CN101429550B - 一种原位杂交综合检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交综合检测试剂盒，其包括两组杂交探针和标记物。还公开利用本试剂盒原位杂交检测与肝癌发生、转移相关的AFP mRNA和RhoGDI2基因的方法，包括以下步骤：(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒可在基因水平上检测AFP mRNA和RhoGDI2基因的表达量，比AFP检测更早期，能达到真正的早期诊断的目的，可有效提高肝癌治愈率，同时，本发明的检测方法简单方便，便于应用。

Description

一种原位杂交综合检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测和疾病诊断领域，更具体地说，是涉及与肝癌发生、转移相关基因的检测技术。

背景技术

肝癌在我国和亚洲的发病率比较高，死亡率在全球排第四，在我国高居第二。5年的生存率，不论在东方，还是西方，一般不超过5％，主要原因之一就是与肝癌的转移问题有关，如何攻克肝癌的治疗后转移复发问题，仍是当前面临的一个十分艰巨的任务。肝癌与其它癌症转移的发生机制一样，是多基因参与的动态变化过程，如果做到早期诊断，和治疗后的转移复发的检测，这是延长生存期和治愈的希望所在。由于肝脏隐匿在上腹深部，有肋骨为其屏障，故肿瘤早期不易发现，另外，肝脏有强大的代偿能力，早期无症状，这也给早诊带来困难，此外，一旦肝癌症状出现就到了晚期。做到在无症状人群中就能早期发现病例和治疗后及早检测转移复发的情况，也就是说在基因水平做到早诊和治疗后的及早检测转移复发，这对控制降低肝癌的死亡率有非常重要的临床意义。在肝癌转移复发的研究中，已发现诸多观察肝癌转移的分子标记物及相关因子，建立了一些诊断参数和技术指标，但这些指标大多的依据来自于后期病理变化的反应及术后或其它治疗后，如影像医学已见到占位性病灶的复发或肝癌转移复发后相关蛋白的变化，这离转移复发的早期诊断还有一个时间和空间过程。

如何从单细胞水平和基因水平做到早期诊断和转移复发的早期检测是我们要实现治愈肝癌的关键。现在临床上有一个错误概念，依照传统的影像医学和结合其它生化检测指标，判定占位性的癌症在二公分以下是属于早期癌症，这一概念值得认真讨论。医学影像学的2CM以下的肿块属于早期癌症这一界限科学性是不够严谨的，从细胞学的角度，1CM肿块约有1亿个肿瘤细胞，2CM的肿块其三维空间的细胞叠加数目，远不止2亿个肿瘤细胞。由于目前临床上的诊断手段比较缺乏，通过X线、B超、CT、核磁共振等的手段能分辨在1-2CM以下的肿瘤已经不错。而事实上是，从单克隆癌细胞到2CM以下的肿块可能是相当长的病理演变过程，可能是一年或两年及三年以上，从癌变前期到癌细胞形成及生成2CM肿块要经过相当长的病理演变过程，在这个病理演变过程中，难以证实早先形成癌细胞克隆肿块是唯一的癌块，可能在最早形成克隆肿块的同时，癌细胞通过不同的途径迁移到其它部位克隆生长。这在临床上已得到证实，一旦切除肿块后，其他地方会出现复发或其它多发的肿块先后形成或转移。因此，在临床上以2CM以下大小的肿块来界分早期与否，不够严谨，事实上这时的癌变已属于晚期，这是导致癌症死亡率不降的真正理由。

随着分子生物学技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学和癌症基因组学研究的深入开展，至今，有可能在基因水平上做到更科学的早期诊断，特别是在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

AFP是甲胎蛋白，它的功能及出现的病理生理机制已研究得相当清楚，临床一直用AFP生化指标诊断肝癌的发生，在蛋白水平有非常重要的临床意义。根据文献及统计资料显示，AFP阳性病人，大多影像检查中有大的占位现象，AFP阴性的病人肝癌的发病率也不低，特别是癌肿小于2CM以下的病人，AFP的阳性率很低，其癌块直径2CM以上和直径2CM以下的肝癌阳性率分别是50％和20％。所以，AFP的诊断指标不能说是早期，更早期的诊断应该是AFP mRNA，AFP基因的检查。

