KR101270123B1

KR101270123B1 - 항산화용 조성물

Info

Publication number: KR101270123B1
Application number: KR1020050069957A
Authority: KR
Inventors: 김현기
Original assignee: 김현기
Priority date: 2005-07-30
Filing date: 2005-07-30
Publication date: 2013-05-31
Also published as: KR20070015261A

Abstract

본 발명은 프레닐레틴(prenyletin), 프락시딘 메틸 에테르(fraxidin methyl ether), 산틸레틴(xanthyletin), 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터(methylorsellinic acid ethyl ester), 해마톰믹 산 에틸 에스터(haematommic acid ethyl ester), 디프라틱 산(diffratic acid), 메톡살렌(methoxsalen) 및 쿨만닌(kuhlmannin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 항산화 활성이 탁월하여 생체 내 프리 라디칼을 조절하는 항산화제로 유용하게 사용될 수 있다.

프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌, 쿨만닌

Description

항산화용 조성물{Antioxidant composition}

본 발명은 항산화 효과가 탁월한 항산화용 조성물에 관한 것이다.

노화 과정(aging process)은 다양한 이론에 의해 특성 지워지는데(Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of aging. Nature 408: 239-247; 2000, Sohal, R. S. 등, Mechanism of agin: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. Free Radic . Biol . Med . 33: 575-586; 2002, 및 Roy, A. K. 등, Impacts of transcriptional regulation on aging and senescence. Aging Res. Rev. 1: 367-380; 2002 참조), 그 중에서도 생활속도(rate of living) 이론 및 프리 라디칼(free radical) 이론이 노화 과정의 주 이론이다. 최근에, 프리 라디칼 이론이 노화 상태를 만족시키는 많은 설명을 제공할 수 있다는 것이 증명된 이래(Sohal, R. S. 등, Mechanism of agin: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. Free Radic . Biol . Med . 33: 575-586; 2002 참조), 노화의 프리 라디칼 이론이 많은 과학자로부터 관심과 동의를 얻고 있다. 이 이론에서 노화는 세포 내 다양한 생물학적 분자에 프리 라디칼 매개 산화적 스트레스가 축적되어 발생한다고 판단한다(Lin, M. T. 등, The oxidative damage theory of aging. Clin . Neurosci . Res. 2: 305-315; 2003 참조).

또한 산화적 스트레스는 명백하게 세포 기능을 손상시키며 에이즈, 신경퇴행성 질환, 암과 같은 악성 질환, 당뇨병, 죽상경화증, 류마티스성 관절염 및 허혈을 포함하는 몇몇 질병의 발병기전과 관련성이 크다(Lin, M. T. 등, The oxidative damage theory of aging. Clin . Neurosci. Res. 2: 305-315; 2003 및 Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol . Rev. 82: 47-95; 2002 참조). 즉 이러한 프리 라디칼은 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, 디옥시리보핵산 (DNA) 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌 질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자가면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들 활성산소에 의한 체내 지질성분의 과산화 작용으로 생성되는 지질 과산화물은 체내의 다른 과산화물들과 함께 정상세포를 파괴함으로써 각종 기능장애를 야기해 질병의 원인이 되기도 한다 (Halliwell B., Drugs 42: 569, 1991; Fukuzawa K. 등, J. Act. Oxyg. Free Rad. 1: 55, 1990; 및 Neuzil J. 등, J. Med. 320: 915, 1989 참조).

혐기성 대사에 의해 정상 상태에서 일정하게 생성되는 ROS(reactive oxygen species) 및 RNS(reactive nitrogen species)는 과산소 음이온(superoxide anion), 하이드록실 라디칼, 비라디칼(nonradical) 과산화수소(hydrogen peroxide), 퍼옥시니트라이트(peroxinitrite), 니트록실(nitroxyl) 음이온 및 니트릭 옥사이드와 같은 프리 라티칼을 함유하고 있다(Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol . Rev. 82: 47-95; 2002, Curtin, J. F. 등, Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis. J. Immunol . Methods 265: 49-72; 2002., 및 Beckman, K. B. 등, The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev. 78: 547-581; 1998 참조). 정상적 생물학적 시스템에서 산화환원(redox) 항상성은 ROS 생성과 항산화제라고 불리는 다양한 종류의 스캐빈저(scavenger) 사이의 균형을 조절하여 유지된다.

