KR100743499B1 - 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 8-옥소-구아노신(8-oxo-guanosine, oh8G), 8-옥소-데옥시구아노신(8-oxo-deoxyguanosine, oh8dG) 중 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 마크로파지의 Rac2의 활성을 억제 시키며, 또한 이로 인하여 NADPH oxidase의 활성이 억제되고 동시에 활성산소 생성을 억제한다.

또한, 본 발명의 조성물은 LPS에 의하여 유도되는 pro-inflammatory cytokine의 혈중농도 상승 억제, 폐 조직에서의 MPO(myeloperoxidase) 활성 상승 억제, 폐 조직에서 Rac2 활성 증가 억제, 그리고 LPS에 의한 마우스 사망율을 현저히 억제한다.

따라서, 본 발명의 항염증용 조성물은 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스, 다발성 경피증, 성인 호흡곤란 증후군 등의 다양한 염증 질환에 대한 항염증제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항염증용 조성물{Composition for anti-inflammation}

도1은, C57B/L 마우스의 마크로파지에서 PMA에 의하여 유도된 Rac2 활성이, oh8dG 투여에 의하여 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인한 도이다.

도2는, PMA에 의하여 활성화된 마크로파지에서, NADPH 소비가 oh8dG 투여에 의하여 농도의존적으로 억제되는 것을 나타낸 도이다.

도3은, PMA에 의하여 활성화된 마크로파지에서, 활성산소의 생성이 oh8dG 투여에 의하여 농도의존적으로 억제되는 것을 나타낸 도이다.

도4는, PMA에 의하여 활성화된 마크로파지에서, 활성산소의 생성이 oh8dG, oh8G 투여에 의하여 다른 물질 투여시와 비교하여 현저히 억제되는 것을 나타낸 도이다.

도5는, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 혈중 TNF-α 농도가 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도6은, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 혈중 IL-6의 농도가 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도7은, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 혈중 IFN-γ의 농도가 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도8은, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 혈중 IL-12p70의 농도가 농도의존적 으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도9는, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 혈중 IL-18의 농도가 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도10은, LPS 처리한 마우스에서 oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 폐로의 호중구 침투가 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도11은, LPS 처리한 마우스에서 oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 폐에서의 Rac2 활성이 농도의존적으로 감소한 것을 나타낸 도이다.

도12는, Balb/c 마우스에 LPS를 50mg/kg b.w. 투여하여 유도된 폐혈성 쇽에 대하여, oh8dG, oh8G의 전처리에 의하여 생존율의 보호효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 항염증용 조성물에 관한 것이다.

