CN1873020A - RhoGDI2肿瘤转移抑制基因的诊断和治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了RhoGDI2作为一种新的肿瘤转移抑制基因的诊断与治疗方法，RhoGDI2的核苷酸序列，其所编码的氨基酸和可能的功能。这个基因的全套cDNA序列为605个碱基对。在正常人体中具有很高的表达，在各种类型的肿瘤转移患者中表达极低，甚至不表达。这是该基因与其它已发现的肿瘤抑制和肿瘤转移抑制基因的不同之处。它在大部分肿瘤转移患者或临床未见转移而病人症状不佳者均见表达降低或表达缺失。该基因是肿瘤转移抑制基因，本发明用该基因表达程度对各种类型的肿瘤患者进行转移程度、疗效、预后的判断和用于肿瘤的预测医学。本发明还提供了相应的诊断试剂盒和基因治疗药物。

Description

RhoGDI2肿瘤转移抑制基因的诊断和治疗方法

本发明用来自美国希望基因治疗有限公司和上海凯铱威机电有限公司的资金进行，美国希望基因治疗有限公司和上海凯铱威机电有限公司在本发明中拥有一些权利。

发明领域

本发明涉及正常人和肿瘤患者体内的基因表达，特别是涉及RhoGDI2基因的肿瘤转移抑制功能，及用该基因的表达程度和表达量来诊断肿瘤转移状况和用该基因的相关药物来治疗癌症。

背景技术

DNA重组技术的进展促使了正常细胞基因的发现，比如控制生长、发育分化的原癌基因和肿瘤抑制基因，以及肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因。在某些情况下，这些基因调节改变和表达异常引起正常细胞表现为肿瘤生长行为，直至肿瘤细胞转移。迄今为止，已知100多种癌基因和30多种资料可查的肿瘤抑制基因，以及数种肿瘤转移抑制基因。根据其功能特征，可分为不同种类。这些基因包括：(1)生长因子和生长因子受体；(2)存在细胞质和细胞核之间的细胞内信号转录通路信使；(3)影响基因表达和DNA复制的调节蛋白以及仍在研究证实中的具有其它功能。

恶性肿瘤的转移是个复杂的过程，包括癌细胞由原发肿瘤脱落，进入细胞外基质和血管或淋巴管，并在适宜的组织器官中生长，肿瘤细胞在转移中必须突破肿瘤细胞原发部位的细胞外基质(Extracellular Matrix)所形成的屏障结构。对于癌症形成过程科学界已有相当的认识，但是对癌症如何转移，至今仍然不是很了解，是否由部分基因表达异常或细胞内信息传导失调等因素造成，研究者们均在探索中，初步认为是由于机体在基因水平上抗癌，抑制转移与癌变，癌细胞转移的综合平衡失调所致。癌症如果不转移，大致上可由外科手术或化学方法或放疗来治疗，但是如果癌细胞转移，扩散到其它组织或其它器官，就变得难以治疗。事实上，癌症转移所造成的死亡率为90％。近年来的研究发现，存在促使转移的转移基因(Metatic Genes)和抑制转移的基因(Metastasis SuppressorGenes)。肿瘤抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的恶性表型；而肿瘤转移抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的转移表型。关于肿瘤转移抑制基因已有不少研究，1988年美国国立癌症研究院(NCI)Steeg等发现，在7株具有不同转移能力的鼠K-1735黑色素瘤细胞中，有一段基因，其mRNA水平与肿瘤细胞的转移呈负相关并且在低转移的癌细胞株中mRNA水平高出高转移细胞10倍之多。他们把这一基因暂定为Nm23(Non-Metastasis)。以后在啮齿类动物肿瘤转移模型，细胞转染实验中，也证明了Nm23mRNA水平与转移抑制表型密切相关。进一步的研究发现，在人基因组中有两个亚型Nm23基因，分别表示为Nm23-H1和Nm23-H2。Nm23-H1基因定位于第17号染色体着丝点附近，约P″--Q″间。研究表明Nm23-H1和Nm23-H2不但为两个完全不同的基因，而且分别受两个独立的调控系统所调节，其中Nm23-H1的mRNA水平似乎与肿瘤细胞转移关系更为密切。