산화제-항산화제 균형의 일시적 변동은 일반적으로 반대 종(counter species)의 생성을 증감하여 조절되고 시간의 경과에 따라 항정상태(steady-state)로 돌아온다(Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol . Rev. 82: 47-95; 2002, Zhang, M. 등, Redox sensing by prokaryotic transcription factors. Biochem . Pharmacol . 59: 1-6; 2000., Adler, V. 등, Regulation of JNK signaling by GSTp. EMBO J. 18: 1321-1334; 1999., Nakamura, H. 등, Adult T cell leukemia-derived factor/human thioredoxin protects endotherial F-2 cell injury caused by activated neorophils or hydrogen peroxide. Immunol . Lett . 42: 75-80; 1994., 및 Shuli, S. 등, Differential regulation of antioxidant enzymes in response to oxidants. J. Biol. Chem . 266: 24398-24403; 1991. 참조). 그러나, 대량의 ROS 또는 RNS이 비정상적으로 지속적으로 생성된다면 신호전달 및 유전자 발현에 있어 지속적 변화를 야기하고, 이것이 결과적으로 일정한 질병을 야기할 수 있다.

일시적으로 과-형성된 세포 내 ROS 또는 외부 ROS에의 노출을 포함하는 산화 적 스트레스에 대한 효소적 및 비-효소적 자가 방어 시스템이 광범위하게 확인, 연구되어왔다. 카타라제, SOD, 글루타치온 포옥시다제 (GPX)는 효소적 방어 시스템의 일종이며, 비-효소적 시스템은 토코페롤, 아스코르베이트, 유레이트(urate), 글루타치온 등이 있다(Sies, H., Strategies of antioxidant defense. Eur . J. biochem. 215: 213-219; 1993 참조).

한편 일본 특허공보 제7300412호에서는 메틸 갈레이트 등을 이용한 활성 산소 제거제 및 조성물을 개시하고 있으나 메틸 갈레이트(methyl gallate), 프락신(Fraxin) 등은 항산화 효과가 상대적으로 약해 복용량이 많아진다는 문제점이 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 항산화 효과가 탁월한 항산화용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 프레닐레틴(prenyletin), 프락시딘 메틸 에테르(fraxidin methyl ether), 산틸레틴(xanthyletin), 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터(methylorsellinic acid ethyl ester), 해마톰믹 산 에틸 에스터(haematommic acid ethyl ester), 디프라틱 산(diffratic acid), 메톡살렌(methoxsalen) 및 쿨만닌(kuhlmannin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 항산화제로 사용하는 새로운 용도를 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 프레닐레틴, 하기 화학식 2로 표시되는 프락시딘 메틸 에테르, 하기 화학식 3으로 표시되는 산틸레틴, 하기 화학식 4로 표시되는 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 하기 화학식 5로 표시되는 해마톰믹 산 에틸 에스터, 하기 화학식 6으로 표시되는 디프라틱 산, 하기 화학식 7로 표시되는 메톡살렌 및 하기 화학식 8로 표시되는 쿨만닌으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 전술한 항산화용 조성물의 유효성분이 해마톰믹 산 에틸 에스터인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 뇌졸증, 파킨슨병, 심장질환, 혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자가면역질환 또는 노화의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 항산화용 조성물에 대해 상세히 설명한다.

기존의 항산화제로 알려진 하기 화학식 9로 표시되는 프락신 및 하기 화학식 10로 표시되는 메틸 갈레이트가 복용량 대비하여 항산화 효과가 부족하다고 판단되었으며, 따라서 이러한 구조와 유사한 구조를 가진 화합물 중에서 보다 탁월한 항산화 효과를 가진 물질을 찾고자 하였다.