생체에서 끊임없이 생성되는 활성산소는 세포의 주요 물질을 파괴하는데 DNA는 대표적인 공격 대상 물질의 하나이다. 활성산소에 의한 DNA의 손상에는 여러 종류가 있지만 가장 대표적인 손상의 하나는 활성산소가 guanine 염기의 8번 위치에 수산화 반응을 일으켜 생성되는 8-hydroxyguanine(8-oxoguanine, 이하 ‘8-oxo-G’라고 함)으로 알려졌다(Kasai H. Mutat Res. 1997 Dec;387(3):147-63; Wu LL, et al. Clin Chim Acta. 2004 Jan;339(1-2):1-9). 그러나 지금까지 8-oxo-G에 관한 대부분의 연구는 DNA에 존재하는 8-oxo-G을 중심으로 돌연변이 또는 발암 작용에 국 한되어 왔다. 왜냐하면 생체 내의 구아닌이 항상 시토신(C)과 쌍을 이루는데 반하여, 8-oxo-G는 adenine(A)과 쌍을 이루어 CG를 TA로 전환시키는 돌연변이 작용을 가지고 있기 때문이다(Shibutani S, et al. Nature. 1991, 349: 431-4; Kamiya H, et al. Cancer Res. 1992, 52: 3483-5). 또한 세포 DNA 내에, 8-oxo-G의 생성이 많은 발암물질(Cancer Res. 1996 Feb 15;56(4):683-8; Cancer Res. 1997 Apr 1;57(7):1281-7; Free Radic Biol Med. 1995 Mar;18(3):431-6) 및 방사선(Environ Health Perspect. 1993 Mar;99:261-3; FEBS Lett. 2004 Jan 2;556(1-3):104-10)에 의해서 증가되는 동시에 각종 발암억제 물질(chemopreventive agent)에 의해서는 억제(Baik SC, et al. Cancer Res. 1996, 56: 1279-82.; Chung MH, et al. Free Radic Biol Med. 1992, 12: 523-5.; Fraga CG, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 88: 11003-6.)될 뿐만 아니라 DNA에 존재하는 8-oxo-G를 제거하는 효소가 밝혀졌다(Tchou J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 88: 4690-4.; Lee YS, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1993, 196: 1545-51). 이는 DNA 내의 8-oxo-G는 발암 유발 작용을 가지고 있으며, 따라서 제거되어야 하는 변형 염기임을 강력히 시사하는 것이다. 또한 8-oxo-G는 핵 DNA의 구아닌 뿐만 아니라 세포질에 존재하는 dGTP(deoxyguanosine triphosphate) 및 GTP(guanosine triphosphate)의 구아닌 염기에서 생성됨이 알려졌다. 왜냐하면 세포에는 dGTP 및 GTP의 구아닌 염기가 활성산소에 의해서 8-oxo-G로 변성되어 생긴 8-oxo-dGTP 및 8-oxo-GTP를 8-oxo-dGMP 및 oh8GMP로 가수 분해시키는 효소 즉 8-oxo-dGTPase(Mut T라고도 함)가 존재하기 때문이다(Shinmura K, et al. Nucleic Acids Res. 2000, 28: 4912-8). 이 효 소의 작용으로 8-oxo-dGTP 및 8-oxo-GTP는 각각 DNA 또는 RNA로 삽입되지 못하므로 세포질내의 8-oxo-dGTP 및 8-oxo-GTP에 의한 유전 정보교환이 방해되고 있다. 이와 같이 DNA내의 8-oxo-dG 또는 세포질 dGTP(또는 GTP)내의 8-oxo-dG에 대한 연구는 모두 유전정보의 교환에 의한 돌연변이 또는 발암 작용에 집중되어 왔다.

한편 Ras는 산화적 스트레스(oxidative stress)에 대한 세포반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 하나로 알려진 ERK(extracellular signal-regulated kinase)는 활성산소에 의해 활성화되며(Fialkow L, et al. J Biol Chem. 1994 Dec 9;269(49): 31234-42.; Guyton KZ, et al. J Biol Chem. 1996 Feb 23;271(8):4138-42), 이때 Ras가 관여함이 보고되었다(Lander HM, et al. J Biol Chem. 1995 Sep 8;270(36):21195-8; Aikawa R, et al. J Clin Invest. 1997 Oct 1;100(7):1813-21). 최근 산화적 스트레스(oxidative stress) 시 세포질 내의 GTP로부터 8-oxo-GTP가 생성되고, Ras는 GTP보다도 8-oxo-GTP에 의하여 더욱 활성화되며, 활성화된 Ras는 downstream의 kinase들을 모두 활성화시킴이 관찰되었다(Yoon SH, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Feb 4;327(1):342-8). 이에 따라, 세포질 내의 8-oxo-dGTP 및 8-oxo-GTP는 단순히 DNA 또는 RNA에 삽입되어 유전정보 교환 방해 작용을 하는 단순한 부산물로만 국한되지 않고 세포기능에 영향을 주는 생리활성을 가지는 물질일 수 있다는 가능성이 대두되기 시작하였다.

