KR102344674B1 - 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물 - Google Patents
8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102344674B1 KR102344674B1 KR1020200032016A KR20200032016A KR102344674B1 KR 102344674 B1 KR102344674 B1 KR 102344674B1 KR 1020200032016 A KR1020200032016 A KR 1020200032016A KR 20200032016 A KR20200032016 A KR 20200032016A KR 102344674 B1 KR102344674 B1 KR 102344674B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- organ
- composition
- treatment
- oh8dg
- preservation solution
- Prior art date
Links
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 119
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 title claims abstract description 104
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims abstract description 33
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000162 organ preservation solution Substances 0.000 claims description 83
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 41
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 239000000082 organ preservation Substances 0.000 claims description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 claims description 10
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 claims description 10
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 claims description 7
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 38
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 abstract description 15
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 31
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 description 24
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 24
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 11
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 11
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 11
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 11
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 7
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- -1 OCT compound Chemical class 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012349 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling Methods 0.000 description 3
- VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-2',7'-dichloro-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(OC(=O)C)=C1 VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940099584 lactobionate Drugs 0.000 description 2
- JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N lactobionic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FECNVDHIIJYRIA-UHFFFAOYSA-N 2-oxopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O.OC(=O)CCC(=O)C(O)=O FECNVDHIIJYRIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-2-[2-(5-methoxy-2-nitrosophenyl)ethyl]-1-nitrosobenzene Chemical compound COC1=CC=C(N=O)C(CCC=2C(=CC=C(OC)C=2)N=O)=C1 YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 108091006671 Ion Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000037862 Ion Transporter Human genes 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700042768 University of Wisconsin-lactobionate solution Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 1
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229950001002 cianidanol Drugs 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000012841 histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002727 hyperosmolar Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A01N1/021—
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
- A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
본 발명은 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물에 관한 것으로, 상기 8-옥소-2'-디옥시구아노신은 장기보존액과 함께 사용 시에, 장기조직 세포의 활성산소 증가를 억제하고, 세포사멸인자인 Bcl-2, P-53 및 BAX의 발현을 억제하고, 세포사멸 정도를 감소시켜, 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 세포, 조직, 기관 또는 장기를 보존하는 조성물이다.
장기이식을 위해 장기를 적출하면, 장기를 이식할 때까지 적출된 장기는 혈액 공급이 중단되므로 허혈에 노출된다. 허혈에 노출되었던 장기가 이식수술이 끝나서 혈액을 재공급받게 되면, 오히려 허혈에 노출된 때보다 활성산소가 다량 생성되어 조직 손상을 유발하여, 장기이식수술의 경과가 나빠지는 문제가 발생할 수 있다. 이렇게 이식된 장기에 손상이 발생하는 기전을 허혈-재관류 손상이라고 하며, 근본적인 손상원인은 허혈 후 재관류가 시작되면서, 허혈에 노출된 동안 낮아진 세포 내 산도를 정상으로 돌리기 위해 세포막의 다양한 이온채널이 과작동되기 때문이다.
구체적으로, 허혈에 노출된 동안에는 ATP 공급이 중단되어, ATP를 이용하여 작동하는 Na+/K+ 펌프의 활성이 떨어지고, 이로 인해 세포 내 Na+ 농도가 높아지면서 보상적으로 세포 내 Ca2 + 유입이 증가되어, 세포 내 Ca2 + 농도가 높은 상태가 된다. 장기이식수술이 끝나고 혈액을 재공급하여, 허혈이 중단되고 재관류가 시작되면, 세포 내 Ca2 + 농도를 낮추기 위해 다양한 이온채널이 과작동하게 된다. 이때, 이온채널 과작동으로 인해, 활성산소가 급격하게 증가하여, 이식된 장기에서 세포 손상이 발생하는 것이다(J Cardiovasc Electrophysiol 2006: 17: S134-S140).
이러한 허혈-재관류 손상을 줄이기 위해 다양한 장기 보존 방법이 사용되고 있다. 가장 많이 사용되고 있는 방법은, 이식대상인 장기에 장기보존액을 투여하고, 적출 후에도 장기보존액에 보관하였다가 이식수술에 사용하는 것이다. 이때, 장기보존액은 장기조직의 산소소모량을 줄여 세포 손상을 최소화하기 위해, 온도를 4℃ 정도로 낮추어 사용한다.
다양한 종류의 장기보존액이 사용되고 있는데, 대부분 허혈-재관류 손상을 줄이기 위해 세포의 산도를 조절할 수 있는 buffer(완충제)가 들어 있거나, 재관류 후 과작동하는 이온채널의 활성을 조절하기 위해, Na+의 농도를 낮추거나 K+ 농도를 높인 용액을 사용한다. 대표적인 장기보존액의 예로 HTK(Histidinetryptophan-ketoglutarate) 용액이 있는데, 다른 장기보존액에 비해 비교적 낮은 농도인 10 mEq/L의 칼륨을 함유하며, 생물학적 완충제인 histidine 및 histidine hydrochloride를 사용하여 혈액보다 우수한 완충능을 제공한다.
