonalen Anti-CD73- und Anti-CD90-Antikörpern eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen) und frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind (das charakteristisch für hämatopoetische Zellen ist und bisher nie bei mesenchymalen Stammzellen beschrieben wurde) und (deshalb) mit monoklonalen Anti-CD45-Antikörpern keine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und die kryokonservierbar sind, dass Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen frei von fatalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nichthumanen Fremdproteinen sind und ausschließlich humane, native oder rekombinant hergestellte Proteine enthalten, dass das Mittel frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen (und damit potentiell humanimmunogenen, d. h. für den menschlichen Organismus immunogenen) Fremdproteinen ist, und dass das Mittel frei von Hyaluronsäure ist.
Demgegenüber ist noch von Spees et al. (2004) beschrieben worden, dass und wie FCS aus humanen Zellen (hMSCs) wieder (weitgehend) entfernt werden kann, weil davon ausgegangen wurde, dass die Zellen in FCS-haltigem Medium zumindest angezüchtet werden müssen.
Der Ausdruck ”Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: adipose tissue derived stem cells) kurz ADSC” steht im vorliegenden Kontext (i) für oligopotente oder multipotente Zellen, die aus dem Fettgewebe eines nicht-embryonalen, nämlich postnatalen, juvenilen oder adulten humanen Spenders stammen und die Fähigkeit besitzen, sich unbegrenzt teilen zu können (Selbstreplikation) und Tochterzellen produzieren zu können, die u. a. zu Zellen der Haut und des darunter liegenden Fett- und Bindegewebes, insbesondere zu Adipozyten, Endothelzellen, Keratinozyten oder Fibroblasten ausdifferenzieren, und (ii) ebenso für solche Tochterzellen (Progenitorzellen oder Vorläuferzellen).
Der Ausdruck ”Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut” umfasst im vorliegenden Kontext insbesondere die Verringerung von Falten und anderen Zeichen der Hautalterung und die Verbesserung von Narbentiefe und Narbenqualität. Zeichen der Hautalterung sind u. a. Verlust an Elastizität und Tonus, und die Bildung von Pigmentierungsstörungen, wie z. B. die sogenannten Altersflecken.
Der Ausdruck ”kosmetische, nicht-chirurgische Behandlung” bedeutet im vorliegenden Kontext, dass die betreffende Behandlung keine unumkehrbaren Schädigung oder Zerstörung von lebenden Zellen oder Gewebeteilen des lebenden Körpers mit sich bringt oder zur Folge hat, und dass sie keinen Eingriff umfasst, für den der Berufsstand der Ärzte speziell ausgebildet wird und für den Ärzte besondere Verantwortung übernehmen. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen 'kosmetische, nicht-chirurgische Behandlung' ist die Erhaltung des Lebens und der Gesundheit des Körpers nicht von Bedeutung. Selbst wenn die Behandlung in einer Ausführungsvariante einen Injektions-Schritt aufweist oder umfasst, so stellt dieser nur einen minimalen und keinen erheblichen physischen Eingriff am Körper dar. Seine Durchführung erfordert keine medizinischen Fachkenntnisse, und sofern er mit der erforderlichen Sorgfalt und Kompetenz ausgeführt wird, ist er mit keinem oder jedenfalls mit keinem wesentlichen Gesundheitsrisiko verbunden.
Der Ausdruck ”Oberflächen-Antigene CD [...] aufweisen” und ”positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen” bedeutet im vorliegenden Kontext, dass die überprüften Zellen im Vergleich zu Kontrollansätzen eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, z. B. im Durchflusszytometer im Vergleich zu den Kontrollansätzen eine höhere Signalintensität der Fluoreszenz aufweisen, welche mit dem Vorhandensein der entsprechenden Oberflächen-Antigenen auf den Zellen korreliert. Demgegenüber gilt ein CD-Oberflächenmolekül dann als negativ nachgewiesen und nicht vorhanden (fehlend), wenn die analysierten Zellen keine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, d. h. wenn z. B. im Durchflusszytometer ihre Signalkurve nahezu oder vollständig deckungsgleich mit der Signalkurve der Kontrollansätze ist.
Die Analyse der Oberflächencharakteristika der ADSC erfolgt vorzugsweise nachdem die Zellen mit dem erfindungsgemäßen Isolationsverfahren isoliert und dem aufgeführten Kulturverfahren kultiviert und wenigstens einmal passagiert wurden. Besonders bevorzugt erfolgt die Analyse, wenn sich die Zellen in Passage 3 oder 4 befinden. Ein sehr gut geeignetes Analyseverfahren ist die Durchflusszytometrie.
Der Ausdruck ”nicht-humane Fremdproteine” steht hier im Kontext für Proteine, die in dieser Form natürlicherweise nicht in oder von menschlichen Zellen oder humantransgenen tierischen Zellen oder rekombinant in Bakterien synthetisiert werden, und die im menschlichen Körper eine immunologische Reaktion hervorrufen können.
In einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verwendung sind die Stammzellen wenigstens einmal, vorzugsweise zweimal (2x) passagierte, humane, autologe oder allogene ADSC, und sie weisen zusätzlich eines oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 auf, so dass sie mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern) der Gruppe: Anti-CD13-, Anti-CD44-, Anti-CD49a-, Anti-CD63-, Anti-CD105- und Anti-CD166 eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und/oder sie sind frei von dem Oberflächen-Antigenen CD34.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht zudem in der Verwendung der erfindungsgemäßen Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) zur Herstellung eines Mittels für die Verwendung in einem therapeutischen und/oder chirurgischen Verfahren zur rekonstruktiven Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen und/oder funktionellen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts. Die hierbei eingesetzten ADSC sind – wie bei der Verwendung zur Herstellung eines Mittels für die kosmetische Behandlung – humane autologe oder allogene ADSC, die primär isoliert oder expandiert oder expandierte und passagierte sind, die die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen und frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind, und die kryokonservierbar sind. Auch dieses Mittel ist frei von FCS und BSA und anderen nicht-humanen Fremdproteinen, weil Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen ausschließlich humane (native oder rekombinant hergestellte) Proteine enthalten.
Wie beim erfindungsgemäßen Mittel für die kosmetische Behandlung sind auch bei dem Mittel für die therapeutische und/oder chirurgische Behandlung die humanen autologen oder allogenen ADSC wenigstens einmal, vorzugsweise zweimal (2x) passagiert und weisen zusätzlich zu den Oberflächenmarkern CD73 und CD90 eines oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 auf und/oder sind zusätzlich frei von dem Oberflächen-Antigenen CD34.
Grundsätzlich ist es möglich, in diesen beschriebenen erfindungsgemäßen Verwendungen anstelle der humanen autologen oder allogenen ADSC hierzu äquivalente, nämlich humanimmunkompatible xerogene (speziesfremde) ADSC zu verwenden. Erfindungsgemäß wesentlich ist jedoch, dass die zur Isolation, Kultivierung, Expansion (= zahlenmäßige Vermehrung) und Passagierung eingesetzten Medien und alle Wasch- und sonstigen angewendeten Inkubationslösungen grundsätzlich frei von nicht-humanen Fremdproteinen sind und ausschließlich humane, nämlich von menschlichen Zellen synthetisierte oder synthetisierbare, native oder rekombinant hergestellte Proteine enthalten oder hierzu äquivalente, human-immunkompatible xerogene Proteine.
Sämtliche erfindungsgemäß hergestellten Mittel sind frei von Hyaluronsäure, um damit einhergehende unerwünschte Nebenwirkungen auszuschließen.
Die zur Herstellung der beschriebenen erfindungsgemäßen Mittel verwendeten ADSC sind durch die Art und Reihenfolge der folgenden Maßnahmen erhältlich:

(a) Gewinnung von subkutane Fettgewebe (z. B. mittels Kanüle oder Liposuktionsapparatur oder mittels Exzision).
(b) Biochemischer und/oder chemischer und/oder physikalischer Aufschluss des Gewebes zu Einzelzellen und/oder Einzelzell-Konglomeraten in Suspension.
(e) Filtrierung der gewonnenen Suspension durch einen Filter mit Maschenweite von 20 μm bis 300 μm, vorzugsweise 100 μm.
(f) Zentrifugieren des in (e) gewonnenen Filtrats für 1 bis 15 Minuten bei 120 × g bis 2300 × g, vorzugsweise 700 × g und 4°C bis 40°C.
(i) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in autologem oder allogenem Blut-Serum oder -Plasma oder autologem oder allogenem Blutbestandteilen oder Zellkulturmedium (z. B. Dulbecco's Modified Eagle Medium, M199 oder MCDB-201) oder in hierzu homologen humanhistokompatiblen Flüssigkeiten, jeweils mit oder ohne Zusätzen an humanem (nativem oder rekombinant hergestelltem) Serum und/oder Plasma und/oder an humanen (nativen oder rekombinant hergestellten) Wachstumsfaktoren, Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika und/oder anderen Stoffen.

Die Schritte (a) bis (i) werden hierbei ohne Einsatz von fötalem Kälberserum (FCS) oder bovinem Serumalbumin (BSA) oder anderen nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt.
Die auf diese Weise erhaltenen erfindungsgemäßen ADSC können entweder direkt appliziert werden oder zwecks Expandierung (= zahlenmäßiger Vermehrung) in Zellkulturgefäße ausgesät und einige Zeit kultiviert und ggf. auch passagiert werden.
Der Schritt (b) kann insbesondere die folgenden Teilschritte umfassen:

(b-b) mechanisches Zerkleinern des Fettgewebes, wahlweise nach vorhergehendem Entfernen von fibrösem Gewebe und sichtbaren Blutgefäßen durch z. B. Herausschneiden.
(b-c) Waschen des Fettgewebes aus (b-b), vorzugsweise in phosphat-gepufferter Salzlösung (engl. ”phosphate buffered saline”, kurz PBS), die einen Zusatz an humanem Blutserum oder an humanem Serumalbumin oder einer anderen humanen Blutkomponente enthalten kann.