이에 본 발명자들은, Ras 이외의 small GTP-binding 단백질인 Rac에 대한 8-oxo-GTP의 효과를 검증하기로 하였다. Rac은 백혈구에서 NADPH oxidase 활성화를 유도하여 활성산소를 생성시킬 뿐만 아니라(Blood. 2002 Oct 15;100(8):2692-6; J Immunol. 2004 Nov 15;173(10):5971-9; J Biol Chem. 1983 Aug 25;258(16):9631-5; J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4613-20.; J Biol Chem. 1994 Mar 11;269(10):7055-8), 백혈구의 식균작용(phagocytosis)(J Immunol. 2004 Nov 15;173(10):5971-9; J Biol Chem. 2004 Oct 8;279(41):43273-84) 및 백혈구의 이동(J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4613-20.; Ridley AJ. Trends Cell Biol. 2001, 11: 471-7)에 필수적으로 작용하는 small GTP-binding 단백질이므로 만약 Ras와는 달리 8-oxo-GTP가 Rac에 억제작용을 나타낸다면 백혈구의 염증유발 작용을 억제시킬 수 있기 때문이다. 그러나 Rac에 대한 작용 또는 염증억제 작용은 8-oxo-GTP의 인산기(phosphate기)가 없는 8-oxo-Gua의 nucleoside인 8-oxo-guanosine(oh8G) 및 8-oxo-deoxyguanosine(oh8dG)을 사용하였다. 왜냐하면 8-oxo-GTP는 세포나 조직의 homogenate에서는 작용을 발휘할 수 있지만, 세포막을 통과하지 못하므로 세포와 반응시키거나 생체의 투여하였을 때에는 전혀 작용을 나타내지 못하기 때문이다.

따라서, 본 발명에서는 8-oxo-Gua의 두 가지의 nucleoside, 즉, oh8G 및 oh8dG의 Rac에 대한 억제작용을 비롯한 항염증 작용을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하 는 항염증용 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 예방방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 치료방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 8-옥소-구아노신(8-oxo-guanosine, oh8G), 8-옥소-데옥시구아노신(8-oxo-deoxyguanosine, oh8dG) 중 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항염증용 조성물은 유효성분으로 8-옥소-데옥시구아노신을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항염증용 조성물은 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스(Lupus ethrythematosus), 다발성 경피증(multiple scleroderma), 성인 호흡곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome, ARDS)에서 선택된 하나 이상의 염증 질환에 항염증제로 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 예방방법을 제공한다.

또한 본 발명은 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 oh8G(8-oxo-G) 또는 oh8dG(8-oxo-dG)는 구아닌 뉴클레오시드의 산화물이다.

하기 실시예들을 통하여 확인된 바와 같이, 상기 성분 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 마우스 마크로파지의 Rac2의 활성을 억제 시키며, 또한 이로 인하여 NADPH oxidase의 활성이 억제되고 동시에 마우스 마크로파지로부터 활성산소 생성을 억제한다.

또한, 본 발명의 조성물은 LPS에 의하여 유도되는 pro-inflmmatory cytokine의 혈중농도 상승 억제, 폐 조직에서의 MPO(Myeloperoxidase) 활성 상승 억제, 폐 조직에서 Rac2 활성 증가 억제, 그리고 LPS에 의한 마우스 사망을 현저히 억제한다. 이 같은 본 발명의 oh8dG를 함유하는 조성물의 항염증 효과는 대표적인 NSAIDs의 하나인 아스피린(ASA)에 비하여 현저히 우수하다.

이와 같이, oh8G, oh8dG 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은, 백혈구의 Rac을 억제하여 그 효능을 나타내므로 현재 가장 널리 쓰이고 있는 NSAIDs계 항염증제와는 달리 소화기 장애 등의 부작용을 거의 나타내지 않는 우수한 항염증제로 사용될 수 있다.

NSAIDs계 항염증제의 부작용은 이들이 Cox(cyclooxygenase) 중 Cox2만 억제하지 않고 Cox1 까지 억제하기 때문인 것으로 보이며, nucleoside로부터 예상되는 가장 위험한 부작용은 이들이 DNA 또는 RNA로의 삽입에 의한 유전정보 교환인데 미리 guanylate kinase 등 이들을 oh8G 및 oh8dG 로 전환시키는 효소의 작용을 갖지 않으므로 DNA나 RNA로 삽입될 수 없음이 밝혀졌다.

