CN103789428A - 引物对及其应用及检测sept9dna甲基化状态的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。本发明还公开了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列；所述SEPT9DNA为经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA。本发明另外公开了一种如上所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。

Description

引物对及其应用及检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种引物对及检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，以及所述引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
背景技术
结直肠癌是较为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。据统计，世界范围内2007年新增结直肠癌病例数为120万，当年因结直肠癌死亡人数达60万，在西方国家其发病率居恶性肿瘤谱的第二位。随着生活水平的不断提高和饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，在我国大城市的结直肠癌致死率排在第四，乡村结直肠癌致死率排在第五。
结直肠癌的发生是多种遗传和后天变化转化正常的粘膜为癌前病变腺瘤，以致最终的结直肠癌。及时发现和去掉前期腺瘤可以显著地降低结直肠癌病人的死亡率。结直肠癌早期诊断并手术的病人五年生存率可以达到90%以上。但是晚期结直肠癌病人五年生存率低于10%。因此，提高结直肠癌诊断特别是早期诊断是非常重要的。
早期结直肠癌常常没有症状。这表明需要对适龄的没有症状的人群进行结直肠癌普查。目前，普遍使用的结直肠癌检查方法主要有两种：一是结直肠镜检查，这是检测结直肠癌的金标准，但该方法有侵入性，昂贵，不易操作，并大部适龄人群难以接受，很难用于大规模普查。二是粪便隐匿血检测和粪便免疫组化检测，主要通过检测粪便里的血迹来作为结直肠癌早期诊断的依据，该方法虽然是非侵入性的，廉价的，但是缺乏灵敏性和特异性。
在过去的几十年，随着基因组学、遗传学和分子生物学技术的飞速发展，研究发现：对比正常组织，在结直肠癌肿瘤中基因p16、ALX4、SEP9、TMEFF2、BMMP3、EYA2和Vimentin有不正常的甲基化。这些基因是潜在的结直肠癌生物标记物。非细胞外周血中的DNA研究表明，释放到血液中的肿瘤DNA可以作为生物标记物用来检测肿瘤。
但目前现有的方法对结直肠癌检测的特异性和灵敏度均较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有结直肠癌检测方法特异性和灵敏度低的缺陷，提供一种能够高特异性和灵敏度检测结直肠癌的引物对和试剂盒，以及所述引物对在制备用于检测SEPT9基因甲基化状态的试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。
另一方面，本发明提供了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。
再一方面，本发明还提供了一种如上所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
通过上述技术方案，能够有效地提高SEPT9DNA甲基化检测的灵敏度和特异性，其检测的敏感度可高达90%、特异度高达88%。因此，本发明的引物和试剂盒能够更好地防治结直肠癌，从而降低结直肠癌对人类健康的危害。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物（5’-GYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATT-3’）和如SEQID No：2所示的下游引物（5’-CCRAAATAATCCCATCCAAC-3’）。
其中，Y和R均为退化碱基，Y为C或T，R为A或G。
另一方面，本发明提供了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。
需要指明的是，本文中，所述SEPT9DNA是指SEPT9基因的V2启动子区，研究发现，在结直肠癌的组织样本中，该区域内的甲基化水平最高，而在正常人群或患有其它疾病的人群中，该区域内的甲基化水平最低。因此，检测该区域内DNA的甲基化水平能够有效地进行结直肠癌的诊断。SEPT9DNA的V2启动子区的核苷酸序列如SEQ ID No：17所示（GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAACGCGTAGTTGGATGGGATTATTTCGG），其中，该基因中加有下划线的核苷酸为甲基化区域。
另外，本发明还需要指出的是，所述SEPT9DNA可以是甲基化的SEPT9DNA，也可以是未甲基化的SEPT9DNA，还可以是甲基化的SEPT9DNA和未甲基化的SEPT9DNA的混合SEPT9DNA。所述经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA是指对上述甲基化的或未甲基化的或混合的SEPT9DNA进行亚硫酸氢盐处理。其中，所述亚硫酸氢盐处理具有本领域公知的含义，也即，所述亚硫酸氢盐处理能够将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持所有甲基化的胞嘧啶不变。
