CN103353527A - 检测肿瘤侵袭性的pnc检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是指检测肿瘤侵袭性新靶标PNC的检测试剂盒及其应用。检测肿瘤侵袭性的PNC检测试剂盒，所述试剂盒的检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。本发明描述PNC免疫组化检测试剂盒和检测肿瘤侵袭性的PNC免疫荧光检测试剂盒的组成及其使用方法。另外，本发明还提供了一种筛选新型抗转移化合物及其中药单体的方法，筛选新型抗转移化合物的方法也可用于筛选小分子化合物和中药单体。本发明采用PNC试剂盒检测癌症患者穿刺组织标本中的PNC比例，方法简便，易于操作，稳定性好；采用PNC试剂盒检测化合物作用后肿瘤细胞中的PNC比例，配合计算机编程分析，可实现新药的高通量筛选。

Description

检测肿瘤侵袭性的PNC检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是指检测肿瘤侵袭性新靶标PNC的检测试剂盒及其应用。

背景技术

目前随着全球恶性肿瘤新发率的不断增长，肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病之一。我国恶性肿瘤死亡率亦呈持续增长趋势，而侵袭性（浸润-转移）作为恶性肿瘤的重要标志之一，是导致癌症患者死亡的主要原因，因此有必要探寻有效且易于临床监测的肿瘤侵袭性分子标记物。肿瘤侵袭性机制和新型分子标记物的探索是目前肿瘤生物学研究领域的一大热点。但目前临床上对于肿瘤预后的评判和个体化化疗方案的制定尚缺乏明确的标准和参考依据，国内外尚缺乏适用于临床检测的肿瘤侵袭性诊断试剂盒。另外，针对抗癌新药，尤其是抗转移药物长期处于市场需求“饥渴状态”的现状。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供可用于组织石蜡/冰冻切片和细胞爬片等样本的PNC检测试剂盒。

检测肿瘤侵袭性的PNC检测试剂盒，所述试剂盒的检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

检测肿瘤侵袭性的PNC免疫组化检测试剂盒，包括抗原修复浓缩液、过氧化物酶阻断液、封闭血清、检测一抗、生物素标记二抗、链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液、DAB显色液、甲基绿染色液，其特征在于：所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

PNC免疫组化检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）组织石蜡切片脱腊水化后，用PBS洗三次；

2）采用微波法进行组织抗原修复，再依次滴加过氧化物酶阻断溶液和封闭血清；

3）除去血清后，滴加适当稀释的PTB或CUG-BP1检测一抗，并孵育；

4）弃一抗后，PBS 洗三次，滴加生物素标记的二抗，孵育后再以PBS 洗三次；

5）滴加链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，孵育后用PBS洗三次，再用新鲜配制的DAB溶液进行显色；

6）超纯水冲洗，甲基绿复染后再水洗，最后经干燥透明后封片。

进一步的，PNC免疫组化检测试剂盒用于组织石蜡切片，组织芯片的检测。

检测肿瘤侵袭性的PNC免疫荧光检测试剂盒，包括检测一抗、AlexaFluor 488标记二抗、DAPI、防荧光淬灭封片剂，其特征在于：所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

PNC免疫荧光检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用PBS洗三次；

2）经0.5% Triton X-100破膜后，滴加适当稀释的PTB或CUG-BP1检测一抗，并孵育；

3）弃一抗后，PBS 洗三次，滴加Alexa Fluor 488标记的二抗，孵育后再以PBS 洗三次；

4）DAPI复染细胞核并水洗后，滴加防荧光淬灭封片剂进行封片。

其中，所述PNC免疫荧光检测试剂盒用于组织冰冻切片，细胞爬片的检测。

另外，本发明还提供了一种筛选新型抗转移化合物及其中药单体的方法。

一种筛选新型抗转移化合物的方法，包括如下步骤：（1）采用权利要求5所述的PNC免疫荧光检测试剂盒检测化合物作用后肿瘤细胞中的PNC比例，并统计分析PNC抑制率；（2）根据PNC抑制率与新型化合物的抗转移潜力呈正相关来筛选化合物。