따라서, oh8G, oh8dG 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 NSAIDs와 같은 부작용을 나타내지 않는 새로운 항염증제로 사용될 수 있다. 예를 들면, 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스(Lupus ethrythematosus), 다발성 경피증(multiple scleroderma), 성인 호흡곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome, ARDS) 등 각종 자가 면역 질환을 포함하는 염증성 질환에 사용될 수 있다. 특히 LPS에 의한 마우스의 사망에서 사람에게는 폐혈증 때 나타나는 성인 호흡곤란 증후군과 유사한 현상이므로 현재 뚜렷한 치료제가 없는 ARDS에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 투여량은 염증을 억제 또는 치료하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01mg/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 예방방법 또는 치료방법에서 투여방법은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 예방방법 또는 치료방법에서 투여량은 염증을 억제하거나 치료하는데 유효한 양으로서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예1 . oh8dG 에 의한 마우스 마크로파지(macrophage)의 Rac2 활성 억제 효과 확인

1-1. 생쥐에서의 마크로파지의 분리

본 발명의 실시예에서는 마우스 마크로파지를 사용하였으며 그 이유는 마우스의 대량 확보가 가능하고 마크로파지 역시 각종 염증 질환에서 중요한 역할을 하는 대표적인 백혈구이기 때문이다.

C57BL/6종의 8주령 암컷 생쥐 복강에 마크로파지 활성자(macrophage activator)인 Tg(Thiol glycollate) medium을 200㎕을 주사하고 3일 후 희생하여 PBS 10㎖을 복강에 주사하고 약 2분간 생쥐를 좌우 앞뒤로 약하게 흔들어 주었다. 그 후 바로 복강에 주사한 PBS를 다시 뽑아내어 원심분리하여 세포를 침전시켜 세포수를 계수한 후, 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지를 첨가하여 세포 배양용 디쉬에 접종(seeding)하였다.

1-2. Rac2 활성 억제 확인

백혈구의 활성산소 생성, 식균작용 및 이동에 주로 관여하는 것으로 알려진 Rac2에 대한 oh8dG (Barry & Associate Co., USA)의 효과를 확인하였다.

우선 마우스 마크로파지를 PMA(phorbol mylistate acetate)로 처리한 경우 Rac2의 활성이 증가하였다(도 1). 이는 마치 세균을 식균할 때 Rac2가 활성화되는 기전과 같다. 그러나 이 같은 PMA에 의한 Rac2의 활성화는 8-oxo-dG 전처리에 의하여 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다(도 1). 양성 대조군(positive control)으로 사용한 Rac2 억제제인 DPI(diphenylene iodide) 역시 Rac2의 활성을 억제시킴을 관찰할 수 있었다.

실시예2 . oh8dG 에 의한 마우스 마크로파지의 NADPH oxidase 활성억제 효과 확인

염증반응에서 Rac2는 NADPH oxidase를 활성화시키므로, oh8dG가 NADPH oxidase의 활성화에 미치는 영향을 확인하였다.

실시예1-1에서 분리한 마우스 마크로파지 세포를 60mm dish 에 약 80% 정도 seeding 하여 인산완충액(PBS, phosphate buffered saline)으로 세척하고, 세포를 디쉬에서 떨어뜨린 후 PBS 1㎖을 첨가하여 8-oxo-dG를 농도별로 15분 동안 선 처리 한 후 PMA 10㎍/㎖을 5분 동안 처리하였다. 그 후 NADPH 85㎍/㎖을 첨가하여 스펙트로포토미터로 340nm에서 30분 동안 시간별로 흡광도(A340)를 측정하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, oh8dG는 복강으로부터 분리한 마크로파지(PEM, peritonial exudate macrophage)에서 PMA에 의해 증가된 NADPH oxidase의 활성화를 농도 의존적으로 억제시켰다. 즉, NADPH oxidase는 NADPH를 산화시키며 이에 따라 A340를 감소시키는데 A340의 감소가 oh8dG에 의하여 억제되고 있음을 보여주고 있다. 양성 대조군으로 사용한 DPI 역시 NADPH oxidase의 활성을 억제시킴을 관찰할 수 있었다.