研究证明，Timp-1和Timp-2基因对肿瘤转移有抑制作用。前面已提到由胶原蛋白组成的基底膜是阻止肿瘤转移的主要屏障，但它能被IV型胶原酶降解。金属蛋白酶抑制物Timp-1和Timp-2都是胶原酶基因家族的糖蛋白抑制物，在转移的肿瘤细胞中，Timp的mRNA表达及Timp蛋白活性低于非转移性肿瘤，而转移性肿瘤细胞所产生的IV型胶原酶活性要高于非转移性肿瘤细胞。实验证明，用Timp-1反义RNA转染鼠3G3细胞，Timp-1表达受抑制，而细胞恶性增加，通过静脉输入重组Timp-1发现实验动物体内恶性肿瘤转移受到了抑制。Timp-2主要与72000IV型胶原酶形成复合物而使酶活性消失，它能与72000IV型胶原酶或酶原结合，并能抑制金属蛋白酶家族所有酶类的活性。实验证明由Ras基因转染的鼠N1H3T3细胞所引起的肺转移瘤，用Timp-2静脉输入裸鼠体内，可以抑制肿瘤细胞的转移。Timp-1和Timp-2主要通过抑制金属蛋白的酶类的治疗而阻止肿瘤转移。

1995年Dong等从前列腺癌杂交细胞AT6.1的第11号染色体中分离到特异性抑制前列腺转移基因，命名为Kail(kang Ai I)，近来，第四军医大学西京医院宋晖发现，Kail基因的表达下降或缺失与卵巢恶性肿瘤的发生及转移密切相关。他们利用脂质体介导Kail cDNA转染高转移性人卵巢癌细胞系HO-8910PM，蛋白表达水平有显著差异。

麻省理工学院怀德海研究所的Robert Weinberg最近发表了与癌症转移早期相关的研究结果，他们使用微阵列(microarray)技术来分析会转移的老鼠乳腺癌细胞的基因表现，从中找到一个重要的转录因子：TWIST，这个转录因子在胚胎发育中的某些过程中，肩负着引发细胞移动，以及组织重组的任务，而类似的细胞移动以及组织重组情况在肿瘤转移的时候也会发生。他们发现TWIST会使由钙粘附素E(E-cadherin)所调控的细胞粘附作用失效，以及产生上皮细胞上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，而且被阻断了TWIST表现的癌细胞其转移的程度会降低，在人类乳腺癌中侵润性小叶癌中，也观察到TWIST抑制了钙粘附素E的表现。Thon Hopikin医院的Kenneth Kinzler等科学家，1995年开始在由肠癌转移到肝脏的癌细胞中，广泛搜寻基因表现情况，发现在癌症过程中，无论癌细胞或正常细胞均有部分基因会过度表达或抑制，PRL-3的酵素不在正常细胞表达，而在转移癌细胞中大量表达。此外，有人从鼠的非转移乳腺癌细胞株DMBA-8中克隆出一种WDNM1基因，该基因RNA的表达是转移性乳腺癌细胞株的20倍，随后克隆出的第二株WDNM2基因，其表达水平与肿瘤的转移型呈负相关。

尽管学者对肿瘤转移抑制基因的研究做出了贡献，但肿瘤转移抑制基因的表达异常的分子机制不十分清楚，彻底研究清楚肿瘤转移的机制以及与肿瘤转移抑制基因之间的关系是新世纪人类的一大任务。

根据财富杂志的调查，从1972年至今，在美国国家癌症研究院的资助项目中，只有不到0.5％的项目研究癌症转移，去年，该研究院资助项目有8900个，其中，92％甚至没有提到癌转移。本发明提供的肿瘤转移抑制基因RhoGDI2，是位于染色体12P123的一个Rho家族基因，它们与GTP和GDP-1功能和细胞内移动有关。RhoGDI2在正常人体组织或器官中广泛表达，但在人类各种类型肿瘤及肿瘤转移患者中表达明显下降，甚至缺失。这是它与其它肿瘤转移抑制基因不同之处。在人类各种类型癌症中扮演了一个重要的角色。本发明表明RhoGDI2基因在正常人群的表达与在人类各种类型癌症患者的表达显著差异，它的发现能满足肿瘤患者的早期诊断，预后，肿瘤预测医学及治疗的需要。