弗吉尼亚大学的泌尿学与分子生理学教授Dan Theodorescu博士领导的科学小组研究表明，RhoGDI2基因与癌细胞转移有关系，当RhoGDI2基因在癌细胞中有活性时，细胞就产生一种能够阻止癌细胞浸入到其他器官的蛋白，该项研究发表在2006年11月15日期的《癌症研究》(《cancerresearch》)杂志上。本发明人在对大量样本——广泛性腺癌(肝、肺、肾、胃、子宫、卵巢、乳房、直肠等组织细胞)检测中观察到，肝癌病人伴有转移者，RhoGDI2基因表达量降低或零表达，该指标有重要的临床价值。RhoGDI2基因表达量降低或零表达，证明肝癌已转移和复发。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。

综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交综合检测试剂盒，包含两组原位杂交检测探针和标记物。

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与肝癌早期发生、转移相关的AFP mRNA和RhoGDI2基因的原位杂交检测方法。

发明内容

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交综合检测试剂盒，其包括两组杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：1及SEQ IDNO：2所示序列，其分别为AFP mRNA基因及RhoGDI2基因的序列。AFPmRNA是表明肝癌发生的基因，其核苷酸序列长度是2032bp，位于染色体4q11¹¹-q13¹³位点上；RhoGDI2基因是一种癌症转移抑制基因，其核苷酸序列长度是605bp，位于染色体12p.3位点上。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛及纳米材料，优选地高辛。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。

本发明的试剂盒是采用核酸原位杂交技术，以甲胎蛋白基因AFPmRNA和RhoGDI2基因为检测对象，检测的底物是人体血液标本和组织细胞的RNA的表达量，原位杂交的显色方法能半定量和定量提示AFP mRNA和RhoGDI2基因表达量，根据统计学的方法，建立肝癌早期诊断和治疗后及早检测复发转移情况的标准和数值。AFP mRNA的阳性和表达增高，病人已患肝癌，RhoGDI2基因表达量降低或零表达，证明肝癌已转移和复发。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

本发明的试剂盒的组分是由杂交探针、杂交液、显色剂、增强剂等组成。本试剂盒的杂交原理是将基因AFP mRNA和RhoGDI2的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体，通过选用不同的RNA聚合酶，控制RNA的转录方向，从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(sense probe)和与mRNA互补的反义RNA探针(antisense probe)，用反义RNA探针与被检人体白细胞或组织细胞(待测mRNA)进行原位杂交，用同义RNA探针与被检人体白细胞或组织细胞(待测mRNA)进行原位杂交，作于反义RNA探针的阴性(内)对照，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明还提供一种AFP mRNA和RhoGDI2基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤：

(1)在上述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测mRNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

(2)检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或肝组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或肝脏组织细胞来自肝癌和/或伴有转移灶的患者、健康人。

本发明的检测方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的AFP mRNA和RhoGDI2基因表达量，用来确定肝癌是否发生和/或转移，临床研究表明，AFP mRNA与肝癌发生有关，而RhoGDI2基因与癌症转移有关。由于AFP mRNA表达由癌细胞(单个克隆细胞)产生，AFP mRNA可作为早期肝癌诊断指标，做AFP mRNA的检测有助于AFP蛋白阴性时，影像学检查难以确诊占位病变以前，及早确诊肝癌的发生。RhoGDI2是癌症转移抑制基因，本发明人在对大量样本——广泛性腺癌(肝、肺、肾、胃、子宫、卵巢、乳房、直肠等组织细胞)检测中观察到，肝癌病人伴有转移者，RhoGDI2基因表达量降低或零表达，该指标有重要的临床价值。AFP mRNA的阳性和表达增高，病人已患肝癌，RhoGDI2基因表达量降低或零表达，证明肝癌已转移和复发。

