CN101852697B

CN101852697B - 一种检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN101852697B
Application number: CN201010182346XA
Authority: CN
Inventors: 谢佐福
Original assignee: FUZHOU TRIPLEX BIOSCIENCES Co Ltd
Current assignee: FUZHOU TRIPLEX BIOSCIENCES Co Ltd
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2030-05-26
Also published as: CN101852697A

Abstract

本发明提供了一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法；所述试剂盒组成包括：酶固定液、色素基质（1）、色素基质（2）、酶底物、磷酸缓冲液以及迈尔苏木素染液。该试剂盒用于检测脱落细胞的方法主要通过预制染色孵育液、迈尔苏木素染色、梯度酒精脱水得到染色涂片。该方法利用酸性α-醋酸萘酯酶染色法靶向性检测宫颈脱落细胞中的A萘酚酯酶酶，从而有针对性地显示脱落细胞中增生活跃及潜在异型增生的细胞群。本发明对增生细胞的敏感性较高，核大细胞比常规巴氏染色明显易见，尤其是各种炎性修复反应的鳞状细胞亦可呈阳性，可从形态学上予以区别，达到提高阳性检出率、降低假阴性、提高效率的目的。

Description

一种检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法。

背景技术

酸性α-醋酸萘酯酶染色技术原理为T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解α-醋酸萘酯，产生α-萘酚，α-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在含有该酶的细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀。

早在上个世纪六十年代，就有人研究了正常宫颈、宫颈癌前病变及宫颈鳞状细胞癌组织中若干酶的组织化学表达情况，在冰冻切片中，宫颈癌和癌旁组织中某些酶远比正常组织高。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法；利用酸性α-醋酸萘酯酶染色法靶向性检测宫颈脱落细胞中的a萘酚酯酶酶，从而有针对性地显示脱落细胞中增生活跃及潜在异型增生的细胞群。

本发明的基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，基试剂包括：

试剂A：酶固定液 50ml/瓶 1瓶；所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为6.6，配制为：称取100mg 的KH₂PO₄和20mg的Na₂HPO₄，先溶解于30ml水中，然后加入45ml丙酮和4%（重量比，下同）甲醛水溶液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6.6，置4℃冰箱中保存；分装：50ml/瓶；

试剂B：采用10ml的棕色塑料滴瓶内装0.3ml色素基质（1），共5瓶；所述试剂 B的色素基质（1）为新品红或副品红溶液，配制为：称取4g新品红或副品红加入到100 ml浓度为2mol/L的HCl水溶液中，40～60℃水浴直至新品红或副品红溶解，用滤纸过滤后，置4℃冰箱中保存；分装：10ml棕色塑料滴瓶，每瓶分装0.3ml；

试剂C：色素基质（2）2ml/瓶，1瓶；所述试剂C的色素基质（2）为重量比为1～10%的亚硝酸钠水溶液, 分装：棕色塑料滴瓶 2 ml/瓶；

试剂D：酶底物 3ml/滴瓶 1瓶；所述试剂D的酶底物为重量比为1～5%的α-醋酸萘酯溶液：称取2g α-醋酸萘酯溶于100ml丙酮中，置4℃ 避光保存；分装：棕色塑料滴瓶，3ml/滴瓶；

试剂E：pH7.6磷酸缓冲液 200ml/瓶 1瓶；所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为1/15mol/L，pH为5.7～8.0：称取KH₂PO₄9．08g溶于1000ml蒸馏水中，该液为A液；称取Na₂HPO₄·12H₂O 23.882g溶于1000 ml蒸馏水中，为B液，以A液13ml与B液87ml混匀即可；分装：塑料瓶，200ml/瓶。

迈尔苏木素染液： 50ml/瓶，1瓶；所述迈尔苏木素染液将苏木素0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g和碘酸钠0.02g，搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，继续煮沸3-10min，冷却、过滤，放置16～20小时，即可使用；分装取50ml滴瓶，每瓶装量50 ml。

