CN102586441A - 大肠癌早期相关dna检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大肠癌早期相关DNA检测方法，其特点是，包括步骤：a、提取血浆或血清样品的循环DNA；b、将循环DNA进行甲基化修饰；c、采用PCR引物对和TaqMan MGB荧光探针对步骤b得到的循环DNA进行荧光定量PCR，其中PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；d、根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析循环DNA中是否存在大肠癌早期相关DNA。还涉及相关的检测探针组合物和试剂盒。本发明的大肠癌早期相关DNA检测方法设计巧妙，相对传统大肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，检测结果准确可靠，从而可作为医师治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及疾病相关DNA检测技术领域，更具体地，涉及大肠癌早期相关DNA检测方法技术领域，特别是指一种大肠癌早期相关DNA检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒。
背景技术
结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤。据世界流行病学调查，结肠癌在欧美人群中发病率很高，居内脏种瘤第二位。随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，其发病率在国内也呈逐年上各趋势。
目前的结肠癌诊断技术有X线检查，纤维结肠镜检查，CT检查等可视化物理诊断方法和潜血试验，血清癌胚抗原测定，血红蛋白测定，组织病理学检查等生化技术。可视化物理诊断方法往往到癌症发展后期才能检出，并对检测人员的技术，经验要求较高。血清癌胚抗原对结肠癌的诊断阳性率不高(50％-60％)，尤其对早期肠癌的敏感性很差(10％-20％)，故无法将它用于无症状人群的结肠癌筛选。组织病理学检查等是侵入性检查，具有不同程度的风险性。
荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，能实时监控反应过程，并结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量的PCR技术。循环DNA是指存在于血浆或血清中的游离DNA。肿瘤细胞在增殖，转移和凋亡中都会不断的释放DNA进入血液循环中，因此癌症相关循环血DNA是监测肿瘤的生理和病理变化，细胞代谢分化的重要指标。
因此，如果能够采用循环血DNA PCR定量技术对大肠癌早期相关DNA进行检测，则循环血DNA PCR定量技术检测相对目前主流的结肠癌诊断技术来说，具有快速、准确、直观的特点。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种大肠癌早期相关DNA检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒，该检测方法设计巧妙，相对传统大肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，检测结果准确可靠，从而可作为医师治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种大肠癌早期相关DNA检测方法，其特点是，包括步骤：
a.提取血浆或血清样品的循环DNA；
b.将所述循环DNA进行甲基化修饰；
c.采用PCR引物对和TaqMan MGB荧光探针对所述步骤b得到的循环DNA进行荧光定量PCR，其中所述PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
d.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述循环DNA中是否存在大肠癌早期相关DNA。
较佳地，在所述步骤b中，采用重亚硫酸盐对所述循环DNA进行甲基化修饰。
在本发明的第二方面，提供了一种大肠癌早期相关DNA检测探针组合物，其特点是，包括PCR引物对和TaqMan MGB荧光探针，其中所述PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种大肠癌早期相关DNA检测试剂盒，其特点是，包括引物容器和荧光探针容器，所述引物容器内具有PCR引物对干燥粉末或溶液，所述荧光探针容器内具有TaqMan MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述PCR引物对是SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明的创新点在于通过荧光定量PCR技术检测人体血浆或血清中是否存在大肠癌早期相关DNA，设计巧妙，相对传统大肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，检测结果准确可靠，从而可作为医师治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。
1试剂
1.1定量PCR探针：
定量PCR使用的引物探针(序列如下)溶解在TE缓冲液中，浓度5μM.-20℃冻存。
1.2纯净水
1.3微量DNA硅珠抽提试剂盒
1.3.1裂解缓冲液：NaI 6M，Na2SO3 0.1M，室温保存。
1.3.2蛋白酶K，20μg/μL，室温保存。
1.3.3硅珠，1g/mL，室温保存。
1.3.4洗涤缓冲液1：100mM NaCl，50％乙醇，10mM TE buffer pH 7.5，室温保存。