根据本发明，本领域技术人员能够理解的是，在退火的过程中，所述阻拦序列（blocker）优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，是指blocker的复性温度高于所述引物的复性温度，并且blocker只与经亚硫酸氢盐处理的未甲基化的SEPT9DNA相结合。此处“阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合”是指blocker的序列长度能够部分覆盖如上的引物对在经亚硫酸氢盐处理的DNA模板上的结合区，从而能够阻止引物对与经亚硫酸氢盐处理的未甲基化的SEPT9DNA结合。
根据本发明，所述blocker的核苷酸序列没有特别的限制，只要其能够具有如上的特性即可。本领域技术人员能够根据本发明提供的引物对以及如上的blocker的特性，利用本领域常规的技术手段，得到符合本发明要求的blocker。优选的情况下，所述blocker的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示（5'-TCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACT-3'），或者为将SEQ ID No：3所示的序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述blocker特性的核苷酸序列。例如，所述blocker的5’端可以起始于SEQ ID No：8的59-54位的核苷酸，3’端可以终止于SEQ ID No：8的25-15位的核苷酸。其中，下划线处的核苷酸特异性结合经亚硫酸氢盐转化为的尿嘧啶。所述取代、缺失的核苷酸不包括这些核苷酸。优选地，所述blocker的核苷酸序列可以选自SEQ ID No：3、SEQ ID No：4（5'-ATCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAAC-3'）、SEQID No：5（5'-CCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACTA-3'）、SEQID No：6（5'-CAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACTAATAAAC-3'）和SEQ ID No：7（5'-CATCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAA-3'）所示的序列中的一种或多种。其中，加有下划线的碱基为与转化的尿嘧啶相配对的碱基。
根据本发明，根据不同的需求，本发明的试剂盒中还可以包括或不包括其它组分。例如，当仅用于定性检测时，可以将对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA（待测核酸样品）进行PCR扩增后的产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，将待测核酸样品的条带的宽度和亮度，与作为阴性对照的未甲基化的SEPT9DNA的条带的宽度和亮度进行比较，初步判断待测核酸样品中SEPT9DNA的甲基化程度。其中，条带越宽，亮度越高表明甲基化程度越高。
当用于定量检测时，所述试剂盒中还可以包括荧光染料和/或SEPT9Taqman探针，并使用实时定量PCR的方法对待测核酸样品中SEPT9DNA的甲基化程度进行检测。所述荧光染料可以为本领域常规的用于实时定量PCR的染料，例如，可以为FAM，VIC/JOE，NED/TAMRA/Cy3，ROX/TexasRed和Cy5中的一种或多种。所述SEPT9Taqman探针具有本领域公知的含义，是指在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，能够优先于本发明的引物对特异性结合到经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA的非引物结合处，在PCR扩增的过程中通过DNA聚合酶的剪切完成荧光的释放。此处需要指明的是，所述SEPT9Taqman探针是在不影响blocker阻止本发明的引物对与经亚硫酸氢盐处理的未甲基化的SEPT9DNA结合的情况下，能够优先于本发明的引物对特异性结合到经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA的非引物结合处。
本发明对所述探针的核苷酸序列没有特别的限制，只要其能够特异性结合到经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA的非引物结合处，并且不与引物对和blocker结合即可。本领域技术人员能够根据本发明提供的引物对、如上的blocker的特性以及如上的探针的特性，利用本领域常规的技术手段，得到符合本发明要求的探针。优选的情况下，所述SEPT9Taqman探针为SEQ IDNo：8所示的序列，或者将SEQ ID No：8所示的序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述探针的性能的核苷酸序列。例如，所述SEPT9Taqman探针可以根据SEQ ID No：8的52位核苷酸和27位核苷酸之间的序列进行设计。优选地，所述SEPT9Taqman探针的核苷酸序列可以选自SEQ ID No：8、SEQ ID No：9（5'-CGTTAACCGCGAAATCCGACA-3'）、SEQ ID No：10（5'-CGTTAACCGCGAAATCCGACAT-3'）、SEQ ID No：11（5'-CGTTAACCGCGAAATCCGACATA-3'）、SEQ ID No：12（5'-GCGTTAACCGCGAAATCCGA-3'）和SEQ ID No：13（5'-CGCGTTAACCGCGAAATCC-3'）所示的序列中的一种或多种。
其中，所述SEPT9Taqman探针的5’端连接的报告荧光基团和3’端连接的淬灭荧光基团可以为本领域公知的各种用于探针的报告荧光基团和淬灭荧光基团。本发明在此不再赘述。