(b-d) Inkubation des Fettgewebes aus (b-c) mit Enzymen (z. B. Kollagenasen und/oder Proteasen) oder mit nicht-biologischen chemischen Substanzen in Inkubationspuffer (vorzugsweise Krebs-Ringer-Lösung), um das Gewebe in Einzelzellen oder Einzelzell-Konglomerate aufzuschließen/aufzulösen, und nachfolgende Filtration durch Siebe. Der Inkubationspuffer kann einen Zusatz von (vorzugsweise 0%–1%) humanem Blutserum oder humanem Serumalbumin oder einer anderen humanen Blutkomponente aufweisen.

Zwischen die Schritte (f) und (i) und können noch die folgenden Schritte (g) und (h) eingefügt werden, um eventuell noch vorhandene Erythrozyten durch Lysierung vollständig zu entfernen:

(g) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in einer wässrigen Lösung, die einen Gehalt an 0,1 mM EDTA, 155 mM Ammoniumchlorid und 10 mM Kaliumbikarbonat aufweist.
(h) Zentrifugieren der in (g) gewonnenen Mischung für 1 bis 15 Minuten bei 120 × g bis 2300 × g, vorzugsweise 700 × g und 4°C bis 40°C.

Die nach Schritt (i) vorliegenden ADSC werden vorzugsweise in einem Kulturmedium expandiert (= zahlenmäßig vermehrt) und/oder passagiert, das 0% bis 50%, vorzugsweise 0% bis 25%, weiter vorzugsweise 0% bis 10% und besonders bevorzugt 0% bis 2% menschliches autologes oder allogenes Serum enthält.
So werden ADSC erhalten, die frei von nicht-humanen und damit potentiell humanimmunogenen, d. h. für den menschlichen Organismus immunogenen Fremdproteinen sind, welche aus dem Serum (der Serum-Komponente) des Kulturmediums stammen können, aber auch aus anderen Komponenten des Isolations- und Kultivierungsverfahrens.
Jedes der erfindungsgemäß hergesteilten Mittel kann eine Suspension zur Injektion oder anderweitigen Einbringung (z. B. Needling) in die Haut oder Unterhaut des Subjekts umfassen, wobei diese Suspension autologes humanes Serum enthalten kann und frei von FCS und BSA und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist.
Kosmetische oder ästhetische Defekte, die mit dem erfindungsgemäßen Mittel erfolgreich behandelt werden können, sind insbesondere eine Hautfalte, ein Dehnungsstreifen (z. B. Schwangerschaftsstreifen, Stria graviditatis), eine abgesenkte Narbe, eine kutane oder subkutane Vertiefung nicht-traumatischen Ursprungs oder eine Unterentwicklung der Lippe.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht auch in der Bereitstellung von humanen, autologen oder allogenen Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC), die zur Behandlung von Defekten, insbesondere kosmetischen oder ästhetischen und/oder funktionellen Defekten, in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts geeignet und vorgesehen sind, und die sich dadurch auszeichnen, dass sie (i) wenigstens die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen (so dass sie mit monoklonalen Anti-CD37- und Anti-CD90-Antikörpern eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen), dass sie (ii) frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind (und deshalb mit monoklonalen Anti-CD-45-Antikörpern keine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen), dass sie (iii) primär isoliert (d. h. unmittelbar zuvor aus dem Fettgewebe isoliert und nicht-expandiert) oder expandiert oder expandiert und passagiert sind, wobei Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen frei von FCS und BSA und anderen nicht-humanen Fremdproteinen sind und ausschließlich humane (native oder rekombinant hergestellte) Proteine enthalten, dass sie (iv) kryokonservierbar sind, und dass sie (v) frei von FCS und BSA und anderen nicht-humanen (und damit potentiell human-immunogenen, d. h. für den menschlichen Organismus imunogenen) Fremdproteinen sind, und dass sie frei von Hyaluronsäure sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese erfindungsgemäßen ADSC wenigstens einmal, vorzugsweise wenigstens zweimal (2x) passagierte, humane, autologe oder allogene ADSC, die wenigstens einen zusätzlichen Oberflächenmarker aufweisen, der aus der Gruppe der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 stammt, und/oder die das Oberflächen-Antigen CD34 nicht aufweisen (d. h. davon frei sind).
Die Gewinnung dieser ADSC erfolgt vorzugsweise in einem Verfahren mit den in der vorliegenden Beschreibung bereits angegebenen Maßnahmen/Verfahrensschritten (a), (b), (e), (f), (i) und der zusätzlichen Maßnahme bzw. dem zusätzlichen Verfahrensschritt (k), nämlich des Nachweises des Vorhandenseins (der Expression) der Oberflächenmoleküle CD73 und CD90 und des Nichtvorhandenseins (Fehlens) des Oberflächenmoleküls CD45. Der Schritt (b) kann insbesondere die bereits genannten Teilschritt (b-b), (b-c) und/oder (b-d) umfassen.
Im Anschluss an die Maßnahme/den Verfahrensschritt (f) können zusätzlich die ebenfalls bereits angegebenen Maßnahmen/Verfahrensschritte (g) und (h) durchgeführt werden. Die nach Schritt (e) oder (g) oder (i) vorliegenden ADSC werden in einem Kulturmedium expandiert und/oder passagiert, das 0% bis 50%, vorzugsweise 0% bis 25%, weiter vorzugsweise 0% bis 10% und besonders bevorzugt 0% bis 2% menschliches autologes oder allogenes Serum enthält.
Alle Schritte (a) bis (i) werden grundsätzlich ohne Einsatz von nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt. Die so erhaltenen ADSC sind folglich frei von xenogenen, human-immunogenen Proteinen (die bei herkömmlicher Kultivierung unter Einsatz von beispielsweise Fötalem Kälberserum 'FCS' oder Bovinem Serumalbumin 'BSA' in diesen Serum-Komponenten des Kulturmediums enthalten sind).
Ergänzend zu oder auch anstelle von Maßnahme/Verfahrensschritt (k) kann der Schritt (1) durchgeführt werden, nämlich der Nachweis des Differenzierungspotentials der Zellen in Adipozyten (adipogenen Differenzierung) und/oder Osteoblasten (osteogenen Differenzierung) und/oder Chondrozyten (chondrogenen Differenzierung).
Die auf diese Weise gewonnenen erfindungsgemäßen ADSC können entweder direkte appliziert werden, oder sie können zwecks (weiterer) Expandierung/zahlenmäßiger Vermehrung in Zellkulturgefäße ausgesät und einige Zeit kultiviert und ggf. auch passagiert und/oder kryokonserviert werden.
Die Bereitstellung der ADCS für die erfindungsgemäß vorgesehenen Verwendungen erfolgt vorzugsweise in Form einer injizierbaren Suspension, die frei von FCS und BSA und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist, und die autologes humanes Serum enthalten kann.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht auch in der Bereitstellung einer Zubereitung für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts, wobei diese Zubereitung erfindungsgemäße ADSC gemäß vorstehender Beschreibung enthält und mit den vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich ist. Die Zubereitung kann einen pharmazeutisch und/oder physiologisch akzeptablen Träger für die ADSC umfassen, der auch nachträglich zugegeben worden sein kann.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht ferner in der Bereitstellung eines Kits (Teile-Sets) für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen und/oder funktionellen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, umfassend: (a) eine Injektionsapparatur (z. B. eine Spritze), die für eine Injektion in die Subkutis und/oder Dermis und/oder Epidermis der menschlichen Haut geeignet ist, (b) humane Stammzellen gemäß vorstehender Beschreibung und (c) eine pharmazeutisch und/oder physiologisch akzeptable Trägerlösung, die vorzugsweise bereits in den Injektionsapparat (beispielsweise in den Spritzenhohlraum) eingefüllt ist.
Eine Lösung der genannten Aufgabe und Gegenstand der Erfindung ist zudem ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen Defekten in der Haut eines Subjekts, das durch die folgenden Schritte (a) bis (c) gekennzeichnet ist:

(a) Das Bereitstellen eines Mittels, das primär isolierte (d. h. unmittelbar zuvor isolierte und nicht-expandierte) oder expandierte oder expandierte und passagierte, humane, autologe oder allogene Stammzellen aus Fettgewebe (ADSC) als Wirkstoff umfasst/enthält. Diese ADSC sind kryokonservierbar. Sie weisen die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 auf, so dass sie mit monoklonalen Anti-CD73- und Anti-CD90-Antikörpern eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und sie sind frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 (das charakteristisch für hämatopoetische Zellen ist und bisher nie bei mesenchymalen Stammzellen beschrieben wurde) und zeigen deshalb mit monoklonalen Anti-CD45-Antikörpern keine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion. Das Mittel ist ganz oder im Wesentlichen, d. h. vollständig oder nahezu vollständig frei von nicht-humanen und damit potentiell human-imunogenen, d. h. für den menschlichen Organismus imunogenen Fremdproteinen, weil Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen ausschließlich humane, native oder rekombinant hergestellte Proteine enthalten.
(b) Das Identifizieren eines kosmetischen und/oder ästhetischen Defekts in der Haut, der durch Verstärkung des unterliegenden subkutanen oder dermalen Gewebes im Bereich des Defekts behebbar oder verringerbar ist.
(c). Das Applizieren eines wirksamen Volumens des Mittels an der Haut im Bereich des Defekts.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens sind die Stammzellen in Schritt (a) wenigstens einmal, vorzugsweise wenigstens zweimal (2x) passagierte, humane, autologe oder allogene ADSC, und sie weisen zusätzlich einen oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 auf, so dass sie mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern) der Gruppe: Anti-CD13-, Anti-CD44-, Anti-CD49a-, Anti-CD63-, Anti-CD105-und Anti-CD166 eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und/oder sie sind frei von dem Oberflächen-Antigenen CD34.
Anstelle der humanen, autologen oder allogenen ADSC können auch hierzu äquivalente, nämlich human-immunkompatible xerogene (speziesfremde) ADSC verwendet werden. Erfindungsgemäß wesentlich ist, dass auch die zur Isolation, Kultivierung, Expansion und Passagierung dieser xerogenen ADSC eingesetzten Medien und alle Wasch- und sonstigen angewendeten Inkubationslösungen grundsätzlich frei von nicht-humanen Fremdproteinen sind und ausschließlich humane, native oder rekombinant hergestellte Proteine oder xerogene human-transgene Proteine enthalten.