실시예3 . oh8dG , oh8G 에 의한 마우스 마크로파지의 활성산소 생성 억제 효과 확인

염증반응에서 Rac2에 의해 활성화된 NADPH oxidase는 활성산소 생성을 유발하므로, oh8dG가 마우스 마크로파지의 활성산소 생성을 억제하는 효과를 확인하였다.

실시예1-1에서 분리한 마우스 마크로파지 세포를 96 well dish 에 약 7x10⁴ 개를 seeding 하였다. 8-oxo-dG 외 여러 유도체를 농도별로 15분 동안 선 처리 한 후 PMA 10㎍/㎖을 5분 동안 처리하였다. 세포외의(extracellular) ROS를 감지할 수 있는 OxyBURST Green probes라는 형광물질을 처리 후 microplate fluorescence reader에서 490nm/525nm에서 측정하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, oh8dG는 PMA 자극으로 유발된 활성산소 생성을 농도 의존적으로 억제시켰다. 특히 oh8dG의 농도가 증가함에 따라 PMA를 넣지 않은 상태에서의 생성보다도 더욱 낮아지고 있음을 보여주고 있다. 이는 실험에 사용된 마우스 마크로파지를 분리하는 과정에서 이미 Rac2가 활성화되어 활성산소 생성이 증가 되어 있음을 의미하고 있다.

그러나 8-oxo-GTP-γS(8-oxo-GTP의 비가수분해 형)는 전혀 효과가 없음을 보여주고 있다(도 3). 따라서 8-oxo-guanine의 nucleotide는 약물로 사용할 수 없 음을 강력히 시사하고 있다.

도 4는 oh8dG, oh8G에 의한 마우스 마크로파지의 활성산소 생성 억제 효과를 DNA 염기 화합물의 효과와 비교하였다. 우선 시료의 용매로 사용한 DMSO는 약간 감소시켰다. 이는 아마도 DMSO가 활성산소 scanvenging 작용 때문일 것으로. 정상 guanine(G), 정상 deoxyguanine(dG), 정상 adenosine(A) 역시 약간의 억제효과는 있으나 oh8dG 보다는 훨씬 약하였다. 그러나 oh8G는 oh8dG와 같은 정도의 억제 작용을 나타내었다.

실시예4 . lypopolysaccharide ( LPS )로 처리된 마우스의 혈중 proinflammatory cytokine 농도 억제 효과 확인

oh8dG, oh8G의 항염작용 효과를 동물실험으로 확인하기 위하여, 마우스에 LPS를 투여하여 염증을 유발시킨 후 염증유발에 관련된 혈중 cytokine의 억제효과를 확인하였다.

4-1. 실험동물

6주령의 수컷 Balb/c 생쥐 복강에, 생리식염수에 녹인 oh8dG (6, 30, 60 mg/kg b.w.), oh8G (6, 30, 60 mg/kg b.w.), 및 ASA, dG, G, A (60 mg/kg b.w.)를 각각 주사하였다. 4시간 후, 염증을 유발하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, 1mg/kg b.w.)를 복강주사(i.p.)하고, 2 시간 후 에테르(ether) 마취 하에서 생쥐의 혈액을 복부하대정맥 및 심장에서 생쥐 당 약 600 ㎕ 채취하고, 장기로는 폐, 심장, 간, 신장을 채취하여 냉동보관하였다. 각 실험군은 생쥐 10마리로 구성하였다.

4-2. oh8dG , oh8G 에 의한 염증유발 사이토카인 억제효과 확인

상기 4-1에서 채취한 혈액은 실온에서 1시간 보관 후 8,000g에서 20분간 원심분리하여 상층에 형성된 혈청(serum)을 취하여 분주 후 -80 ℃에 냉동보관하였다. 사이토카인 측정은 두 가지 방법 즉, Cayman Co. (USA)에서 구입한 사이토카인 측정시스템 혹은 Multicytokine analysis system을 사용하였다. 각 실험군 당 측정개체수는 5마리씩 하였다.