进一步的，所述筛选方法步骤（1）的具体步骤如下：

1）肿瘤细胞爬片过夜后，分别加入梯度浓度的化合物作用12～24小时，以添加化合物助溶剂DMSO的作为对照；

2）细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，按PNC免疫荧光试剂盒的操作步骤进行检测；

3） PNC免疫荧光染色并封片后的片子，于激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜下观察并计数含PNC的细胞占总细胞的比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值；

4） 计算PNC抑制率：PNC抑制率=(助溶剂DMSO组的PNC比例-化合物组的PNC比例）／助溶剂DMSO组的PNC比例×100%，再行统计分析。

筛选新型抗转移化合物的方法也可用于筛选小分子化合物和中药单体。

下面对本发明做进一步阐述：

PNC（perinucleolar compartment）是一个与肿瘤侵袭性密切相关的细胞核亚结构（图1为PNC在HepG2细胞中的亚细胞定位图；图2为PNC在PC-3M细胞中的亚细胞定位图；其中，PTB抗体（绿色）免疫荧光染色后，采用激光共聚焦显微镜观察。PNC是一个形态不规则、电子结构致密的与细胞核仁邻近的特殊结构。），包括PNC的主要成分（PNC主要由MRP等非编码RNA和PTB、CUG-BP1等RNA结合蛋白所组成），PNC比例在不同细胞系中存在差异（PNC在正常细胞株中比例低，而在实体瘤细胞系中比例明显增加）（图3），PNC比例在侵袭性不同的肿瘤组织中存在差异（PNC在正常乳腺组织中不可见，其比例随乳腺癌侵袭性增加而上升，最高可达99％）（图4），DNA掺入型化疗药物可显著降低PNC比例（图5）。PNC作为一种特殊的细胞核亚结构与肿瘤细胞的侵袭性密切相关，并且在前列腺癌荷瘤模型小鼠和乳腺癌患者病理标本的研究中，均证实肿瘤细胞核中PNC比例与其侵袭性呈正相关，并且与患者预后密切相关。

由于肿瘤细胞核中PNC比例与其侵袭性呈正相关，并且与患者预后密切相关。因此以PNC为探针，开发出适用于肿瘤侵袭性监测的诊断试剂盒，这对于高转移风险癌症的预警具有重要意义，有望对这类患者实现早期干预而改善其预后，同时亦可避免“一刀切”的治疗模式和过度治疗，对于指导个体化治疗方案的施治具有重要意义。基于新型肿瘤转移分子标记物的药物高通量筛选方式的建立对于药物的选择性开发也至关重要。

本发明公开了一种检测肿瘤侵袭性的PNC检测的免疫组化试剂盒及其使用方法。包括抗原修复浓缩液、过氧化物酶阻断液、封闭血清、PTB检测一抗或CUG-BP1检测一抗、生物素标记二抗、链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液、DAB显色液、甲基绿染色液。步骤如下：

1、石蜡切片脱腊水化后，用PBS洗三次，每次3 分钟；

2、10×抗原修复浓缩液以超纯水稀释后，没过切片组织，并微波炉煮沸2分钟，修复组织抗原；

3、每张切片滴加50μl 过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗三次，每次3 分钟；

4、除去PBS 液，每张切片滴加50μl 封闭血清，室温下孵育30 分钟；

5、除去血清，每张切片滴加50μl 的PTB抗体（1:100-1:500稀释）或50μl 的CUG-BP1抗体（1:100-1:500稀释），室温下孵育60 分钟，或4℃孵育过夜；

6、PBS 洗三次，每次5 分钟。除去PBS 液，每张切片滴加50μl生物素标记的二抗，室温下孵育30 分钟。PBS 洗三次，每次5 分钟；

7、除去PBS 液，每张切片滴加50μl 链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育15 分钟。PBS洗三次，每次5 分钟；

8、除去PBS 液，每张切片滴加50μl 新鲜配制的DAB 溶液，显微镜下观察1－3分钟；

9、超纯水冲洗，甲基绿复染5分钟，自来水冲洗；

10、切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片并显微镜观察。

本发明还公开了一种检测肿瘤侵袭性的PNC检测的免疫荧光试剂盒及其使用方法。包括PTB检测一抗或CUG-BP1检测一抗、Alexa Fluor 488标记二抗、DAPI、防荧光淬灭封片剂等。步骤如下：

