CN105123670B - 用于进行组织保存的组合物以及方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
用于复苏、储备、以及保存器官以及组织的功能完整性的方法以及组合物。通过维持ATP(三磷酸腺苷)的水平，线粒体的功能，心肌细胞的收缩性，预防酸中毒，抑制细胞凋亡的诱发，维持变力性(inotrophy)以及变松性(lusitropy)从而维持代谢功能，其中所述的变力性以及变松性的维持是通过调节钙离子、钠离子、钾离子以及氯离子来完成的。
Description
本申请是2008年2月19日递交的申请号为200880011995.4，发明名称为“用于进行组织保存的组合物以及方法”的分案申请
相关的美国申请
本申请要求享有申请日为2007年2月17日的USSN60/901,844、申请日为2007年2月20日的USSN 60/902,587、以及申请日为2007年8月27日的USSN 60/966,511的优先权，上述每篇申请均完整的在此引入作为参考。
发明所属技术领域
本发明涉及组织保存。
发明的背景技术
心脏移植的主要障碍在于供体心脏的可利用性有限以及供体心脏的质量不好，这种质量不好归因于在存储过程中的退化。利用当前的实践以及保存溶液，所述的保存时间的极限是4-6个小时，并且在美国，所有的心脏异体移植物都是从刚刚发生脑死亡的、参与到生命支撑体系中的心脏搏动的供体处获得的。而且，当前的实践导致了被移植心脏的加速的血管病变的显著发病率的产生。照此，目前紧迫的需要一类长期存储的溶液，能够保存供体心脏的结构完整性以及生理学完整性。
发明概述
本发明提供了一种溶液，所述的溶液在进行植入之前对一种从人类处收集的器官或者从与人类相容处收集的器官进行保存，所述的收集到的器官需要在一段保存过程中或者鉴定过程中被保存或者复苏，其中所述的植入包括移植或者复植。本发明所述的溶液还能够允许所述的器官在所述的保存过程中被进行运输，从而改变其地理位置。本发明提供了用于进行器官存储的经过改进的组合物、方法、以及装置，所述的组合物、方法、以及装置保存了所述器官的功能完整性，并且重建了无功能性器官或者退化器官的功能。增加心脏停搏(NBH)供体的使用以及更长时间的储存供体心脏能够在本质上增加所述的供体库的大小，并且允许供体心脏在更长的距离内进行运输，从而增强接受者的可利用性。作为所述的经过改进的存储方法的结果，完整无缺的、具有功能性冠状动脉内皮的心脏的移植能够使血管病变最小化，所述的血管病变是在使用当前的技术进行心脏移植之后发生的。
本发明提供了用于保存或者复苏生物组织的组合物。所述的组合物中含有一种生理盐溶液以及下述组分中的至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，或者至少五种：用于生成三磷酸腺苷(ATP)的底物，用于消耗氨的底物，用于缓冲细胞内酸度的试剂，用于淬火(quench)活性氧组分的试剂，和/或用于平衡组织水肿/脱水的试剂。
在一个方面，所述的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于生成三磷酸腺苷的底物。任选的，所述的用于生成三磷酸腺苷的底物是磷酸肌酸，肌酸乙酯，二肌酸苹果酸，肌酸葡糖酸，果糖，蔗糖，核糖，己糖或者戊糖。可以选择的，所述的用于生成三磷酸腺苷的底物是肌酸乳清酸，一水合肌酸，腺苷，或者葡萄糖。
所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于消耗氨的化合物。任选的，所述的用于消耗氨的化合物是鸟氨酸或者羧基磷酸。可以选择的，所述的用于消耗氨的化合物是L-瓜氨酸苹果酸。
在另外一个方面，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于缓冲细胞内酸度的试剂。在一个方面，所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂是组氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，赖氨酸，或者牛磺酸。可以选择的，所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂是碳酸氢钠，Tris-羟甲基氨基甲烷(THAM)，或者L-肌肽。
任选的，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于淬火活性氧组分的试剂。在一个方面，所述的用于淬火活性氧组分的试剂是二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇，乙酰半胱氨酸，α-硫辛酸，牛磺酸，白藜芦醇(Resveratrol)，叶黄素，硒，甲硫氨酸，或者生育酚/维生素E。
在另外一个方面，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于平衡组织的水分含量(水肿/脱水)的试剂。所述的用于平衡组织的水分含量的试剂包括甘露醇，尿素，丙三醇，异山梨醇，或者五水合蜜三糖。任选的，所述的用于平衡组织的水分含量的试剂是五水合蜜三糖的penta片段。
所述的溶液被用来对存活的供体心脏、用于移植而临时存储的存活的供体心脏、以及尸体供体的心脏进行复苏，并且允许对存活的、存储的、或者尸体的器官例如心脏进行延长的临时存储。存活的供体心脏以及尸体心脏的心肌细胞的功能得以保存，并且所述的存活的供体心脏以及尸体心脏的冠状动脉以及腔室的内皮功能也得以保存。当在死亡之后的短时间内将所述的器官与本发明所述的溶液进行接触并且将器官存储于所述的溶液中时，所述的溶液还能够介导代谢性变化以及退化性变化的逆转，并且能够对所述心脏(以及其他器官)中的细胞死亡以及细胞存活能力的恶化进行抑制。通过维持三磷酸腺苷的水平，线粒体的功能，心肌细胞的收缩性，预防酸中毒，抑制细胞凋亡的诱发，从而维持代谢功能。通过调节钙离子、钠离子、钾离子以及氯离子来维持变力性(inotrophy)以及变松性(lusitropy)。所述溶液的缓冲能力能够预防酸中毒。所述的溶液保存了所述器官中的钙动员，一氧化氮的生成，并且维持了所述冠状动脉的内皮依赖性血管收缩功能以及内皮不依赖性血管收缩功能。通过调节离子浓度以及水通道蛋白(aquaporin)通道，在再灌注时预防了脱水以及随后的过度水合(水肿)，并且预防了缺血性再灌注损伤。所述的溶液以及存储系统是一种自我持续性的再生系统，用于生成三磷酸腺苷以及一氧化氮的底物。
所述的组合物能够预防缺血性再灌注损伤。这项功能是由抗坏血酸以及谷胱甘肽，肉碱(通过预防乙酰辅酶A的积累，所述的积累能够导致自由基-缺血性再灌注损伤的发生)，肌肽以及α-硫辛酸来介导的，上述物质均是自由基(羟基自由基，纯态氧，过氧化氢自由基以及超氧化物)清除剂。所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及用于预防器官和/或组织的脱水和/或水肿的试剂。所述的溶液中还含有其他的盐类包括氯化镁，氯化钠，和/或磷酸氢二钠。
通过对钠离子(较少)以及钾离子(较多)(即，同渗容摩)进行调节，可以对所述心脏的脱水(在存储过程中)以及经过再灌注之后的过度水合或者水肿进行控制。所述的溶液是轻微低渗的以及轻微低同渗容摩(hyposmolar)的，因此能够在存储过程中驱使水进入所述的心脏内并且在再灌注过程中进行平衡。外部氯化钾浓度的增加弥补了所述的钾电流(接近于能斯特电势)并且防止钾随水向外运动(钾离子的水合壳层)。还可以通过对所述的水通道蛋白通道进行的调节来对脱水/水肿进行控制，其中所述的对于水通道蛋白通道进行的调节是经由所述的离子电流完成的。同样的，外部的钾可能延迟/降低了钙离子向所述细胞内的运动，因而经由钙激活的钾通道来预防脱水。例如，所述的溶液中含有125毫摩钠以及7毫摩钾。在一个方面，所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于生成三磷酸腺苷的底物。例如，所述的用于生成三磷酸腺苷的底物是肌酸乳清酸，一水合肌酸，腺苷，或者葡萄糖。二氯乙酸通过对能够使丙酮酸脱氢酶(PDH)发生磷酸化的激酶进行抑制致使其失活来增加三磷酸腺苷的生成。二氯乙酸通过促进所述的三羧酸(TCA)循环来诱导三磷酸腺苷的合成。
在所述的瓜氨酸苹果酸-精氨酸循环中，苹果酸盐(从瓜氨酸中分裂出来)进入所述的三羧酸循环从而生成更多的三磷酸腺苷。同样的，瓜氨酸苹果酸转化成精氨酸以及延胡索酸盐；延胡索酸盐进入所述的三羧酸循环从而促进更多的三磷酸腺苷的生成。在三羧酸循环中，苹果酸盐以及延胡索酸盐都能够引发更多三磷酸腺苷的生成。
所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于缓冲酸度的试剂。用于缓冲细胞内酸度的试剂是肌酸乳清酸，其通过促进肌肽的合成来缓冲细胞内酸度。一水合肌酸通过增加能量的产生并且减少乳酸盐的积累来缓冲酸度。酸度还可以通过碳酸氢钠、Tris-三羟甲基氨基甲烷(THAM)、以及L-肌肽来进行缓冲(细胞内酸度)。二氯乙酸通过降低被保存的器官中的乳酸盐的水平来控制酸度，因此所述的溶液也如此。L-肉碱能够促进心肌乳酸盐的产量的降低，因此能够降低酸度。
所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于消耗氨的底物。例如，所述的用于消耗氨的底物是L-瓜氨酸苹果酸。氨与羧基磷酸混合后形成瓜氨酸苹果酸，这形成了一氧化氮以及三磷酸腺苷的底物。