도 5는 TNF-α의 혈중농도에 미치는 영향이다. 도 5에서 보는 바와 같이 oh8dG는 농도 의존적으로 LPS에 의한 TNF-α 농도상승을 억제시켰다. 이러한 작용은 아스피린(ASA) 보다도 더 강력하였다. oh8G 역시 억제 작용을 나타내었으나 oh8dG보다는 약하였다. 그러나 정상 dG는 전혀 작용을 나타내지 아니하였고, G와 A는 미미한 작용효과를 나타내었다.

도 6은 IL-6의 혈중농도에 미치는 영향이다. 도 6에서 보는 바와 같이 8-oxo-dG는 농도 의존적으로 LPS에 의한 IL-6의 농도증가를 현저히 억제시켰다. 이같은 작용은 ASA와 유사하였고 8-oxo-G역시 8-oxo-dG만큼 강력한 효과를 나타내었다.

도 7은 INF-γ의 혈중농도에 미치는 영향이다. 도 7에서 보는 바와 같이 8-oxo-dG는 INF-γ의 농도 상승을 현저히 억제시켰다. 다른 화합물 역시 억제작용을 나타내었으나 8-oxo-dG보다는 약하였다.

도 8은 IL-12p70의 혈중농도에 미치는 영향이다. 도 8에서 보는 바와 같이 oh8dG는 LPS 대조군, 즉 정상 마우스에 있는 양보다도 IL-12p70의 혈중농도를 더욱 농도별로 감소시켰다. 그러나 oh8dG는 큰 효과를 보이지 않았다. ASA도 정상군의 양보다 감소시키나 oh8dG보다는 약하였다.

도 9는 IL-18의 혈중농도에 미치는 영향이다. 도 9에서 보는 바와 같이 oh8dG는 농도 의존적으로 IL-18의 혈중농도를 감소시켰다. oh8G도 oh8dG보다는 약하나 감소효과를 보였다. 이 경우에도 ASA의 효과는 oh8dG 최고사용농도의 효과보다는 약하였다. 다른 대조군에서는, 비록 실험값의 오차가 큰 경우도 있으나 큰 효과가 없었다.

실시예5 . oh8dG , oh8G 에 의한 마우스 폐의 Myeloperoxidase ( MPO ) 활성 억제 효과 확인

실시예4-1에서 얻은 마우스 폐조직을 조직용해 용액 (50mM potassium phosphate buffer, pH 6.0, 0.5% hexadectltrimethylammonium bromide)에 녹인 후 homogenizer를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄물은 초음파분쇄기(ultrasonicator)를 사용하여 10초씩 3회 분쇄하였다. 분쇄물을 4 ℃ 냉장원심분리기에서 12,000g로 10분간 분리하여 상층액을 취한 후 분주하여 -80 ℃에 냉동 보관하였다.

MPO 활성도 측정은 해동한 단백질 40㎍/40㎕, 1.6mM tetra-methyl-benzidine, 0.1 mM hydrogen peroxide를 총 120 ㎕ 부피에서 37 ℃에서 2분간 반응시킨 후, 얼음 위에서 2M 황산을 가하여 반응을 중지시켰다. 반응 결과의 색 변화는 multiplate reader에서 450nm에서 측정하였다.

도 10은 마우스의 폐에 침투한 호중구의 myeloperoxidase 활성을 측정 비교한 자료이다. 정상군의 폐에서는 약 0.17 U/mg tissue의 활성을 보였으나 LPS 처치 후 약 1 U/mg tissue로 증가하였다. oh8dG는 농도 의존적으로 이 효소의 활성을 현저히 감소시켰다. oh8G는 오차범위 내에서 농도별 감소 효과를 보였으나 현저하지는 않았다. ASA는 감소효과를 보였으나 oh8dG에 비하여는 현저히 약하였다. 다른 대조군들의 효과는 oh8dG에 비하여 크지 않았다.

실시예6 . oh8dG , oh8G 에 의한 마우스 폐조직 중 호중구 및 대식세포의 Rac2 활성 억제 효과 확인

실시예4-1로부터 얻은 폐조직을 해동하여 용해용액(25mM Tris HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1% NP-40, 1 mM DTT, 5% glycerol)에 녹이고 homogenizer로 분쇄한 후, 초음파분쇄기에서 10초씩 3회 분쇄시켰다.

