CN102533990A - 乳腺癌变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与乳腺癌变前期病理演变有密切相关的锌指蛋白703Zincfingerprotein（ZNF703）基因的mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测ZNF703基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。

Description

乳腺癌变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与乳腺癌前变的mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。  

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万（贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万），700多万患者，每年的花费是1.4万亿，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性（多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善（动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化（癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上（特殊病例除外），很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨（有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中），其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成（单克隆）前,就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本（癌症病人、高危人群、家属史人群、正常对照），对ZNF703基因与乳腺癌的早期预警进行检测分析。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，这种疾病通常发生在乳房腺上皮组织，发病率占各种恶性肿瘤的7-10%，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见恶性肿瘤之一。中国女性乳腺癌的发病率越来愈高，越来越年轻。据世界卫生组织估计全球每年约有120万妇女被确诊患乳腺癌。在我国，乳腺癌已成为现代女性的“头号杀手”。“在情况最为严重，每300名女性就有1名乳腺癌患者，发病率居全国第一。”专家表示，压力大、吸烟饮酒、晚睡晚起、缺乏足够运动、使用含雌激素的补品化妆品、晚育以及生养后不哺乳等因素，让职业女性如教师、办公族、企业家成为乳腺癌高发人群，她们得癌的比例约占女性乳腺癌患者的40。“过往10年中，全世界乳腺癌发病率年增8%。ZNF703是这五年来发现的第一个（乳腺癌）致癌基因。在平均12个乳腺细胞中有一个细胞会高度活化，这就是英国每年高达4000例乳腺癌的原因所在。致癌基因是一种在正常情况下有助于指导健康细胞正常分裂的基因，但一旦它高度活化，它将会扰乱细胞分裂过程的正常的中止与平衡。这种危害被描述成是“像一辆汽车的油门被粘住了”，细胞和其子细胞将永远分裂下去。

在英国癌症研究中心的剑桥研究学会和在加拿大温哥华的不列颠哥伦比亚癌症机构的科学家们进行了这项研究，该研究被刊登在EMBO欧洲分子生物学组织期刊分子医学上。他们研究了1172份乳腺肿瘤样本中基因的活跃性，同时也研究了乳腺癌细胞的在实验室的生长情况。他们剔除了其他基因直到只剩下8号染色体的一个区域中的ZNF703基因，这个基因在所有的样本测试中异常活跃。在对两个病人的研究中显示，ZNF703是唯一高度活化的基因，该研究同时还显示它导致了癌症的恶化。该研究项目的主要负责人——剑桥研究学会的Carlos Caldas教授说：“20年前，科学家们第一次发现DNA中的这个区域可能藏有与乳腺癌的产生有关的基因。但是只有拥有了当今的科学技术，我们才有可能有效地缩小搜索范围从而精确地找出相关的基因。”他还说：“更为关键的是，测试这个基因在一个病人的肿瘤中是否高度活化能帮助凸显那些更可能对标准激素治疗有抵抗作用的情况，有助于确定药物治疗与人体是否匹配。”在英国癌症研究中心担任癌症信息指导的Lesley Walker医生说：“这是近五年来在乳腺癌方面发现的第一个这种类型的基因。这真是让人兴奋不已，因为它将是开发新的治疗乳腺癌的药物的首要治疗目标，这种新药将用来专门针对目标肿瘤中的这种高度活化的基因。在不久的将来，这将很有希望使癌症治疗变得更为有效。”进一步的分析证实ZNF703基因的高度活跃可能与乳癌干细胞的发生有关，使乳癌的根治带来困难。这些研究结果表明，以ZNF703为具体目标，作为乳腺癌变前期筛查的靶基因有一定的临床意义。

将ZNF703的mRNA作为早期筛查乳腺癌变前期有非常重要的临床诊断意义。ZNF703的mRNA在乳腺癌变前期及癌变过程中表达过度。它作于乳腺癌变前期筛查、及乳腺腺癌治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了大胆创新。特别是筛选临床标本（正常人群、癌症高危人群、癌症好发人群、肿瘤患者），突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。

目前对ZNF703基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料ZNF703基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。

本发明人在针对创新性发明的要求，设计了不同数据例组（乳腺癌患者、高危人群（未婚高龄女性）、正常对照人）例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上乳腺癌症病人ZNF703基因都过度表达，高危人群有不同程度表达15-25%,家属发病史人员有几例呈低表达，正常人都是零表达。表明ZNF703基因乳腺癌变前期筛查的重要标志物。

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA）和检测的靶mRNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上）。

鉴于目前临床上癌症的诊断（影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断）是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。 