所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于预防器官和/或组织的脱水和/或水肿的试剂，一种用于生成三磷酸腺苷的底物，一种用于缓冲酸度的试剂，以及一种用于消耗氨的底物。优选的，所述的组合物中包括下述化合物以及浓度：
大约0.147克/升氯化钙(1毫摩)
大约0.52克/升氯化钾(7毫摩)
大约0.06克/升磷酸钾(一钾盐)(0.44毫摩)
大约0.11克/升氯化镁(六水合物)(0.50毫摩)
大约0.125克/升硫酸镁(五水合物)(0.50毫摩)
大约7.30克/升氯化钠(125毫摩)
大约0.35克/升碳酸氢钠(4.2毫摩)
大约0.05克/升磷酸钠(二钠盐；五水合物)(0.19毫摩)
大约1.98克/升葡萄糖/D-葡萄糖(11毫摩)
大约0.27克/升腺苷(1毫摩)
大约0.46克/升谷胱甘肽(还原态；1.5毫摩)
大约0.18克/升抗坏血酸(1毫摩)
大约0.21克/升L-精氨酸(1毫摩)
大约0.27克/升肌酸乳清酸(0.5毫摩)
大约0.30克/升一水合肌酸(2毫摩)
大约0.15克/升L-瓜氨酸苹果酸(1毫摩)
大约0.08克/升二氯乙酸(0.5毫摩)
大约2.3克/升L-肌肽(10毫摩)
大约2.0克/升L-肉碱(10毫摩)
大约0.021克/升α-硫辛酸(0.1毫摩)
大约0.50毫升/升胰岛素(10毫克/毫升)
用于调整pH的THAM(Tris-羟甲基氨基甲烷；100毫摩储备液，12.1克/升)
(大约1升蒸馏水)。
将上述的成分混合在一起，从而形成一种溶液。在混合了其余的成分之后，任选的加入胰岛素。例如，在将一种器官浸没于所述的溶液之前的几分钟的时间里或者几小时的时间里加入胰岛素，所述的几分钟时间例如是0.5分钟，1分钟，2分钟，5分钟，所述的几小时时间例如是0.5小时，1小时，2小时，3小时，4小时，或者5小时。
一种优选的组合物中包括存在于下述剂量范围内的化合物，从而形成一种具有期望比例的组合物：
0.1-0.5克/升氯化钙
0.25-0.75克/升氯化钾(7毫摩)
0.01-0.5克/升磷酸钾(一钾盐)
0.01-0.5克/升氯化镁(六水合物)
0.01-0.5克/升硫酸镁(五水合物)
5.0-10.0克/升氯化钠(125毫摩)
0.01-0.5克/升碳酸氢钠
0.01-0.5克/升磷酸钠(二钠盐；五水合物)
1.0-5.0克/升D-葡萄糖/葡萄糖(11毫摩)
0.01-0.5克/升腺苷(1毫摩)
0.01-0.75克/升谷胱甘肽(还原态；1.5毫摩)
0.01-0.5克/升抗坏血酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升L-精氨酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升肌酸乳清酸(0.5毫摩)
0.01-0.5克/升一水合肌酸(2毫摩)
0.01-0.5克/升L-瓜氨酸苹果酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升二氯乙酸(0.5毫摩)
0.23-2.3克/升L-肌肽(1-10毫摩)
0.20-2.0克/升L-肉碱(1-10毫摩)
0.0021-0.21克/升α-硫辛酸(0.01-1.0毫摩)
0.25-0.75毫升/升胰岛素(10毫克/毫升)
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
(0.01-3.0升蒸馏水)。
例如，所述的溶液中含有：
大约0.14克/升氯化钙
大约0.52克/升氯化钾(7毫摩)
大约0.06克/升磷酸钾(一钾盐)
大约0.10克/升氯化镁(六水合物)
大约0.10克/升硫酸镁(五水合物)
大约7.31克/升氯化钠(125毫摩)
大约0.35克/升碳酸氢钠
大约0.05克/升磷酸钠(二钠盐；五水合物)
大约1.98克/升葡萄糖/D-葡萄糖(11毫摩)
大约0.27克/升腺苷(1毫摩)
大约0.46克/升谷胱甘肽(还原态；1.5毫摩)
大约0.18克/升抗坏血酸(1毫摩)
大约0.21克/升L-精氨酸(1毫摩)
大约0.27克/升肌酸乳清酸(0.5毫摩)
大约0.30克/升一水合肌酸(2毫摩)
大约0.15克/升L-瓜氨酸苹果酸(1毫摩)
大约0.08克/升二氯乙酸(0.5毫摩)
大约2.3克/升L-肌肽(10毫摩)
大约2.0克/升L-肉碱(10毫摩)
大约0.021克/升α-硫辛酸(0.1毫摩)
大约0.50毫升/升胰岛素(10毫克/毫升)
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
(大约1升蒸馏水)。
上文中所描述的溶液被用来维持器官的生理学完整性。所述的器官或者组织与其接触了至少1个小时的时间，其中所述的器官或者组织优选是从人类机体或者动物机体中分离出来的。或者，所述的器官或者组织是在原位进行灌注的，即，在被从所述的机体中分离出来之前进行灌注。例如，在尸体或者存活的患者体内使所述的器官或者组织在原位发生接触。所述的器官或者组织与所述的溶液接触的时间从大约1-5个小时，例如4个小时，直至几天的时间，例如1天，2天，5天，8天，10天或者更长的时间。
使用所述的溶液能够顺利的对各种不同的器官以及组织类型进行存储以及复苏。例如，所述的器官或者组织是心脏。其他适合的组织/器官包括肾脏，肝脏，胃，脾脏，胰腺，肺脏，大脑，眼睛，肠，膀胱，皮肤或者真皮组织，血管例如静脉或者动脉，心脏瓣膜，精子，以及卵母细胞。
所述的维持或者恢复器官或者组织的生理学完整性的方法是通过下述手段来实现的：将所述的器官或者组织与上文中所描述的溶液进行一段时间的接触，这样一来酯酶活性在＞150任意荧光光子单位的范围内，细胞内一氧化氮(NO)浓度在大于1纳摩的范围内，并且所述器官中的所述细胞的线粒体膜的膜电位比＞1.00。所述的溶液能够保存完整的心肌细胞收缩蛋白(肌浆球蛋白重链(HC)，肌浆球蛋白轻链(LC)，acitinin，肌动蛋白，肌钙蛋白C)；内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)，窖蛋白(caveolin)，以及瑞斯托霉素辅因子(vWF)，例如，正如利用Western以及免疫印迹法所评价的，然而使用先前的溶液对例如心脏这样的组织/器官进行存储能够导致例如肌浆球蛋白重链这样的蛋白发生降解，从而危及到所述被移植器官的完整性以及功能。这些组分的缺失或者破碎标志着所述器官的退化。临床参数包括左心室舒张末压(LVEDP)0-30毫米汞柱，血压(BP)100-140/60-100，pH＞6.8。所述的溶液还能够抑制器官狭窄，斑块，凝结的形成，以及粥瘤(动脉硬化症)的形成，这在移植案例中是一种严重的问题，其中所述的器官狭窄、斑块、凝结的形成归因于内皮的损伤。
同样存在于本发明中的是一种用于鉴定器官或者组织的生理学完整性的方法。将所述的器官或者组织与上文中所描述的溶液(或者另外一种溶液)进行接触，并且对浓度水平或者下述参数中的一种或者多种的活性进行检测或者鉴定。需要进行鉴定的生物学指数包括酯酶，一氧化氮，或者细胞膜电位。酯酶活性在＞150任意(荧光光子)单位的范围内，细胞内一氧化氮(NO)浓度在大于1纳摩的范围内，并且所述器官中的所述细胞的线粒体膜的膜电位比＞1.00(极化的与去极化的比例，其中，大于1标志着所述的线粒体膜是极化的并且所述的组织是健康的)。上述的数值标志着所述的器官或者组织适合被移植到作为接受者的存活的哺乳动物体内，其中所述的器官或者组织例如是心脏。
所述的用于制备存储/复苏溶液的组合物任选的以下面所列出的成分/剂量或者其成倍增加的剂量被包装在试剂盒内，即，扩大规模，从而制备出2倍，3倍，5倍，10倍，20倍剂量的所述溶液。一种范例性的试剂盒中含有
0.1-0.5克/升氯化钙
0.25-0.75克/升氯化钾(7毫摩)
0.01-0.5克/升磷酸钾(一钾盐)
0.01-0.5克/升氯化镁(六水合物)
0.01-0.5克/升硫酸镁(五水合物)
5.0-10.0克/升氯化钠(125毫摩)
0.01-0.5克/升碳酸氢钠
0.01-0.5克/升磷酸钠(二钠盐；五水合物)
1.0-5.0克/升D-葡萄糖(11毫摩)
0.01-0.5克/升腺苷(1毫摩)
0.01-0.75克/升谷胱甘肽(还原态；1.5毫摩)
0.01-0.5克/升抗坏血酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升L-精氨酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升肌酸乳清酸(0.5毫摩)
0.01-0.5克/升一水合肌酸(2毫摩)
0.01-0.5克/升L-瓜氨酸苹果酸(1毫摩)
0.01-0.5克/升二氯乙酸(0.5毫摩)
0.23-2.3克/升L-肌肽(1-10毫摩)
0.20-2.0克/升L-肉碱(1-10毫摩)
0.0021-0.21克/升α-硫辛酸(0.01-1.0毫摩)
0.25-0.75毫升/升胰岛素(10毫克/毫升)
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
这些成分与使用说明书一同进行包装，并且将它们与0.01-2.0升蒸馏水进行混合。如上文中所述，在使用之前的短时间里任选的加入胰岛素，即，在向所述的溶液中加入器官之前的短时间里。将所述的试剂盒包装，并且在不含有无菌水成分的条件下进行出售。例如，所述的试剂盒中含有
大约0.14克/升氯化钙
大约0.52克/升氯化钾(7毫摩)
大约0.06克/升磷酸钾(一钾盐)
大约0.10克/升氯化镁(六水合物)
大约0.10克/升硫酸镁(五水合物)