1.3.5洗涤缓冲液2：75％乙醇代替。
1.3.675％乙醇：取30mL无水乙醇和10mL ddH2O混合，室温保存。
1.3.7TE缓冲液，室温保存。
1.4EZ DNA Methylation-Gold Kit Ca#：D5005
1.4.1CT转化剂：使用前加入900μL ddH2O，300μL M-稀释缓冲液，50μL M-溶解缓冲液，涡旋振荡混匀后稍微离心，可在-20℃下冻存一月。使用前需37℃预热，震荡混匀。
1.4.2M-稀释缓冲液，室温保存。
1.4.3M-溶解缓冲液，室温保存。
1.4.4M-洗涤缓冲液，使用前加入3体积的无水乙醇，室温保存。
1.4.5M-结合缓冲液，室温保存。
1.4.6M-脱磺化缓冲液，室温保存。
1.5Cancer Marker荧光定量PCR试剂盒
1.5.12×SensiMix dT。
1.5.2正向与反向引物，5μM。
1.5.3探针，5μM。
1.6无水乙醇，室温保存。
1.7三羟甲基氨基甲烷，室温保存。
1.8乙二胺四乙酸，室温保存。
2仪器与耗材
2.1离心管：1.5mL，15mL，50mL。
2.2PCR管，8联。
2.3微量移液器与吸头：2.5μL，10μL，20μL，200μL，1mL。
2.2冰箱：4℃，-20℃，-80℃。
2.3空气摇床。
2.4离心机。50mL转子，1.5mL转子，微型离心机。
2.5量筒：50mL
2.6恒温加热器。
2.7水浴锅。
2.8涡旋振荡器。
2.9384孔板。
2.10封板膜。
2.11ABI 7900荧光定量PCR仪。
2.12Zymo-SpinTM IC柱。
2.13温度计。
3实验步骤
3.1制备血浆样品
3.1.1自人体内抽取约10ml新鲜血液，置于15mL离心管中，血液离心前可在室温下保存4hr。
3.1.21,500g离心10min，转移上清到一个新的离心管中，注意不要吸到淡黄色的细胞层。
3.1.3再次1,500g离心10min，将上清以5mL分装并冻存到-80℃冰箱中，血浆可在-80℃下保存2年。
3.2抽提循环DNA
3.2.1取1个50mL离心管，向其中依次加入5mL血浆，5mL裂解缓冲液，150μL蛋白酶K(20μg/μL)，20μL硅珠，颠倒混匀5次。摇床室温100rpm振荡混匀20min，如果血浆不足5mL，用水补足体积。
3.2.29,000g离心3min，丢弃上清。
3.2.3.加入1ml洗涤缓冲液1重悬沉淀，转移到1.5mL离心管中，12,000g离心1min，丢弃上清。
3.2.4加入1mL洗涤缓冲液2，充分重悬沉淀，12,000g离心1min，丢弃上清，重复洗涤1次。
3.2.5尽量吸走全部上清，在56℃离心管恒温加热器上加热3min，注意不要让液体蒸发干。
3.2.6加入100μL TE缓冲液，涡旋震荡后离心20sec，在65℃中水浴15min。
3.2.714,000g离心3min，转移到新的1.5mL离心管中，打开盖子在50℃加热板上自然蒸发2-3hr，使液体体积减少约到40μL，转移到-20℃中冻存。
3.3质控点1：定量PCR检查循环DNA的质量
3.3.1配制CFF1定量PCR体系.
| 组分 | 体积 |
| 2×SensiMix dT | 10μL |
| CFF1引物对F和R(各5μM) | 1μL |
| CFF1探针(5μM) | 1uL |
| ddH2O | 7μL |
| 循环DNA | 1μL |
3.3.2点样：将配制好的PCR Mix 19μL分装到384孔板中，各取1μL循环DNA样品加入到Mix中，另取1μL ddH2O加入Mix中作为阴性对照NTC。点样后将384孔板用封板膜封口，涡旋振荡后4000g离心2min。
3.3.3定量PCR：将384孔板置于ABI 7900荧光定量PCR仪中，按以下条件进行定量PCR。
3.3.4结果分析：将阈值设置为0.2，当Ct值在20-35之间且熔链曲线中有突出单峰，峰值在75℃左右时可视为阳性结果，认为循环DNA提取成功。
3.4重亚硫酸盐转化循环DNA
3.4.1配制CT转化剂：向装有CT转化剂粉末的棕色管中加入900μL ddH2O，300μLM-稀释缓冲液，50μL M-溶解缓冲液，涡旋振荡混匀后稍微离心。
3.4.2配制M-洗涤缓冲液：向6mL M-洗涤缓冲液浓缩液中加入24mL/无水乙醇，振荡混匀。
3.4.3.向20μL循环DNA样品中加入130μL CT转化剂，如果DNA样品不足20μL，用水补足，轻弹或吹打混匀，稍微离心。注意：如果DNA样品量大于20μL，需要修改CT转化剂的配制步骤：DNA样品每多10μL，降低配制CT转化剂时ddH2O的量100μL，其它组分的量不变。
3.4.4.将样品放在PCR仪中，98℃变性10min，64℃温育2.5hr，可4℃保存过夜。
3.4.5.加入600μL M-结合缓冲液到Zymo-SpinTM IC柱中，将收集柱装在一个收集管中。注意：收集柱的最大容积为800μL。每步操作都要注意尽快倒空收集管中的液体，避免残留污染。
3.4.6.加入转化后的样品到含有M-结合缓冲液的收集柱中，关上盖子，颠倒混匀数次。
3.4.7.最大转速离心30sec，丢弃液体。
3.4.8.加入100μL M-洗涤缓冲液，最大转速离心30sec。
3.4.9.加入200μL M-脱磺化缓冲液，25℃静置15-20min，最大转速离心30sec。
3.4.10.加入200μL M-洗涤缓冲液，最大转速离心30sec。
3.4.11.将收集柱转移到1个1.5mL离心管中，加入10μL M-洗脱缓冲液，最大转速离心30sec。注意：可用ddH2O或TE(pH≥6.0)代替洗脱液。
3.4.12.纯化后的DNA可长期冻存于-80℃中，一个定量PCR反应使用1-4μL DNA，如果需要可加大到10μL，洗脱液的体积可超过10μL，但会降低DNA溶度。
3.5质控点2：定量PCR检查转化DNA的质量
3.5.1配制H14B定量PCR体系.