하지만, 현재 시판되고 있는 장기보존액으로는 허혈-재관류 손상에 관여하는 다양한 이온채널들을 한꺼번에 제어할 수 없으며, 산도 조절도 완벽하지 않다. 특히 저온의 장기보존액을 사용하게 되면, 오히려 Na+/K+ 펌프의 손상을 유발함으로써, 이온채널 기능이상으로 인해 활성산소 생성이 촉진되어 장기조직 손상이 가중될 수 있다. 또한, HTK 용액도 허혈-재관류 손상이 일어나는 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 종래의 장기보존액에서는 장기손상 방지작용이 충분하지 아니하여, 본 발명자들은 장기이식수술 시에 유용한 장기손상 방지용 조성물을 제공하고자 연구하였다. 그 결과, 8-옥소-2'-디옥시구아노신이 장기보존액과 함께 사용시에, 장기조직 세포의 활성산소 증가를 억제하고, 세포사멸인자인 Bcl-2, P-53 및 BAX의 발현을 억제하고, 장기조직 세포의 세포사멸 정도를 감소시키는 효과가 있는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 허혈-재관류 손상으로 인한 장기손상을 방지하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고농도 K+를 포함하는 장기보존액의 사용에 따라 발생하는 장기손상을 방지할 수 있는 조성물 및 상기 장기보존액을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 측면은, K+를 포함하는 장기보존액에 8-옥소-2'-디옥시구아노신이 첨가된 장기보존액의 형태로 상기 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 측면은, 장기보존액 및 상기 조성물을 포함하는 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명에 따른 8-옥소-2'-디옥시구아노신은 장기보존액과 함께 사용 시에, 장기조직 세포의 활성산소 증가를 억제하고, 세포사멸인자인 Bcl-2, P-53 및 BAX의 발현을 억제하고, 세포사멸 정도를 감소시켜, 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(위 사진) 또는 간(아래 사진) 조직세포 내 활성산소 변화를 측정한 공촛점 현미경 사진이다.
도 2는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내 활성산소 변화 측정 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 4는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 6은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 8은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 10은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 간 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 11은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내 활성산소 변화 측정 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 4는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 6은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 8은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 10은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 간 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 11은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은,
8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물을 제공한다.
장기이식을 위해 장기를 적출하면, 장기를 이식할 때까지 적출된 장기는 혈액 공급이 중단되므로 허혈에 노출된다. 허혈에 노출되었던 장기가 이식수술이 끝나서 혈액을 재공급받게 되면, 허혈에 노출된 동안 낮아진 세포 내 산도를 정상으로 돌리기 위해 세포막의 다양한 이온채널이 과작동되므로, 활성산소가 다량 생성되어 조직 손상을 유발하는 허혈-재관류 손상이 발생할 수 있다.
이에 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지를 위하여, 상기 조성물을 장기보존액과 함께 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 조성물을 장기보존액과 함께 사용 시에, 장기조직 세포의 활성산소 증가를 억제하고, 세포사멸인자인 Bcl-2, P-53 및 BAX의 발현을 억제하고, 세포사멸 정도를 감소시킴으로써 장기손상을 방지할 수 있다.
한편, 장기보존액과 함께 사용되는 경우에 상기 8-옥소-2'-디옥시구아노신(oh8dG)의 농도는 1 내지 1000 μg/mL, 3 내지 700 μg/mL, 6 내지 400 μg/mL, 10 내지 100 μg/mL, 50 내지 150 μg/mL 또는 90 내지 110 μg/mL일 때에 장기손상을 방지할 수 있으나, 이는 예시일뿐, 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 장기보존액의 종류는 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate), 유로-콜린(Euro-Collins)액, UW액(Jamieson, N.V. et al., Transplantation, 46:517(1988)) 또는 콜린스액((Collins et al., Lancet, 2:1219(1969))일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
HTK는 히스티딘 (histidine), 트립토판 (tryptophan), 케토글루타레이트 (α-ketoglutarte)를 주성분으로 하는 결정성 심정지액으로 알려져있는데, 심장수술 시의 심정지액으로서 뿐만이 아니라, 심장, 신장, 간, 췌장 등의 장기 이식수술에서 장기보존액으로서의 효과도 우수한 것으로도 알려져있다.
상기 장기보존액의 사용량은 장기이식수술을 받는 사람의 나이, 체중, 질환의 경중 등의 요인에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 10 mL/minute/장기무게(g), 0.3 내지 7 mL/minute/장기무게(g), 0.5 내지 4 mL/minute/장기무게(g), 0.8 내지 2 mL/minute/장기무게(g), 0.2 내지 3 mL/minute/장기무게(g) 또는 0.7 내지 8 mL/minute/장기무게(g)일 수 있으나, 이는 예시일뿐, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 장기이식수술을 위한 장기적출 이후 재관류로 인한 장기조직의 손상을 방지할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 장기는 신장 또는 간일 수 있다.
나아가, 상기 조성물은 장기보존액과 동시적으로 처리할 수 있는데, 본 발명의 실험예에서는 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate) 용액과 8-옥소-2'-디옥시구아노신(oh8dG)이 함께 사용된 바 있다(실험예 1 내지 실험예 5 참조).
또한 상기 조성물 및 장기보존액을 동시에 처리하는 것은 구체적으로, 장기에 혈액을 공급하는 주혈관을 통해 상기 조성물 및 장기보존액을 주입한 후에, 장기이식수술 전까지 상기 조성물 및 장기보존액에 장기를 담그는 것이다.