Die erfindungsgemäßen ADSC und die damit hergestellten kosmetischen oder therapeutischen Mittel ermöglichen erstmals eine kurzfristige Bereitstellung von isolierten und eindeutig identifizierten humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe mit multipotentem Differenzierungspotential in ausreichender Menge für eine gezielte lokale Applikation an der Haut eines Subjekts, insbesondere der Haut des Proben-Spenden (autologe Applikation) oder eines anderen humanen Empfängers (allogene Applikation), und wobei diese Applikation den gewünschten Effekt hat, dass bereits nach wenigen Wochen (beispielsweise zwei Wochen nach Applikation per Injektion) statistisch signifikant größere Hautdicken und Neubildung von Kollagen und Elastin nachweisbar sind und eine Glättung der Haut (d. h. des Subkutis- und/oder Dermisgewebes) beobachtet werden kann, die über mehrere Monate und Jahren fortbesteht (Langzeiteffekt). Diese Effekte werden ohne zusätzlichen Einsatz von Hyaluronsäure oder andere im Stand der Technik zur Behandlung von Körperdeformationen bekannten Stoffen erreicht, so dass die von diesen Stoffen ausgehenden unerwünschten Nebenwirkungen vollständig ausgeschlossen sind.
Die Tatsache, dass die ADSC erfindungsgemäß entweder (i) direkt nach Isolation ohne Expandierung und/oder Passagierung erfindungsgemäß eingesetzt werden oder (ii) zunächst serumfrei oder unter Zusatz von ausschließliche humanem (autologem oder allogenem) Serum kultiviert und gegebenenfalls auch expandiert und wahlweise zudem pasagiert werden (d. h. ohne Kontakt zu Serum aus Rindern oder allgemein aus nicht genetisch entsprechend modifizierten und somit nicht human-analogen anderen Spezies), bevor sie appliziert oder in der Herstellung einer Zubereitung für die kosmetische oder therapeutischen Behandlung eingesetzt werden, hat die Vorteile, dass das Risiko einer allergischen Reaktion reduziert ist, und auch die Gefahr einer Übertragung von Erkrankungen anderer Spezies (z. B. boviner spongiformer Enzephalopathie) minimiert ist Da bekanntermaßen bereits der einmalige Kontakt von humanen Zellen mit tierischem Serum, auch bovinem Serum, zu einer dauerhaften Veränderung in ihrem Verhalten führen kam, haben die erfindungsgemäß bereitgestellten und verwendeten ADSC den weiteren Vorteil, dass solche Veränderungen ausgeschlossen sind und somit die Verträglichkeit und physiologische Stabilität bei einer Rückführung in Haut und/oder Weichteilgewebe eines humanen Subjekts weiter optimiert ist.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten und verwendeten ADSC sind somit uneingeschränkt, histokompatibel mit dem Subjekt, dem sie verabreicht werden (sollen).
Die Eigenschaft der erfindungsgemäßen ADSC, dass sie mehrere Monate (bis Jahre) tiefgefroren gelagert (kryokonserviert) werden können, ohne dass damit nachweisbare Qualitätsverluste einhergehen, hat den Vorteil, dass die ADSC ihrem Spender oder anderen Empfängern auch noch Jahre nach der Primärisolation verabreicht werden können und den angestrebten Erfolg herbeiführen. Der mit der Primärisolation verbundene Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand fällt also nur einmal an und die dabei gewonnenen Zellen können maximal effektiv über mehrere Jahre genutzt werden. Außerdem können die Zellen zu einem Zeitpunkt gewonnen werden, zu dem noch keine gegebenenfalls systemisch wirksame Erkrankung vorliegt oder ein hohes Spenderalter gegeben ist, das für die Proliferations- und Differenzierungseigenschaften der ADSC eine wichtige Rolle spielen kann. Sie können also quasi auf Vorrat gewonnen und aufbewahrt werden.
Zwecks Charakterisierung der erfindungsgemäßen Stammzellen wird vorzugsweise zusätzlich zum Nachweis der vorhandenen Oberflächenmoleküle CD73, CD90 und CD105 auch das Vorhandensein eines oder mehrere der für ADSC ebenfalls immunphänotypisch charakteristischen Oberflächenmoleküle CD13, CD44, CD49a, CD63, und CD166 nachgewiesen. Weiter vorzugsweise wird alternativ oder kumulativ zusätzlich das Nicht-Vorhandensein eines oder mehrerer der Oberflächenmoleküle CD31, CD34 und CD45 nachgewiesen.
CD34 ist charakteristisch für hämatopoetische Zellen und wird von kultivierten ADSC kaum noch exprimiert (Hong et al. 2010; Mitchell et al. 2006). CD44 ist eine Oberflächenmolekül vieler Zelltypen (Goodison et al. 1999), kann aber von humanen ADSC ebenfalls exprimiert werden (Baglioni et al. 2009). CD106 ist charakteristisch für humane mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark, kann aber von ADSC ebenfalls exprimiert werden.
Typische Defekte, die mit den erfindungsgemäßen ADSC bzw. mit den darauf basierenden erfindungsgemäßen Mitteln und erfindungsgemäßen Verwendungen und Verfahren erfolgreich behandelt d. h. teilweise oder vollständig behoben werden können, sind unter anderem Hautfalten, Dehnungsstreifen (z. B. Schwangerschaftsstreifen), abgesenkte Narben, Hautvertiefungen nicht-traumatischen Ursprungs und Volumendefizite der Lippe des Weichteilgewebes und der Haut.
Die Verwendung der ADSC bzw. des damit hergestellten Mittels bei der therapeutischen Behandlung von Defekten in der Haut und/oder Weichteilgeweben hat die Vorteile, dass eine beschleunigte und qualitativ bessere Heilung von Wunden, von Hautbeschädigungen oder von Hauterkrankungen, wie z. B. Ulzerationen erreicht wird. Dieser Effekt wird insbesondere auch dadurch erreicht, dass die erfindungsgemäßen ADSC eine vermehrte Elastin- und Kollagenbildung bewirken.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehörigen Figuren näher erläutert. Sofern nicht anders angegeben stammen alle in den Versuchen verwendeten Chemikalien von Sigma-Aldrich, München, Deutschland und sind im Handel erhältlich.
Die Figuren zeigen:
1: Ergebnis einer Durchflusszytometrie-Analyse mit erfindungsgemäß isolierten ADSC nach Inkubation der ADSC mit den Antikörpern CD13, CD44, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105, CD166 (als ”Positiv-Marker”) und den Antikörpern CD31, CD34 und CD45 (als ”Negativ-Marker”); Die Analyseprofile zeigen ein positives Ergebis für CD13, 44, 49a, 63, 73, 90, 105 und 166 und ein negatives Ergebnis für CD31, 34 und 45.
2: obere Reihe: erfindungsgemäß isolierte ADSC nach Induktion einer adipogenen Differenzierung und nach Färbung mit Öl Rot; die Rotfärbung zeigt gefärbte intrazelluläre Lipidtropfen an; untere Reihe: erfindungsgemäß isolierte ADSC derselben Charge ohne Induktion einer adipogenen Differenzierung und nach Färbung mit Öl Rot; es ist keine Rotfärbung erkennbar.
3: obere Reihe: erfindungsgemäß isolierte ADSC nach Induktion einer osteogenen Differenzierung und nach Färbung mit Alizarin Rot; die Rotfärbung zeigt gefärbtes extrazelluläres Calcium an; untere Reihe: erfindungsgemäß isolierte ADSC derselben Charge ohne Induktion einer osteogenen Differenzierung und nach Färbung mit Alizarin Rot; es ist keine Rotfärbung erkennbar.
4: extrazellulär abgelagertes Calcium von erfindungsgemäß isolierten ADSC der Chargen Donor 1 bis Donor 6 nach Induktion einer osteogenen Differenzierung, angegeben in μg pro μg Protein.
5: spezifische GPDH-Aktivität (in mU pro mg Protein, wobei eine Enzymeinheit U derjenigen Menge Enzym entspricht, die die Umwandlung von einem μmol Substrat pro Minute unter definierten Bedingungen katalysiert) von erfindungsgemäß isolierten ADSC der Chargen Donor 1 bis Donor 6 nach Induktion einer adipogenen Differenzierung im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrollzellen derselben Chargen.
6: durchschnittliche doppelte Hautfaltendicke (in mm) nach Injektion von ADSC im Vergleich zu Kontrollhaut, Ergebnisse der Kalipermessung an Tag 7, 12, 14/15, 42/43, 56/57, 91 und 98/99 nach der Injektion.
7: durchschnittliche Differenz der Hautdicke von Hautarealen, die mit ADSC-Injektionen behandelt wurden (”ADSC-Injektionsareal) gegenüber Hautarealen, die nicht mit ADSC-Injektionen sondern mit Injektionen von Zellkulturmedium behandelt wurden (”Kontrollareal”), Ergebnisse der Kalipermessung an Tag 7, 14/15, 42/43, 56/57 91 und 98/99 nach der Injektion.
Die Konzentrationsangaben ”M”, ”mM” und ”μM” beziehen sich auf Mol pro Liter, Millimol pro Liter und Mikromol pro Liter.
Beispiel 1: Verfahren zur Gewinnung der ADSC (Primärisolat)
(A) allgemeines Verfahrensprotokoll
Subkutanes Fettgewebe wird aus einer beliebigen Region des Körpers mittels einer dünnen Kanüle (z. B. nach Coleman), mittels Fettabsaugung (Liposuktion) oder mittels Exzision gewonnen.
Vor der Weiterverarbeitung wird das gewonnene subkutane Fettgewebe mechanisch zerkleinert, sofern das erforderlich erscheint. Der Zerkleinerungsschritt kann aber auch unterbleiben, insbesondere im Fall von Liposuktionsmaterial. Aus exzidiertem Fett kann mittels Kanüle oder Liposuktionsapparatur Fett abgesaugt werden.