1、细胞爬片或组织冰冻切片，4%多聚甲醛室温固定20 分钟，用PBS洗三次，每次3 分钟；

2、0.5% Triton X-100 室温破膜20 分钟；

3、除去Triton X-100，每张片子滴加50μl 的PTB抗体（1:500稀释），室温下孵育60 分钟。PBS洗3次，每次3 分；

4、除去PBS 液，每张切片滴加50μl Alexa Fluor 488标记的二抗。室温避光孵育30 分钟。PBS 洗3 次，每次3分钟；

5、DAPI复染细胞核2 分钟，超纯水洗2次，每次3分钟；

6、每张切片加10μl防荧光淬灭封片剂进行封片，并荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

本发明所需要的材料、试剂均可由市场购得。

另外，本发明公开了一种PNC检测试剂盒在抗肿瘤转移新药筛选中的应用，为检测化合物作用后肿瘤细胞中的PNC比例。

本发明的优点在于：

1、PNC是由多种蛋白和RNA组合而成的特殊结构，以PNC作为肿瘤转移预测、预后评估和疗效监测的指标，较之单纯基因或蛋白检测更为可靠；

2、采用PNC试剂盒检测癌症患者穿刺组织标本中的PNC比例，方法简便，易于操作，稳定性好；

3、采用PNC试剂盒检测化合物作用后肿瘤细胞中的PNC比例，配合计算机编程分析，可实现新药的高通量筛选。

附图说明

图1为PNC在HepG2细胞中的亚细胞定位图；图2为PNC在PC-3M细胞中的亚细胞定位图；

其中，PTB抗体（绿色）免疫荧光染色后，采用激光共聚焦显微镜观察。PNC是一个形态不规则、电子结构致密的与细胞核仁邻近的特殊结构。

图3为不同细胞系中的PNC比例柱状图；

其中，PNC比例在正常细胞株和原代培养细胞中低，而在实体瘤细胞系中比例明显增加。

图4为乳腺癌病理标本中PNC比例与乳腺癌转移性相关性柱状图；

其中，PNC比例在原位乳腺癌、淋巴结和远处转移灶肿瘤细胞中逐步增加。

图5为采用常规化疗药物处理HeLa或PC-3M细胞后PNC比例柱状图；

其中，DNA掺入型化疗药物可显著减少肿瘤细胞的PNC比例及大小。

具体实施例

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。

PNC免疫组化检测试剂盒：包括抗原修复浓缩液、过氧化物酶阻断液、封闭血清、检测一抗、生物素标记二抗、链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液、DAB显色液、甲基绿染色液，所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

PNC免疫荧光检测试剂盒，包括检测一抗、Alexa Fluor 488标记二抗、DAPI、防荧光淬灭封片剂，所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

实施例1

一、收集不同临床分期和病理分级的乳腺浸润性导管癌病例的肿瘤穿刺标本，石蜡包埋切片。

二、采用PNC免疫组化试剂盒进行检测：

1、石蜡切片脱腊水化后，用PBS（pH=7.4）洗三次，每次3 分钟；

2、10×抗原修复浓缩液以超纯水稀释10倍后，没过切片组织，并微波炉煮沸2分钟，修复组织抗原；

3、每张切片滴加50μl 过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS（pH=7.4）洗三次，每次3 分钟；

4、除去PBS液，每张切片滴加50μl封闭血清，室温下孵育30 分钟；

5、除去血清，每张切片滴加50μl 的PTB抗体（1:200稀释）（或滴加50μl 的CUG-BP1抗体（1:200稀释）），室温下孵育60 分钟；

6、弃一抗后，PBS（pH=7.4）洗三次，每次5 分钟。除去PBS 液，每张切片滴加50μl生物素标记的二抗，室温下孵育30 分钟。PBS（pH=7.4）洗三次，每次5 分钟；

7、除去PBS 液，每张切片滴加50μl链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育15 分钟。PBS（pH=7.4）洗三次，每次5 分钟；