发明概述

本发明基于一种RhoGDI2基因新的肿瘤转移抑制功能，属于创新型的发现。RhoGDI2不同于其它转移抑制基因的作用局限性，它在人类各种肿瘤的表达均降低或缺失。在肿瘤的转移机制中扮演了一个十分重要的角色。在实施方案中，本发明提供一种诊断方法，检测在受试着组织，血液标本RhoGDI2的表达量，它包括用一种检测RhoGDI2的试剂与含RhoGDI2的靶细胞组分接触，上述细胞组分包括核酸(mRNA)或蛋白。本发明提供一种原位杂交诊断试剂盒和一种常规PCR或定量PCR方法来检测受试者中和RhoGDI2有关的肿瘤转移抑制基因的表达程度物实验中，不同组批的裸鼠肿瘤模型，经局部瘤体或肌肉注射含RhoGDI2的质粒或腺相关病毒载体携带的治疗基因进行实验性治疗基因，实验结果表明RhoGDI2基因有抑制肿瘤转移作用。

此外，本发明提供一种基因治疗方法，包括将一种包含与启动子可操作地连接的编码RhoGDI2的核苷酸序列的表达载体(重组在腺相关病毒或其它病毒中治疗基因)导入宿主受试者细胞内。本发明中RhoGDI2可以是质粒DNA或重组在rAV，rAAV载体和非病毒载体中。

发明详述

本发明提供RhoGDI2一种新的肿瘤转移抑制功能基因，RhoGDI2位于染色体12P12.3位点上，是Rho家族性基因。在第一次实施方案中，本发明提供检测在一受试者的RhoGDI2有关的表达降低或缺失的方法，包括用一种反应或结合RhoGDI2的试剂，接触怀疑有与RhoGDI2表达降低的靶细胞组分并检测RhoGDI2(靶细胞组分可能是核酸，如DNA或mRNA，或可能是蛋白，当组分是核酸时，典型的试剂是核酸探针或PCR引物；当靶细胞组分是蛋白时，典型的试剂是抗体探针。靶细胞组分可直接原位检测，或和探针接触前从其它细胞组分用本领域技术人员熟知普通方法分离。检测方法包括本领域技术人员熟知的DNA和RNA印迹分析，Rnas保护，免疫分析和其它检测方法。探针的检测性标记采用本领域技术人员熟知的同位素荧光化合物，生物发光化学物，化学发光化合物，金属鲎合物或酶，以及其它合成标志。技术人员能用日常实验确定上述标志)。本发明优选的样品是血液的白细胞，或其它器官组织和细胞。通过本发明的方法能检测人类各种类型肿瘤患者体内的RhoGDI2表达异常，包括：肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、胆道癌、白血病、甲状腺癌、骨癌以及神经细胞瘤和畸形细胞瘤，以上各种类型的恶性肿瘤在实施方案中均已作过检测，且与正常人对比有非常意义。

在实施方案例一中，本发明试剂盒包括划分为几个部分的一个承载装置，紧密地放在一个或多个容器，如小瓶等，容器具的每一个包括用本发明的不同组分之一，试剂盒内放置的试剂测试量可以是单一受试者，也可以是多个受试者使用。例如，容器之一是可以检测性标记的探针。上述探针可分别特异性地针对靶蛋白或靶核酸的抗体或核苷酸。其中，靶物指示本发明的RhoGDI2的表达变化有关。试剂盒用来检测靶物RhoGDI2的表达量。检测方法利用核酸原位杂交技术，对血液标本或组织片进行直接的核酸原位杂交。检测原位杂交的试剂盒包括：核酸，探针，抗体及抗体的连接物，显色剂等，本发明也提供一常规PCR或定量PCR方法，(本领域技术人员熟知PCR方法)来检测受试者中和RhoGDI2有关的肿瘤转移抑制基因的表达程度。

本发明也提供一种由RhoGDI2表达降低或缺失导致肿瘤发生转移的基因治疗。通过导入合适的含RhoGDI2的结构基因至RhoGDI2基因表达降低或缺失的肿瘤患者和肿瘤转移患者的体内，上述治疗方法会获得其疗效。

用于本发明基因治疗方法的各种病毒载体包括：腺病毒，疱疹病毒，腺相关病毒。除病毒载体外，非病毒载体包括：脂质体，纳米材料与氨基酸组成的包装载体，可以运载RhoGDI2基因进入细胞中转录，表达相关蛋白。本发明也包括将RhoGDI2导入受试者自身干细胞，再回输到体内或导入异体造血干细胞，间充质干细胞，再注入受试者体内。以上各种载体均能将RhoGDI2基因转染到受试者体内，在受试者细胞内转录，复制，表达，达到治疗目的。以上各种载体应用与RhoGDI2基因重组技术，本领域的技术人员均能熟练掌握。