Anschließend erfolgt ein enzymatischer (biologischer) oder chemischer (nichtbiologischer) oder physikalischer Aufschluss des Gewebes, so dass sich die Verbindungen zwischen den Zellverbänden und Einzelzellen lesen. Das derart aufgelöste Gewebe wird durch Siebgewebe mit verschiedener Porengröße filtriert, wobei Bindegewebe und andere größere unverdaute Anteile entfernt werden.
Danach wird eine Zentrifugation durchgeführt, vorzugsweise 7 Minuten bei 700 × g und Raumtemperatur, wodurch reife Adipozyten und noch vorhandenes. Bindegewebe oder unverdaute andere Gewebereste von den Stammzellen abgetrennt (separiert) werden. Das mit der Zentrifugation erhaltene Pellet enthält die Stammzellen. Dieses Pellet wird vom Überstand abgetrennt, bei Bedarf noch ein- oder mehrmals gewaschen (z. B. mit phosphatgepufferter Salzlösung – engl. ”phosphate buffered saline” – kurz PBS, die einen Gehalt von vorzugsweise 0% bis 1% an humanem Blutserum und/oder andere Zusatzstoffe aufweisen kann) und in einer geeigneten Flüssigkeit resuspendiert. Erfindungsgemäß geeignete Flüssigkeiten sind: autologes oder allogenes (Blut-)Serum oder Plasma oder Blutbestandteile, oder Zellkulturmedium (z. B. Dulbecco's Modified Eagle Medium, M199 oder MCDB-201) mit oder ohne Zusätzen an Serum, Plasma, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika und/oder anderen Stoffen, oder hierzu homologe humanhistokompatible Flüssigkeiten.
Die erhaltene Zellsuspension ist das sogenannte Primärisolat. Dieses Primärisolat kann sofort anschließend appliziert werden oder in ein Zellkulturgefäß eingebracht und dort weiter vermehrt werden. Primärisolate können aber auch tiefgefroren (kryokonserviert) werden, um sie so für eine Applikation zu einem späteren Zeitpunkt aufzubewahren.
(B) Protokoll eines konkreten Ausführungsbeispiels
Subkutanes Fettgewebe wurde aus einer beliebigen Region des Körpers mittels einer dünnen Kanüle (z. B. nach Coleman), mittels Fettabsaugung (Liposuktion) oder mittels Exzision gewonnen und daraus die mesenchymalen Bindegewebszellen wie folgt isoliert: Fibröses Gewebe und sichtbare Blutgefäße wurden manuell entfernt z. B. durch Herausschneiden von größeren sichtbaren Bindegewebssträngen und/oder durch Gewebeaufschluss mit z. B. Enzymen und anschließender Filtration durch z. B. Siebgewebe. Das verbleibende Fettgewebe wurde zweimal mit PBS (Phosphate buffered Saline) mit einem Gehalt von 1% humanem Blutserum gewaschen, dann zerkleinert und danach mit 1,5 mg/ml Kollagenase (Collagenase CLS; 220 U/mg, Biochrom) in Krebs-Ringer-Lösung (Sigma) mit einem Gehalt von 1% humanem Blutserum für 45 Minuten unter konstantem Schütteln bei 37°C behandelt. Anschließend wurde diese Mischung für 7 Minuten bei 700 × g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen (das Pellet) wurden in einer Lösung der Zusammensetzung 1% humanes Serum und PBS resuspendiert, durch einen Filter mit 100 μm Maschenweite (Neolab) passiert und danach zweimal mit PBS mit einem Gehalt von 1% humanem Blutserum gewaschen. Eventuelle vorhandene Erythrozyten wurden durch Behandlung über 3 Minuten mit einer Mischung aus 155 mM Ammoniumchlorid, 10 mM Kaliumbikarbonat und 0,1 mM EDTA lysiert und durch zweimaliges Waschen mit anschließender Zentrifugation entfernt. (Dieser Schritt der Erythrozytenentfernung ist optional). Die derart aufgereinigten Zellen stellen das Primärisolat dar.
Beispiel 2: Kultivierung und gegebenenfalls Passagierung des Primärisolats
(A) allgemeines Verfahrensprotokoll
Für eine länger (Stunden bis Wochen) andauernde Kultivierung und für Passagierungen der Zellen des gemäß Beispiel 1 hergestellten Primärisolats werden die derart isolierten ADSC in Expansionsmedium bei vorzugsweise 37°C unter Begasung mit vorzugsweise 5% CO₂-Gehalt inkubiert.
Das Expansionsmedium besteht aus 60% glukosearmem DMEM (”DMEM low glucose”, 1 g/1 D-glucose) (z. B. Invitrogen), 40% MCDB-201, 1 × Insulin-Transferrin-Selenium (z. B. Firma Becton Dickinson), 10^–8 M Dexamethason, 0,1 mM Ascorbinsäure-2-phosphat, 0% bis 10%, vorzugsweise 0% bis 2% humanem autologem oder allogenem Blutserum, 100 U/ml Penicillin (z. B. Firma Biochrom), 0,1 mg/ml Streptomycin (z. B. Firma Biochrom), 0 ng bis 50 ng/ml, vorzugsweise 0 ng bis 10 ng/ml EGF (z. B. 10 ng/ml rhEGF, Firma Miltenyi) und 0 ng bis 50 ng/ml, vorzugsweise 0 ng bis 10 ng/ml PDGF (z. B. 10 ng/ml rhPDGF-BB, Firma CellSystems). Die Zusätze an Serum und/oder Wachstumsfaktoren können bei Bedarf gänzlich entfallen.
Nach etwa 12 Stunden erster Kultivierung wird das Medium zum ersten Mal gewechselt, wobei nicht anhaftende Zellen entfernt werden. Im Verlauf der weiteren Kultivierung wird das Medium regelmäßig, vorzugsweise täglich oder alle zwei Tage gewechselt (Passage 0).
Sobald die kultivierten Zellen eine etwa 70%ige Konfluenz erreicht haben, werden sie das erste Mal passagiert. Hierfür werden sie durch Behandlung mit 0,25%igem Trypsin-EDTA (z. B. Firma Biochrom) vom Kulturgefäß und voneinander gelöst, dann bei Raumtemperatur und 250 × g zentrifugiert, danach in Expansionsmedium resuspendiert und schließlich in Kulturschalen überführt, wobei sie so portioniert werden, dass pro Kulturschale eine Zelldichte von 3,5 × 10³ Zellen/cm² vorliegt (Passage 1).
Für eine Applikation am Subjekt von expandierten und passagierten ADSC werden die Zellen der Passage 1 noch einmal oder mehrmals, vorzugsweise bis zur Passage drei oder Passage vier passagiert, bevor sie für die Applikation zubereitet werden.
Sowohl die expandierten unpassagierten als auch die expandierten und passagierten ADSC und ebenso das Primärisolat (.d. h die nicht expandierten ADSC) können tiefgefroren (kryokonserviert) werden, um sie für eine Applikation oder Expansion oder Vordifferenzierung oder Charakterisierung zu einem späteren Zeitpunkt aufzubewahren.
Vor oder nach, vorzugsweise nach einer Kryokonservierung können die ADSC des Primärisolats oder die expandierten und gegebenenfalls passagierten ADSC noch in verschiedene Richtungen vordifferenziert werden.
(B)-Protokoll eines konkreten Ausführungsbeispiels
Bei sechs humanen Probanden (2 männlichen und 4 weiblichen) im Alter zwischen 21 und 57 Jahren (mittleres Alter 32,2 Jahre) wurde subkutanes Fettgewebe jeweils frisch entnommenem und jeweils ein Primärisolat gemäß Beispiel 1 hergestellt. Die Isolate wurden gemäß Beispiel 2(A) expandiert und zweimal oder dreimal weiter passagiert, so dass sie sich zuletzt in Passage 3 oder Passage 4 befanden.
Beispiel 3: Charakterisierung von isolierten ADSC mittels Durchflusszytometrie
Die gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC der Passage 3 oder 4 wurden durchflusszytometrisch auf das Vorhandensein von für mesenchymale Stammzellen bekanntermaßen charakteristischen Oberflächenmarkern untersucht. Zur Detektion dieser charakteristischen Oberflächenmarker wurden die folgenden Fluorochrom-konjugierten monoclonalen Antikörper verwendet: anti-CD13-APC, anti-CD31-FITC, anti-CD34-FITC, anti-CD44-APC, anti-CD45-FITC, anti-CD49a-PE, anti-CD73-PE, anti-CD90-APC, anti-CD105-FITC und anti-CD166-PE (alle Firma Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA).
Die ADSC wurden durch Behandlung mit 0,25%igem Trypsin-EDTA (Firma Biochrom) vom Kulturgefäß und voneinander gelöst. Anschließend wurden Aliquots von 100:000 Zellen mit jeweils einem, für ein zelluläres Oberflächen-Epitop spezifischen Fluorochromkonjugierten monoklonalen Antikörper in sogenanntem ”FACS”-Puffer (bestehend aus: 1% FCS und 0,1% NaN₃ in PBS) für 30 Minuten auf Eis inkubiert, zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und anschließend mit 1% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Analysierung der Zellen jedes Aliquots erfolgte mittels einer Durchflusszytometrie-Apparatur (”Canto flow cytometry system”, kurz ”FACS”) der Firma Becton Dickinson (Deutschland, USA)
Die Messwerterfassung und die Analyse der gewonnenen Daten erfolgte mit der ”Diva Software” der Firma Becton Dickinson (Deutschland, USA).
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen (siehe 1), dass die ADSC der verschiedenen Spender alle eine positive Reaktion mit den Antikörpern CD13, CD44, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105 und CD166 zeigten, und negativ mit den Antikörpern CD31, CD34 und CD45 reagierten. Damit erfüllen die getesteten Zellen die im Stand der Technik übereinstimmend anerkannten Kriterien (”consensus criteria”) für mesenchymale Stammzellen.