大约7.31克/升氯化钠(125毫摩)
大约0.35克/升碳酸氢钠
大约0.05克/升磷酸钠(二钠盐；五水合物)
大约1.98克/升葡萄糖/D-葡萄糖(11毫摩)
大约0.27克/升腺苷(1毫摩)
大约0.46克/升谷胱甘肽(还原态；1.5毫摩)
大约0.18克/升抗坏血酸(1毫摩)
大约0.21克/升L-精氨酸(1毫摩)
大约0.27克/升肌酸乳清酸(0.5毫摩)
大约0.30克/升一水合肌酸(2毫摩)
大约0.15克/升L-瓜氨酸苹果酸(1毫摩)
大约0.08克/升二氯乙酸(0.5毫摩)
大约2.3克/升L-肌肽(10毫摩)
大约2.0克/升L-肉碱(10毫摩)
大约0.021克/升α-硫辛酸(0.1毫摩)
大约0.50毫升/升胰岛素(10毫克/毫升)
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
任选的，所述的溶液是纳米尺寸的，从而增加了穿透所述的细胞膜的效率。纳米尺寸指的是所述的颗粒尺寸被降低到亚微型的范围，所述的最终的颗粒尺寸通常为1-10纳米(ηm)。所述的颗粒尺寸的降低引发了所述溶液穿透所述的细胞膜的效率发生了显著的提高。在一个方面，所述的效率被提高，使得所述溶液的至少20％，至少25％，至少50％，至少75％，或者至少100％能够穿透所述的细胞膜。
本发明提供了对本发明所述的溶液进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在将所述的溶液用于本发明所描述的方法之前进行的。或者，本发明提供了对水进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在加入所述溶液的其他化合物/试剂之前进行的。在另外一个方面，本发明提供了对水进行纳米尺寸处理以及对所述溶液中的每种化合物/试剂进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在混合到溶液之前分别进行的。
在一个方面，所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水包(water packet)或者水团(water cluster)。任选的，所述的水包或者水团为1-10纳米(ηm)，1-25纳米，25-50纳米，50-75纳米，75-100纳米，100-200纳米，200-500纳米，或者500-999纳米。
本发明还提供了测量离体心脏的pH的方法，所述的方法包括将所述的心脏与本发明所述的溶液进行接触，并且测定所述的离体心脏的pH，其中pH在6.8至7.0的范围内标志着所述的心脏适合进行移植。
本发明还提供了测量本发明所述溶液的pH的方法，所述的方法包括将一个离体的心脏与本发明所述的溶液进行接触，并且测定本发明所述溶液的pH，其中pH在6.8至7.0的范围内标志着所述的心脏适合进行移植。
除了用于存储/保存器官以及组织的溶液以及方法之外，本发明还包括一种灌注装置。所述装置的元件包括一个腔室组件，一个灌注回路，以及一个温度控制单元，其中所述的灌注回路包括一个第一导管，用于向所述的器官提供所述的溶液。所述的装置包括一个固定化的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧酸激酶以及乳酸脱氢酶(LDH)柱，使其成为一个自我持续性的系统。例如，从心室中流出的所述溶液可能含有一些乳酸，所述的乳酸随后被所述的乳酸脱氢酶不断的转化成丙酮酸盐，随着所述的溶液一起回流至所述的腔室。之后，丙酮酸盐进行所述的三羧酸循环，用于连续的生成三磷酸腺苷。相类似的，在所述的三羧酸循环中生成的草酰乙酸盐被磷酸烯醇式丙酮酸羧酸激酶转化成磷酸烯醇式丙酮酸盐。磷酸烯醇式丙酮酸盐转化成丙酮酸盐生成性三磷酸腺苷。同样的，丙酮酸盐进行所述的三羧酸循环中，从而生成更多的三磷酸腺苷。因此，所述的装置允许所述的循环对底物进行连续的再生。能量代谢在所述的系统中得以维持，直至全部的葡萄糖和/或脂肪酸被消耗掉，这仅能在长时间的存储情况中发生，例如，超过大约2周或者10天的时间。例如，所述的装置适用于脉管组织中，例如心脏以及血管，以及肾脏，肝脏，胃，脾脏，胰腺，肺脏，大脑，眼睛，肠，以及膀胱。
一种用于维护或者复苏哺乳动物器官的系统包括一个容器，用于保持所述的器官与上文中所描述的组合物或者溶液进行接触，一种递送工具，用于将所述的组合物递送至所述器官的至少一个脉管中，一种分离工具，用于将所述的组合物转移出所述的器官，温度控制工具，氧化工具，过滤工具，以及流动控制工具。所述的递送工具，分离工具，温度工具，氧化工具，过滤工具，以及流动控制工具提供或者重建了一种生理学可接受性的哺乳动物环境。一种自我持续性的系统包括下述元件：一氧化氮的持续生产，三磷酸腺苷的持续生成，酸中毒以及氢离子的缓冲，以及氨的淬火。所述的元件之间优选是相互连接的。
本发明的其他特征以及优点将通过下述对于优选实施方式的描述以及权利要求而变得显而易见。本发明中所引用的全部参考文献均在此引入作为参考。
附图的简要描述
附图1是一系列的显微镜照片，描述的是在收集之后的0分钟，15分钟以及120分钟时，左心室(LV)的前室壁以及后室壁中的心室心肌细胞的酯酶活性(绿色)以及细胞坏死(红色)。
附图2是一个柱状图表，其表明了在收集之后的0分钟，15分钟以及120分钟时，左心室(LV)的前室壁以及后室壁中的心室心肌细胞的酯酶活性。
附图3是一系列的显微镜照片，表示的是在收集之后的0分钟，15分钟以及120分钟时，左心室(LV)的前室壁以及后室壁中的心室心肌细胞线粒体的极化作用(红色)与去极化作用(绿色)的比例。
附图4是一个柱状图表，表示的是在收集之后的0分钟，15分钟，30分钟以及120分钟时，左心室(LV)的前室壁以及后室壁中的心室心肌细胞线粒体的极化作用与去极化作用的比例。
附图5是一系列的显微镜照片，表示的是猪心脏的左心室后室壁的坏死(红色)以及酯酶活性(绿色)，其中所述的猪心脏在本发明所述的溶液中培养了4个小时，或者在施尔生液(Celsior)中培养了4个小时，前者被标注为“Lazarus”。
附图6是一个绘图，表示的是在每个试验组中的左心室前心肌层以及后心肌层中的酯酶活性，所述的每个试验组即，在施尔生液中进行了4个小时的存储；在Lazarus中进行了4个小时的存储；在Lazarus中进行了4个小时的存储的心脏停搏供体(NBHD)；以及在Lazarus中进行了10天的存储的心脏停搏供体。
附图7是一个柱状图表，识别出的是在Lazarus溶液中经过1小时，2小时，3小时，4小时，以及5小时的存储之后所述的心脏停搏供体模型的左心室的前室壁以及后室壁中的酯酶活性。
附图8是一系列的图像，表明的是在施尔生液或者Lazarus溶液中经过0分钟，60分钟，120分钟，180分钟，以及240分钟的存储之后，所述的左心室前室壁中的心肌细胞线粒体的红色(极化作用)与绿色(去极化作用)的比例。
附图9是一系列的显微镜照片，表示的是猪心脏的动脉左前降支中的坏死(红色)以及酯酶活性(绿色)，其中所述的猪心脏在Lazarus或者施尔生液中进行了4个小时的培养。
附图10是一系列的图像，描述的是在利用缓激肽进行刺激之前以及之后，使用施尔生液或者Lazarus处理过的猪心脏动脉左前降支中的钙的动员(红色)以及一氧化氮的生成(绿色)。
附图11是一个绘图，表示的是在利用缓激肽进行刺激之后，使用施尔生液处理过的猪心脏动脉左前降支中的钙的动员以及一氧化氮的生成。
附图12是一个柱状图表，表明的是在利用缓激肽进行刺激之后，使用Lazarus处理4个小时的猪心脏(死后1小时)动脉左前降支中的钙的动员以及一氧化氮的生成。
附图13是一系列的图像，描述的是在施尔生液或者Lazarus中经过4个小时的培养之后，心肌层中的肌浆球蛋白以及肌动蛋白的免疫荧光标记。
附图14是一系列的显微镜照片，表明的是在施尔生液或者Lazarus中经过4个小时的培养之后，心肌层中的肌钙蛋白C以及Actinin的免疫荧光标记。
附图15是一幅Western印迹的照片，表示的是死后的猪的心脏的前侧活体组织切片(A)以及后侧活体组织切片(P)中肌浆球蛋白轻链蛋白的存在，其中所述的猪心脏在Lazarus或者施尔生液中存储了240分钟。
附图16是一幅Western印迹的照片，表示的是死后的猪的心脏的前侧活体组织切片(A)以及后侧活体组织切片(P)中Actinin的存在，其中所述的猪心脏在Lazarus或者施尔生液中存储了240分钟。
附图17是一系列的显微镜照片，表示的是在施尔生液或者Lazarus中经过4个小时的培养之后，内皮中的内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的免疫荧光标记。
附图18是一系列的图像，描述的是心肌层以及左主干冠状动脉(死后1小时)的坏死(红色)以及酯酶活性(绿色)，其中所述的心肌层以及左主干冠状动脉在Lazarus溶液中经过了10天的存储。
附图19是柱状图表，表明的是前侧心肌层以及后侧心肌层(死后1小时)的酯酶活性，其中所述的心肌层在Lazarus溶液中经过了10天的存储。
附图20是一系列的显微镜照片，表示的是在利用缓激肽进行刺激之后，使用Lazarus处理了10天的猪心脏动脉左前降支中的钙的动员(红色)以及一氧化氮的生成(绿色)。
附图21是绘图，表示的是在Lazarus溶液中经过10天的存储之后，肝脏的酯酶活性。
附图22是柱状图表，表示的是在Lazarus溶液中经过10天的存储之后，肝脏坏死的百分率。
附图23是图表，表示的是在存储过程中心脏中的能量代谢。
附图24是图表，描述的是在存储过程中心脏中氨的生成。
附图25是图表，表明的是在存储过程中，肌酸对于心脏中的三磷酸腺苷的生成以及代谢机制的维持所起到的作用。