本发明的具体实施步骤，是业内人士熟知的核酸杂交技术，依次进行标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析，其中杂交的具体步骤包括：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以AFP mRNA和RhoGDI2基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

如上所述，当检测到AFP mRNA的表达高于正常对照时，则可预测受试者为肝癌早期或肝癌易感性。RhoGDI2已被公认为肿瘤转移抑制基因，我们在研究中证实，RhoGDI2基因与广谱腺癌症转移密切相关，病患者中该基因的表达量比正常人表达量都低。

本发明具有如下有益效果：

由于AFP血液检测肝癌，诊断准确率较低，其癌块直径2CM以上和直径2CM以下的肝癌阳性率分别是50％和20％，如何做到影像医学手段无法检查到癌肿，在AFP蛋白出现前，就能发现肝癌已发生及已转移复发，这就是本发明基因诊断的意义所在：本发明选用AFP mRNA和RhoGDI2这两组基因，开发出肝癌早期诊断和转移复发的检测试剂盒，可在基因水平上检测消化器官癌症细胞中AFP mRNA和RhoGDI2基因表达量，有助于临床及早发现肝癌，及早治疗，以及治疗后及早检测复发转移变化，做到早诊、早治、早预防，甚至根治的目的，同时应用于肝癌的预测医学亦有重要的临床意义。

与其他癌症检测试剂盒相比，二组基因同时检测可动态观察癌症变化全过程，可更有效地检测癌变动态。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

附图说明

图1是本发明AFP mRNA和RhoGDI2基因原位杂交实施例图。

图2是本发明实施例中肝癌病人AFP过量表达图片。

图3是本发明实施例中肝癌病人RhoGDI2表达降低图片。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以AFPmRNA和RhoGDI2基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成：

消化液            100μL/管            1管/盒           无色透明液体

保护液            100μL/管            1管/盒           无色透明液体

预杂交液          1300μL/管           2管/盒           无色透明液体

正义杂交液        10μL/管             1管/盒           无色透明液体

反义杂交液        10μL/管             1管/盒           无色透明液体

封闭液            1000μL/管           1管/盒           无色透明液体

碱性磷酸酶抗体    1μL/管              1管/盒           无色透明液体

显色剂A           175μL/管            1管/盒           黄色液体

显色剂B           320μL/管            1管/盒           无色透明液体

缓冲液I           90mL/瓶             1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液II          80mL/瓶             1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液III         20mL/瓶             3瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV          90mL/瓶             1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

固定液            90mL/瓶             1瓶/盒           无色透明液体

阳性对照标本            6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2).将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3).将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4).10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水至100mL既可)。

实施例2

应用核酸原位杂交检测方法对癌症早期AFP mRNA和RhoGDI2基因表达的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液I99.9ml，即为使用浓度)50ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3).用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I，99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min(以上过程都在玻璃缸进行)，取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25μL/片(加在有细胞的地方)，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％、90％、95％的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内：

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min；

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min；

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8).用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内，加0.5％封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100μL/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。(此步骤不需加盖玻片)；

10).取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml1×缓冲液III)100μL/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性(此步骤不需加盖玻片)；

12).取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13).用1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

实施例3

肝癌病人20名，正常对照组10名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者AFP基因有过度表达，细胞染色；正常对照组AFP基因不表达，细胞无染色。期中临床诊断转移的病人30例RhoGDI2基因表达降低，10例病人RhoGDI2基因不表达，细胞无染色。具体结果见图2、图3。

序列表：

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种原位杂交综合检测试剂盒及检测方法

<130>/

<150>200710171737.X

<151>2007-11-30

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1830

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

<210>2

<211>606

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

Claims (1)

1.一种原位杂交综合检测试剂盒，包括两组杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列分别如序列表SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示；所述的标记物选自放射性物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛及纳米材料；所述试剂盒包括杂交液；所述试剂盒包括增强剂；所述试剂盒包括显色剂。

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