그리고 상기 조성물은 K+를 포함하는 장기보존액에 8-옥소-2'-디옥시구아노신이 첨가된 장기보존액일 수 있고, 여기서 K+의 농도는 1 내지 100 mM, 3 내지 70 mM, 5 내지 40 mM, 7 내지 20 mM, 4 내지 50 mM 또는 6 내지 80 mM일 수 있으나, 이는 예시일 뿐, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 K+를 포함하는 장기보존액은 Na+, Mg2 +, Ca2 +, 히스티딘(histidine), 트립토판(tryptophan), 케토글루타르산(Ketoglutarate), 만니톨(mannitol)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 활성산소의 증가를 억제하는 효과가 우수하여, 활성산소로 인한 장기조직의 손상을 막을 수 있다.
본 발명의 일 실험예에서 쥐의 신장과 간을 분리한 후, HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리하면, HTK만 처리한 경우보다 분리된 신장 또는 간의 활성산소 증가가 억제되는 것을 확인하였으므로, 이를 통해 상기 조성물이 장기조직의 손상을 방지할 수 있음을 알 수 있다(실험예 1, 도 1 및 도 2 참조).
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 장기조직 세포의 이온수송체 활성을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있다.
장기이식수술이 끝나고 혈액을 재공급하여, 허혈이 중단되고 재관류가 시작되면, 세포 내 Ca2 + 농도를 낮추기 위해 다양한 이온채널이 과작동하게 된다. 이때, 이온채널 과작동으로 인해, 활성산소가 급격하게 증가하여, 이식된 장기에서 세포가 손상된다.
또한, 본 발명의 일 실험예에서 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우, 분리된 신장 또는 간의 활성산소 증가가 억제되는 것을 확인하였으므로, 상기 이온채널 과작동을 억제하고 활성을 감소시켰음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 P-53, BAX 및 COX-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 감소시킬 수 있다.
장기조직 세포가 장기보존액에 노출되면 세포사멸인자들의 발현이 증가하는데, 이를 억제하면 장기조직 세포의 사멸을 줄여 장기손상을 방지할 수 있음이 알려져있다.
본 발명의 일 실험예에서 HTK만 처리되는 경우보다 HTK와 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리한 경우에, 신장 또는 간 조직 세포의 세포사멸인자인 Bcl-2, P-53 또는 BAX의 RNA 발현정도가 감소하는 것을 확인하였다(실험예 2, 도 3 및 도 4 참조).
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 섬유화인자 증가 우려가 발생하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실험예에서 HTK만 처리되는 경우 및 HTK와 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리한 경우, 모두 CTGF의 RNA 발현정도 및 단백질 발현정도가 비슷하였으므로, 부작용으로서 섬유화증가 우려가 없음을 확인하였다(실험예 3, 실험예 4, 도 5 내지 8 참조).
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물은 세포사멸 정도를 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실험예에서 세포사멸의 확인방법인 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) assay를 수행하였는데, 대조군인 분리 직후로서 약물 처리가 없는 경우 및 HTK만 2시간 처리한 경우보다 HTK 2시간 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우에, 신장 또는 간 조직 세포의 DNA fragmentation 정도, 즉 세포사멸 정도가 감소함을 확인하였다(실험예 5, 도 9 내지 도 11 참조).
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물이, 장기조직의 손상을 방지할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 측면은,
장기보존액 및 상기 장기손상 방지용 조성물을 포함하는 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트를 제공한다.
상기 장기보존용 키트는 장기이식수술 시에 장기보존액 사용으로 인한 장기손상의 방지를 위해, 장기보존액 및 상기 조성물을 함께 사용할 수 있도록 하는 키트이다.
여기서 장기보존액, 상기 조성물, 장기손상에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
또한 장기보존액 및 상기 조성물은 동시적으로 처리할 수 있는데, 본 발명의 일 실험예에서는 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate)와 8-옥소-2'-디옥시구아노신(oh8dG)이 함께 사용된 바 있다.
나아가 장기보존액과 상기 조성물이 혼합되어 처리될 수 있다.
상기 조성물은 활성산소의 증가를 억제할 수 있다.
상기 조성물은 P-53, BAX 및 COX-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 감소시킬 수 있다.
상기 장기는 신장 또는 간일 수 있다.
상기 조성물은 세포사멸 정도를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 "장기"는 본 발명의 조성물이 적용되는 대상을 구체적으로 표현한 것일 뿐이며, 본 발명의 조성물은 좁은 의미의 장기 이외에도 좁은 의미의 장기의 일부분, 조직 그리고 조직의 일부분, 세포의 보존에도 적용된다. 따라서 본 발명의 이식용 장기 보존액과 관련하여 이용되는 용어 "장기"는 상기한 좁은 의미의 장기 및 이의 일부, 조직 그리고 조직의 일부분을 포함하는 포괄적인 의미로 해석된다. 상기 조직으로서는, 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 상피조직, 결합 조직, 근육조직, 신경 조직 등이 포함된다. 또한, 상기 좁은 의미의 장기로서는, 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 피부, 혈관, 각막, 신장, 심장, 간장, 탯줄, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장, 뇌, 사지 말초, 망막 등이 포함된다.