附图26是用于心脏的体外复苏以及保存装置的线条图。
附图27是用于心脏的体外保存装置的线条图，所述的装置正处于非工作状态。
附图28是图表，描述的是一种试验设计。
附图29是一幅图画，描述的是一种Gardos通道。
附图30是一幅水通道蛋白的图画(水通道)。
发明的详细描述
本发明提供了一种新的用于供体心脏的存储溶液，所述的存储溶液考虑到了在被用于移植的器官的存储过程中能够发生的各种生物化学过程。所述的溶液允许进行足够长的保存时间，使用心脏停搏(NBH)供体，并且能够为那些接受心脏移植的患者提供改进的临床成果。所述的溶液中包括作用于那些在器官的存储过程中发生的各种损伤过程(在下文中列出)的组分。
尽管在所述的领域中进行了30年的广泛研究，但用于对进行移植的供体心脏进行保存的技术发生了非常小的变化。在心脏移植中，主要的障碍在于经过一段时间的存储之后，供体心脏的可利用性有限以及供体心脏的质量不好。利用当前的实践以及保存溶液，所述的保存时间的极限是4-6个小时(参见Ferrera R等人于1994年在Ann Thorac Surg《胸外 科手术年报》57：1233-1239中发表的文章；Oshima K等人于1999年在J of Heart and LungTrans《心脏以及肺脏移植杂志》18(9)：852-861中发表的文章)，并且在美国，所有的心脏异体移植物都是从刚刚发生脑死亡的、参与到生命支撑体系中的心脏搏动的供体处获得的。作为这种器官库的严重局限性的结果以及在保存上的时间限制的结果，全部的心脏移植候选者中有10-40％在等待新器官的过程中死亡。除此之外，当前，被移植的心脏中的加速的血管病变具有显著的发病率，这在一定程度上归因于经过存储之后的供体心脏的质量不好。
在一段较长的时间内存储供体心脏的能力能够增加所述的供体库的大小，并且允许供体心脏经过更长的距离运输给适合的接受者。而且，较好的保存可能允许使用心脏停搏供体(NBHD)，并且进一步的增加所述的供体库。最后，对经过存储之后的供体心脏的情况进行改善，能够改善接受者的临床结果。
在移植之前对于收集到的供体人类心脏进行的保存承担着保护内皮细胞、保护心肌细胞功能、以及机械收缩性偶联的任务，并且关系到被移植心脏的长期存活。尽管在延长器官的存活能力以及存储能力方面的科学以及技术存在发展，但在过去的20年里在供体心脏保存方面的临床实践上并没有做出多少改变。当前可利用的保存方案使用低体温停循环以及简单的存储方法，使用各种基于晶体的心脏停搏溶液以及保存溶液，并且受到4-6个小时的保存时间长度的限制。除此之外，这些技术不可改变的受到供体心脏的全脑缺血周期的影响，这可能导致功能顿抑或者代谢顿抑，从而引发缺血性再灌注损伤。除此之外，如今一项成功的长时期心脏移植事业的两个主要的局限性在于缺乏足够的心脏供体，以满足大量患者的要求，所述的患者可能会从移植中受到益处，以及相对高比率的长期移植心脏的失效，这种失效主要归因于加速的动脉粥样硬化疾病。
用于收集并且移植人类心脏的外科手术技术已经建立的非常完善。所述的被植出的心脏在存储过程中发生的事情通常标志着所述移植的成功结果。因此，目前紧迫的需要一种用于存储的溶液以及环境。本发明提供了存储溶液，存储方法以及存储装置，它们能够维持被植出的供体心脏的结构完整性以及功能完整性，并且因此能够延长在进行外科手术再植入之前的体外存储时间。这项新近发展的技术的应用能够对停止循环的心脏进行复苏，所述的停止循环发生在30分钟的时间内。这样一来，由于非心脏外伤原因在抢救室中死亡的患者能够成为用于移植的潜在的心脏供体。
本发明提供了一种对收集到的人类心脏(或者其他器官)进行保存的系统，所述的人类心脏(或者其他器官)在进行植入和/或移植之前的保存以及鉴定阶段中需要被保存或者复苏。这个系统允许器官以存活态被保存于复温温度下(并且如果需要的话，可以被运送到变化的地理位置中，用于进行移植)，因此潜在的增加了这些具有此类需求的器官所具有的极端受限的可利用性。为了以存活态保存所述的心脏，本发明考虑到了代谢的厌氧模式以及好氧模式，以及对于内生性舒血管神经(vasodialator)和能量来源的需求。本发明所描述的保存溶液在一段延长的时间内维持了所述器官的存活能力，所述的延长的时间是例如，大约1小时，大约2小时，大约3小时，大约4小时，大约8小时，大约10小时，大约15小时，大约20小时，或者大约1天。本发明所述的溶液提供了适合于心肌细胞以及内皮细胞的能量代谢的营养物质。在另外一个方面，所述的溶液提供了保护性成分，能够帮助所述的组织/细胞抵抗由长期保存带来的损伤效应。而且，所述的溶液提供了用于抵抗经由移植产生的干燥以及再水合水肿的保护。
本发明还提供了一种灌注系统，所述的灌注系统不仅允许所述的溶液经由所述的冠状脉管系统进行循环，还允许所述的溶液经由所述的静态心脏的所有间隔进行循环。这确保了所述的富含营养物质的溶液从内部以及外部浸没了整个器官。
本发明还提供了一种方法，所述的方法能够在进行移植之前将营养物质以及中间代谢产物逐渐的灌注到所述的心脏中。心脏的这种灌注方式将所述的静态心脏在生理学上转化为恢复的窦性心律，而不会产生有害的挛缩以及缺血性再灌注损伤。
因此，本发明所述的组合物、方法、系统/装置以及媒介能够在保存的过程中对所述的供体心脏进行保存、复苏以及维持，其中所述的供体心脏是处于静态或者搏动状态的，从而确保所述保存介质的均匀分布。对于搏动状态的心脏的维持能够进一步的维持供体心脏正常的代谢，收缩，以及内皮功能，其中所述的供体心脏经过了当前4-6个小时的低体温停循环以及存储的窗口期(window)。
本发明提供了一种新的用于供体心脏的存储溶液，所述的存储溶液考虑到了在被用于移植的器官的存储过程中能够发生的各种生物化学过程。本发明所述的溶液将能够允许进行足够长的保存时间，使用心脏停搏(NBH)供体，并且能够为那些接受心脏移植的患者提供改进的临床成果。
下面描述的是在器官的存储过程中能够发生的某些可能的损伤过程，以及本发明所述的溶液是怎样作用于这些损伤过程的。在存储过程中生成活性氧组分；然而，存在于所述溶液中的抗坏血酸以及还原态的谷胱甘肽(即，还原剂)在存储过程中消耗氧自由基。在存储过程中氢离子的生成能够导致酸中毒；然而，所述溶液中含有具有缓冲活性的试剂。三磷酸腺苷在存储过程中发生了减少；然而，所述溶液中含有用于生成三磷酸腺苷的底物并且能够维持所述心脏的代谢机制。作为存储过程中氨基酸分解的结果，能够生成氨；然而，所述溶液中含有用于消耗氨的底物并且能够生成用于进行厌氧代谢/好氧代谢的底物。存储同样能够导致所述器官的脱水/水肿；然而，所述溶液中的离子组分被进行了处理，其目的在于维持所述细胞内的正常的水含量，从而预防所述的再灌注肌细胞发生水肿。这同样为肌细胞的收缩提供了一种理想的环境。
附图23-25描述的是所述的心脏在存储过程中的某些代谢途径，以及本发明所述的溶液是怎样作用于这些过程的。附图23描述的是所述的心脏在存储过程中的能量代谢途径，而附图24描述的是关于所述心脏中的氨的生成的途径。附图25描述的是所述心脏的能量代谢，其中涉及到三磷酸腺苷的存储以及氢离子的生成。
存储过程中的心肌脱水
在器官存储中一个显著的问题是脱水。例如，在心脏组织中，心肌脱水经由下述代谢过程发生。细胞中三磷酸腺苷的减少导致钠离子的增加，进而导致钠离子的渗漏以及钠-钾三磷酸腺苷酶活性的降低。钠-钙交换剂反向的引起细胞中钙离子的堵塞。随后，钙离子的进一步增加导致钙离子诱导的钙的释放，所述的释放是从肌质网(SR)中释放出来的。钙离子还诱导了所述的GARDOS通道，所述的通道导致钾离子以及水的缺失(附图29)。水通道蛋白是水从所述的细胞中流出的途径，并且经由再灌注流回到所述的细胞中(附图30)。
为了抵消上述提及的事件的进展，所述的溶液中含有相对低的钠离子浓度(大约125毫摩)以及些许较高的钾离子浓度(7毫摩)。通过预防心肌层的脱水，一旦重新建立了灌注，本发明所述的溶液能够防止所述细胞对于水的快速吸收。
在本文中所描述的发明之前，当前可以利用的器官存储溶液无一能够充分的对活化的半通道和/或水通道蛋白的潜在任务产生作用，其中所述的潜在任务是在所述被存储的器官中诱发水肿以及离子失衡，其中所述的被存储的器官特别是指心脏。间隙连接蛋白基因Connexin 43含有半通道，所述的半通道同样也是间隙连接的组分，并且已经证明在心脏的心肌细胞以及内皮细胞中存在水通道蛋白(AQP1)。这些通道的活化可能对处于存储过程中的器官的离子失衡、水肿、以及硬度的形成产生重要的作用。细胞体积的增加(水肿)以及硬度的增加能够引发所述的器官在移植时发生失效，或者可能需要显著的药理学干涉，用以逆转这种趋势直至所述的器官能够发挥功能。本发明能够作用于与这些通道的活化相关的问题，从而对被存储的器官的可存活性保存进行改进。
对本发明所述的溶液进行优化能够预防半通道的活化，从而避免在器官的存储过程中发生水肿，离子失衡以及能量损耗。这些要素在体外存储过程中提供了一种有利的环境以及对细胞的支撑。正如下文所述的实施例中所表示的，对于长时间存储于本发明所述的溶液中的心脏搏动供体(BHD)心脏以及心脏停搏供体(NBHD)心脏的心肌细胞以及内皮的结构以及功能上所产生的保护，证明了这种设想。