ChemFinder (Cambridgesoft, MA, 미국)를 이용하여 프락신 및 메틸 갈레이트와 70% 이상의 구조 유사성(structural silmilarity)을 보이는 화합물 32개를 company's chemical library system에서 선정한 후 세포 생존력 평가 실험을 통하여 항산화 효과를 검증하였다.

이러한 효과 평가 실험을 통하여 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌이 기존 항산화제인 프락신 및 메틸 갈레이트 보다 뛰어난 항산화 효과를 가진다는 것을 밝혀 내었다.

본 발명에서 사용한 항산화 효과 평가 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 내피(endothelium)는 ROS에 의해 야기되는 상해에 민감한 것으로 알려 져 있으며(Valen, G. 등, Hydrogen peroxide induces endotherial cell atypia and cytoskeleton deplymerization. Free Radic. Biol. Med. 26: 1480-148; 1999 참조), 대조적으로 내피 세포에 의해 방출된 프리 라디칼은 저밀도 지질(low density lipid, LDL)의 산화를 중재하는 것으로 알려졌다(Zapolska-Downar, D. 등, Ibuprofen protects low density lipoproteins against oxidative modification. Life Sci. 65: 2289-2303; 1999 참조). 내피 세포의 하나인 HUVEC는 산화적 스트레스 관련 연구에서 사용되어 왔으며, H₂O₂에 의한 산화적 스트레스는 다양한 기전에 의해서 HUVEC의 세포 기능을 손상시키는 것으로 보고되었다(Valen, G. 등, Hydrogen peroxide induces endotherial cell atypia and cytoskeleton deplymerization. Free Radic. Biol. Med. 26: 1480-148; 1999., Estrada-Garcia, L. 등, Effects of oxidative stress and antioxidant treatments on eicosanoid synthesis and lipid peroxidation in long term humaan umbilical vein endotherial cells culture. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 67: 13-25; 2002., 및 Waxman, A. 등, Interleukin-11 and interleukin-6 protect cultured human endothelial cells from H₂O₂-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29: 513-522; 2003 참조). 따라서 본 연구에서는 산화적 스트레스에 대한 선택된 화합물들의 세포 보호 활성을 평가하기 위하여 HUVEC를 이용한 평가방법을 사용하였다.

이러한 결과를 바탕으로, 본 발명은 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산 틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 항산화 활성이 우수한 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌 질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자가면역질환 등의 각종 질병 및 노화를 예방 및 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항산화용 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효성분 이외에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 미결정셀룰로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스 테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이외에도 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 제조방법, 제형, 투여방법 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항산화용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명 유효성분 화합물의 통상적인 1일 투여량은 성인의 경우 0.001 내지 5,000 ㎎이며 증상에 따라 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것으 로 해석되어서는 안 된다.

< HUVEC 의 배양>

HUVEC는 탯줄(umbilical cord)로부터 분리하였다. 정맥을 캐뉼레이션(cannulation)하고 PBS(phosphate-buffered saline, 170 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄, 3.3 mM KCl, 및 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)로 플러슁(flushing)한 후 0.2% (v/v) 콜라게나제(collagenase) 타입 Ⅱ (Sigma사, St. Louis, MO, 미국) PBS로 채웠다. 37℃ (5% CO₂)에서 10분 동안 배양한 후, M-199 매질로 플러슁하여 콜라게나제를 제거하고 세포를 펠렛화하기 위하여 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포를 그 후 성장 배지 (M-199)에 재현탁하였고, 1% (v/v) 액상 젤라틴 (Sigma사) PBS로 미리 코팅된 25 ㎠ 세포 배양 플라스크에 시딩하였다. 세포를 시험시작까지 성장시켰다.

