CN105624273A - 结直肠癌的检测引物、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CA4基因的检测引物，该引物包括甲基化扩增引物；其中，甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR；和/或，CA4基因的检测引物包括BGS引物；其中，BGS引物包括具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR。采用本发明的检测引物，基于CA4基因这一生物标记物进行，通过提取并扩增CA4基因后检测CA4基因甲基化状态，则可进一步辅助结直肠癌以及复发的可能性检测；相比现有的检测方法具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

Description

结直肠癌的检测引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种CA4基因的检测引物、试剂盒及试剂盒的使用方法。

背景技术

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤死因的第三位，临床上结肠癌外科手术治疗失败的主要原因是术后复发和转移，尤其是肝转移。因此，对结肠癌预后因素的分析有助于确定有术后复发可能的高危个体，筛选影响结肠癌患者术后复发的独立指标，为临床选择更合适的治疗方案。

传统的术后筛查方法包括粪便潜血试验、粪便免疫试验、结肠钡剂灌肠检查、乙状结肠镜检查及结肠镜检查等等。其中，粪便潜血试验和粪便免疫试验具有一定的特异性和灵敏性，但前提是患者已存在明显的肿瘤大小，因此不适用于结直肠癌复发的早期检测。内窥镜检查是目前结直肠癌筛查的最好方法，但由于这种方法具有侵入性、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用。因此，现今对结肠癌预后的诊断，均是以临床、病理学和影像学信息为基础，仍处于经验性判准的阶段，远远不能适应对结直肠癌有复发风险的高危人群的筛查和诊断的需求。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种通过检测结直肠癌预后复发的生物标记物CA4基因甲基化，进而实现结直肠癌的检测引物、试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种CA4基因的检测引物，所述CA4基因的检测引物包括甲基化扩增引物；其中，所述甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR；

和/或，所述CA4基因的检测引物包括BGS引物；其中，所述BGS引物包括具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR。

采用本发明的检测引物，基于CA4基因这一生物标记物进行，通过提取并扩增CA4基因后扩增，并检测扩增产物中CA4基因甲基化状态，则可进一步辅助结直肠癌以及复发的可能性检测；相比现有的检测方法具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

本发明进一步提出一种采用上述引物的试剂盒，以及使用该试剂盒进行CA4基因检测的方法。

采用本发明的方法，其实过程中基于试剂盒中的基于CA4基因的检测引物实施，其目的在于CA4基因这一结直肠癌生物标记物进行，通过提取并扩增CA4基因后扩增，并检测扩增产物中CA4基因甲基化状态，则可进一步辅助结直肠癌以及复发的可能性检测；相比现有的检测方法具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例CA4在结肠癌细胞系中mRNA的表达水平检测示意图；

图2为本发明实施例CA4在成对的结肠癌和癌旁组织中的相对表达量对比示意图；

图3为本发明实施例外源性CA4在裸鼠肿瘤细胞中的表达的影响示意图；

图4为本发明实施例去甲基化试剂对CA4表达的影响示意图；

图5为本发明实施例检测的CA4基因启动子的CpG岛的识别结果图；

图6为本发明实施例肿瘤和正常结肠组织中CA4基因甲基化水平对比示意图；

图7为本发明实施例肿瘤和正常结肠组织中CA4基因甲基化水平示意图；

图8为本发明实施例对结肠癌患者预后复发的Kaplan-Meier分析曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种CA4基因的检测方法，包括如下步骤：

S10，获取待测标样；

S20，提取待测标样中包含CA4基因的基因组DNA；

S30，对提取的基因组DNA用亚硫酸氢钠进行处理修饰；

S40，将处理修饰后的基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平。

本发明通过针对以CA4基因作为结直肠癌预后复发大量筛查的生物标记物，采用将上述方式中采用对待测标样的基因组DNA中的CA4基因的进行扩增，并验证CA4基因的甲基化水平，实现间接辅助结直肠癌预后复发大量筛查。

其中在本发明中，采用的待测标样可以选结直肠癌细胞等样本，然后提取其中含有CA4基因的基因组DNA，并对基因组DNA进行扩增；其中基因组DNA提取过程可以采用试剂盒进行，其操作过程可以采用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒，操作参照试剂盒进行。提取完成之后利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，选择浓度和纯度较好的样本DNA进行PCR扩增。

同时，步骤S30中采用亚硫酸氢钠对提取的基因组DNA进行处理修饰，基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰使用ZymoResearch公司的EZDNAmethylation-goldkit，操作参照试剂盒推荐方法进行。采用亚硫酸氢钠盐的修饰处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，在PCR扩增所需片段时因为尿嘧啶会全部转化成胸腺嘧啶，那么最后可以将扩增得到的产物DNA进行分析，与未发生甲基化的正常序列对比，则可以最终判断是否发生了甲基化，以及甲基化发生的程度。