8、除去PBS 液，每张切片滴加50μl新鲜配制的DAB 溶液，显微镜下观察1－3分钟；

9、超纯水冲洗，甲基绿复染5分钟，自来水冲洗；

10、切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

三、显微镜下观察并计数视野中含PNC的细胞占总细胞的比例，取5个视野的平均值，再进行统计分析。

四、由图4所示，PNC比例与乳腺癌的进展程度（以临床病理分级为标准）密切相关：PNC比例在无转移的原位乳腺癌、发生淋巴结转移的原位灶和发生远处转移的原位灶肿瘤细胞中的比例逐步增加。且PNC比例在乳腺癌原发灶、淋巴结转移灶和转移灶中的比例逐渐升高，原发病灶组织中PNC比例约15.5%，而远处转移灶肿瘤中可达近100%（图4）。

因此可以看出，PNC与乳腺肿瘤的状态密切相关，尤其是肿瘤转移的新靶标。通过PNC免疫组化试剂盒可以方便的进行乳腺癌的分子病理诊断，进而为乳腺癌患者的肿瘤转移风险预警，预后评估提供重要帮助。

实施例2

一、肝癌肝组织微阵列芯片定制：包含30例肝细胞癌，12例肝内胆管细胞癌，5例转移癌，8例肝硬化，10例炎症，5例癌旁组织，5例正常肝组织，每例一点。

二、采用PNC免疫组化试剂盒进行检测：

1、石蜡切片脱腊水化后，用PBS洗三次，每次3 分钟；

2、10×抗原修复浓缩液以PBS稀释后，没过切片组织，并微波炉煮沸2分钟，修复组织抗原；

3、每张切片滴加50μl过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗三次，每次3 分钟；

4、除去PBS 液，切片滴加50μl封闭血清，室温下孵育30 分钟；

5、除去血清，切片滴加50μl PTB抗体（1:200稀释）（或滴加50μl 的CUG-BP1抗体（1:200稀释）），4℃孵育过夜；

6、PBS洗三次，每次5 分钟。除去PBS液，滴加50μl生物素标记的二抗，室温下孵育30 分钟。PBS 洗三次，每次5 分钟；

7、除去PBS 液，滴加50μl链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育15 分钟。PBS洗三次，每次5 分钟；

8、除去PBS液，滴加50μl新鲜配制的DAB 溶液，显微镜下观察1－3分钟；

9、超纯水冲洗，甲基绿复染5分钟，自来水冲洗；

10、切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

三、显微镜下观察并计数视野中含PNC的细胞占总细胞的比例，取5个视野的平均值，再进行统计分析。

四、PNC比例与肝癌进程（以临床病理分级为标准）密切相关：肝细胞癌的PNC比例平均约13.5%，肝内胆管细胞癌的PNC比例平均约20.2%，转移癌的PNC比例平均约60.5%，肝硬化的PNC比例平均约2.5%，炎症肝组织的PNC比例平均约1.6%，癌旁组织的PNC比例平均约1.1%，正常肝组织未见PNC。

因此，采用PNC免疫组化试剂盒进行重大肝病的分子病理诊断，可为肝炎-肝硬化-肝癌进程提供新的监测指标，并为肝癌转移风险预警等提供依据。

实施例3

一、化疗药物Amonafide作为一类TopoⅡ抑制剂具有高效且不导致耐药等优势，但由于其会产生有毒代谢产物，导致骨髓抑制而具有较大的毒副作用，因此终止了进一步的临床研究。对其苯环基团进行结构修饰而合成了一系列Amonafide的衍生型化合物（A1~A10）。

二、HepG2细胞采用普通细胞培养液（高糖DMEM+10%FBS），于24孔细胞培养板中进行细胞爬片，1ml/孔。

三、Amonafide衍生化合物A1~A10分别用DMSO助溶，再进行梯度稀释。

四、待细胞贴壁（过夜）后，弃去普通细胞培养液，分别于各孔添加含梯度剂量（1μM, 10μM, 30μM和100μM）Amonafide衍生化合物的细胞培养液，以DMSO作为对照。

五、药物作用24小时后，弃去培养上清，采用PNC免疫荧光试剂盒进行检测，步骤如下：

1、细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定20 分钟，用PBS（PH=7.4）洗三次，每次3 分钟；

2、0.5% Triton X-100 室温破膜20 分钟；

3、除去Triton X-100，每张片子滴加50μl 的PTB抗体（1:500稀释）（也可以滴加CUG-BP1抗体（1:500稀释）），室温下孵育60 分钟。PBS洗3次，每次3 分；