| 组分 | 体积 |
| 2×SensiMix dT | 10μL |
| HB14对F和R(各5μM) | 1μL |
| HB14探针(5μM) | 1μL |
| ddH2O | 3μL |
| 转化DNA | 5μL |
3.5.2点样：将配制的PCR Mix 15μL分装到384孔板中，各取5μL转化DNA样品加入到Mix中，另取5μL ddH2O加入Mix中作为阴性对照NTC。点样后将384孔板用封板膜封口，涡旋振荡后4000g离心2min。
3.5.3.定量PCR：将384孔板置于ABI 7900荧光定量PCR仪中，按以下条件进行定量PCR.
3.5.4.结果分析：将阈值设置为0.2，当Ct值在20-35之间且熔链曲线中有突出单峰，峰值在75℃左右时可视为阳性结果，认为转化DNA成功。
3.6定量PCR检测结肠癌DNA
3.6.1配制Cancer Marker T定量PCR体系.
| 组分 | 体积 |
| 2×SensiMix dT | 10μL |
| Cancer Marker引物对F&R各(5μM) | 1μL |
| Cancer Marker探针(5μM) | 1μL |
| ddH2O | 3μL |
| 转化DNA | 5μL |
3.6.2点样：将配制好的PCR Mix 15μL分装到384孔板中，各取5μL转化DNA样品加入到Mix中，另取5μL ddH2O加入Mix中作为阴性对照NTC。点样后将384孔板用封板膜封口，涡旋振荡后4000g离心2min。
3.6.3定量PCR：将384孔板置于ABI 7900荧光定量PCR仪中，按以下条件进行定量PCR.
3.6.4.结果分析：将阈值设置为0.2，当Ct值在30-40之间，且熔链曲线中有突出单峰，峰值在75℃左右时可视为阳性结果，认为血浆中存在大肠癌早期相关DNA。
4实施例
取得确诊为结肠癌病人的肿瘤不同发展期血浆5份，正常人血浆2份，按上述步骤进行定量PCR。结果如下表：
可见，本方法对阳性和阴性样本的敏感性和特应性均达到100％，是一种相当可靠的技术手段。
本发明的大肠癌早期相关DNA检测方法相对目前主流的结肠癌诊断技术来说，具有快速、准确、直观的特点。在本发明的实验中，荧光定量PCR能检测到正常人血浆中的极微量的游离癌症DNA，因此该技术对早期癌症的诊断具有传统技术不可比拟的优越性。总之，利用荧光定量PCR检测癌症循环血DNA相对传统技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，是值得推广应用，具有很大市场价值的新技术。
综上所述，本发明的大肠癌早期相关DNA检测方法设计巧妙，相对传统大肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，检测结果准确可靠，从而可作为医师治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (4)
1.一种大肠癌早期相关DNA检测方法，其特征在于，包括步骤：
a.提取血浆或血清样品的循环DNA；
b.将所述循环DNA进行甲基化修饰；
c.采用PCR引物对和TaqMan MGB荧光探针对所述步骤b得到的循环DNA进行荧光定量PCR，其中所述PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
d.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述循环DNA中是否存在大肠癌早期相关DNA。
2.根据权利要求1所述的大肠癌早期相关DNA检测方法，其特征在于，在所述步骤b中，采用重亚硫酸盐对所述循环DNA进行甲基化修饰。
3.一种大肠癌早期相关DNA检测探针组合物，其特征在于，包括PCR引物对和TaqManMGB荧光探针，其中所述PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
4.一种大肠癌早期相关DNA检测试剂盒，其特征在于，包括引物容器和荧光探针容器，所述引物容器内具有PCR引物对干燥粉末或溶液，所述荧光探针容器内具有TaqManMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述PCR引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
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