Beispiel 4: Induktion einer adipogenen Differenzierung der isolierten ADSC
Zur Induzierung einer adipogenen Differenzierung wurden die gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC von 6 Probanden, d. h. 6 verschiedene erfindungsgemäß isolierte ADSC-Chargen in glukosereiches Expansionsmedium überführt (glukosearmes Expansionsmedium wären ebenso gut einsetzbar gewesen) und auf eine Dichte von 24,000 Zellen/cm² eingestellt. (Gemäß Beispiel 1 bereitgestellte ADSC aus Primärisolaten wären ebenso gut einsetzbar gewesen.) Das glukosereiche Expansionsmedium ist das Expansionsmedium gemäß Beispiel 1, jedoch mit 4,5 g/l D-Glukose haltigem DMEM (z. B. ”DMEM high Glucose” – 4,5 g/l D-Glucose, der Firma Invitrogen).
Sobald die kultivierten Zellen eine 90%ige Konfluenz erreicht haben, wurden sie d. h. wurde diese Zellschicht zunächst zwei Tage in modifiziertem glukosereichem Expansionsmedium I und anschließend einen Tag in modifiziertem glukosereichem Expansionsmedium II kultiviert, und diese Abfolge (dieser Zyklus) wurde dreimal wiederholt.
Das modifizierte glukosereiche Expansionsmedium I besteht ausschließlich aus 4,5 g/l D-Glukose-haltigem DMEM mit einem Gehalt an humanem autologem oder allogenem Blutserum von 5% und mit einem Zusatz an 500 μM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin, 1 μM Dexamethason und 1 μM Indomethacin (”IDI-mix”).
Das modifizierte glukosereiche Expansionsmedium II besteht ausschließlich aus 4,5 g/l D-Glukose-haltigem DMEM mit einem Gehalt an humanem autologem oder allogenem Blutserum von 5% und mit einem Zusatz an 10 μg/ml Insulin.
Kontrollansätze wurden parallel dazu in dem ursprünglichen (nicht modifizierten) glukosereichen (oder ggf. glukosearmen) Expansionsmedium weiterkultiviert.
Der Erfolg der adipogenen Differenzierung wurde anhand der spezifischen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase(GPDH)-Aktivität der Zellen überprüft. (GPDH ist das Schlüsselenzym der Triacylglycerinsynthese von Adipozyten.) Zu diesem Zweck wurde die GPDH-Aktivität auf die Gesamtproteinmenge der jeweiligen (Chargen-)Probe bezogen und somit relativ zur Zellmenge bestimmt. Schwankungen in der tatsächlichen Anzahl der Zellen pro Kulturgefäß haben dadurch keinen Einfluß auf das GPDH-Ergebnis, und gleichzeitig wird so eine Aussage über die Differenzierungsfähigkeit der Gesamtpopulation eines Spenders erhalten.
Am Tag 14 nach Beginn der Induktionsbehandlung wurde jede Zellschicht zweimal mit PBS gewaschen und unter Kühlung auf Eis mit einem Gummischaber (”Rubber Policeman”, z. B. von Firma Roth oder von Firma Costar unter der Bezeichnung ”Cell lifter”) in Extraktionspuffer (50 mM Tris, pH 7,5; 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol) überführt. Die so erhaltene Zellsuspension wurde auf Eis mit dem Mikrotip eines Bandelin Sonopuls HD 3100 Sonifiers und der Einstellung 4 Sekunden, 0.02 KJ behandelt. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und 8.000 × g für 5 Minuten. Der dabei gewonnene Überstand wurde in ein frisches Meßgefäß überführt und den Analyseverfahren hinsichtlich GPDH-Aktivität und Gesamtproteingehalt unterworfen.
Die Bestimmung der GPDH-Aktivität erfolgte nach der Methode von Wise und Green (1979) mit geringfügigen Abwandlungen. Sie wurde mit verschiedenen Zellkonzentrationen in einer Pufferlösung der Zusammensetzung: 100 mM Triethanolamine/HCl mit pH 7,5; 2,5 mM EDTA; 0,12 mM NADH, 0,2 mM Dihydroxyazcetonphosphat und 0,1 mM β-Mercaptoethanol auf ein Endvolumen von 125 μl eingestellt, durchgeführt. Die Bestimmung der ΔOD₃₄₀-Werte erfolgte mit einem Tecan Sunrise Photometer (Firma Tecan, Crailsheim, Deutschland) bei Zimmertemperatur in einer 96-Well-UV-Platte (z. B. der Firma Greiner, Frickenhausen, Deutschland) und die Analyse der ermittelten Daten erfolgte mit der Magellan V6.4 Software (Firma Tecan, a. a. O).
Der Gesamtproteingehalt wurde über die Bicinchoninsäure-Reaktion quantitativ photometrisch bestimmt. Zur Durchführung der Bicinchoninsäure-Reaktion wurde der ”BCA-Assays” der Firma Pierce, Perbio, Bonn, Germany, ohne Modifikationen genau nach Angaben des Herstellers verwendet. Zu jeder untersuchten Zellschicht wurden drei Proben parallel angesetzt und jeweils der Bicinchoninsäure-Reaktion unterworfen und anschließend photometrisch analysiert.
Aus den ermittelten Daten zur GPDH-Aktivität und den Ergebnissen des BCA-Assays, d. h. den Daten zum Gesamtproteingehalt einer jeweiligen Probe wurde die spezifische GPDH-Aktivität berechnet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Sie zeigen, dass die erfindungsgemäß isolierten ADSC der Chargen Donor 1 bis Donor 6 nach Induktion einer adipogenen Differenzierung im Vergleich zu Kontrollzellen derselben Chargen eine signifikante hohe spezifische GPDH-Aktivität aufweisen, was als Indiz für einen ausgeprägten Lipidstoffwechsel in diesen Zellen zu werten ist.
Zusätzlich wurden in Parallelansätzen am Tag 14 nach Beginn der Induktionsbehandlung und in entsprechenden Kontrollansätzen die Zellschichten mit Öl-Rot behandelt und mikroskopisch analysiert, ob intrazelluläre Lipidtropfen nachweisbar sind. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Sie zeigen, dass bei den ADSC mit Induktionsbehandlung rot gefärbte Lipidtropfen in den Zellen nachweisbar sind und folglich eine adipogene Differenzierung stattgefunden hat. In den Kontrollzellen ohne Induktionsbehandlung waren nach Öl-Rot-Färbung keine Lipidtropfen erkennbar.
Beispiel 5: Induktion einer osteogenen Differenzierung der isolierten Zellen
Die Induzierung einer osteogenen Differenzierung wurde nach der Methode von Lin et al. (2005) durchgeführt, jedoch mit Abwandlung der Glukosekonzentration, nämlich der Verwendung von DMEM mit 4,5 g/l D-Glukose (im folgenden abgekürzt zu ”HGL”) oder von DMEM mit 1 g/l D-Glukose (im folgenden abgekürzt zu ”LGL”).
Hierfür wurden die gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC von 6 Probanden, d. h. 6 verschiedene erfindungsgemäß isolierte ADSC-Chargen (gemäß Beispiel 1 bereitgestellte ADSC aus Primärisolaten wären ebenso gut einsetzbar gewesen) jeweils in zwei parallelen Testansätzen in Expansionsmedium überführt und mit einer initialen Dichte von 24,000 Zellen/cm² ausgesät. Ein Testansatz ”HGL” wurde mit glukosereichem ”HGL”-Expansionsmedium und ein Testansatz ”LGL” wurde mit glukosearmem ”LGL”-Expansionsmedium durchgeführt. Das ”HGL”- Expansionsmedium hat die Zusammensetzung des Expansionsmediums gemäß Beispiel 1, jedoch mit 4,5 g/l D Glukose haltigem DMEM (z. B. ”DMEM high Glucose” – 4,5 g/l D-Glucose, der Firma Invitrogen). Das ”LGL”-Expansionsmedium hat die Zusammensetzung des Expansionsmediums gemäß Beispiel 1.
Sobald die kultivierten Zellen eine 90%ige Konfluenz erreicht hatten, wurde zwecks Initiierung der osteogenen Induktion ihr Kulturmedium verändert:
Das HGL-Expansionsmedium wurde ersetzt durch ein HGL-haltiges Kulturmedium der Zusammensetzung DMEM mit 4,5 g/l D-Glukose, 5% humanem autologen oder allogenen Blutserum, 50 μM L-Ascorbat-2-Phosphat, 0,1 μM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphatdisodium.
Das LGL-Expansionsmedium wurde ersetzt durch ein LGL-haltiges Kulturmedium der Zusammensetzung 60% DMEM mit 1 g/l D-Glukose, 5% humanem autologem oder allogenem Blutserum, 50 μM L-Ascorbat-2-Phosphat, 0,1 μM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphatdisodium.
Als Positiv-Kontrollansätze wurden Zellen jedes Donors (Spenders), d. h. von jeder der sechs Chargen, mit einem kommerziell erhältlichen Differenzierungssystem für ADSC (z. B. dem hMSC Osteogenic BulletKit^TM (PT-3924 & PT-4120), lot 0000115438 der Firma Lonza Group Ltd., Schweiz, behandelt.
„Der Erfolg der osteogenen Differenzierung der Zellen wurde anhand ihrer Kalziumproduktion und anhand der Bildung von mineralisierter extrazellulärer Matrix überprüft.
Für die Bestimmung der Kalziumproduktion der Zellen wurden die kultivierten Zellschichten 14, 21, 35 und 42 Tage nach der Induktion der Differenzierung zunächst zweimal mit PBS ohne Mg²⁺/Ca²⁺ gewaschen. Danach wurden die Zellen bei Zimmertemperatur für 2 Stunden unter Rütteln mit 0,6 M HCl inkubiert, um extrazellulär abgelagertes Ca²⁺ zu extrahieren. Von jedem Ansatz wurde der Extrakt (d. h. die HCL-Lösung, die das extrazelluäre Calcium enthält, das aus dem Zellmonolayer unter Einfluss Von Salzsäure herausgelöst wurde) anschließen für 5 Minuten bei 15,700 × g zentrifugiert. In den erhaltenen Überständen wurden mit der O-Cresolphthalein Komplex Methode (z. B. Fluitest Ca-CPC, Biocon, Vöhl-Marienhagen, Germany) der Ca² ⁺-Gehalt quantitativ bestimmt.