因此在上述步骤S30亚硫酸氢钠盐的处理之后，步骤S40通过对修饰后的基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平，该步骤的实现可以通过如下三种方式进行：

S40a，MSP法：采用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR，对所提取的基因组DNA进行扩增；扩增过程中，处理修饰后的DNA为模板，采用上述引物，联合DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、去离子水混合，进行PCR扩增。

其中，在本发明步骤S40a实施过程中，在甲基化引物进行阳性扩增的基础上，还可以另外增加非甲基化引物作为进行阴性对照，非甲基化引物对包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物CA4-UR。

上述扩增结束之后，取10μlPCR产物，以DL2000为标准分子量，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。通过双重扩增的结果，如果甲基化引物扩增阳性，非甲基化引物扩增阴性，那表明结果为CA4基因发生完全甲基化；如果甲基化引物和非甲基化引物扩增均出现阳性条带，表明结果为CA4基因发生部分甲基化，结果仍然视为阳性；如果甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性，则表明CA4基因未发生甲基化。根据上述三种情形所获得的CA4基因甲基化状态，则可进一步确定病人患有结直肠癌以及复发的可能性。

S40b，BGS法：即硫化基因序列测序反应法，以步骤S30修饰后的DNA为模板，利用具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR进行扩增，然后将扩增产物进行测序，测序结果经Editsequencing软件分析CA4甲基化情况，并且与未经亚硫酸氢钠盐处理的扩增产物的测序结果比对，通过比对中甲基化的状态便可以的进一步确定病人患有结直肠癌以及复发的可能性。

S40c，COBRA法：即COBRA大批量检测结直肠癌组织中CA4甲基化状态，采用BGS引物即具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR进行扩增；之后将PCR产物经BstUI酶处理，60℃酶切过夜。第二日将反应后的混合液，以DL2000为标准分子量，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

结果判定标准：①样品除外在原有大小位点的条带外，其余位点有酶切后形成的不同大小片段的一条或一条以上条带即为甲基化阳性；②样品除外在原有大小位点条带外，完全没有其余酶切后形成的条带即视为甲基化阴性。

采用本发明的检测方法，基于CA4基因这一生物标记物进行，通过提取并扩增CA4基因后检测CA4基因甲基化状态，则可进一步确定病人患有结直肠癌以及复发的可能性。相比现有的检测方法，具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

引物名称	序列	长度	序列表编号
				上游引物CA4-MF	GTCGTTGTTGAGTGGAGAGGACGC	24bp	SEQ.ID.No.1
下游引物CA4-MR	CGCGAATACAACGATCCTACCG	22bp	SEQ.ID.No.2
				上游引物CA4-UF	GTTGTTGTTGAGTGGAGAGGATGT	24bp	SEQ.ID.No.3
下游引物CA4-UR	CACCACAAATACAACAATCCTACCA	25bp	SEQ.ID.No.4
				上游引物CA4-BF	TATAGGGTAAGAGGTGGTTAGGTAGG	26bp	SEQ.ID.No.5
下游引物CA4-BR	CATCCTTATCAAAAACTCCCAACT	24bp	SEQ.ID.No.6

为使本发明上述方法过程中CA4基因作为生物标记，进行检测的过程实施细节更加清楚完整、易于本领域技术人员的实施参考，以及使本发明的突出的进步性效果更加显著，以下通过实施例对上述过程的实施进行具体的验证说明。

实施例1

结直肠癌中CA4的表达下调试验：

利用Trizol法提取细胞总RNA并经AppliedBiosystems公司cDNAReverseTranscription试剂盒反转录为cDNA，操作均按试剂盒推荐方法进行。根据人CA4核苷酸序列设计用于半定量PCR的引物CA4-F1和CA4-R1；其中，

引物CA4-F1:5’-CCGGCTCAGAGGACTCTT-3’，

引物CA4-R1:5’-GTTGGAGGACTCGGCTTGAA-3’；

使用半定量PCR法检测了9种肠癌细胞系：CaCO2,DLD-1,HCT116,HT29,LOVO,LS180,SW480,SW620和SW1116中CA4的mRNA表达水平，其结果如图1所示，图1为本实施例1中检测CA4在结肠癌细胞系中mRNA的表达水平。从图1中可以看出结果显示这9种肠癌细胞中CA4的mRNA水平均低于正常肠粘膜对照组织的水平。