外部的钙的生理学浓度的降低(＜1-1.3毫摩)，谷胱甘肽的还原(改变的氧化还原电位)，能量状态(＜三磷酸腺苷)，磷酸化作用，或者有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶的活化，或者活性氧组分以及同渗容摩的任意增加均导致半通道的开放。当心脏或者器官在存储过程中所遭遇到的全部这些参数，都可以进行彼此间相互独立的操作，用于活化所述的半通道。由于非选择性而导致的半通道的开放，允许外部的钠离子、氯离子、以及钙离子自由的流至所述的细胞质内，并且允许钾离子自由的从所述的细胞质中流出。由于建立了过量的细胞内负电荷(阴性带电的大分子)，内部氯离子浓度的增加可能需要经由水通道蛋白和/或半通道进行水的吸收，从而维持等渗条件。随后所述通道的关闭可能建立一种具有较高稳态的细胞体积。然而，为了对所述增加的体积进行平衡并且避免破裂，所述的细胞通过重新排列所述的细胞骨架来进行补偿，所述的重新排列产生了细胞的硬度。细胞体积的增加(水肿)以及硬度的增加能够引发所述的器官在移植时发生失效，或者可能需要显著的药理学干涉，用以逆转这种趋势直至所述的器官能够发挥功能。半通道的活化导致所述的心脏在存储过程中发生水和离子的积累以及水肿。本发明所述溶液中的组分，包括生理学浓度的钙，将能够预防在所述被存储的器官中发生上述提及的有害变化中的任意一项。
任选的，所述的溶液是纳米尺寸的，从而增加了所述溶液穿透所述细胞膜的效率，可以使用本领域中任何已知的方法制成纳米尺寸，包括那些在美国专利No.6,521,248以及No.7,198,254中所描述的方法，上述文献被完整的引入作为参考。纳米尺寸指的是所述的颗粒尺寸被降低到亚微型的范围，所述的最终的颗粒尺寸通常为1-10纳米(ηm)。所述的颗粒尺寸的降低引发了所述溶液穿透所述的细胞膜的效率发生了显著的提高。在一个方面，所述的效率被提高，使得所述溶液的至少20％，至少25％，至少50％，至少75％，或者至少100％能够穿透所述的细胞膜。
本发明提供了对本发明所述的溶液进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在将所述的溶液用于本发明所描述的方法之前进行的。或者，本发明提供了对水进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在加入所述溶液的其他化合物/试剂之前进行的。在另外一个方面，本发明提供了对水进行纳米尺寸处理以及对所述溶液中的每种化合物/试剂进行纳米尺寸处理的方法，所述的处理是在混合到溶液之前分别进行的。
在一个方面，所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水包或者水团。任选的，所述的水包或者水团为1-10纳米，1-25纳米，25-50纳米，50-75纳米，75-100纳米，100-200纳米，200-500纳米，或者500-999纳米。
存储时间的增加显著的改善了经过存储之后的供体心脏/器官的状况，并且允许使用心脏停搏供体，这将对移植外科手术的当前景象产生意义深远的影响。如果使用所述的溶液代替当前的保存溶液，将可以产生即刻的影响。
对于心肌以及内皮的结构以及功能进行细胞水平的评价表明，溶液能够实现这些目标中的每一个。如果在条件完全相同的情况下与施尔生液(一种普遍使用的对心脏移植物进行存储的溶液)进行对比，当存储于本发明所述的溶液中时，所述的心肌层的结构以及功能发生了显著的改善，其中本发明所述的溶液被称为“Lazarus”。此外，在死后1小时(心脏停搏供体)以及经过10天或者两周的存储之后，这些参数仍然被保存完好。
实施例1.一般的方法
进行试验来对比Lazarus以及施尔生液(一种在心脏移植中当前被使用的保存溶液)，所述的对比涉及它们对于所述的心肌层以及冠状内皮层所产生的作用，使用各种显微镜分析以及生物化学分析进行评价。使用搏动的心脏模型以及心脏停搏供体模型进行对比。
所述的Lazarus溶液中含有下述物质：
动物试验方案
在本项研究中所使用的全体动物都接受到了依照“Guide for the Care and Useof Laboratory Animals《实验动物的关怀以及使用指南》”而实施的人性关怀。使用下述动物试验方案实施对器官存储溶液的鉴定研究。所述的研究包括三个试验组以及一个对照组，每组中使用三只猪(野猪)。在所述的对照组中，收集到所述的心脏并且利用盐水浸泡过的剖腹手术衬垫来保持潮湿，从而模拟心脏的衰变。在有规律的时间间隔处完成活组织切片检查以及生物化学分析，所述的有规律的时间间隔代表着不存在干扰的心脏衰变。在所述的试验组中，有9只猪(45-50千克)；每组中有三只猪。使用多光子显微镜检测以及其他生物化学检测(Western以及免疫印迹分析)收集数据，用于对存储于所述溶液4小时之后的心肌层以及冠状内皮层的结构以及功能进行鉴定。所述的试验设计在附图28中进行了描述。
对于每个动物而言，在所述试验的清晨记录体重。向每个动物进行4-6毫克/千克泰拉瑞(Telazol)以及2毫克/千克塞拉嗪(Xylazine)的肌肉内注射(IM)，之后进行插管并且与一个提供100％氧气的呼吸器进行连接。利用18标准刻度(gauge)的针头穿透耳静脉从而获得一个静脉内通路。在所述试验的过程中利用1-2％的异氟烷维持麻醉状态并且放置心电图(EKG)导线用于进行连续的监测。暴露出右侧股动脉并且使用一个18标准刻度(gauge)的导管进行插管，通过Power Lab对血压进行连续的监测。
进行胸骨切口并且打开所述的心包膜，并且使用2-0蚕丝缝合线将其提升至皮肤。接下来，插入Kuri心肌pH探针，并且利用一个存在于右心房内的探针作为参考探针。首先放置一个左心室(LV)后室壁电极并且利用3-0铬缝合线进行固定。随后以同样的方式对所述的左心室前室壁电极进行固定。允许探针进行5分钟的平衡，并且在贯穿所述试验的佘下部分中使用所述的pH监测器对心肌的pH以及温度进行监测。在试验组1以及2中，经由所述的动脉通道使用300毫克/千克的肝磷脂。等待5-10分钟使所述的肝磷脂发挥作用后，在所述的升主动脉内放置一个12标准刻度(gauge)的导管，用于进行心肌麻醉液的灌注。进行主动脉阻断，并且经由所述的主动脉心肌麻醉液导管在4℃下施用心肌麻醉液1升(三只猪接受施尔生液，三只猪接受500cc 15毫摩的氯化钾Lazarus/500cc 7毫摩的氯化钾Lazarus)。所述的心肌麻醉液经由所述的下腔静脉(IVC)以及左上肺静脉流出。当以150毫摩汞柱的水平施用完1升的溶液之后，快速收集所述的心脏并且提取所述的左心室前室壁以及后室壁的活组织切片，送至所述的显微镜实验室用以进行鉴定。
在试验组3中(心脏停搏供体-死后1小时，Lazarus)，在放置所述的主动脉导管之前不施用肝磷脂，并且经由所述的导管对猪进行抽血，用来模拟外伤性死亡。之后允许所述的心脏停止循环并在1个小时之后进行收集。随后，在4℃下将每个心脏浸泡于施尔生液(三只猪)或者Lazarus(六只猪——三只来自于心脏搏动模型而三只来自于心脏停搏供体模型)四小时。在存储过程中对心肌的pH以及温度进行连续的监测，并且在1小时的时间间隔处提取所述的前室壁以及后室壁的活组织切片，直至到达收集过后的四个小时。同样的，在收集过后的四小时的时间点处，从所述的动脉左前降支中切割一个两厘米的片段，并且送至显微镜实验室，用于进行生物化学鉴定。
在所述的心脏停搏供体模型中，将所述的心脏在Lazarus溶液中额外存储10天，随后再次进行活组织切片检查。同样从所述的心脏停搏供体组中收集肝脏，存储10天后进行活组织切片检查。
表1：活组织切片检查以及pH测量的时间表
存活/死亡检测
按照下述方法完成显微镜分析以及生物化学分析。使用存活/死亡检测(Molecular Probes(分子探针)，Eugene，OR)对来自于每个活组织切片的心肌层以及内皮层的结构的存活能力进行检测。使用钙黄绿素-AM(绿色)以及溴乙非啶同型二聚体(红色)对心脏活组织切片进行标记，并且利用多光子显微镜方法进行图像的观察。为所述的心肌层样本以及冠状样本装载具有膜透过性的钙黄绿素-AM酯以及具有膜不透过性的溴乙非啶同型二聚体。所述的钙黄绿素在细胞中进行累积并且通过所述细胞的酯酶进行了转化，从而生成一种存在于存活的细胞中的绿色荧光素(所述检测中的“存活(Live)”部分)。采用Metamorph软件对其进行量化，从而计算出荧光信号的平均强度。所述的具有膜不透过性的溴乙非啶同型二聚体染料进入妥协细胞中并且插入到核酸之中，从而生成一种红色的荧光素(所述检测中的“死亡(Dead)”部分)。对这些细胞进行计数，并且将它们占细胞总数的比例记录下来。
细胞内一氧化氮浓度的测定
按照先前的研究中所描述的方法，使用二氨基荧光素(DAF)对血管内皮一氧化氮的生成进行测定(参见Thatte H等人于1999年在Proc.Natl.Acad.Sci《美国科学院院刊》96(22)：12583中发表的文章；Nakatsubo N等人于1998年在FEBS Lett《欧洲生物化学学会联合会快报》427(2)：263中发表的文章)。为所述的组织装载具有膜透过性的4，5-二氨基荧光素，其可以被内皮酯酶进行粘着，从而形成一种膜不透过性的形式。随后这种染料能够与细胞内生成的一氧化氮发生反应，从而生成明亮的荧光性的三唑基荧光素衍生物。使用Hank平衡盐溶液(HBSS)对所述的样本进行洗涤并且将其安装在显微镜下。对一氧化氮的基线生成进行鉴定，之后使用10微摩的缓激肽对所述的冠状内皮层进行刺激。使用细胞内一氧化氮的浓度作为内皮健康的指数。
线粒体膜电位试剂盒检测(JC-1Assay)：对线粒体膜电位的鉴定
使用线粒体膜电位试剂盒(JC-1)膜电位染料对心肌细胞进行标记。在488纳米处对荧光素进行激发，并且使用窄带滤光片测定520纳米以及585纳米处的发射量。当线粒体维持膜的极化作用时，JC-1形成j-集合体(红色)，而当膜发生去极化作用时，其解离成单体(绿色)，其中所述的去极化作用能够导致细胞色素C以及预凋亡信号因子的渗漏。
利用多光子显微镜方法对来自于上述检测中的图像进行实时的鉴定。使用标准的Western印迹以及免疫荧光检验法对所述心脏的收缩机制的结构完整性进行测定，并且使用多光子显微镜方法完成确认检测。