효소의 활성도 측정은 단백질 500 ㎍에 활성 Rac2에 붙는 PAK-1 PBD bead (Upstate Biotechnology Co., USA)를 7 ㎕ 더 한 후 냉장고에서 1시간 회전 상태로 보관하였다. 그 결과물들은 냉장원심분리기에서 14,000g 로 4초간 분리하여 bead만 확보하고 위의 용해용액으로 3회 세척하였다. 결과물 bead에는 활성화된 Rac2가 붙어 있으므로 SDS sample 용액을 가하고 95 ℃에서 끓인 후 12% 아크릴아마이드 젤에서 전기영동하여 분리하였다. 일차항체로는 Santa Cruz Co. (USA)의 항체를 사용하여 Western blotting을 실시하였다.

도 11은 폐조직에 존재하는 호중구 및 대식세포의 Rac2 활성도를 측정 비교한 결과이다. LPS처치에 의하여 Rac2는 활성화가 증가하였으나, oh8dG의 사전 처치는 농도 의존적으로 이의 활성을 현저히 억제하였다. oh8G도 다소 억제하나 oh8dG에 대비하여 효과가 적었다. ASA는 Rac2를 억제하지 못하였고, dG, G는 다소 감소시키는 효과를 보였다.

실시예7 . 폐혈병성 쇽 (septic shock)에 의한 마우스 사망률 감소 효과 확인

실시예4-1에서 언급한 방법으로 실험 약물들을 60mg/kg b.w.로 주사 후 LPS를 50 mg/kg b.w.로 주사하였다. 각 일정 시간별로 생존한 마우스를 계수하였다.

도 12는 LPS에 의한 폐혈병성 쇽 (septic shock)에 대한 oh8dG의 보호효과를 마우스의 생존 여부 결과로 나타낸 도이다. LPS를 50mg/kg b.w.로 복강주사시 24시간 이내에 급격한 마우스의 사망이 있었다. 24시간 내에 10마리 중 9마리가 사망하였다. 그러나 oh8dG를 사전 처치한 경우에는 동일 시간 내의 사망률이 완만하였다. 즉, 마우스의 사망이 지체되었다. 36시간 후 oh8dG를 처치한 군의 경우 10마리 중 3마리, ASA를 처치한 경우 10마리 중 1마리가 생존하였다.

따라서, 본 발명의 조성물이 폐혈성 쇽에 의한 사망률을 감소시키는 작용효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 살펴본 바와 같이, 본 발명의 oh8G, oh8dG 중 하나 이상의 성분을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 마크로파지의 Rac2의 활성을 억제 시키며, 또한 이로 인하여 NADPH oxidase의 활성이 억제되고 동시에 마크로파지로부터 활성산소 생성을 억제한다.

또한, 본 발명의 조성물은 LPS에 의하여 유도되는 pro-inflammatory cytokine의 혈중농도 상승 억제, 폐 조직에서의 MPO 활성 상승 억제, 폐 조직에서 Rac2 활성 증가 억제, 그리고 LPS에 의한 마우스 사망률을 현저히 억제한다. 이러한 본 발명의 조성물은 대표적인 NSAIDs의 하나인 아스피린(ASA) 에 비하여 현저히 우수한 항염증 효과를 나타내며, NSAIDs계 항염증제와는 달리 소화기 장애 등의 부작용을 거의 나타내지 않으므로 우수한 항염증제로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 항염증용 조성물은 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스, 다발성 경피증, 성인 호흡곤란 증후군 등의 다양한 염증 질환에 대한 항염증제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 8-옥소-구아노신, 8-옥소-데옥시구아노신 중 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 8-옥소-데옥시구아노신을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 염증은 류마티스 관절염인 항염증용 약학 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 염증은 홍반성 루푸스인 항염증용 약학 조성물.
5. 제 2항에 있어서, 상기 염증은 다발성 경피증인 항염증용 약학 조성물.
6. 제 2항에 있어서, 상기 염증은 성인 호흡곤란 증후군인 항염증용 약학 조성물.

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