본 발명의 조성물은 장기가 체외에서 보관되는 경우에, 장기에 가해지는 각종 스트레스로 인한 손상을 방지하는 효과를 갖는 물질을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 동물 또는 사람의 각종 장기를 이식하는 외과적인 수술 과정에 있어, 이들 장기가 체외에서 보관 후에 이식되는 단계를 거치게 되면, 허혈-재관류에 의한 손상을 받게 되기 때문에, 이를 방지하기 위하여 삼투압 조절제뿐만 아니라, 장기 손상을 가져오는 중요한 요인 중 하나인 ATP(adenosine 5'-triphosphate) 결여 (depletion)를 방지하는 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate) 공급원, 허혈-재관류에 의해 산화성 스트레스를 억제하는 항산화제 및 전해질 이온, 항생제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 또한, 장기 보존능을 더욱 향상시키기 위하여 호르몬, 성장인자, 효소 또는 천연 추출물을 더 포함할 수 있다.
상기 삼투압 조절제는 고삼투압(hyperosmolar)을 유도하며, 장기의 냉장 보관에서 자주 발견되는 세포 부종 (cell oedema)을 억제하는 작용을 하고, 포도당(glucose), 락토비오네이트(lactobionate), 라피노즈(raffinose), 하이드록시에틸 전분(Hydroxyethyl starch), 수크로즈(Sucrose), 글루코네이트(Gluconate), 또는 만니톨(Mannitol)을 사용할 수 있으나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 사용할 수 있는 삼투압 조절제라면 특별히 제한되지 않는다.
삼투압 조절제의 사용량은, 하이드록시에틸 전분이 이용되는 경우에는 20 내지 70 g/L, 락토바이오네이트가 이용되는 경우에는 60 내지 120 mM, 라피노오스가 이용되는 경우에는 10 내지 50 mM이 바람직하나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 적용할 수 있는 사용량이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate) 공급원은 포도당(glucose), 아데노신(adenosine) 또는 알파-케토글루타레이트(α-Ketoglutarate)일 수 있으나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 사용할 수 있는 아데노신 트리포스페이드 공급원이라면 특별히 제한되지 않는다.
아데노신 트리포스페이트 공급원의 사용량은. 아데노신이 이용되는 경우에는 1 내지 20 mM, 알파-케토글루타레이트가 사용되는 경우에는 1 내지 20 mM이 바람직하나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 적용할 수 있는 사용량이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 항산화제는 플라보노이드(Flavonoid), 글루타치온(Glutathione), 카테킨(Catechin), 폴리페놀(polyphenol), 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 알로푸리놀(allopurinol)일 수 있으나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 사용할 수 있는 아데노신 트리포스페이드 공급원이라면 특별히 제한되지 않는다.
항산화제의 사용량은, 글루타치온이 이용되는 경우에는 1 내지 10 mM, 알로푸리놀이 이용되는 경우에는 0.5 내지 5 mM이 바람직하나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 적용할 수 있는 사용량이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin), 겐타마이신(Gentamycin), 네오마이신(Neomycin) 또는 아프라마이신(Apramycin)일 수 있으나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 사용할 수 있는 항생제라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 전해질 이온은 나트륨 이온(Na+), 칼륨 이온(K+), 인산이수소 이온(H2PO4 -), 인산수소 이온 (HPO4 2 -), 마그네슘 이온(Mg2 +), 황산 이온(SO4 2-), 염소 이온(Cl-), 칼슘 이온(Ca2 +) 또는 탄산 이온(H2CO3 -)일 수 있으나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 사용할 수 있는 전해질 이온이라면 특별히 제한되지 않는다.
전해질 이온의 사용량은, 나트륨 이온(Na+)이 이용되는 경우에는 3 내지 200 mM, 칼륨 이온(K+)이 이용되는 경우에는 5 내지 200 mM, 마그네슘 이온(Mg2 +)이 이용되는 경우에는 1 내지 50 mM, 칼슘 이온(Ca2 +)이 이용되는 경우에는 1 내지 10 mM이 바람직하나, 이는 예시일뿐, 통상의 기술자가 적용할 수 있는 사용량이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 삼투압은 280 내지 400 mOsm/L일 수 있고, 보다 바람직하게는 300 내지 350 mOsm/L일 수 있고, 가장 바람직하게는 320 내지 330 mOsm/L일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 pH는 생리적 pH에 근접한 것일 수 있고, 바람직하게는 약 7.4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물의 준비
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물 내에 포함되는 8-옥소-2'-디옥시구아노신(8-Oxo-2'-deoxyguanosine, oh8dG)은 시판되는 것을 사용할 수 있고, 통상 제조되는 방법으로 얻어지는 것을 사용할 수도 있다.
그리고 상기 조성물은 8-옥소-2'-디옥시구아노신 외에도 K+, Na+, Mg2 +, Ca2 +, 히스티딘(histidine), 트립토판(tryptophan), 케토글루타르산(Ketoglutarate), 만니톨(mannitol)을 더 포함할 수 있으며, 이는 예시일뿐, 이에 한정되는 것이 아니며, 통상의 기술자에게 널리 알려져 통상 사용할 수 있는 성분을 더 포함할 수 있다.