Zusätzlich wurde der Proteingehalt der jeweiligen Zellkultur bestimmt, um den ermittelten Calcium-Gehalt auf die Gesamtproteinmenge der eingesetzten Zellen beziehen zu können und somit einen von der tatsächlich eingesetzten Zellzahl unabhängigen relativen Wert zu erhalten. Hierfür wurden die auf der Zellkulturoberfläche befindlichen Zellen dreimal mit PBS ohne Mg²⁺/Ca²⁺ gewaschen, mit einem Gummischaber (”Rubber Policeman” a. a. O) irr 0,1 M NaOH/1% SDS überführt und wie in Beispiel 4 beschrieben mit Ultraschall behandelt. Es folgte eine Zentrifugation bei 4°C und 8,000 × g für 5 Minuten und in dem erhaltenen Überstand wurde der Proteingehalt mit bekannten Verfahren (hier dem BCA-Kit der Firma Pierce, Rockford, USA) bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse der Zellen am Tag 42 nach der osteogenen Induktion sind in 4 dargestellt. Sie zeigen, dass die erfindungsgemäß isolierten ADSC der sechs Chargen Donor 1 bis Donor 6 nach Induktion einer osteogenen Differenzierung signifikante Mengen an Calcium extrazellulär abgelagert hatten.
Um festzustellen, ob die isolierten Zellen mineralisierte extrazelluläre Matrix gebildet hatten, wurde eine qualitative Bestimmung von extrazellulär abgelagertem Calcium durch Alizarin-Rot-Färbung durchgeführt. Hierzu wurden die kultivierten Zellschichten 42 Tage nach der Induktion der Differenzierung zweimal mit PBS im Überschuss gewaschen und anschließend mit vorgekühltem 70% Ethanol für 1 Stunde bei minus 20°C fixiert. Im Anschluß an einen kurzen Waschschritt mit H₂O wurde die Zelllage mit 40 mM Alizarin Rot (pH 4.2) für 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Absaugen von ungebundenem Farbstoff wurden die Zellen zweimal mit H₂O im Überschuss gewaschen und für die anschließende mikroskopische Analyse in PBS aufgenommen.
Die Ergebnisse der mikroskopischen Analyse zeigen (siehe 3), dass die ostengen differenzierten Zellen extrazelluläres Calcium abgelagert haben (3: rote Färbung des extrazellulären Calciums durch Alizarin Rot) und folglich eine funktionelle Reifung in Richtung Knochenzelle durchlaufen haben. Im Gegensatz dazu zeigen die nicht ostengen induzierten Zellen der Negativ-Kontrollansätze keine Differenzierung und keine Calciumablagerung.
Beispiel 6: Überprüfung des Verbleibs der isolierten und in vivo transplantierten Zellen im Gewebeverband
Um festzustellen, ob sich die isolierten Zellen nach der Injektion in den Organismus in den dort vorhandenen Gewebeverband integrieren, nicht von Makrophagen abgeräumt werden und sich zu reifen anderen Zelltypen ausdifferenzieren, wurde mit den gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC eine Nukleofektion (d. h. eine Transfektion mittels Elektroporation, bei der das genetische Material durch das Zytoplasma hindurch in den Zellkern eingeschleust wird) mit Green Fluorescent Protein (GFP) markierter Plasmid-DNA durchgeführt. Dabei wurde der Amaxa VPE-1001 Human MSC Nucleofector^® Kit und der Nucleofector 2b Apparat (beide erhältlich bei Lonza Köln GmbH, Köln, Deutschland) verwendet.
2 μg GFP-Plasmid-DNA wurden in Nukleofektorlösung auf Raumtemperatur gebracht. 500 μl Zellkulturmedium (z. B. Expansionsmedium, s. o.) wurden auf 37°C vorgewärmt. Die zu transfizierenden Zellkulturen wurden mit HBSS (Hank's buffered salt solution) gewaschen, HBSS wurde abgesaugt, und anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von Trypsin (s. o.) von der Kulturgefäßoberfläche und voneinander gelöst. Nach dem Abstoppen der Trypsinwirkung durch Trypsin-Neutralisierende Lösung (TNS) (z. B.: 0.105% Trypsin Inhibitor in PBS), wurde die Zellzahl bestimmt und Aliquots von jeweils 4 – 45 × 10⁵ ADSC bereitgestellt. Die Aliquots/Ansätze wurden 10 Minuten bei 200 × g zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und verworfen und das Pellet in 100 μl Nukleofektor-Lösung resuspendiert und mit 2 μg GFP-Plasmid-DNA gemischt. Die Mischung wurde in eine verschließbare Elektroporationsküvette überführt, die geschlossenen Küvette in das Nukleofektionsgerät eingesetzt, und ein geeignetes Elektroporationsprogrammes (z. B. C17 oder U23) gestarten. Nach Ende des Programms wurde der behandelten Zellmischung 500 μl vorgewärmtes Medium (z. B.
Expansionsmedium) zugegeben und diese Mischung in ein Zellkulturgefäß (z. B. eine 6 well-Platte) überführt.
Mit der Nukelofektion der ADSC wurde erreicht, dass das GFP-Plasmid in den Zellkern der ADSC integriert wurde und dort für das grün autofluoreszierende Protein GFP kodiert, so dass alle derart markierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop ein grüne Eigenfluoreszenz im Zellkern zeigen. Anhand dieser Eigenfluoreszenz können diese ADSC und auch ihre Abkömmlinge im Gewebeverband selbst zu einem späteren Zeitpunkt wieder gefunden werden. (Da das GFP natürlicherweise nicht in Säugetieren vorkommt, beweist die grüne Eigenfluoreszenz im Zellkern einer Zelle im Gewebe eines Säugerorganismus, dem zuvor erfindungsgemäß isolierte und mit dem GFP-Plasmid transfizierte ADSC verabreicht worden waren, dass die betreffende Zelle von einer dieser transplantierten ADSC abstammen muß.)
Durch Inkubation der identifizierten Zellen bzw. des sie enthaltenden Gewebes (z. B. in Form eines Gewebeschnittes) mit spezifischen Antikörpern gegen z. B. Gefäßzellen (z. B. CD31) kann festgestellt werden, zu welchem Zelltyp sich die ADSC zwischenzeitlich entwickelt (differenziert) hat.
Beispiel 7: Histologische Charakterisierung der isolierten ADSC
Zwecks Evaluierung der in Beispiel 6 gewonnenen Ergebnisse wurden im Tierversuch, bei dem ADSC in die Haut von Balb-c- Mäusen injiziert wurden, die gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC der Passage 4 dahingehend untersucht, ob die Zellen nach der Applikation an bestimmten Hautstellen auf den Applikationsbereich begrenzt bleiben und sich in den Gewebeverband integrieren und zu ortsständigen Zellen ausdifferenzieren, oder ob sie im Zuge einer Immunreaktion des Tieroranismus von Makrophagen entfernt werden, oder ob sie abwandern, d. h. in andere Körperregionen (Gewebe und Organe) migrieren, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen hervorgerufen werden könnten.
Außerdem wurde untersucht, ob die Applikation der ADSC neben einer Verdickung der Haut, die klinisch dokumentiert werden kann, auch strukturelle Veränderungen wie insbesondere eine Zunahme an Kollagen- und Elastinfasern hervorruft (bewirkt).
Für das Monitoring (die Beobachtung, Überwachung und Erfassung/Protokollierung) der applizierten Zellen in-vivo wurden die ADSC vor dieser Applikation mit dem Membran-Fluoreszenzmarker Chloromethyl-Benzamidodialkylcarbocyanin (CM-Dil) und/oder mit Green-fluorescent-Protein (GFP) markiert. Hierfür wurden die gemäß Beispiel 2B gewonnenen ADSC (gemäß Beispiel 1 bereitgestellte ADSC aus Primärisolaten wären ebenso gut einsetzbar gewesen) durch Behandlung mit 0,25%igem Trypsin-EDTA (Biochrom) vom Kulturgefäß und voneinander gelöst und bei Raumtemperatur und 250 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in modifiziertem Expansionsmedium resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Das modifizierte Expansionsmedium ist das Expansionsmedium gemäß Beispiel 1 ohne humanes Blutserum und ohne die Wachstumsfaktoren EGF und PDGF. Nach Zugabe von 20 μM CM-DiI (Vibrant CM-DiI, #V22888, Molecular Probes) wurde zunächst für 5 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend für weitere 15 Minuten unter konstantem langsamem Schütteln bei 40°C. Danach wurde die Zellsuspension bei Raumtemperatur und 250 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit glukosearmem DMEM (”DMEM low glucose”, 1 g/l D-glucose) zweimal gewaschen. Anschließend wurden die Zellen durch einen Filter mit 40 μm Maschenweite (z. B. BD Falcon^TM Cell Strainer) gefiltert, in dem o. g. modifizierten Expansionsmedium resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/100 μl eingestellt.
Die Tierversuche wurden gemäß den Vorschriften des Deutschen Tierschutzgesetzes, dem Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten der Ruprecht. Karls Universität Heidelberg, Deutschland durchgeführt.
Sechs Wochen alte weibliche BALBc AnN Nude Nacktmäuse mit einem Gewicht von ca. 20 g (von Firma Janvier, Europa) wurden unter Tag-Nacht-Bedingungen mit dem Rhythmus 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel gehalten und mit standardisiertem Hausfutter (z. B. ALS vendi) und Wasser ad libitum ernährt.
Für die Versuche würden zunächst auf der Rückenhaut der Mäuse spiegelbildlich jeweils rechts und links der Wirbelsäule die Ecken eines 1 × 1 cm großen quadratischen Hautareals mit schwarzer Tinte eintätowiert.