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与乳腺癌发生、转移、复发相关的ZNF703基因的原位杂交检测方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针如SEQ ID NO.1所示序列，是ZNF703基因序列中间一段碱基序列，从500到1300bp，ZNF703基因的RNA序列号：NM_025069，ZNF703基因如SEQ ID NO.2所示序列，其核苷酸序列长度是2174bp，CDS是198..1970bp，位于染色体 8p11.23"上。（在探针标记过程中如果基因序列太长，超过1000bp以上，我们会用CDS的序列来设计探针，如果CDS的序列也超过1000bp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析）。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。

本发明的癌变前期ZNF703基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA

水平，及早对乳腺癌变前期筛查及乳腺癌经治疗后复发、转移、扩散的早期预警。ZNF703基因是一种类似致癌基因，它的高表达表明有乳腺癌变的可能及治疗后有可能复发、转移，提示临床医生及早介入诊治。

本发明还提供一种ZNF703基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自乳腺癌患者、乳癌高危人群、健康女性。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的乳腺癌高危人群、乳癌经治疗后病人复发、转移及正常女性乳癌前期的筛查。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以ZNF703基因为检测对象，合成探针是ZNF703基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供ZNF703基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人ZNF703基因表达低或不表达，即不显色，ZNF703基因在乳腺癌病人、高危人群和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以ZNF703基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的ZNF703基因的mRNA，用来确定乳腺癌是否发生和/或转移。因为ZNF703基因在正常人中低表达或不表达，如果ZNF703基因表达高度，说明乳腺癌变风险非常高，已及治疗后病人可能已复发、转移、扩散，从而获得乳腺癌变前期的筛查和诊断信息，帮助临床医生及早介入。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

如上所述，当检测到ZNF703基因的表达高于正常对照时，则可预测受试者为乳腺癌变已发生。

本发明具有如下有益效果：

本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌变发生和病理演变过程中乳腺癌变的发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测标志物（癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子）和影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因水平上检测ZNF703基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床乳腺癌变前期高风险人群，一个真正的早期筛查以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施乳癌的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治乳癌恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

附图说明

图1是本发明ZNF703基因原位杂交技术流程图。

图2是本发明实施例中乳腺癌病人ZNF703过量表达图片。

图3是本发明实施例中正常人ZNF703表达图片。

图4是高危人群的ZNF703表达图片。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以ZNF703基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成：

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL, 加水至100mL既可)。

实施例2

应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本ZNF703基因表达量的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min, 再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液                                                

, 99ml即为使用浓度)洗10min, 三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内, 加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片,弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内,用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片, 盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片,弃去盖玻片, 将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次,每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s,取出玻片,自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内,加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片, 盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片,用1×缓冲液Ⅲ洗30s,自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片,盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次, 每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中,混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

乳腺癌病人20例，高危人群（未婚高龄女性）20例，正常对照女性20例。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交（图1）。结果表示，所有癌症患者ZNF703基因有过度表达，细胞染色深；20例高危人群有低表达；20例正常对照组ZNF703基因不表达，细胞无染色具体结果见图2（乳腺癌）、图3（高危人群）、图4（正常人群）。

乳腺癌症人数	表达量%	高危人数	表达量%	正常人数	表达量%
						1	88	1	19	1	0
2	84	2	18	2	0
						3	74	3	23	3	0
4	82	4	26	4	0
						5	76	5	28	5	0
6	84	6	19	6	0
						7	92	7	25	7	0
8	84	8	26	8	0
						9	86	9	24	9	0
10	90	10	27	10	0
						12	79	12	18	12	0
13	88	13	22	13	0
						14	68	14	20	14	0
15	72	15	19	15	0
						16	80	16	20	16	0
17	75	17	22	17	0
						18	86	18	28	18	0
19	78	19	27	19	0
						20	69	20	20	20	0

序列表

 