多光子显微镜方法以及共聚焦显微镜方法
按照下述方法进行多光子显微镜方法以及共聚焦显微镜方法。使用BioRad MRC1024ES多光子成像系统以及Zeiss(蔡司)Axiovert S 100倒置式显微镜对荧光素模式以及透射光模式进行量化以及图像研究，其中所述的多光子成像系统偶联了一个锁定模式的Spectra-Physics可调节性MaiTai钛-蓝宝石激光系统(脉冲持续时间＜80飞秒，重复率82百万赫兹(MHz))，而所述的倒置式显微镜装配有一个高质量的25X/1.2NA空气，水浸40X/1.2NA 63X/1.2NA以及100X/1.4NA油浸物镜。多光子成像的主要优点包括减少荧光团的光漂白，减少本底荧光，减少对存活细胞的光损伤，并且与传统的共聚焦显微镜方法所具有的可能的成像深度相比(深度50μ)，它增加了在样本的更深处(深度大约1000μ)进行成像的能力。所述的技术允许获得同时的明视场图像，以及对形态变化的显像和量化。多光子技术具有的这些独特的特点为所述的系统提供了多功能性，允许通过各种广泛存在的不同的荧光素探针对存活的或者经过固定化培养的内皮细胞(EC)以及完整组织进行成像，用于调查各种生理学过程，其中所述的完整组织例如是人类的心脏组织以及血管。所述的BioRad MRC1024ES系统装配有一个传统的氪-氩激光以及一个飞秒钛-蓝宝石激光，其中所述的氪-氩激光具有488纳米、568纳米以及647纳米的发射光线，而所述的钛-蓝宝石激光被调节在735-990纳米之间。通过同时使用所述的传统激光以及钛-蓝宝石激光，可以按照比例量度对线粒体膜电位以及细胞溶液游离性钙离子进行成像(通过使用例如，钙橙染料)，并且同时对生成的一氧化氮(使用二氨基荧光素-2DA)以及整个静脉的直径以及体积发生的变化进行观察。在波长488/568下对所述的酯酶活性进行测量以及标准化处理，光电倍增管(PMT)1使用激光功率被削弱90％的2/864，而光电倍增管2使用激光功率被削弱90％的2/1297，以及卡尔曼3滤波器(规则系统)。使用MetaMorph成像处理软件(Universal Imaging，PA)对所述的荧光素进行量化。
实施例2：Lazarus溶液对于组织以及器官对照组所产生的作用的鉴定
对所述的对照组(心脏衰变)进行的存活/死亡检测的结果在附图1以及附图2中被表示出来。在所述的对照组中，在经过120分钟的时间后，左心室(LV)的前室壁以及后室壁的心室心肌细胞的酯酶活性(绿色荧光素)发生了时间依赖性的降低，而所述心室心肌细胞的细胞死亡/坏死(红色荧光素)发生了时间依赖性的增加(附图1以及附图2)。附图2描述的是一个绘图，代表着所述的对照组(心脏衰变)在时间结束后发生的酯酶活性的降低。而且，用于对所述的对照组的线粒体膜电位进行鉴定的线粒体膜电位检测试剂盒检测(JC-1)的结果表明，所述的心室心肌细胞线粒体膜存在时间依赖性的去极化作用(附图3：在每组中，左栏代表的是极化作用(红色)；在每组中，右栏代表的是去极化作用(绿色))。正如附图4中的代表性绘图所示，在所述对照组中的线粒体发生了增加的去极化作用。
试验组
下述试验的目的在于将本发明所述的Lazarus溶液与施尔生液进行比较，所述的施尔生液是一种在心脏移植中普遍使用的存储溶液。正如上文以及附图28中所描述的，将每个猪心脏在上述指明的存储溶液(施尔生或者Lazarus)中保存4小时。与所述的Lazarus心脏搏动模型以及Lazarus死亡1小时(心脏停搏)组相比，所述的施尔生组表现出更少的酯酶活性(附图5，6，以及7)，更多的坏死(附图5)，以及更强的线粒体膜的去极化作用(附图8)(分别通过存活/死亡检测以及线粒体膜电位检测试剂盒检测)。
正如附图5中所示，在所述的施尔生组表现出增加的坏死(红色；每组中的左栏)以及降低的酯酶活性(绿色；每组中的右栏)的同时，两个Lazarus组表现出最小程度的坏死(红色)以及升高的酯酶活性(绿色)。同时对于在不改变溶液的情况下Lazarus对猪的停搏心脏保存10天的能力进行了鉴定(附图6)。附图6中的结果以绘图的形式描述了在每个试验组中的所述的酯酶活性，这表明，与所述的施尔生组相比，在每个Lazarus组中存在更多的存活细胞，这意味着Lazarus在保存所述的猪心脏方面更加有效。接下来，对于在10℃下在Lazarus溶液中存储了4个小时的死后1小时的尸体心脏中的酯酶活性进行了测定。正如附图7中所示，在将所述的心脏停搏供体模型在Lazarus中存储4个小时之后，与基线相比的酯酶活性以及稳定性有所增加。
线粒体膜电位能够提供能量，依靠这种能量，在所述的克雷布斯循环中能够生成三磷酸腺苷。这样一来，经由上文中所描述的线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测，可以对猪心脏的线粒体膜电位进行测定，其中所述的猪心脏在存储溶液中进行了4个小时的保存。红色(极化作用；每组中的左栏)与绿色(去极化作用；每组中的右栏)的比例大于1，这表示着在心肌细胞中具有健康的线粒体，即，具备生成三磷酸腺苷的条件。正如附图8中所示，与所述的施尔生组相比，在每个Lazarus组中的猪心脏的线粒体膜电位维持的更好。而且，正如附图8中所示，在所述的Lazarus组中经过240分钟的时间后，线粒体膜电位的极化作用被恢复了。
同样对于猪心脏的动脉左前降支(LAD)进行所述的存活/死亡检测，其中所述的猪心脏在溶液中经过了4个小时的保存。正如附图9中所示，在所述的施尔生组中，所述的冠状动脉出现显著的坏死(红色；每组中的左栏)，而在两个Lazarus组中均出现最小程度的坏死。与所述的施尔生组相比，每个Lazarus组中的酯酶活性(绿色；每组中的右栏)同样也更加强健。
在使用缓激肽对猪心脏的动脉左前降支(LAD)进行刺激之前以及之后，对内皮功能(钙的动员以及一氧化氮(NO)的生成)进行鉴定，其中所述的猪心脏在溶液中经过了4个小时的保存。为应答于缓激肽而出现的钙动员的增加以及一氧化氮生成的增加表明，在两个Lazarus组中，内皮功能被得以更好的保存(附图10，11，12)。正如附图10中所示，两个Lazarus组在基线处以及在经过缓激肽的刺激之后(分别为之前以及之后)具有更强的钙动员(红色；每组中的顶端行)以及更多的一氧化氮的生成(绿色；每组中的底端行)。附图11是一个代表性的绘图，表示的是猪心脏的动脉左前降支对于缓激肽的内皮应答(钙的动员以及一氧化氮的生成)，其中所述的猪心脏被保存在施尔生液中。基线处的两个参数都小于1.2。附图12是一个代表性的绘图，表示的是心脏停搏供体猪心脏(死后1小时)的动脉左前降支对于缓激肽的内皮应答(钙的动员以及一氧化氮的生成)，其中所述的猪心脏在Lazarus中经过了4个小时的保存。与附图11中所示的施尔生心脏搏动模型组相比，对于所述刺激的应答更加强健(＞2)。这些结果表明，在Lazarus溶液中保存后的内皮功能由于在施尔生液中保存后的内皮功能。
使用Western印迹检测法以及免疫印迹检测法进行的结构检测
通过对所述心肌层的结构成分进行标记，来鉴定在所述心脏中的收缩性部件的结构完整性。将所述的心肌层结构成分进行保存(附图13，14，15，以及16)，其中所述的心肌层结构成分已经在Lazarus中经过了4个小时的存储。附图13表示的是在施尔生液或者Lazarus中经过了4个小时的存储之后，肌浆球蛋白以及肌动蛋白的免疫荧光素标记结果。附图14表示的是在施尔生液或者Lazarus中经过了4个小时的存储之后，肌钙蛋白C以及Actinin的免疫荧光素标记结果。正如附图14中所示，将肌钙蛋白C以及Actinin(所述收缩机制中的结构成分)保存在Lazarus中。而且，所述的结果表明，在所述的Lazarus组中，所述的荧光素呈现出有线条的外观(在所述的施尔生组中并未出现)，这意味着这些结构蛋白在完整的收缩性部件中形成了组织。
正如附图15中所示，针对1号、2号以及3号猪的死后解剖心脏的前侧活组织切片(A)以及后侧活组织切片(B)进行Western印迹分析，其中所述的猪心脏被存储在Lazarus或者施尔生液中。使用小鼠抗肌浆球蛋白(轻链；cat#M4401，来自于Sigma；10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)；7.5微克/装载良好)对肌浆球蛋白轻链蛋白(20kd)进行识别。正如附图16中所示，针对2号猪的死后解剖心脏的前侧活组织切片(A)以及后侧活组织切片(B)进行Western印迹分析，其中所述的猪心脏被存储在Lazarus或者施尔生液中。使用小鼠抗actinin(cat#7811，来自于Sigma；10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)；15微克/装载良好)对actinin蛋白(100kd)进行识别。与施尔生组相比，在Lazarus中经过存储后的这些Western印迹呈现出更宽的带，这说明所述的心肌收缩机制中的两种结构成分(肌浆球蛋白轻链以及Actinin)得到了很好的保存。
为了证实在Lazarus中进行保存的内皮功能优于在施尔生液中进行保存的内皮功能，对动脉左前降支(LAD)中的内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)进行免疫荧光标记，其中所述的动脉左前降支在施尔生液或者Lazarus中经过了4个小时的存储。内皮型一氧化氮合成酶是存在于内皮层中负责一氧化氮的生成的酶。正如附图17中所示，与存储于施尔生液中的心脏相比，被存储于Lazarus中的心脏的内皮层中的内皮型一氧化氮合成酶染色更加强健。这些结果表明，Lazarus在保存内皮细胞方面比施尔生液更加有效。