한편 하기 실험예들에서, 상기 조성물은 K+를 포함하는 장기보존액과 동시적으로 사용되었다. 또한 하기 실험예들에서, HTK 처리 또는 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리하는 것은, 구체적으로, 장기에 혈액을 공급하는 주혈관을 통해 상기 약물을 주입한 후에, 장기이식수술 전까지 상기 약물에 장기를 담그는 것을 의미한다.
<
실험예
1> 장기조직 분리 후 활성산소 변화 측정
본 발명에 따른 장기손상 방지용 조성물을 신장 또는 간 조직세포에 처리하였을 때, 활성산소의 변화를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
장기보존액 사용에 따라 활성산소가 증가하면, 과도한 이온 불균형이 초래되고 조직세포의 산성화가 일어나 장기조직이 손상될 수 있으므로, 활성산소 증가가 억제되면 장기조직 손상을 방지할 수 있다.
8주령의 수컷 쥐의 신장과 간을 분리하였다. 분리된 신장과 간에 대해, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate) 처리, HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다.
약물 처리한 후에, OCT compound를 이용하고 액체질소에 담그어 신장과 간 조직을 동결시켰고, Cryo section기계를 이용하여 절편된 신장과 간 조직을 슬라이드 글라스에 붙여주었다. 잘 말린 슬라이드 글라스에 소수성 펜으로 가이드라인을 그려주었고, 세포 내 활성산소의 양을 측정하기 위해 DCFDA 염색을 진행하였다.
DCFDA dye를 10 μM의 농도로 15분간 조직위에 로딩하여주고, DPBS로 2회 씻어준 뒤, 바로 공촛점 현미경을 이용해 495 nm의 파장의 빛을 쬐어준 후 방출되는 530 nm 파장의 빛을 측정하였다. 활성산소가 증가하면 녹색인 530 nm 파장의 빛의 세기가 증가하므로, 이를 통해 세포 내 활성산소의 양을 측정함으로써, 활성산소의 증감변화를 확인하였다.
도 1은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(위 사진) 또는 간(아래 사진) 조직세포 내 활성산소 변화를 측정한 공촛점 현미경 사진이다.
도 2는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내 활성산소 변화 측정 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
분리된 신장과 간 모두, HTK만 처리한 경우보다 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우에 세포 내 활성산소 농도가 감소하였고, oh8dG 처리시간 차이에 따른 유의성은 있지 않았다(도 1 및 도 2 참조).
상기 결과는 oh8dG 없이 장기보존액만 처리되면 활성산소가 증가하지만, 장기보존액과 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리하면 활성산소의 증가가 억제되는 것을 나타낸다. 이를 통해, 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 활성산소의 증가를 억제하므로, 장기조직의 손상을 방지할 수 있음을 알 수 있다.
<
실험예
2> 장기조직 세포의
세포사멸인자인
Bcl
-2, P-53 또는
BAX
감소여부
측정
장기보존액의 노출에 의해 세포사멸인자들의 발현이 증가하는데, 본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 처리를 통한 세포사멸인자인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2), P-53 또는 BAX 감소효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
Bcl-2, p53 및 BAX는 세포사멸을 조절하는 단백질로 잘 알려져있어, 이들의 발현정도는 세포사멸의 척도가 될 수 있으므로, 겔 전기영동법을 통해 RNA 발현정도를 측정하였다.
8주령의 수컷 쥐의 신장과 간을 분리하였다. 분리된 신장과 간에 대해, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate) 처리, HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다. 약물처리된 조직을 잘게 다진 후에 Hybrid-RiboEX extraction syste을 이용하여 조직에서 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 분광광도계인 ND-1000으로 그 농도를 측정하였다. 그리고 RT-PCR 키트를 이용해 42℃에서 1시간, 94℃에서 5분의 조건으로 cDNA를 합성하고, GAPDH, Bcl-2, P-53 및 BAX의 프라이머를 상기 cDNA와 섞어 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 58℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분 동안 45 cycle의 조건으로 합성하였다. 이렇게 만들어진 PCR 생성물은 1% 아가로스(agarose) 겔에 로딩하고 100 mV에서 24분간 전기 영동한 뒤, GelDocXR을 이용해 전기영동된 밴드를 확인하였다.
도 3은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 4는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직세포 내에서 P-53, BAX 및 Bcl-2의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
분리된 신장과 간 모두, HTK만 처리한 경우보다 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우에 Bcl-2, P-53 또는 BAX의 RNA 발현정도가 감소하였다. 또한, 간의 경우에는 oh8dG 처리시간이 길수록 Bcl-2 또는 P-53의 RNA 발현정도는 더욱 감소하는 유의한 결과가 있었다(도 3 및 도 4 참조).
상기 결과는 oh8dG 없이 장기보존액만 처리되는 경우보다, 장기보존액과 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리하면 세포사멸이 감소하는 것을 나타낸다. 이를 통해, 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 장기보존액과 함께 사용하여 세포사멸인자의 발현을 감소시키므로, 장기조직의 손상을 방지할 수 있음을 알 수 있다.
<
실험예
3> 장기조직 세포의
CTGF
발현정도
측정 1
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 처리를 통한 CTGF(connective tissue growth factor) 발현정도를 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
CTGF는 섬유화 및 섬유세포의 성장, 분화 및 이동에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 겔 전기영동법을 통해 RNA 발현정도를 측정하였다.