SEQ ID NO：1（探针序列）

501 ccggacccgc cgccctcctc caaactcaac tcggtggcgg

      541 cggcggccaa cgggctggga gcggagaagg accccggccg ctcagccccg ggcgccgcct

      601 ccgcagccgc ggccctgaag cagctggggg actcaccggc cgaggacaag tccagcttca

      661 agccctactc caagggctcc ggcggcggcg actcccgcaa agacagcggc tcctcctcgg

      721 tgtcttccac ctcctcctcg tcctcctcgt ccccgggaga caaggcgggc ttcagggtcc

      781 ccagcgccgc ctgcccgccc tttcccccgc atggagcgcc ggtctccgca tcctcgtcct

      841 cgtcgtcgcc cggcggctcc cgcggcggct ccccgcacca ctctgactgc aagaacggcg

      901 gcggggttgg cggcggggag ctggacaaga aagaccagga gcccaagccc agcccggagc

      961 cggcagccgt gagccgcggc ggcggtgggg agcccggggc gcacggtggc gccgagtccg

     1021 gggcctccgg gcgcaagtcc gagccgccct cggcgctggt gggggccggc cacgtggcgc

     1081 cggtgtctcc ctacaagccg ggccactcgg tgttcccgct gccgccctcc agcattggct

     1141 accacggctc catcgtgggc gcctacgccg gctacccgtc tcagttcgtg cctggcctgg

     1201 atcctagcaa gtccggcctc gtgggaggcc agctgtctgg gggcctgggc ctgccgccgg

     1261 gcaagccccc cagctccagc ccgctcaccg gggcctcccc

SEQ ID NO：2 ZNF703基因序列号：NM_025069

1 gtttttgtgt tgctagccgg ggccagcggc ggtggcggcg gcggcggagg cgtcggtgga

       61 ggaggggagg cggcgaggag gcgcagctcc cgctgcaccg cgatcgacgc tgcggagcga

      121 gcccacccgc cccgggagct cgcctccccg gtgctccccc gccctccccg cccccccagc

      181 ggcgctgcct cctccaaatg agcgattcgc ccgctggatc taacccaagg acacccgaaa

      241 gcagcggcag cggcagcggc ggcggcggga agaggccggc ggtgccggca gcggtgtccc

      301 tcttgccacc ggcggacccc ctgcgccagg cgaaccggct cccgatcagg gtcctgaaga

      361 tgctgagcgc tcacaccggt cacctcctgc acccggagta cctgcagccg ctgtcctcca

      421 ctcccgtcag ccccattgag ctggacgcca agaagagccc cttggcgctg ctggctcaga

      481 cctgctcgca gatcggcaag ccggacccgc cgccctcctc caaactcaac tcggtggcgg

      541 cggcggccaa cgggctggga gcggagaagg accccggccg ctcagccccg ggcgccgcct

      601 ccgcagccgc ggccctgaag cagctggggg actcaccggc cgaggacaag tccagcttca

      661 agccctactc caagggctcc ggcggcggcg actcccgcaa agacagcggc tcctcctcgg

      721 tgtcttccac ctcctcctcg tcctcctcgt ccccgggaga caaggcgggc ttcagggtcc

      781 ccagcgccgc ctgcccgccc tttcccccgc atggagcgcc ggtctccgca tcctcgtcct

      841 cgtcgtcgcc cggcggctcc cgcggcggct ccccgcacca ctctgactgc aagaacggcg

      901 gcggggttgg cggcggggag ctggacaaga aagaccagga gcccaagccc agcccggagc

      961 cggcagccgt gagccgcggc ggcggtgggg agcccggggc gcacggtggc gccgagtccg

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     1081 cggtgtctcc ctacaagccg ggccactcgg tgttcccgct gccgccctcc agcattggct

     1141 accacggctc catcgtgggc gcctacgccg gctacccgtc tcagttcgtg cctggcctgg

     1201 atcctagcaa gtccggcctc gtgggaggcc agctgtctgg gggcctgggc ctgccgccgg

     1261 gcaagccccc cagctccagc ccgctcaccg gggcctcccc gccctccttc ctgcagggat

     1321 tatgccgcga cccctattgc ttgggaggtt accacggcgc ctcgcacctc ggcggctcca

     1381 gctgctccac ctgcagcgcg cacgaccctg ccgggcccag cctgaaggcg gggggctacc

     1441 cgctggtgta ccccgggcac ccgctgcagc ccgccgcgct ctcgtccagc gccgcccagg

     1501 ccgcgctccc cggccacccg ctctacacct acggcttcat gctgcagaac gaaccgctgc

     1561 cgcacagctg caactgggtg gcagccagtg ggccgtgcga caagcgcttc gccacctcgg

     1621 aggagctgct cagccaccta cggacccaca cggccctgcc gggagccgag aaacttctgg

     1681 ccgcctaccc cggggcctcg ggcctgggca gcgccgccgc cgccgccgcc gccgccgcct

     1741 cctgccatct gcacctcccc ccgcccgccg cccccggcag ccccgggtcg ctgtccttgc

     1801 ggaatccaca cactttgggc ctaagccggt accaccccta tggcaagagc cacttatcca

     1861 cagcgggggg cctggccgtg ccgtccctcc ccacagccgg accctactat tcgccatacg

     1921 cgctgtatgg acagagacta gcttcagcct cggcgctggg ataccagtaa ctacagctct

     1981 tcctccaccc cagccccctc accctcctcc ctctccctcc tcctccctcc ccacctgccg

     2041 tcgccgctgc aacctccact actgcttgac cctgccggga ttccccaccc aacccttccc

     2101 caccggactg tgtatttatt tactataatg ttagcttaca agctgggaat ataagtgcat

     2161 taacggccca catg

Claims (10)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针如序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种ZNF703基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液白细胞标本选自乳腺癌患者、高危人群、遗传家属、正常女性标本。

10.ZNF703基因在制备检测乳腺癌原位杂交试剂盒中的应用。

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