来自于心脏以及肝脏的10天的数据
在另外的研究中，对作为存储溶液对心脏以及肝脏进行10天存储的Lazarus进行了鉴定。经过10天之后，被存储于Lazarus中的所述心脏具有最小程度的坏死，强健的酯酶活性(存活/死亡检测——附图18以及19)，以及保存完好的内皮功能(附图20)。而且，被存储于Lazarus中的所述肝脏同样具有最小程度的坏死以及强健的酯酶活性(附图20以及21)。针对死后1小时的尸体组的心肌层以及冠状动脉左主干进行所述的存活/死亡检测，其中所述的心肌层以及冠状动脉左主干在Lazarus中经过了10天的存储。正如附图18中所示，被存储于Lazarus溶液中10天之后的心肌层以及冠状动脉左主干(死后1小时尸体解剖)具有最小程度的坏死(红色；两组中的左栏)以及显著的酯酶活性(绿色；两组中的右栏)，这意味着在Lazarus溶液中进行10天的存储能够对所述的心脏进行保存。附图19是一个代表性的绘图，表示的是在Lazarus中经过10天的存储之后所述的心肌层的酯酶活性的保存。在Lazarus溶液中存储10天之后，Lazarus对于酯酶活性的保存能力优于在施尔生液中存储4小时之后所述施尔生液对于酯酶活性的保存能力。(直接的比较参见附图6)。
对使用缓激肽刺激的动脉左前降支的内皮功能(钙的动员以及一氧化氮的生成)进行鉴定，其中所述的动脉左前降支在Lazarus中经过了10天的存储。正如附图20中所示，Lazarus溶液保存了动脉左前降支中的钙的动员(红色；左栏)以及一氧化氮的生成(绿色；中间栏)，这意味着在Lazarus中经过10天的存储之后，所述的内皮功能被得以保存。
附图21是一个代表性的绘图，表示的是在肝脏中被得以保存的酯酶活性，其中所述的肝脏于4℃下在Lazarus中经过了10天的存储。附图22表示的是肝脏样本中坏死的平均百分率少于15％，其中所述的肝脏样本于4℃下在Lazarus中经过了10天的存储，这意味着在Lazarus溶液中经过10天的存储之后，所述的肝脏被得以保存。
实施例3：灌注装置
附图26以及27描述的是灌注装置以及系统。附图26表示的是对人类心脏进行体外复苏以及保存的系统。所述的后负荷球囊泵控制主动脉的后负荷血压。所述的后负荷球囊泵任选的被压力调节器或者调节阀所替代。将心脏参数维持在下述范围内：后负荷和/或球囊泵压力为60-80毫米汞柱；主动脉根压力为40-80毫米汞柱(用于在存储过程中进行灌注)；流速为100-300cc/分钟；心脏输出量(CO)＞2升/分钟；以及血压(BP)为120-140/60-80毫米汞柱。所述的腔室以及水池(reservoir)中含有所述的溶液，例如，Lazarus溶液。所述系统中有两个元件是自我持续性的：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧酸激酶板以及乳酸脱氢酶(LDH)板。
按照下述内容实施一种复苏(唤醒)心脏的方法：
1.快速收集心脏并且在非常冰冷的Lazarus(4℃)中利用高浓度的钾(15毫摩)使所述的心脏停止循环。
2.利用仪器对所述的心脏进行快速处理，维持低温——即，在室温下停留最短的时间。
3.转移到过量的冰冷的Lazarus中并且在4℃下存储24小时。
次日：
1.按照需要，确立好血液化学机制。
2.准备好冰冷的Lazarus心肌麻醉液，其中含有碳酸氢钠19毫当量(mEq)，氯化钾18.5毫当量，硫酸镁37毫当量/升。
3.准备好未被氧化的血液。
4.以4∶1的比例混合血液以及Lazarus(确保适当的化学剂量；即，确认最终的钙浓度，镁浓度，钾浓度以及钠浓度)
5.利用#4对所述的灌注系统进行灌注——维持温度在15-20℃或者更低
6.快速将所述的心脏钩在所述的设备内；在经过身体检查之后(颜色，质地，可触知性，水肿/缩水等等)。
7.温度维持在15℃时，经由所述的主动脉根对所述的心脏进行灌注，灌注使用的是以4∶1的比例存在的未被氧化的血液(红细胞压积10-15％)以及心肌麻醉液(Lazarus，含有碳酸氢钠19毫当量，氯化钾18.5毫当量，硫酸镁37毫当量/升)，在40毫米汞柱的条件下灌注20-30分钟。
8.在20℃下利用被氧化的血液(红细胞压积＞15％)进行再灌注，灌注压力40毫米汞柱，灌注20分钟。提升所述的灌注压力至60毫米汞柱并且在30分钟的时间内将所述的温度逐步升高至37℃。所述的器官缓慢的升温至，例如，10℃，18℃，20℃，22℃等等，直至所述的器官达到37℃。
9.在所述试验的过程中检查过度挛缩。
10.所述的心脏运行至窦性心律，具有正常的心脏输出量(CO)以及左心室舒张末压(LVEDP)，收缩/舒张压。
11.进行转变，经由正常的生理学途径对所述的心脏进行灌注，通过所述的肺静脉或者左心房(心脏处于工作状态)。
12.将所述的心脏维持在工作状态，直至达到期望的稳定态。
13.测量心脏功能参数。
使用本发明所述的、在下文中被称为β-Lazarus溶液的溶液对所述的心脏进行重新启动，其中所述的心脏在α-Lazarus中进行了存储。表2表示的是在β-Lazarus中每种试剂的浓度。使用碳酸氢钠(8.4％)或者Tris-羟甲基氨基甲烷(THAM)将其pH调整至7.4，并且维持在21-37℃下。
替代性方案：
1.将所述的心脏钩在所述的灌注系统中。
2.在40-120毫米汞柱下将β-lazarus在所述的心脏中循环，其中所述的心脏具有非工作状态的构造(即，经由所述的主动脉根)，直至所述的灌注液和/或心脏的pH稳定在＞7.2；这一过程可能需要花费30分钟或者更久的灌注时间，来达到这种状态。
3.为了使之能够发生，通常按照需要，需要对所述的循环β-Lazarus的pH进行调整，所述的调整使用碳酸氢钠或者Tris-羟甲基氨基甲烷，依照在线彩色多普勒显像(CDI)以及血液气体监测进行调整。一旦达到所述的稳定态，将所述的循环β-Lazarus的pH维持在7.4。
4.按照需要，依照在线监测结果，将所述的β-Lazarus浓度，钙浓度，钾浓度以及钠浓度调整至生理水平。
5.一旦所述溶液的pH在7.4下稳定了5-10分钟，缓慢的排放出所述的β-Lazarus，同时使用血小板以及不含白细胞计数(WBC)的全血对其进行替代，直至所述的水池中达到4∶1(血液：β-lazarus)的配给量。或者，按照需要，这一配给量可以变化为5∶0，3∶2，2∶3，等等。
6.一旦所述的系统重新获得稳定态：即电解液以及pH的生理学水平(在线测量值)，将灌注血液：lazarus的温度缓慢的升高，每2-5分钟升高1℃，直至达到37℃。按照需要，在这段时间内对所述的电解液以及pH进行持续的调整。
7.一旦所述的温度达到28-30℃，所述的心脏应当开始搏动并且当所述的温度被升高至β7℃时，持续进行搏动。在这一阶段，所述的血液：Lazarus混合液可以完全被全血所替代。
8.之后可以按照描述的方法将所述的系统转换至工作状态，并且按照需要进行监测。
表2.用于对心脏进行重新启动的β-Lazarus器官保存溶液中的组分
附图27表示的是对人类心脏进行体外保存的系统，其中所述的人类心脏处于非工作状态。使用这一系统，器官例如心脏在进行复苏之前能够维持达到10天或者两周。灌注是经由所述的主动脉进行的，并且维持一种流动，例如，直通流动或者脉冲流动。所述溶液的流动抑制了凋亡基因的活化，而所述的流速为大约40毫升/分钟。将所述的存储单元保持在4-21℃的温度下，例如，在4-15℃的范围内。为了维持这样的温度，将所述的单元放置在一个冷却的腔室或者冰冷的房间内。可以选择的，所述的系统包括一个热交换器，用于调节并且维持在所期望的温度下。
在一个方面，在冰冷的温度下，在本发明所述的溶液中使用高浓度的钾离子使所述的心脏停止循环。优选的，存在于所述溶液中的高浓度的钾离子不会对所述心脏的内皮层以及离子通道产生伤害。更加优选的，从所述心脏中将所述的高浓度钾离子驱除出去，从而避免损伤。任选的，存在于本发明所述溶液中的镁的浓度是变化的。
在另外一个方面，对所述搏动的心脏的功能性进行评价，从而确定所述的心脏是否适合进行移植。任选的，对所述心脏的收缩性和/或所述心脏的pH进行评价，从而确定所述的心脏是否适合进行移植。可以选择的，对所述心脏腔室内的压力和/或体积进行测定，其目的在于对所述心脏的功能性进行评价。
在一个方面，本发明所述的系统能够将所述的组织维持在冰冷的温度下，例如，在4-15℃的范围内。在有规律的时间间隔处对所述溶液的pH进行测定，例如，每1小时，每2小时，每4小时，每8小时，或者每10小时。当所述的pH下降至低于6.8时，向所述的系统中加入本发明所述的新鲜溶液，其目的在于增加浸泡所述组织的所述溶液的pH。重复进行这一过程，直至所述的pH稳定在6.8至7.0左右，这标志着存储于所述组织中的三磷酸腺苷得到了补充。优选的，所述的组织是心脏。在一个方面，当所述系统的pH稳定在6.8至7.0之间时，所述的心脏重新启动。
可以选择的，在有规律的时间间隔处对所述组织的pH进行测定，例如，每1小时，每2小时，每4小时，每8小时，或者每10小时。优选的，所述的组织是心脏。任选的，使用pH电极对所述心脏的pH进行测定。或者，使用一种光纤探针系统对所述心脏的pH进行测定。在一个方面，对所述心脏的心肌层、前室壁、和/或后室壁的pH进行测定。
对所述组织或者溶液的pH进行测定，用以评价所述的组织是否适合进行移植。优选的，所述的组织是心脏。所述心脏的pH在6.8至7.0之间标志着所述的心脏在存储过程中得到的充分的保护。优选的，适合进行移植的所述心脏的pH在6.8至7.0之间。
本发明还提供了下述内容：在所述组织/器官的切离、存储、或者复苏的过程中对所述组织或者溶液的pH进行测定。优选的，所述的组织/器官是心脏。