根据本发明一种优选的情况，所述试剂盒还包括内参扩增引物、PCR反应试剂、细胞基因组DNA提取试剂和甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理试剂中的一种或多种。
根据本发明，所述内参扩增引物可以根据具体选择的内参基因而定，所选择的内参基因可以为本领域常规的可用作内参的持家基因，例如，可以为β-肌动蛋白，GAPDH和18s-rRNA中的一种或多种。根据本发明一种优选的实施方式，所述内参基因为β-肌动蛋白，其相应的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No：14（5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3’）和SEQID No：15（5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’）所示。
根据本发明，当用于定量检测时，本发明的试剂盒中还可以包括β-肌动蛋白Taqman探针，β-肌动蛋白Taqman探针可以为本领域常规的各种用于β-肌动蛋白的探针，例如，其核苷酸序列可以为SEQ ID No：16（5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’）所示。其中，所述β-肌动蛋白Taqman探针的5’端连接的报告荧光基团和3’端连接的淬灭荧光基团可以为本领域公知的各种用于探针的报告荧光基团和淬灭荧光基团。本发明在此不再赘述。但本发明需要说明的是，如果在同一PCR反应扩增体系中同时进行目的基因以及内参基因的扩增，则所述SEPT9Taqman探针和β-肌动蛋白Taqman探针的5’端连接的报告荧光基团的发光颜色不同。
其中所述PCR扩增试剂、细胞基因组DNA提取试剂和甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理试剂可以为本领域常规的用于实时定量PCR扩增的试剂、细胞基因组DNA提取试剂和甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理试剂，其使用方法也为本领域技术人员所公知，本发明在此不再详细赘述。
再一方面，本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
根据本发明一种优选的实施方式，可以根据如下的方法使用本发明的试剂盒以对SEPT9DNA甲基化状态进行检测。该方法包括：在blocker的存在下，使用本发明提供的引物对对经亚硫酸氢盐处理的待测核酸样本和未甲基化的阴性对照进行PCR扩增，并测定待测核酸样本相对于阴性对照的扩增产物的增加量，所述增加量指示了SEPT9DNA甲基化的水平。
其中，在如上的PCR扩增反应体系中，反应体系为30μL，经亚硫酸氢盐处理的模板的浓度可以为0.1-100pg，SEPT9上游引物的浓度可以为0.2-0.3μM，SEPT9下游引物的浓度可以为0.2-0.3μM，blocker的浓度可以为0.9-1.2μM。当用于定量时，还可以在如上所述的PCR反应体系中加入0.1-0.2μM的SEPT9Taqman探针，各0.2-0.3μM的β-肌动蛋白上游引物和下游引物，0.1-0.2μM的β-肌动蛋白Taqman探针。其中，SEPT9Taqman探针和β-肌动蛋白Taqman探针5’端连接的报告荧光基团的发光颜色不同。
其中，所述PCR反应包括预变性过程和不低于50个循环的扩增反应，每个循环的扩增反应包括以下三个阶段：变性阶段、退火延伸阶段，其中，所述预变性阶段的反应条件包括：94-95℃，反应0.5-2min，所述变性阶段的反应条件包括94-95℃，反应8-12s，所述退火延伸阶段的反应条件包括56-58℃，反应15-20s。
当定性检测时，可以将扩增后的产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，其中，相对于阴性对照，待测核酸样本电泳条带的宽度和亮度指示了SEPT9DNA甲基化的水平，当用于定量检测时，相对于阴性对照，待测核酸样本的荧光强度指示了SEPT9DNA甲基化的水平。
根据本发明一种优选的实施方式，可以根据CP值判断甲基化的阳性和阴性，例如，对每个样品进行3次重复PCR，监测反应过程中的CP值。其中，如果待测核酸样品的3个重复中有一个的CP值小于45.0，判断为甲基化阳性；如果没有一个的CP值小于45.0，并且内参的CP值小于39，则判断为甲基化阴性。其中，交叉点（crossing point，简称CP）是指荧光强度达到所设定的阈值时PCR所进行的循环数，一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，并将3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍作为阈值。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中；
DNA提取试剂盒购自金麦格，货号为NA009-2；
亚硫酸氢盐转化试剂盒Tiangen，货号为DP215；
DNA聚合酶购自Tiangen，货号为FP208；
以下所用的所有SEPT9Taqman探针的5’端连接的报告荧光基团为5/6-FAM，3’端连接的淬灭荧光基团为31ABkFQ；
β-肌动蛋白Taqman探针5’端连接的报告荧光基团为HEX，3’端连接的淬灭荧光基团为IAbFQSp。
制备例
（1）样本的收集
收集肠镜检查后不超过一周的94例正常和50例结直肠癌病人的血浆，对于每个样本，收集10毫升血液于一个EDTA真空试管中，每个试管以1350g离心12min，将上清转移至15毫升锥管中，再将每个锥管以1350g离心12min，然后将上清转移至4毫升管中，-70℃冷冻备用。
分别使用DNA提取试剂盒和亚硫酸氢盐转化试剂盒，并按照其各自的说明书对以上收集的4毫升血浆样品进行DNA的提取以及亚硫酸氢盐的转化，得到待亚硫酸氢盐转化的测核酸样品。
实施例
用于说明本发明提供的引物对以及试剂盒。