4、除去PBS 液，每张切片滴加50μl Alexa Fluor 488标记的二抗。室温避光孵育30 分钟。PBS 洗3 次，每次3分钟；

5、DAPI复染细胞核2 分钟，超纯水洗2次，每次3分钟；

6、每张切片加10μl防荧光淬灭封片剂进行封片。

六、激光共聚焦显微镜下观察并计数含PNC的细胞占总细胞的比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值，再进行统计分析。

七、统计不同剂量、不同药物处理后HepG2细胞中的PNC比例，筛选出PNC抑制率最高的2种衍生化合物——A1和A4。

八、在肝癌荷瘤小鼠模型（裸鼠皮下接种Huh7-luci细胞）上进一步验证A1和A4的抗肿瘤疗效。A4在体内具有更好的抗肿瘤效果，且毒副作用低于Amonafide，有望作为肝癌新药进行下一步开发验证。

因此，采用PNC免疫荧光试剂盒进行新型小分子化合物的先期筛选，可为药物的选择性开发提供依据。

同理，该筛选新型抗转移化合物的方法可以用于小分子化合物和中药单体的筛选。

Claims (10)

1.检测肿瘤侵袭性的PNC检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

2.检测肿瘤侵袭性的PNC免疫组化检测试剂盒，包括抗原修复浓缩液、过氧化物酶阻断液、封闭血清、检测一抗、生物素标记二抗、链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液、DAB显色液、甲基绿染色液，其特征在于：所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

3.如权利要求2所述PNC免疫组化检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）组织石蜡切片脱腊水化后，用PBS洗三次；

2）采用微波法进行组织抗原修复，再依次滴加过氧化物酶阻断溶液和封闭血清；

3）除去血清后，滴加适当稀释的PTB或CUG-BP1检测一抗，并孵育；

4）弃一抗后，PBS 洗三次，滴加生物素标记的二抗，孵育后再以PBS 洗三次；

5）滴加链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，孵育后用PBS洗三次，再用新鲜配制的DAB溶液进行显色；

6）超纯水冲洗，甲基绿复染后再水洗，最后经干燥透明后封片。

4.如权利要求2所述PNC免疫组化检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于组织石蜡切片，组织芯片的检测。

5.检测肿瘤侵袭性的PNC免疫荧光检测试剂盒，包括检测一抗、AlexaFluor 488标记二抗、DAPI、防荧光淬灭封片剂，其特征在于：所述检测一抗为PTB或CUG-BP1的抗体。

6.如权利要求5所述PNC免疫荧光检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用PBS洗三次；

2）经0.5% Triton X-100破膜后，滴加适当稀释的PTB或CUG-BP1检测一抗，并孵育；

3）弃一抗后，PBS 洗三次，滴加Alexa Fluor 488标记的二抗，孵育后再以PBS 洗三次；

4）DAPI复染细胞核并水洗后，滴加防荧光淬灭封片剂进行封片。

7.如权利要求5所述的检测肿瘤侵袭性的PNC免疫荧光检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于组织冰冻切片，细胞爬片的检测。

8.一种筛选新型抗转移化合物的方法，包括如下步骤：（1）采用权利要求5所述的PNC免疫荧光检测试剂盒检测化合物作用后肿瘤细胞中的PNC比例，并统计分析PNC抑制率；（2）根据PNC抑制率与新型化合物的抗转移潜力呈正相关来筛选化合物。

9.根据权利要求8所述的筛选新型抗转移化合物的方法，其特征在于：所述筛选方法步骤（1）的具体步骤如下：

1）肿瘤细胞爬片过夜后，分别加入梯度浓度的化合物作用12～24小时，以添加化合物助溶剂DMSO的作为对照；

2）细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，按PNC免疫荧光试剂盒的操作步骤进行检测；

3） PNC免疫荧光染色并封片后的片子，于激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜下观察并计数含PNC的细胞占总细胞的比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值；

4） 计算PNC抑制率：PNC抑制率=(助溶剂DMSO组的PNC比例-化合物组的PNC比例）／助溶剂DMSO组的PNC比例×100%，再行统计分析。

10.如权利要求8或9所述的筛选新型抗转移化合物的方法，其特征在于：可用于小分子化合物和中药单体的筛选。

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