使用上述基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒检测宫颈细胞的方法，依次包括以下步骤：

（1）预制染色孵育液：

取试剂B 0.1～0.5ml，滴入0.1～0.5ml试剂C，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂D 0.2～0.4ml，轻轻摇晃后再加入试剂E 8～10ml，即成孵育液；该液体为一次性使用，配置后应在1小时内用完；剩余液体应废弃，不可留用；

（2）染色方法

① 细胞抹片：采用液基细胞的自然沉降法制备宫颈细胞抹片，待细胞最终在沉降孔内自然沉降10 分钟后加入试剂A 300-800微升，1分钟后1-2min倾去液体；

②加入蒸馏水300-1000微升水洗20～50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内，一次滴入6滴（0.3ml），于室温下放置5-15分钟；

③ 倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入300-1000微升蒸馏水，洗2-3遍；

④ 加入迈尔苏木素染液300-1000微升，2-8分钟后倾去迈尔苏木素染液；

⑤ 再在载有细胞的孔内加入试剂E 300-1000微升，放置20-60s；

⑥梯度酒精脱水, 风干后用中性树胶封固；得到染色涂片；于显微镜下观察。

本发明的试剂盒储存：2-8℃保存，保质期 6个月。

（3）结果分析

本发明的试剂盒检测的可表现阳性的宫颈细胞归类如下：

1. 异常细胞：呈棕红色细颗粒，不规则分布于胞浆中

HPV感染的细胞，如图1所示；

不典型鳞状细胞-不明意义(ASC-US)，如图2所示；

不典型鳞状细胞-倾向高度病变(ASC-H)，如图3所示；

低度病变细胞(LSIL) ，如图4所示；

高度病变细胞(HSIL) ，如图5所示；

鳞状细胞癌，如图6所示。

2. 正常及反应性细胞：

正常成熟鳞状细胞：阴性，如图7所示；

宫颈柱状细胞：棕色颗粒弥漫均匀分布，如图8所示；

化生细胞：棕红色颗粒弥漫均匀分布，如图9所示；

修复反应细胞：较稀疏均匀的棕红色细小颗粒，如图10所示；

组织细胞：偶见，呈棕红色颗粒，容易识别，如图 11所示。

3. 微生物

念珠菌：鲜艳的浅棕色，如图 12所示。

本发明的显著优点：

1、本发明的的染色液对增生细胞的敏感性较高，核大细胞比常规巴氏染色明显易见，尤其是各种炎性修复反应的鳞状细胞亦可呈阳性，可从形态学上予以区别，达到提高阳性检出率、降低假阴性、提高效率的目的。

2、化生细胞和高度病变的细胞的鉴别，在液基细胞学中是一个难题，由于技术原因，其核的微细结构不易察看清楚。本发明主要依据核的改变来辨别，能清楚地显示那些少量散在甚至是个别存在的不典型鳞状细胞。

附图说明

图1是HPV感染的细胞（典型或不典型的挖空细胞）；

图2为不典型鳞状细胞-不明意义(ASC-US)；

图3为不典型鳞状细胞-倾向高度病变(ASC-H)；

图4为低度病变细胞(LSIL)；

图5为高度病变细胞(HSIL)；

图6为鳞状细胞癌；

图7为正常成熟鳞状细胞：阴性；

图8为宫颈柱状细胞：棕色颗粒弥漫均匀分布；

图9为化生细胞：棕红色颗粒弥漫均匀分布；

图10为修复反应细胞：较稀疏均匀的棕红色细小颗粒；

图 11为组织细胞；

图 12为念珠菌。

具体实施方式

本发明的基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，其试剂组成包括：

试剂A：酶固定液，50ml；所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为6.6，配制为：称取100mg 的KH₂PO₄和20mg的Na₂HPO₄，先溶解于30ml水中，然后加入45ml丙酮和4%（重量比，下同）甲醛水溶液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6.6，置4℃冰箱中保存；