基于CA4在肿瘤细胞系中的下调现象，我们选取27对肠癌组织样本，并利用实时荧光定量PCR分析其CA4mRNA表达情况。根据人CA4核苷酸序列设计用于实时荧光定量PCR的引物CA4-F2和CA4-R2，引物序列如下：

引物CA4-F2:5’-CACTGGTCCGACTTGCCATA-3’；

引物CA4-R2:5’-GCCTCTTTCACATTCCTCGAT-3’；

以β-actin为内参，也设计一对扩增引物。

以cDNA为模板，应用Roche公司的Light480系统进行实时荧光定量PCR反应，操作参照试剂盒推荐方法进行。将目的基因与β-actin的比值作为其mRNA水平的相对值，实验重复3次。

实验结果采用2-△△Ct相对定量分析法，并以β-actin基因作为内参基因来计算转录的相对差异。具体计算公式为：

①计算△Ct值：△Ct＝Ct(CA4)-Ct(β-actin)；

②计算△△Ct值：△△Ct＝△Ct(样品)-△Ct(对照)；

③计算相对差值2-△△Ct，即经过处理后CA4相对于对照组在mRNA水平上的表达差异。

结果发现25个即93％的肠癌组织中CA4的mRNA水平相比其各自的癌旁组织都明显下调，只有2个样本中的表达出现上调，结果如图2所示，图2为实施例1中CA4在成对的结肠癌和癌旁组织中的相对表达量。从图2所示可以看出，Coloncancer(CC)：肠癌组织；Adjacentnormal(AN)：癌旁组织；纵坐标表示为：log2(CC/AN)＝-△△Ct＝-(△Ct肠癌组织-△Ct癌旁组织)。

实施例2

CA4对裸鼠肿瘤生长的体内试验：

随机将对照细胞株HCT116/vector或HCT116/CA4注入到裸鼠的背侧，并将肿瘤的生长模式进行了比较。肿瘤体积每3天测量一次，持续大约三个星期。肿瘤体积(mm3)通过测量最长和最短的肿瘤直径长度(体积公式＝0.5×长×2×宽)计算。接种后18天，实验终止，老鼠被处死。裸鼠的肿瘤生长曲线如图4所示。注射HCT116/CA4裸鼠的平均肿瘤大小显著低于注射HCT116/vector的对照组裸鼠(P<0.05，方差分析)(n＝5/组)。将肿瘤分离，测量重量。从HCT116/CA4组分离下的肿瘤组织比对照组轻(P<0.01)(图3中B部分)。如图3中B部分，直方图分别表示HCT116/CA4和HCT116/vector两组的肿瘤重量(P值小于0.01，t检验)。使用特定的抗体进行免疫染色证实在HCT116/CA4组的肿瘤组织中存在CA4蛋白表达。然而，在肿瘤对照组没有观察到CA4表达，证据表明，CA4可以抑制结肠癌肿瘤的生长。

实施例3

5-氮-2’-脱氧胞苷处理后肠癌细胞CA4表达水平上调鉴别CA4甲基化为潜在的结直肠癌生物标记物试验：在实施例1的基础上，为确定CA4在肠癌细胞中的低表达是否由启动子区域甲基化导致，我们用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷处理9种肠癌细胞：CaCO2,DLD-1,HCT116,HT29,LOVO,LS180,SW480,SW620和SW1116；并随后对细胞中CA4mRNA表达进行了检测。具体地，1×106细胞接种于100mm培养盘中，培养24h。按以下分组进行实验：

对照组为同期不加药的细胞；

实验组为用2μM5-Aza-dC处理96h的细胞，

处理的实验组每隔24h更换一次培养基。

实验结果显示5-Aza-dC处理后，9种肠癌细胞中CaCO2、DLD-1、HT29、HCT116、LS180和SW1116中CA4mRNA表达水平明显上调，去甲基化试剂对CA4表达的影响如图4所示，5-Aza-dC为5-氮-2’-脱氧胞苷，说明启动子区域甲基化修饰是CA4表达下调的主要原因。

实施例4

S10，取上述9种肠癌细胞作为标样；

S20，使用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取结直肠癌细胞的基因组DNA，操作参照试剂盒进行：

S21，离心收集细胞，用200μl缓冲液PBS洗涤细胞一次，细胞重悬于200μl缓冲液PBS中；

S22，剧烈颠倒充分混匀后加入20μl浓度为20mg/ml蛋白酶K溶液，充分混匀后56℃放置10min；

S23，冷却后加入200μl异丙醇，颠倒充分混匀，出现絮状沉淀；

S24，将上述溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱AC中，6000g离心3min，弃废液；