Eine Woche später wurden acht Million ADSC in 100 μl DMEM, hergestellt gemäß Beispiel 2B, intradermal in das linke Hautareal injiziert und ein äquivalentes Volumen an reinem DMEM zur Kontrolle in das rechte Hautareal injiziert. Die Injektion der Gesamtmenge an ADSC erfolgte in Form von mehreren Injektionen kleiner Teilmengen in parallelen Reihen um eine homogene, flächige plane Verteilung der Zellen in dem gesamten Hautareal zu erreichen.
Die Mäuse wurden willkürlich in drei Gruppen unterteilt, wobei jede Gruppe eine andere Konzentration an ADSC injiziert bekam: Gruppe I erhielt 1 × 10⁶ Zellen, Gruppe II erhielt 4 × 106 Zellen und Gruppe III erhielt 8 × 10⁶ Zellen, jeweils in 400 μl DMEM und jeweils pro linkes Hautareal injiziert. In das korrespondierende rechte Hautareal wurden als Kontrolle jeweils 400 μl DMEM injiziert.
Ab Woche 2 nach der Injektion wurde wöchentlich die Hautdicke mittels Caliper-Technik bestimmt. Der hierbei verwendete Caliper (Pocket Thickness Gauge 0–10 mm, Firma Holex) hat einen Messbereich von 0–10 mm. Die Messung wurde an einer Hautfalte durchgeführt. Dazu wurde die Haut des Hautareals von der Muskulatur abgehoben und mit standardisiertem Druck zu einer Falte zusammengedrückt. Die Dicke dieser Hautfalte wurde zweimal nacheinander bestimmt und daraus der Mittelwert gebildet. Diese Mittelwerte wurden mit den entsprechend gewonnenen Werten der gegenüberliegenden Seite (Kontrollwerten) verglichen. Die injizierten Areale der Haut wurden im vorderen und hinteren Arealbereich getrennt vermessen.
Zwei, vier, acht, 16 Wochen und 12 Monate nach der Zellinjektion wurden jeweils sieben Mäuse getötet und die behandelten Hautareale operativ herausgeschnitten. Diese wurden histologisch hinsichtlich Kollagen- und Elastingehalt, Verteilung der injizierten ADSC und Hautdicke analysiert. Zufällig ausgewählten getöteten Tieren der Gruppe III wurden außerdem Leber, Milz und Lunge entnommen um eine etwaige Translokation der. ADSC in diese Organe zu überprüfen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 6 und 7 dargestellt. Sie zeigen, dass nach einer (d7), zwei (d12, d14/15), sechs (d42/43), acht (d56/57), 13 (d91) und 14 Wochen (d98/99) die Hautdicke in den mit ADSC behandelten Hautarealen statistisch signifikant dicker war als in den Kontroll-Hautarealen (p = 0,038 – <0,001). Die Kontroll-Hautareale waren zu keinem Zeitpunkt signifikant dicker als die mit ADSC behandelten Hautareale.
Beispiel 8: Verabreichung der ADSC an ein Subjekt
Für die Verabreichung der ADSC an ein Subjekt können sowohl Primärisolate gemäß Beispiel l als auch die expandierten unpassagierten oder die expandierten und passagierten ADSC gemäß Beispiel 2 verwendet werden, und zwar entweder frisch hergestellt, d. h. direkt nach der Primärisolation bzw. nach der einfachen Expansion bzw. nach Expansion und Passagierung, oder nach einer Aufbewahrung im tiefgefrorenen (kryokonservierten) Zustand.
Vor der Verabreichung werden die Zellen gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Beispiele 3 bis 7 charakterisiert. Zusätzlich können die Zellen noch in verschiedene Richtungen vordifferenziert werden, z. B. wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben. Die Verabreichung der ADSC an ein Subjekt erfolgt generell durch Applikation an die betreffenden Hautstellen des Subjekts (Lokaltherapie).
(A) Verabreichung durch Injektion der ADSC in oder unter die Haut
Von den erfindungsgemäß isolierten und/oder expandierten und/oder passagierten ADSC werden Aliquots hergestellt, die aus beispielsweise etwa Hunderttausend (10) bis 50 Millionen (50 × 10⁶) Zellen in beispielsweise 500 μl Injektionslösung bestehen. Als Injektionslösung kommen insbesondere autologes oder allogenes Blutserum oder Ringerlösung in Betracht.

(a) Zunächst wird zwecks Glättung von Falten und Erhalt einer strammen Oberfläche das betreffende Hautareal beispielsweise entweder mit zwei Finger vorsichtig auseinander gezogen oder durch Besprühen oder Betupfen mit Alkohol zum Aufquellen gebracht.
(b) Eine Spritze wird mit der ADSC-Suspension befüllt und mit einer Injektionsnadel von beispielsweise 24- oder 26-gauge gekoppelt. Die Nadel wird oberflächennah in die Haut eigeführt. Eine intradermale Injektion wird erreicht, indem der Spritzenkolben so lange leicht gedrückt wird (und dadurch die Zellen injiziert werden), bis eine leichte Bleiche der Haut oder eine leichte Hauterhebung im Sinne einer leichten Quaddel sichtbar wird. Die gleiche Injektion wird ein- bis. mehrmals wiederholt. Dabei wird von derselben Einstichstelle in der Oberhaut ausgehend in einem quasi Tunnel entweder kontinuierlich oder in mehreren kleinen perlschnurartig aufgereihten Depots injiziert. Es kann auch fächerförmig von derselben Einstichstelle aus ein größeres Areal unterspritzt werden, nämlich über eine Mehrzahl fächerförmig angelegter Tunnel, die wiederum kontinuierlich oder mit seriellen Depots befüllt werden.
(c) Zwecks Vergrößerung der Lippen erfolgte die Vorbehandlung für die Injektion wie vorstehend unter (a) beschrieben. Die Injektion erfolgt vorzugsweise intradermal oder subkutan. Hierdurch sind starke Schmerzen, Mundbewegungstörungen oder Störungen beim Mundschluss praktisch ausgeschlossen
(d) Zwecks Glättung tieferer Falten oder sonstiger Unebenheiten der Haut erfolgt die Vorbehandlung für die Injektion wie vorstehend unter (a) beschrieben. Die Injektion selbst erfolgt, indem die Nadel in das subkutane Gewebe oder tief dermal eingeführt und die Zellen dorthin eingespritzt werden. Die gleiche Injektion wird mehrfach in Serien durchgeführt.

(B) durch Applikation auf die Hautoberfläche
Für eine topische Applikation der ADSC auf der Haut werden die ADSC in Form einer Suspension oder Lotion oder Creme oder Salbe (insbesondere als Hydrogel) oder einer anderen Flüssigkeit bereitgestellt. Hierfür werden die erfindungsgemäß isolierten und/oder expandierten und/oder passagierten ADSC in Aliquots portioniert, die aus beispielsweise etwa 10 bis 50 Millionen (50 × 10⁶) Zellen bestehen.
Diese Aliquots werden mit einer pharmazeutisch und physiologisch akzeptablen Träger-Suspension oder -Lotion oder -Creme oder einer äquivalenten anderen Träger-Flüssigkeit gemischt.
Diese Mischung wird mehrmals in zeitlichem Abstand von Stunden oder Tagen oder Wochen auf die betreffenden Hautstellen aufgetragen. Durch zusätzliche mechanische Einwirkung kann das Eindringen in und durch die Hautschichten gefördert werden (z. B. durch multiple Mikroinjektionen ”Needling”).
Beispiel 9: Anwendung an humanen Probanden
Probanden werden Aliquots mit 20 Millionen (20 × 10⁶) Zellen pro 500 μl autologem Blutserum ihrer gemäß Beispiel 2B isolierten, expandierten und passagierten ADSC wie folgt appliziert:

(A) Bei einer Gruppe von Probanden wird zunächst zwecks Glättung von Falten und Erhalt einer strammen Oberfläche das betreffende Hautareal mit zwei Fingern vorsichtig auseinander gezogen. Anschließend wird eine mit der autologen ADSC-Suspension befüllte Spritze mit einer 24- oder 26-gauge Injektionsnadel gekoppelt, und die Nadel wird oberflächennah in die Haut eingeführt. Für eine intradermale Injektion wird der Spritzenkolben so lange leicht gedrückt und dabei die Zellen injiziert, bis eine leichte Bleiche der Haut oder eine leichte Hauterhebung (Quaddel) sichtbar wird. Die gleiche Injektion wird ein- bis mehrmals wiederholt, wobei von derselben Einstichstelle in der Oberhaut ausgehend fächerförmig mehrere ADSC-Depots injiziert werden.
(B) Bei einer anderen Gruppe von Probanden wird die ADSC-Suspension topisch appliziert, nämlich in Form eines Hydrogels (einer Hydrogel-Salbe) auf die Haut aufgebracht.

Hierfür werden von der ADSC-Suspension Aliquots mit 50 Millionen (50 × 10⁶) Zellen pro 500 μl Suspension hergestellt und mit einem pharmazeutisch und physiologisch akzeptablen Hydro-Gel (z. B. hochdisperses Siliziumdioxyd wie beispielsweise Aerosil^®) als Carrier gemischt.
Das ADSC-haltige Hydrogel wird mehrfach im Abstand von jeweils 24 Stunden auf die betreffenden Haustellen aufgetragen.
Durch mechanische Einwirkung wie beispielsweise Klopfen mit den Fingern wird das Eindringen in und durch die Hautschichten gefördert/unterstützt.