试剂B：采用10ml的棕色塑料滴瓶内装0.3ml色素基质（1）；所述试剂 B的色素基质（1）为新品红或副品红溶液，配制为：称取4g新品红或副品红加入到100 ml浓度为2mol/L的HCl水溶液中，40～60℃水浴直至新品红或副品红溶解，用滤纸过滤后，置4℃冰箱中保存；

试剂C：色素基质（2），2ml；所述试剂C的色素基质（2）为重量比为4%的亚硝酸钠水溶液；

试剂D：酶底物，3ml；所述试剂D的酶底物为重量比为2%的α-醋酸萘酯溶液：称取2g α-醋酸萘酯溶于100ml丙酮中，置4℃ 避光保存；

试剂E：pH7.6磷酸缓冲液，200ml；所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为1/15mol/L，pH为7.6：称取KH₂PO₄9．08g溶于1000ml蒸馏水中，该液为A液；称取Na₂HPO₄·12H₂O 23.882g溶于1000 ml蒸馏水中，为B液，以A液13ml与B液87ml混匀即可；

迈尔苏木素染液： 50ml；所述迈尔苏木素染液将苏木素0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g和碘酸钠0.02g，搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，继续煮沸5min，冷却、过滤，放置16～20小时，即可使用。

（1）预制染色孵育液：

取试剂C, 滴入6滴（0.3ml）试剂C到试剂B滴瓶（含0.3ml试剂B）中，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂D 4-8滴（0.2-0.4ml），轻轻摇晃后再加入试剂E 9ml，即成孵育液；该液体为一次性使用，配置后应在1小时内用完；剩余液体应废弃，不可留用；

（2）染色方法

① 细胞抹片：采用液基细胞的自然沉降法制备宫颈细胞抹片，待细胞最终在沉降孔内自然沉降10 分钟后加入试剂A 500微升，1分钟后倾去液体；

②加入蒸馏水500微升水洗20～50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内，一次滴入6滴（0.3ml），于室温下放置5-15分钟；

③ 倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入500微升蒸馏水，洗2-3遍；

④ 加入迈尔苏木素染液500微升，2-8分钟后倾去迈尔苏木素染液；

⑤ 再在载有细胞的孔内加入试剂E 500微升，放置30秒；

⑥ 分别采用重量比为95%的乙醇水溶液和100%乙醇脱水, 风干后用中性树胶封固；得到染色涂片；于显微镜下观察。

以下为本发明的具体实施案例，进一步描述本发明，但是，本发明不仅限于此。

实施例1 正常人宫颈细胞检测

（1）预制染色孵育液：

取试剂C, 滴入6滴（0.3ml）试剂C到试剂B滴瓶（含0.3ml试剂B）中，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂D 4-8滴（0.2-0.4ml），轻轻摇晃后再加入试剂E 9ml，即成孵育液；

（2）染色方法

① 细胞抹片：取健康人的宫颈体液样品约12ml，先以1080rpm离心2min，去除上清液余4ml，再以2000rpm离心10min，去掉上清液，加入试剂E 1000ul，混匀，取混匀的细胞悬液500 ul移至涂有细胞贴附剂的载玻片，自然沉降，待细胞最终在沉降孔内自然沉降10 分钟后加入试剂A 500微升，1分钟后倾去液体；

②加入蒸馏水500微升水洗30s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内，一次滴入6滴（0.3ml），于室温下放置12分钟；

③ 倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入500微升蒸馏水，洗2遍；

④ 加入迈尔苏木素染液500微升，5分钟后倾去迈尔苏木素染液；

⑤ 再在载有细胞的孔内加入试剂E 500微升，放置30秒；

（3）结果分析

如图7所示，显示正常成熟鳞状细胞，呈阴性，无棕红色阳性颗粒。

实施例2 宫颈CIN组织中检测酯酶活性

（一）方法

宫颈CINI—III级锥切手术的新鲜标本，在恒冷箱冰冻切片机中切片，5微米厚。切片滴入试剂A6滴固定5分钟，4°C备用。为获得准确结果，连续收集了10例共50张切片供酯酶染色。

1、切片恢复室温，用蒸馏水洗30秒，吸干组织周围水分。

2、取试剂C 6滴, 滴入到试剂B滴瓶中, 轻轻摇晃, 3分钟后加入试剂D 4滴，轻轻摇晃后再加入试剂E 9ml即成孵育液。每片滴入孵育液，至孵育液淹没组织切片，室温下孵育 10分钟.