S25，分别用750μl抑制物去除液AW1、700μl漂洗液AW2和500μl漂洗液WB洗涤柱子，20000g离心1min，最后加入200μl洗脱缓冲液AE洗脱收集基因组DNA。

S30，基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰使用ZymoResearch公司的EZDNAmethylation-goldkit，操作参照试剂盒推荐方法进行：

S31，将20μlDNA加入130μlCT转换试剂，混匀，于98℃孵育10min，64℃孵育2.5h，4℃保存不超过20h；

S32，将柱子置于收集管中，向柱中加入600μlM-BindingBuffer，接着加入上述DNA混合液于柱子中，上下颠倒混匀，离心，弃废液；

S33，用1100μlM-washBuffer洗涤柱子后加入200μlM-DesulphonationBuffer，室温包被15-20min，离心，弃废液；

S34，用200μlM-washBuffer洗涤柱子2次后，加入10μl的M-ElutionBuffer洗脱收集DNA。

S40，MSP法甲基化分析：将步骤S34中洗脱得到的修饰后的DNA，采用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR，对所提取的基因组DNA进行扩增；扩增片段大小为242bp。

同时为了体现出甲基化阳性和无甲基化的阴性的对比，同时还添加非甲基化引物对包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物CA4-UR；扩增片段大小为245bp。

PCR反应体系：12.5μl；其中含有10×PCRbuffer1.25μl，TaqHS酶0.125μl，10mM的dNTP1.25μl，DNA15ng，10μM的引物各0.625μl，灭菌去离子水补齐至12.5μl。

94℃预变性变性5min；然后进行变性-退火-延伸循环：

72℃延伸10分钟，最后于4℃中保持备用。

每次PCR均以等量去离子水做空白对照。取10μlPCR产物，以DL2000为标准分子量，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

实施例5

按照与实施例4相同的步骤S10～S30进行，不同在步骤S40中采用BGS即硫化基因序列测序反应检测肠癌细胞中CA4基因甲基化的状态：

将步骤S34中洗脱得到的修饰后的DNA，用具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR进行扩增；

反应体系为12.5μl，其中含有10×PCRbuffer1.25μl，TaqHS酶0.125μl，10μM的dNTP1.25μl，DNA10ng，10μM的引物各0.625μl，灭菌去离子水补齐至12.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s、退火45s、72℃30s共40个循环，72℃延伸10min。而后将PCR产物送于华大基因测序。测序结果经Editsequencing软件分析CA4甲基化情况。

通过上述实施例4和实施例5中的检测直肠癌细胞中CA4基因甲基化的状态，结果对CA4基因结构分析发现，于CA4基因启动子及外显子1区域间有一个CpG岛，CA4基因启动子的CpG岛的识别结果图如图5所示，硫化基因序列测序扩增片段如图所示。利用MSP方法检测9种肠癌细胞系中CA4基因甲基化状态，结果显示9种肠癌细胞系中CA4基因均发生100％甲基化，而对照正常结肠组织中CA4基因无明显甲基化修饰如图6所示，其中，U为非甲基化特异性扩增；M为甲基化特异性扩增。

为了进一步检测肠癌细胞中CA4基因甲基化程度，我们利用BGS对4种肠癌细胞DLD-1、HECT116、LOVO、SW620，及正常结肠组织进行了检测。我们分别从正向和逆向检测了每个细胞系的基因序列，以确定每一个CpG位点的甲基化状态。结果如图7所示，图7为BGS测序检测CA4甲基化在结肠癌细胞株和正常结肠组中表达水平；黑点表示发生甲基化的位点、白圈表示未被甲基化的位点、灰点代表甲基化不同的程度。而对照细胞中，只有4.3％的位点发生甲基化。上述结果表明，CA4基因可作为检测结直肠癌的潜在生物标记物，利用MSP或BGS检测CA4基因状态可用于确定病人患有结直肠癌的可能性。

实施例6

该实施例6中，采用COBRA法进行肠癌细胞CA4甲基化检测，检测的过程步骤S10～S30与实施例4～5相同，步骤S40的不同在于采用将收集结肠癌病人结肠样品进行结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA)并提取样品基因组DNA，并进行亚硫酸氢钠修饰。

应用设计的BGS的引物对结肠癌病人的临床组织样品提取的经亚硫酸氢钠修饰的DNA进行PCR扩增。

将PCR产物经BstUI酶处理，60℃酶切过夜。第二日将反应后的混合液，以DL2000为标准分子量，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