< HUVEC 에 대한 과산화수소의 영향 평가>

산화적 스트레스인 과산화수소에 노출된 HUVEC의 생존력 변화를 예비적으로 측정하였다. 0.2 내지 5 mM의 과산화수소 존재하에서 HUVEC를 0.5, 1 또는 2시간 동안 배양한 후 세포 생존력을 측정하였다. 과산화수소를 가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 절차를 거친 대조군의 생존력에 대비하여 퍼센트 비율로 생존력을 나타내었다. 배양 시간에 따른 결과의 유의성 있는 차이는 없었으며, 0.2, 1 및 5 mM 과산화수소의 존재하에서 세포 생존력은 각각 60%, 40%, 및 10% 이었다. 이후 실험에서는 시료 샘플과 활성 사이의 상관성에 대한 보다 많은 정보를 얻고자 산화적 스트레스로 0.2 mM 과산화수소를 사용하였다.

<세포 생존력(viability) 분석>

HUVEC를 96-웰 마이크로 플레이트에 최종적으로 웰 당 10⁴ 세포를 함유하는 100 ㎕ 배양 매질이 되도록 성장시켰다. 세포를 성장하여 합류(confluence)할 때까지 성장시킨 후, 일정 간격으로 시험 샘플 및 과산화수소 처리를 하였다. 먼저 20 μM의 시험 샘플로 1시간 동안 처리한 후, 200 μM의 과산화수소 하에서 1시간 동안 상기 세포를 배양하였다.

세포 생존력을 측정하기 위하여, XTT 분석 키트(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, 미국)를 설명서에 기재된 방법에 따라 사용하였다. 비교군은 항산화제로 알려져 있으며, 구조적으로 본 발명의 화합물들과 유사한 메틸 갈레이트(methyl gallate) 및 프락신(fraxin)을 사용하였으며, 대조군은 시험 샘플로 처리하는 과정을 제외하고는 동일한 절차를 거쳤다. 결과는 대조군의 생존력 대비하여 향상된 정도를 퍼센트 비율로 나타내었으며, 각 시험 샘플당 3회 반복하여 평균값을 하기 표 1에 기재하였다.

화합물명		생존(%)
비교군 1	메틸 갈레이트	18.1
비교군 2	프락신	9.3
실험군 1	프레닐레틴(prenyletin)	26.4
실험군 2	프락시딘 메틸 에테르(fraxidin methyl ether)	29.4
실험군 3	산틸레틴(xanthyletin)	18.4
실험군 4	메틸오르셀리닉 산, 에틸 에스터 (methylorsellinic acid, ethyl ester)	23.7
실험군 5	해마톰믹 산, 에틸 에스터 (haematommic acid, ethyl ester)	56.2
실험군 6	디프라틱 산(diffratic acid)	19.9
실험군 7	메톡살렌(methoxsalen)	20.8
실험군 8	쿨만닌(kuhlmannin)	18.2

상기 표 1에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 프레닐레틴(prenyletin), 프락시딘 메틸 에테르(fraxidin methyl ether), 산틸레틴(xanthyletin), 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터(methylorsellinic acid ethyl ester), 해마톰믹 산 에틸 에스터(haematommic acid ethyl ester), 디프라틱 산(diffratic acid), 메톡살렌(methoxsalen) 및 쿨만닌(kuhlmannin)는 항산화 효과가 우수함을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 프레닐레틴, 프락시딘 메틸 에테르, 산틸레틴, 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터, 해마톰믹 산 에틸 에스터, 디프라틱 산, 메톡살렌 및 쿨만닌의 새로운 용도인 항산화 용도를 제공한다. 따라서 본 발명은 항산화 효과가 탁월한 항산화용 조성물을 제공한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 프레닐레틴(prenyletin), 하기 화학식 2로 표시되는 프락시딘 메틸 에테르(fraxidin methyl ether), 하기 화학식 3으로 표시되는 산틸레틴(xanthyletin), 하기 화학식 4로 표시되는 메틸오르셀리닉 산 에틸 에스터(methylorsellinic acid ethyl ester), 하기 화학식 6으로 표시되는 디프라틱 산(diffratic acid), 하기 화학식 7로 표시되는 메톡살렌(methoxsalen) 및 하기 화학식 8로 표시되는 쿨만닌(kuhlmannin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 뇌졸증, 파킨슨병, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자가면역질환 또는 노화의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.