3、流水冲洗去孵育液后，再用蒸馏水洗 1分钟，三次。

4、滴加迈尔苏木素染液至淹没组织切片，2分钟。

5、水洗返兰，系列酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察。

（二）结果

宫颈鳞状上皮内瘤变区域显示酯酶呈深棕色—浅棕红色，尤其在邻近表层细胞部位，显示强烈的阳性，而非瘤变区域，仅见个别散在的阳性细胞，一些挖空细胞，在其胞浆增厚部亦有明显的阳性轮廓，有的染色深，有的仅有一圈淡淡的浅棕红色晕。在宫颈瘤变粘膜下层的间质里，可见到许多富含酯酶的组织细胞。

（三）小结

宫颈鳞状上皮瘤变区域可见丰富的酯酶存在，而非瘤变区域基本阴性，结果支持了宫颈脱落细胞酯酶检测有助于上皮病变细胞的发现。

实施例3 宫颈液基细胞中检测酯酶活性

（一）方法

1、标本：连续性120 例妇科门诊送检的液基细胞标本，离心、自然沉降制片，每例制成两片，一片按传统巴氏染色，另一片按本发明方法作酯酶染色（见步骤2）

2、酯酶染色：

（1）细胞沉降后往沉降孔滴入试剂A 6滴，5分钟后倾去A固定液。

（2）加入蒸馏水6滴，1分钟后倾去液体。

（3）配制酯酶孵育液：取试剂C 6滴, 滴入到试剂B滴瓶中, 轻轻摇晃, 3分钟后加入试剂D 4滴，轻轻摇晃后再加入试剂E 9ml即成孵育液。每孔滴入孵育液，室温下孵育 10分钟.

（4）、倾去染色液，加入约500微升试剂E，洗2遍。

（5）、加入Mayer苏木素染液500微升，2-8分钟后倾去染液。

（6）、加入试剂E 500微升30秒，如是2次。

（7）、95%、100%酒精脱水, 风干后用中性树胶封固。

3、阳性判断：

阴性：鳞状表层、中、底层细胞无显示色。

阳性+ ：鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈浅棕红色，有时仅在细胞边缘出现淡棕红色晕或不规则着染。

阳性++：鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈弥漫棕红色。

阳性+++：鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈弥漫深棕色。

注：正常柱状细胞和不完全化生细胞、组织细胞亦可呈阳性着色，尤组织细胞常呈鲜艳的棕红色，它们形态学可以识别，故不计入阳性细胞。

4、结果：在120例标本中，按TBS标准，共检出病变细胞23例，不典型鳞状细胞不明意义(ASC-US)8例，不典型鳞状细胞倾向高度病变(ASC-H)1例,低度病变(LSIL)/HPV 6例，高度病变(HSIL)1例，单独提示HPV例6例。这些病例中检出酯酶阳性数为22例，阳性率为95.65%，阳性强度见表1。

表1 22例宫颈病变细胞酯酶检出结果

结果显示，宫颈鳞状上皮病变细胞大多显示酯酶活性，其阳性强度不等，病变较轻的阳性强度较低，提示酯酶染色对发现宫颈异常细胞有辅助作用。

实施例4 检测宫颈液基细胞酯酶活性有助于提高阳性检出率

（一）方法：

1、标本：

2、连续性220 例妇科门诊送检的液基细胞标本，离心、自然沉降制片，每例制成两片（即一份标本制备同时两张细胞涂片，制片时尽可能把细胞均分），一片按传统巴氏染色，共获得巴氏染色涂片220张，设为对照组；另一片按本发明方法作酯酶染色，共获得酯酶染色涂片220张，设为实验组。