8주령의 수컷 쥐의 신장과 간을 분리하였다. 분리된 신장과 간에 대해, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate) 처리, HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다. 약물처리된 조직을 잘게 다진 후에 Hybrid-RiboEX extraction syste을 이용하여 조직에서 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 분광광도계인 ND-1000으로 그 농도를 측정하였다. 그리고 RT-PCR 키트를 이용해 42℃에서 1시간, 94℃에서 5분의 조건으로 cDNA를 합성하고, GAPDH 및 CTGF의 프라이머를 상기 cDNA와 섞어 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 58℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분 동안 45 cycle의 조건으로 합성하였다. 이렇게 만들어진 PCR 생성물은 1% 아가로스(agarose) 겔에 로딩하고 100 mV에서 24분간 전기 영동한 뒤, GelDocXR을 이용해 전기영동된 밴드를 확인하였다.
도 5는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 6은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 RNA 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
분리된 신장과 간 모두, HTK만 처리한 경우 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우를 비교할 때, CTGF의 RNA 발현정도가 비슷하였다(도 5 및 도 6 참조).
상기 결과는 신장 및 간에서 CTGF의 유전자 발현이 oh8dG 처리에 의해 영향을 받지 않는 것을 의미하고, 이를 통해 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 장기보존액과 함께 사용하였을 때에 부작용으로서 섬유화인자 증가가 발생하지 않음을 알 수 있다.
<
실험예
4> 장기조직 세포의
CTGF
발현정도
측정 2
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 처리를 통한 CTGF(connective tissue growth factor) 발현정도를 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
CTGF는 섬유화 및 섬유세포의 성장, 분화 및 이동에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 겔 전기영동법을 통해 단백질 발현정도를 측정하였다.
8주령의 수컷 쥐의 신장과 간을 분리하였다. 분리된 신장과 간에 대해, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate) 처리, HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다. 약물처리된 조직을 잘게 다진 후에, lysis buffer를 200 μL씩 넣고 초음파 처리(sonication)하여 세포를 깨주었다.
이를 다시 원심분리기에 넣고, 4℃, 12000 g에서 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 얻어 Bradford assay를 통해 standard에 맞추어 정량한 후, 595 nm에서 흡광도를 재었다. 측정한 흡광도를 통해 샘플들을 정량하고 이를 다시 sample buffer (2x laemmli sample buffer + 2-Mercaptoethanol)에 섞고 37℃에서 15분간 가열(heating)하였다.
8% SDS-gel에 각각의 샘플들을 10 μL씩 로딩한 후, 120 V에서 15분간 전기영동하고, 150 V에서 30분간 다시 전기영동하였다. 전기영동된 gel을 3M paper와 PVDF membrane 위에 올리고, 판에 끼워 transfer buffer를 넣고 300 mA에서 90분간 이동(transfer)시켰다. 이동된 membrane을 크기에 맞게 잘라, non-fat dry mil에 1시간 동안 담가두고, 1차 항체인 CTGF와 β-actin을 붙여, 24시간 동안 4℃에 보관하였다. 24시간 후, TBST로 10분간 3번씩 세척한 후, 각각 항체에 맞게 HRP 2차 항체를 1시간 붙였다(CTGF: Mouse). 그 후에 다시 TBST로 10분간 4번씩 세척한 후, ECL을 붙여 암실에서 Developer와 fixer를 이용해 발현을 확인하였다.
도 7은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 사진) 또는 간(우측 사진) 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 사진이다.
도 8은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 또는 간 조직세포 내에서 CTGF의 단백질 발현정도를 겔 전기영동법으로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
분리된 신장과 간 모두, HTK만 처리한 경우 및 HTK 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 처리한 경우를 비교할 때, CTGF의 단백질 발현정도가 비슷하였다(도 7 및 도 8 참조).
상기 결과는 신장 및 간에서 CTGF의 단백질 발현이 oh8dG 처리에 의해 영향을 받지 않는 것을 의미하고, 이를 통해 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 장기보존액과 함께 사용하였을 때에 부작용으로서 섬유화인자 증가가 발생하지 않음을 알 수 있다.
<
실험예
5> 장기조직 세포의 세포사멸 정도 평가 1
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 세포사멸 정도의 감소 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) assay를 수행하였으며, 그 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다.
TUNEL assay는 세포사멸의 확인방법으로 잘 알려진 실험법으로서, 세포사멸로 나타나는 DNA 단편화(fragmentation)를 측정하여 세포사멸의 정도를 확인할 수 있다.
8주령의 수컷 쥐의 신장을 분리하였다. 분리된 신장에 대해, 분리한 직후로서 약물을 처리하지 않는 경우, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate)를 2시간 처리, HTK 2시간 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 2시간 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다.
이후 Mold에 조각을 담고 OCT compound를 채워 액체질소에서 얼려주었다. 4가지 경우 모두, Cryo secion기계를 이용하여 슬라이스로 자른 조직을 슬라이드 글라스에 붙여주었다. TUNEL assay 염색에는 TransDetect® Fluorescein TUNEL cell apoptosis Detection Kit (FA201-01) 제품을 이용하여 실험을 진행하였다.