在另外一个方面，对所述心脏腔室内的压力进行测定。任选的，对所述心脏的心室压力进行测定。在一个方面，使用聚酯薄膜(Mylar)导管对所述的压力进行测定。
在一个方面，将所述的心脏存储于本发明所述的溶液中(静态的)。在另外一个方面，对所述心脏的冠状动脉进行灌注。
在另外一个方面，所述的装置含有心脏输入口以及输出口。任选的，在所述的左肺血管以及右肺血管上进行插管。优选的，所述的主动脉以及左心房导管排放至所述装置中。
Claims (32)
1.一种用于保存或者复苏生物组织的组合物，所述的组合物包括一种生理盐溶液，进一步包括：(i)用于生成三磷酸腺苷的组分,其包括腺苷、肌酸乳清酸、一水合肌酸和葡萄糖；(ii)用于消耗氨的底物包括L-瓜氨酸苹果酸；(iii)用于缓冲细胞内酸度的试剂包括L-肉碱；(iv)用于淬火活性氧组分的试剂包括谷胱甘肽和抗坏血酸；以及(v)用于平衡组织水肿/脱水的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于生成三磷酸腺苷的底物进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：磷酸肌酸，肌酸乙酯，二肌酸苹果酸，肌酸葡糖酸，果糖，蔗糖，核糖，己糖以及戊糖。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于生成三磷酸腺苷的底物进一步包括二氯乙酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于消耗氨的化合物进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自由鸟氨酸与羧基磷酸所组成的组中。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：组氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，赖氨酸，以及牛磺酸。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：碳酸氢钠，二氯乙酸，Tris-羟甲基氨基甲烷，以及L-肌肽。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于淬火活性氧组分的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇，乙酰半胱氨酸，α-硫辛酸，牛磺酸，白藜芦醇(Resveratrol)，叶黄素，硒，甲硫氨酸，以及生育酚/维生素E。
8.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括一种用于平衡组织水分含量的试剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述的用于平衡组织水分含量的试剂选自下述组中：甘露醇，尿素，丙三醇，异山梨醇，以及五水合蜜三糖。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生理盐溶液包括水和一种或多种盐选自下述组中：氯化钙，氯化钾，磷酸钾，氯化镁，硫化镁，氯化钠，碳酸氢钠和磷酸钠。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生理盐溶液包括水、氯化钙，氯化钾，磷酸钾，氯化镁，硫化镁，氯化钠，碳酸氢钠和磷酸钠。
12.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括胰岛素。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物中包括：
0.1-0.5克/升氯化钙
0.25-0.75克/升氯化钾
0.01-0.5克/升磷酸钾(一钾盐)
0.01-0.5克/升氯化镁(六水合物)
0.01-0.5克/升硫酸镁(五水合物)
5.0-10.0克/升氯化钠
0.01-0.5克/升碳酸氢钠
0.01-0.5克/升七水合磷酸二钠
1.0-5.0克/升D-葡萄糖/葡萄糖
0.01-0.5克/升腺苷
0.01-0.75克/升谷胱甘肽(还原态)
0.01-0.5克/升抗坏血酸
0.01-0.5克/升L-精氨酸
0.01-0.5克/升肌酸乳清酸
0.01-0.5克/升一水合肌酸
0.01-0.5克/升L-瓜氨酸苹果酸
0.01-0.5克/升二氯乙酸
0.23-2.3克/升L-肌肽
0.20-2.0克/升L-肉碱
0.0021-0.21克/升α-硫辛酸
0.25-0.75毫升/升胰岛素
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
0.01-3.0升蒸馏水。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水团。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水团。
16.一种测量离体心脏的pH的方法，其包括：
h.将所述的离体心脏与权利要求1所述的溶液进行接触；
i.测定所述的离体心脏的pH；
其中存在于6.8至7.0之间的pH标志着所述的心脏适合进行移植。
17.一种测量权利要求1所述的溶液的pH的方法，其包括：
j.将离体心脏与权利要求1所述的溶液进行接触；
k.测定权利要求1所述的溶液的pH；
其中存在于6.8至7.0之间的pH标志着所述的心脏适合进行移植。
18.权利要求1的组合物在来自捐献者的移除器官的保存中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于生成三磷酸腺苷的底物进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：磷酸肌酸，肌酸乙酯，二肌酸苹果酸，肌酸葡糖酸，果糖，蔗糖，核糖，己糖以及戊糖。
20.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于生成三磷酸腺苷的底物进一步包括二氯乙酸。
21.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于消耗氨的化合物进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自由鸟氨酸与羧基磷酸所组成的组中。
22.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：组氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，赖氨酸，以及牛磺酸。
23.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于缓冲细胞内酸度的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：碳酸氢钠，二氯乙酸，Tris-羟甲基氨基甲烷，以及L-肌肽。
24.根据权利要求18所述的应用，其中所述的用于淬火活性氧组分的试剂进一步包括一种或多种化合物，所述的一种或多种化合物选自下述组中：二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇，乙酰半胱氨酸，α-硫辛酸，牛磺酸，白藜芦醇(Resveratrol)，叶黄素，硒，甲硫氨酸，以及生育酚/维生素E。
25.根据权利要求18所述的应用，进一步包括一种用于平衡组织水分含量的试剂。
26.根据权利要求25所述的应用，其中所述的用于平衡组织水分含量的试剂选自下述组中：甘露醇，尿素，丙三醇，异山梨醇，以及五水合蜜三糖。
27.根据权利要求18所述的应用，其中所述生理盐溶液包括水和一种或多种盐选自下述组中：氯化钙，氯化钾，磷酸钾，氯化镁，硫化镁，氯化钠，碳酸氢钠和磷酸钠。
28.根据权利要求18所述的应用，其中所述生理盐溶液包括水、氯化钙，氯化钾，磷酸钾，氯化镁，硫化镁，氯化钠，碳酸氢钠和磷酸钠。
29.根据权利要求18所述的应用，进一步包括胰岛素。
30.根据权利要求18所述的应用，其中所述的组合物中包括：
0.1-0.5克/升氯化钙
0.25-0.75克/升氯化钾
0.01-0.5克/升磷酸钾(一钾盐)
0.01-0.5克/升氯化镁(六水合物)
0.01-0.5克/升硫酸镁(五水合物)
5.0-10.0克/升氯化钠
0.01-0.5克/升碳酸氢钠
0.01-0.5克/升七水合磷酸二钠
1.0-5.0克/升D-葡萄糖/葡萄糖
0.01-0.5克/升腺苷
0.01-0.75克/升谷胱甘肽(还原态)
0.01-0.5克/升抗坏血酸
0.01-0.5克/升L-精氨酸
0.01-0.5克/升肌酸乳清酸
0.01-0.5克/升一水合肌酸
0.01-0.5克/升L-瓜氨酸苹果酸
0.01-0.5克/升二氯乙酸
0.23-2.3克/升L-肌肽
0.20-2.0克/升L-肉碱
0.0021-0.21克/升α-硫辛酸
0.25-0.75毫升/升胰岛素
用于调整pH的Tris-羟甲基氨基甲烷
0.01-3.0升蒸馏水。
31.根据权利要求18所述的应用，其中所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水团。
32.根据权利要求30所述的应用，其中所述的组合物中包括以纳米范围的尺寸存在的水团。
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