2、酯酶染色方法：同实例3

3、读片：

（1）双盲法读片，实验组由课题组医师观察，诊断采用TBS术语，所不同的是，细胞染色阳性并有细胞核异常（包括提示HPV）的病例冠以“ANAE+/异常细胞”，细胞染色阴性且无细胞核异常的登记为阴性；对照组由专职从事宫颈细胞筛查6年资历的细胞助理医师观察。记录两组读片后的结果。

（2）“金标准”确立：由3个医师分别认真复查每一张巴氏染色涂片和酯酶染色涂片，凡诊断结果不一的病例经三人讨论达成一致意见为最后结果，此即“金标准”。

（3）统计学：以两组第一次诊断结果为参数，对照金标准，进行敏感性、特异性及四格表X²统计。

（二）结果：见表2、表3、表4

表2： 220例实验组与对照组的筛查结果

※ X²=3.8673, P=0.0492, P<0.05

表3 220实验组检出结果与复查后诊断结果（金标准）对照

※ 敏感度为97.50% ，特异性 96.97%；阳性预测值 89.19%；阴性预测值 99.22%。

表4 220例巴氏组检出结果与复查后诊断结果对照

敏感度为47.06% ，特异性 99.24%；阳性预测值 94.12%；阴性预测值 87.92%。

Claims

1.一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组成包括：

试剂A：酶固定液，为福尔马林丙酮缓冲液；

试剂B：色素基质（1），为新品红或副品红溶液；

试剂C：色素基质（2），为重量比1～10%的亚硝酸钠水溶液；

试剂D：酶底物，为重量比1～5%的α-醋酸萘酯溶液；

试剂E：磷酸缓冲液；

迈尔苏木素染液；

试剂盒中的试剂配制如下：

所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为6.6，配制为：称取100mg 的KH₂PO₄和20mg的Na₂HPO₄，先溶解于30ml水中，然后加入45ml丙酮和4%（重量比，下同）甲醛水溶液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6.6，置4℃冰箱中保存；

所述试剂 B的色素基质（1）为新品红或副品红溶液，配制为：称取4g新品红或副品红加入到100 ml浓度为2mol/L的HCl水溶液中，40～60℃水浴直至新品红或副品红溶解，用滤纸过滤后，置4℃冰箱中保存；

所述试剂C的色素基质（2）为重量比为4%的亚硝酸钠水溶液；

所述试剂D的酶底物为重量比为2%的α-醋酸萘酯溶液：称取2g α-醋酸萘酯溶于100ml丙酮中，置4℃ 避光保存；

所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为1/15mol/L，pH为5.7～8.0：称取KH₂PO₄9．08g溶于1000ml蒸馏水中，该液为A液；称取Na₂HPO₄·12H₂O 23.882g溶于1000 ml蒸馏水中，为B液，以A液13ml与B液87ml混匀即可；

所述迈尔苏木素染液：将苏木素0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g和碘酸钠0.02g，搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，继续煮沸3-10min，冷却、过滤，放置16～20小时，即可使用；

所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：

（1）预制染色孵育液：

（2）染色方法

②加入蒸馏水300-1000微升水洗20～50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内，一次滴入6滴，于室温下放置5-15分钟；

⑤ 再在载有细胞的孔内加入试剂E 300-1000微升，放置20-60s；

2.根据权利要求1所述的基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组成包括：10瓶试剂/试剂盒，20个抹片/检测试剂盒：

试剂A：酶固定液 50ml/瓶，1瓶；

试剂B：采用10ml的棕色塑料滴瓶内装0.3ml色素基质（1），共5瓶；

试剂C：色素基质（2），2ml/瓶，1瓶；

试剂D：酶底物，3ml/滴瓶，1瓶；

试剂E：pH7.6磷酸缓冲液，200ml/瓶，1瓶；

迈尔苏木素染液：50ml/瓶，1瓶。