소수성 펜을 이용하여 조직 바깥쪽에 가이드라인을 그리고, PBS로 10분씩 3번 세척하였고, 4% paraformaldehyde를 이용하여 상온에서 30분 동안 조직을 고정시켰다. 그리고 PBS로 10분간 3번씩 다시 세척한 후, Permeabilization 용액으로 상온에서 5분간 처리하고, 다시 PBS로 3번씩 세척하였다. Labeling solution과 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 1:25로 섞어 37℃에서 1시간 동안 빛을 차단한 상태에서 조직에 처리하였고, 이를 다시 PBS로 세척한 뒤, Mounting 용액이 들어있는 DAPI 용액을 상온에서 5분간 붙여주었다. 염색된 슬라이드를 형광현미경을 이용하여 488 nm의 파장에서 확인하였다.
도 9는 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 11은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
대조군인 분리 직후로서 약물 처리가 없는 경우보다 HTK를 처리하고 2시간이 지난 후 TUNEL positive cells(조직 손상 척도)가 증가하였지만, HTK와 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리한 경우에는 TUNEL positive cells가 효과적으로 감소하였다(도 9 및 도 11 참조).
상기 결과는 100 μg/mL oh8dG 없이 장기보존액만 처리하면 DNA fragmentation 정도, 즉 세포사멸 정도가 증가하지만, 100 μg/mL oh8dG를 함께 처리하면 세포사멸 정도가 감소하는 것을 나타낸다. 이를 통해, 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 장기보존액과 함께 사용하여 세포사멸을 감소시키므로, 장기조직의 손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
<
실험예
6> 장기조직 세포의 세포사멸 정도 평가 2
본 발명의 장기손상 방지용 조성물의 세포사멸 정도의 감소 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) assay를 수행하였으며, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
TUNEL assay는 세포사멸의 확인방법으로 잘 알려진 실험법으로서, 세포사멸로 나타나는 DNA 단편화(fragmentation)를 측정하여 세포사멸의 정도를 확인할 수 있다.
8주령의 수컷 쥐의 간을 분리하였다. 분리된 간에 대해, 분리한 직후로서 약물을 처리하지 않는 경우, 장기보존액인 HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate)를 2시간 처리, HTK 2시간 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 1시간 처리한 경우, 및 HTK 2시간 처리와 함께 100 μg/mL의 oh8dG를 2시간 처리한 경우로 실험군을 나누어 약물을 처리하였다.
이후 Mold에 조각을 담고 OCT compound를 채워 액체질소에서 얼려주었다. 4가지 경우 모두, Cryo secion기계를 이용하여 슬라이스로 자른 조직을 슬라이드 글라스에 붙여주었다. TUNEL assay 염색에는 TransDetect® Fluorescein TUNEL cell apoptosis Detection Kit (FA201-01) 제품을 이용하여 실험을 진행하였다.
소수성 펜을 이용하여 조직 바깥쪽에 가이드라인을 그리고, PBS로 10분씩 3번 세척하였고, 4% paraformaldehyde를 이용하여 상온에서 30분 동안 조직을 고정시켰다. 그리고 PBS로 10분간 3번씩 다시 세척한 후, Permeabilization 용액으로 상온에서 5분간 처리하고, 다시 PBS로 3번씩 세척하였다. Labeling solution과 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 1:25로 섞어 37℃에서 1시간 동안 빛을 차단한 상태에서 조직에 처리하였고, 이를 다시 PBS로 세척한 뒤, Mounting 용액이 들어있는 DAPI 용액을 상온에서 5분간 붙여주었다. 염색된 슬라이드를 형광현미경을 이용하여 488 nm의 파장에서 확인하였다.
도 10은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 간 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 사진이다.
도 11은 장기보존액(HTK) 처리, 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 1시간 처리, 및 장기보존액 처리와 함께 100 μg/mL oh8dG 2시간 처리에 따른, 쥐의 신장(좌측 그래프) 또는 간(우측 그래프) 조직 내에서 세포사멸 정도를 Tunel assay로 측정한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
대조군인 분리 직후로서 약물 처리가 없는 경우보다 HTK를 처리하고 2시간이 지난 후 TUNEL positive cells(조직 손상 척도)가 증가하였지만, HTK와 함께 100 μg/mL oh8dG를 처리한 경우에는 TUNEL positive cells가 효과적으로 감소하되, 간의 경우에는 oh8dG 처리시간이 길수록 더 감소하였다(도 9 내지 도 11 참조).
상기 결과는 100 μg/mL oh8dG 없이 장기보존액만 처리하면 DNA fragmentation 정도, 즉 세포사멸 정도가 증가하지만, 100 μg/mL oh8dG를 함께 처리하면 세포사멸 정도가 감소하는 것을 나타낸다. 이를 통해, 본 발명의 장기손상 방지용 조성물은 장기보존액과 함께 사용하여 세포사멸을 감소시키므로, 장기조직의 손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
Claims (15)
- 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 장기이식수술을 위한 장기적출 이후 재관류로 인한 장기조직의 손상을 방지하는 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 장기보존액과 동시적으로 처리할 수 있는 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 K+를 포함하는 장기보존액에 8-옥소-2'-디옥시구아노신이 첨가된 장기보존액인 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 K+의 농도가 1 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 활성산소의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 P-53, BAX 및 COX-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 장기는 신장 또는 간인 것을 특징으로 하는, 장기손상 방지용 조성물.