图面说明

RhoGDI2基因在正常成年人血液标本中的表达均值约40％-50％，在临床各类肿瘤病患和肿瘤转移病患中，RhoGDI2表达均降低或缺失，见图1-6；在裸鼠肿瘤模型的实验中，用RhoGDI2重组在AAV载体中，实施基因治疗，图7，8显示RhoGDI2基因药物的治疗效果。

图1是肿瘤病人的原位杂交结果(深色为阳性结果)

图2是正常人的原位杂交结果(深色为阳性结果)

图3是正常人血液RhoGDI2原位杂交结果(1)

图4是正常人血液RhoGDI2原位杂交结果(2)

图5是病人血液RhoGDI2原位杂交结果(1)

图6是病人血液RhoGDI2原位杂交结果(2)

图7是肿瘤模型的RhoGDI2基因治疗结果

图8是肿瘤模型的生理盐水治疗对照

RhoGDI2序列特征：

1.长度：1201碱基对；2.类型：核苷酸；3.链型：单

分子类型：cDNA

直接来源：克隆

特点：

1.名称/关键词：CDS

2.定位：105.....710

                   RhoGDI2.ST25

         SEQUENCE LISTING

<110>上海二医新生基因科技有限公司

<120>RhoGDI2肿瘤转移抑制基因的诊断和治疗方法

<130>RhoGDI2肿瘤转移抑制基因的诊断和治疗方法

<140>2005100263489

<141>2005-09-15

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1216

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>取自人体白细胞

<400>1

ctcattgact tccttcctgt tctaactgcc agtactcaga agtcagagtt gagagacaga     60

ggcaccccgg acagagacgt gaagcactga ataaatagat cagaatgact gaaaaagccc    120

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ttttcccacc ctgtcactca acgtggtccc tagaacaaga ggcttaaaac cgggctttca    900

cccaacctgc tccctctgat cctccatcag ggccagatct tccacgtctc catctcagta    960

                                   RhoGDI2.ST25

cacaatcatt taatatttcc ctgtcttacc cctattcaag caactagagg ccagaaaatg    1020

ggcaaattat cactaacagg tctttgactc aggttccagt agttcattct aatgcctaga    1080

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tcttcttttg tgagagacac tgtaaacgac acaagagaac aagaataaaa caataactgt    1200

gtgtgttctg gctgag                                                    1216

Claims (9)

1.RhoGDI2是一种核苷酸序列，其碱基对长度为605bp，是正常人体内的基因，位于染色体12p12.3位点上。本发明将该基因与下列权利要求一一阐明

2.一种检测在受试者中和RhoGDI2有关的肿瘤转移抑制基因的方法，包括用于RhoGDI2反应的试剂与含RhoGDI2的靶细胞组分接触，检测RhoGDI2基因的表达，对肿瘤病患的诊断，预后，生存期判断以及肿瘤预测医学监测。(本发明提供一种原位杂交诊断试剂盒，用于检测显示有与RhoGDI2表达量相关，包括划分为好几个部分的装置，可紧密地放在一个或多个容器里，包括首要的含检测RhoGDI2基因的核酸的探针的容器；本发明也提供一种常规PCR或定量PCR(Real-TimePCR)方法来检测受试者中和RhoGDI2有关的肿瘤转移抑制基因的表达程度

3.权利要求2的方法，其中RhoGDI2的肿瘤转移抑制功能表达有关的靶细胞组分，选自正常人和各种类型的恶性肿瘤病人白细胞和其它各脏器组织或细胞。其靶细胞组分关键物是核酸(DNA和RNA)或蛋白质(血液的细胞及其它组织块)

4.权利要求2的方法，其中试剂是一种探针，探针是核酸和抗体(多克隆和单克隆)，及探针为可检测性的标记，标记物选自放射性同位素、生物发光化学物、化学发光化合物、荧光化合物、金属鲎合物或酶

5.一种基因治疗方法，包括向宿主受试者细胞内导入一种表达载体，其中表达载体包含与启动子可操作地连接的编码RhoGDI2的核苷酸序列，在宿主体内转录，表达RhoGDI2的相关蛋白，达到治疗作用。

6.权利要求5的方法，其中表达载体被导入离体的受试者细胞中，然后重导入受试者体内和直接导入受试者的细胞中

7.权利要求5的方法，其中表达载体是一种RNA病毒和其它病毒载体(DNA病毒载体)或非病毒载体(脂质体或纳米材料或氨基酸构成的包装载体，或干细胞为载体)

8.权利要求RhoGDI2基因的相关下游产物蛋白质用于肿瘤患者的诊断和治疗

9.权利要求2和5的方法，其中受试者是人。

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