Literaturzitate:

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Claims

Verwendung von Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) zur Herstellung eines Mittels für die Verwendung in einem kosmetischen Verfahren zur kosmetischen Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen primär isolierte oder expandierte oder expandierte und passagierte humane autologe oder allogene ADSC sind, die die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen und mit monoklonalen Anti-CD73- und Anti-CD90-Antikörpern eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und die frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind und mit monoklonalen Anti-CD45-Antikörpern keine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und die kryokonservierbar sind, dass die Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen sind, dass das Mittel frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist, und dass das Mittel frei von Hyaluronsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen wenigstens einmal, vorzugsweise zweimal (2x) passagierte humane autologe oder allogene ADSC sind und zusätzlich eines oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 aufweisen und/oder frei von dem Oberflächen-Antigen CD34 sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die ADSC durch Art und Reihenfolge der folgenden Maßnahmen erhalten worden sind: (a) Gewinnung von subkutanem Fettgewebe (b) Aufschluss des Gewebes zu Einzelzellen und/oder Einzelzell-Konglomeraten in Suspension (e) Filtrierung der gewonnenen Suspension durch einen Filter mit Maschenweite von 20 μm bis 300 μm, (f) Zentrifugieren des in (e) gewonnenen Filtrats für 1 bis 15 Minuten bei 4°C bis 40°C und 120 × g bis 2300 × g, (i) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in autologem oder allogenem Blut-Serum oder -Plasma oder anderen autologen oder allogenen Blutbestandteilen oder Zellkulturmedium oder in hierzu homologen humanhistokompatiblen Flüssigkeiten, jeweils mit oder ohne Zusätze(n) an humanem Blut-Serum und/oder -Plasma und/oder humanen Wachstumsfaktoren, humanen Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika, wobei die Schritte (a) bis (i) ohne Einsatz von fötalem Kälberserum (FCS) oder bovinem Serumalbumin (BSA) oder anderen nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die nach Schritt (i) vorliegenden ADSC in einem Kulturmedium expandiert und/oder passagiert worden sind, das 0% bis 50%, vorzugsweise 0% bis 25%, weiter vorzugsweise 0% bis 10% und besonders bevorzugt 0% bis 2% menschliches autologes oder allogenes Serum enthält.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel eine Suspension zur Injektion in die Haut oder Unterhaut des Subjekts umfasst, wobei diese Suspension autologes humanes Serum enthält und frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der kosmetische oder ästhetische Defekt eine Hautfalte, ein Dehnungsstreifen, eine abgesenkte Narbe, eine kutane oder subkutane Vertiefung nicht-traumatischen Ursprungs oder eine Unterentwicklung der Lippe ist.
Verwendung von Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC) zur Herstellung eines Mittels für die Verwendung in einem therapeutischen und/oder chirurgischen Verfahren zur rekonstruktiven Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen und/oder funktionellen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen primär isolierte oder expandierte oder expandierte und passagierte humane autologe oder allogene ADSC sind, die die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen und mit monoklonalen Anti-CD73- und Anti-CD90-Antikörpern eine positive Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und die frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind und mit monoklonalen Anti-CD45-Antikörpern keine Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion zeigen, und die kryokonservierbar sind, dass die Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen sind, dass das Mittel frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist, und dass das Mittel frei von Hyaluronsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen wenigstens einmal, vorzugsweise zweimal (2x) passagierte humane autologe oder allogene ADSC sind und zusätzlich eines oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, CD105 und CD166 aufweisen und/oder frei von dem Oberflächen-Antigen CD34 sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die ADSC durch Art und Reihenfolge der folgenden Maßnahmen erhalten worden sind: (a) Gewinnung von subkutanem Fettgewebe (b) Aufschluss des Gewebes zu Einzelzellen und/oder Einzelzell-Konglomeraten in Suspension (e) Filtrierung der gewonnenen Suspension durch einen Filter mit Maschenweite von 20 μm bis 300 μm, (f) Zentrifugieren des in (e) gewonnenen Filtrats für 1 bis 15 Minuten bei 4°C bis 40°C und 120 × g bis 2300 × g, (i) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in autologem oder allogenem Blut-Serum oder -Plasma oder anderen autologen oder allogenen Blutbestandteilen oder Zellkulturmedium oder in hierzu homologen humanhistokompatiblen Flüssigkeiten, jeweils mit oder ohne Zusätze(n) an humanem Blut-Serum und/oder -Plasma und/oder humanen Wachstumsfaktoren, humanen Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika, wobei die Schritte (a) bis (i) ohne Einsatz von fötalem Kälberserum (FCS) oder bovinem Serumalbumin (BSA) oder anderen nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die nach Schritt (i) vorliegenden ADSC in einem Kulturmedium expandiert und/oder passagiert worden sind, das 0% bis 50%, vorzugsweise 0% bis 25%, weiter vorzugsweise 0% bis 10% und besonders bevorzugt 0% bis 2% menschliches autologes oder allogenes Serum enthält.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel eine Suspension zur Injektion in die Haut oder Unterhaut des Subjekt umfasst, wobei diese Suspension autologes humanes Serum enthält und frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Defekt eine Hautfalte, ein Dehnungsstreifen, eine abgesenkte Narbe, eine kutane oder subkutane Vertiefung nicht-traumatischen Ursprungs, eine Unterentwicklung der Lippe oder ein anderer kosmetischer oder ästhetischer Defekt ist.
Humane autologe oder allogene Stammzellen aus Fettgewebe (engl.: ”adipose tissue derived stem cells”, kurz ADSC), die die Oberflächen-Antigene CD73 und CD90 aufweisen und frei von dem Oberflächen-Antigen CD45 sind, die primär isoliert sind oder expandiert sind oder expandiert und passagiert sind, wobei Isolationsmedien, Expansionsmedien, Passagierungsmedien, Waschmedien und sonstige angewendete Inkubationslösungen frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen sind, die kryokonservierbar sind, die frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen und frei von Hyaluronsäure sind, geeignet zur Behandlung von Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts.
Humane Stammzellen gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen wenigstens einmal, vorzugsweise wenigstens zweimal (2x) passagierte humane autologe oder allogene ADSC sind und zusätzlich eines oder mehrere der Oberflächen-Antigene CD13, CD44, CD49a, CD63, 105 und CD166 aufweisen und/oder frei von dem Oberflächen-Antigenen CD34 sind.
Humane Stammzellen gemäß Anspruch 13 oder 14 in Form einer injizierbaren Suspension, die frei von Hyaluronsäure und frei von fötalem Kälberserum (FCS) und bovinem Serumalbumin (BSA) und anderen nicht-humanen Fremdproteinen ist.
Humane. Stammzellen gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen durch Art und Reihenfolge der folgenden Maßnahmen erhältlich sind: (a) Gewinnung von subkutanem Fettgewebe (b) Aufschluss des Gewebes zu Einzelzellen und/oder Einzelzell-Konglomeraten in Suspension (e) Filtrierung der gewonnenen Suspension durch einen Filter mit Maschenweite von 20 μm bis 300 μm, (f) Zentrifugieren des in (e) gewonnenen Filtrats für 1 bis 15 Minuten bei 4°C bis 40°C und 120 × g bis 2300 × g, (i) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in autologem oder allogenem Blut-Serum oder -Plasma oder anderen autologen oder allogenen Blutbestandteilen oder Zellkulturmedium oder in hierzu homologen human-histokompatiblen Flüssigkeiten, jeweils mit oder ohne Zusätzen) an humanem Blut-Serum und/oder -Plasma und/oder humanen Wachstumsfaktoren, humanen Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika, (k) Nachweis des Vorhandenseins der Oberflächenmoleküle CD73 und CD90 und des Nichtvorhandenseins des Oberflächenmoleküls CD45, wobei die Schritte (a) bis (i) ohne Einsatz von fötalem Kälberserum (FCS) oder bovinem Serumalbumin (BSA) oder anderen nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt werden.
Humane Stammzellen gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt (1) der Nachweis des Differenzierungspotentials der Zellen in Adipozyten und/oder Osteoblasten und/oder Chondrozyten erfolgt.
Humane Stammzellen gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die nach Schritt (e) oder (i) vorliegenden ADSC in einem Kulturmedium expandiert und/oder passagiert worden sind, das 0% bis 50%, vorzugsweise 0% bis 25%, weiter vorzugsweise 0% bis 10% und besonders bevorzugt 0% bis 2% menschliches autologes oder allogenes Serum enthält.
Kit für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von kosmetischen und/oder ästhetischen und/oder funktionellen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, umfassend: (a) eine Injektionsapparatur, geeignet für eine Injektion in die Subkutis und/oder Dermis und/oder Epidermis der menschlichen Haut, (b) humane Stammzellen gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18 und (c) eine pharmazeutisch und/oder physiologisch akzeptable Trägerlösung.
Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung für die kosmetische oder therapeutische Behandlung von Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte (a) Gewinnung von subkutanem Fettgewebe (b) Aufschluss des Gewebes zu Einzelzellen und/oder Einzelzell-Konglomeraten in Suspension (e) Filtrierung der gewonnenen Suspension durch einen Filter mit einer Maschenweite von 20 μm bis 300 μm, (f) Zentrifugieren des in (e) gewonnenen Filtrats für 1 bis 15 Minuten bei 4°C bis 40°C und 120 × g bis 2300 × g, (i) Resuspendierung des in (f) erhaltenen Pellets in autologem oder allogenem Blut-Serum oder -Plasma oder anderen autologen oder allogenen Blutbestandteilen oder Zellkulturmedium oder in hierzu homologen human-histokompatiblen Flüssigkeiten, jeweils mit oder ohne Zusätzen) an humanem Blut-Serum und/oder -Plasma und/oder humanen Wachstumsfaktoren, humanen Hormonen, Spurenelementen, Vitaminen, Antibiotika, Antimykotika, (k) Nachweis des Vorhandenseins der Oberflächenmoleküle CD73 und CD90 und des Nichtvorhandenseins des Oberflächenmoleküls CD45, wobei die Schritte (a) bis (i) ohne Einsatz von fötalem Kälberserum (FCS) oder bovinem Serumalbumin (BSA) oder anderen nicht-humanen Fremdproteinen durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt (1) der Nachweis des Differenzierungspotentials der Zellen in Adipozyten und/oder Osteoblasten und/oder Chondrozyten erfolgt.
Zubereitung für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung. von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, erhältlich mit einem Verfahren nach Anspruch 20 oder 21.
Zubereitung für die kosmetische und/oder therapeutische Behandlung von kosmetischen oder ästhetischen Defekten in der Haut oder Unterhaut eines Subjekts, bestehend aus humanen Stammzellen gemäß einem der Ansprüche 13 – bis 18 und einem pharmazeutisch und/oder physiologisch akzeptablen Träger.