- 장기보존액 및 제1항의 장기손상 방지용 조성물을 포함하는 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
상기 키트는 장기이식수술을 위한 장기적출 이후 재관류로 인한 장기조직의 손상을 방지하는 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
장기보존액 및 상기 조성물을 동시적으로 처리할 수 있는 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
장기보존액과 상기 조성물이 혼합되어 처리되는 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 활성산소의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 P-53, BAX 및 COX-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
- 제9항에 있어서,
상기 장기는 신장 또는 간인 것을 특징으로 하는, 장기이식수술을 위한 장기보존용 키트.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20190073152 | 2019-06-19 | ||
| KR1020190073152 | 2019-06-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200145656A KR20200145656A (ko) | 2020-12-30 |
| KR102344674B1 true KR102344674B1 (ko) | 2021-12-29 |
Family
ID=74087893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200032016A KR102344674B1 (ko) | 2019-06-19 | 2020-03-16 | 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102344674B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114600897B (zh) * | 2022-05-09 | 2022-08-02 | 山东蓬勃生物科技有限公司 | 2`-脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015182019A1 (ja) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | Ｓｂｉファーマ株式会社 | 臓器保存液 |
| KR101816277B1 (ko) | 2016-10-06 | 2018-01-08 | 가천대학교 산학협력단 | 8-옥소-데옥시구아노신(8-oxo-2'-deoxyguanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 각막 손상 치료용 약학적 조성물 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1475434A1 (en) * | 2003-05-09 | 2004-11-10 | Oncoscience AG | Method for storing tumor cells |
| KR100743499B1 (ko) * | 2005-11-24 | 2007-07-30 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 항염증용 조성물 |
| KR101146367B1 (ko) * | 2009-08-12 | 2012-05-17 | 서울대학교산학협력단 | 방사선에 의한 면역기능 저하 및 조직손상 치료용 조성물 |
| KR102200030B1 (ko) * | 2019-05-29 | 2021-01-08 | 가천대학교 산학협력단 | 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 심정지 시 심장손상 방지용 조성물 |
-
2020
- 2020-03-16 KR KR1020200032016A patent/KR102344674B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015182019A1 (ja) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | Ｓｂｉファーマ株式会社 | 臓器保存液 |
| KR101816277B1 (ko) | 2016-10-06 | 2018-01-08 | 가천대학교 산학협력단 | 8-옥소-데옥시구아노신(8-oxo-2'-deoxyguanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 각막 손상 치료용 약학적 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200145656A (ko) | 2020-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zweier et al. | Recombinant superoxide dismutase reduces oxygen free radical concentrations in reperfused myocardium. | |
| Fahy | The relevance of cryoprotectant “toxicity” to cryobiology | |
| CN105123670B (zh) | 用于进行组织保存的组合物以及方法 | |
| Armitage | Preservation of human cornea | |
| JP6604942B2 (ja) | 細胞安定化 | |
| DE69901877T2 (de) | Perfusions- und/oder konservierungs- und/oder reperfusionslösung zur organtransplantation | |
| NO167075B (no) | Suspensjonsmedium for forlenget lagring av roede blodceller | |
| Howell et al. | The copper content and cytochrome oxidase activity of tissues from normal and swayback lambs | |
| Taylor | Biology of cell survival in the cold: the basis for biopreservation of tissues and organs | |
| JP6292640B2 (ja) | 臓器保存液 | |
| Owada et al. | Resolution of mitochondrial oxidant stress improves aged-cardiovascular performance | |
| KR102344674B1 (ko) | 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 이식용 장기의 보존 시 장기손상 방지용 조성물 | |
| Lochner et al. | Oxidative phosphorylation in infarcting baboon and dog myocardium: effects of mitochondrial isolation and incubation media | |
| Romani et al. | Effect of superoxide dismutase on liver ischemia-reperfusion injury in the rat: a biochemical monitoring | |
| CN106857499B (zh) | 茶多酚与壳聚糖配伍用于制备猪精液保存用稀释液的应用 | |
| Šimoník et al. | Effect of low-density lipoprotein addition to soybean lecithin-based extenders on bull spermatozoa following freezing-thawing-preliminary results. | |
| Giddens Jr et al. | Feline congenital erythropoietic porphyria associated with severe anemia and renal disease. Clinical, morphologic, and biochemical studies | |
| Williams | Effect of external K+ concentration on transmembrane potentials of rabbit thyroid cells | |
| Zubov et al. | Trolox antioxidant as a factor in stabilization of human cord blood nucleated cells during cryopreservation | |
| KR102200030B1 (ko) | 8-옥소-2'-디옥시구아노신을 유효성분으로 포함하는 심정지 시 심장손상 방지용 조성물 | |
| Thompson et al. | Muscle damage in chronic copper poisoning of sheep | |
| CN105407716A (zh) | 用于增加器官和组织保存溶液的氧含量、稳定性和保存期的含聚(o-2-羟乙基)淀粉的制剂 | |
| US11213026B2 (en) | Solution for preserving and/or rinsing an organ to be transplanted | |
| JPH08325101A (ja) | 動物組織保存方法 | |
| Hatori et al. | Myocardial morphology and cardiac function in rats with renal failure |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20200316 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20211015 |
|
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20211224 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20211224 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20241120 Start annual number: 4 End annual number: 4 |