结果判定标准：①样品除外在原有大小位点的条带外，其余位点有酶切后形成的不同大小片段的一条或一条以上条带即为甲基化阳性；②样品除外在原有大小位点条带外，完全没有其余酶切后形成的条带即视为甲基化阴性。

对117位结直肠癌患者组织样品通过COBRA进行CA4甲基化检测。结果发现117个临床患者结肠癌组织样品中有87个为CA4甲基化阳性，检测率为74％。同时将肿瘤和正常结肠组织中CA4基因甲基化水平进行对比检测，其对比检测的结果如图7所示。

在此基础上，进一步我们评估了CA4在结直肠癌复发预测中的临床应用，我们分析了CA4甲基化和临床特征的相关性，包括病人年龄、性别、肿瘤阶段，幽门螺杆菌感染状态，劳伦类型，肿瘤分化和复发数据。然而没有发现其与患者年龄、性别、肿瘤阶段,幽门螺杆菌感染状态,劳伦类型，或肿瘤分化程度统计学意义差异。然而，肿瘤组织中存在CA4甲基化的患者复发比例却比非甲基化的患者高。如图8所示，这是对结肠癌患者预后复发的Kaplan-Meier分析曲线。从曲线的图中可以看出，这种差异是基于复发率较显著(P<0.01)。

本发明进一步还提出一种具有上述CA4基因的检测引物和具有该引物的试剂盒试剂盒，采用本发明的上述试剂盒，试剂盒进行使用的方法对应上述步骤S40的MSP、BGS和COBRA等多种的检测方法，在试剂盒中添加对应的引物；当然还可以提供DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP等等。技术人员根据本发明上述方法步骤的内容，即可实现结直肠癌以及复发的可能性的检测。采用本发明的试剂盒，基于本发明上述方法进行使用，相比现有的检测方法，具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CA4基因的检测引物，其特征在于，所述CA4基因的检测引物包括甲基化扩增引物；其中，所述甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR；

和/或，所述CA4基因的检测引物包括BGS引物；其中，所述BGS引物包括具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR。

2.如权利要求1所述的CA4基因的检测引物，其特征在于，当所述CA4基因的检测引物包括甲基化扩增引物时，所述CA4基因的检测引物还包括非甲基化扩增引物；其中所述非甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物CA4-UR。

3.一种CA4基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括甲基化扩增引物；其中，所述甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物CA4-MF和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物CA4-MR；

和/或，所述试剂盒中包括BGS引物；其中，所述BGS引物包括具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ.ID.No.6碱基序列的下游引物CA4-BR。

4.如权利要求3所述的CA4基因的检测试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒中包括甲基化扩增引物时，所述试剂盒还包括非甲基化扩增引物；其中，所述非甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物CA4-UR。

5.一种如权利要求3所述的CA4基因的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取待测标样；

提取待测标样中包含CA4基因的基因组DNA；

对提取的所述基因组DNA用亚硫酸氢钠进行处理修饰；

将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平。

6.如权利要求5所述的CA4基因的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增步骤为：

以所述处理修饰后的基因组DNA为模板，选用所述试剂盒中的甲基化扩增引物进行PCR，得CA4基因甲基化扩增产物；

检测所述CA4基因甲基化扩增产物的甲基化水平。

7.如权利要求6所述的CA4基因的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增步骤，包括：

以所述处理修饰后的基因组DNA为模板，采用非甲基化扩增引物进行扩增，得CA4基因非甲基化扩增产物；其中，所述非甲基化扩增引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物CA4-UR；

将CA4基因甲基化扩增产物与CA4基因非甲基化扩增产物进行电泳检测，并比对电泳条带。

8.如权利要求5所述的CA4基因的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平步骤包括：

以所述处理修饰后的基因组DNA为模板，选用所述试剂盒中的BGS引物进行PCR扩增，得BGS扩增产物；

将所述BGS扩增产物进行测序。

9.如权利要求8所述的CA4基因的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平步骤，还包括：

以不用亚硫酸氢钠处理修饰的所述基因组DNA为模板，选用所述试剂盒中的BGS引物进行PCR扩增，得对照扩增产物；

将所述对照扩增产物进行测序；

将所述BGS扩增产物的测序结果与所述对照扩增产物的测序结果比对。

10.如权利要求5所述的结直肠癌的检测方法，其特征在于，将所述处理修饰后的基因组DNA用所述试剂盒进行PCR扩增，并检测扩增产物中CA4基因的甲基化水平步骤，包括：

以所述处理修饰后的基因组DNA为模板，选用所述试剂盒中的BGS引物进行PCR扩增，得BGS扩增产物；其中，

将所述BGS扩增产物用BstUI酶切处理，对酶切产物进行电泳检测。