表1
Figure BDA0000460474200000091
按照上表1中的信息进行各实施例的设置，对制备例中得到的待测核酸样品进行PCR扩增，反应体系为30μL，其中，
实施例1及实施例4-6
每个反应体系中包括：模板50pg，SEPT9上下游引物各0.3μM，blocker1.0μM，SEPT9Taqman探针0.15μM，β-肌动蛋白上游引物和下游引物各0.3μM，β-肌动蛋白Taqman探针0.15μM，DNA聚合酶（AmpliGold Taq聚合酶）1.5个酶活力单位，反应体系为30μL；PCR扩增条件包括：95℃预变性0.5min，94.5℃变性10s，58℃退火延伸15s，50个循环。每个样品重复3次。监测反应过程中的CP值。其中，如果待测核酸样品的3个重复中有一个的CP值小于45.0，判断为甲基化阳性；如果没有一个的CP值小于45.0，并且内参的CP值小于39，则判断为甲基化阴性。实施例1中肠镜检测为结直肠患者的检测结果见表2，检测为正常的人群的检测结果见表3，实施例4-6的检测结果与实施例1相似。
实施例2
每个反应体系中包括：模板0.1pg，SEPT9上下游引物各0.2μM，blocker0.9μM，SEPT9Taqman探针0.1μM，β-肌动蛋白上游引物和下游引物各0.25μM，β-肌动蛋白Taqman探针0.1μM，DNA聚合酶（AmpliGold Taq聚合酶）1个酶活力单位，反应体系为30μL；PCR扩增条件包括：94℃预变性2min，95℃变性8s，57℃退火延伸18s，50个循环。每个样品重复3次。监测反应过程中的CP值。其中，如果待测核酸样品的3个重复中有一个的CP值小于45.0，判断为甲基化阳性；如果没有一个的CP值小于45.0，并且内参的CP值小于39，则判断为甲基化阴性。检测结果与实施例1相似。
实施例3
每个反应体系中包括：模板100pg，SEPT9上下游引物各0.25μM，blocker1.2μM，SEPT9Taqman探针0.2μM，β-肌动蛋白上游引物和下游引物各0.2μM，β-肌动蛋白Taqman探针0.2μM，DNA聚合酶（AmpliGold Taq聚合酶）2个酶活力单位，反应体系为30μL；PCR扩增条件包括：94.5℃预变性1min，94℃变性12s，56℃退火延伸20s，50个循环。每个样品重复3次。监测反应过程中的CP值。其中，如果待测核酸样品的3个重复中有一个的CP值小于45.0，判断为甲基化阳性；如果没有一个的CP值小于45.0，并且内参的CP值小于39，则判断为甲基化阴性。检测结果与实施例1相似。
表2
Figure BDA0000460474200000111
Figure BDA0000460474200000121
表3
Figure BDA0000460474200000131
Figure BDA0000460474200000141
由上表2和3可以看出，50例肠镜检测结直肠癌的患者中有45例结肠癌显示SEPT9DNA甲基化阳性（90%敏感性）；94例肠镜检测正常的个体中有83例显示SEPT9DNA甲基化阴性（88.3%特异性）。
由以上实施例和对比例可以看出，本申请提供的引物以及试剂盒对结肠癌的检测具有较高的敏感性和特异性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Figure IDA0000460474270000011
Figure IDA0000460474270000021
Figure IDA0000460474270000031
Figure IDA0000460474270000041
Figure IDA0000460474270000051
Figure IDA0000460474270000061
Figure IDA0000460474270000071
Figure IDA0000460474270000091

Claims (9)

1.一种引物对，其特征在于，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。
2.一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：权利要求1所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于权利要求1所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止权利要求1所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述阻拦序列为SEQ ID No：3所示的序列，或者将SEQ ID No：3所示的序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述阻拦序列的性能的核苷酸序列；优选地，所述阻拦序列为SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6和SEQ ID No：7所示的序列中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中还含有荧光染料和/或SEPT9Taqman探针，所述SEPT9Taqman探针能够在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于权利要求1所述的引物对特异性结合到SEPT9DNA的非引物结合处。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，
所述染料选自FAM，VIC/JOE，NED/TAMRA/Cy3，ROX/TexasRed和Cy5中的一种或多种；
所述SEPT9Taqman探针为SEQ ID No：8所示的序列，或者将SEQ IDNo：8所示的序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述探针的性能的核苷酸序列；优选地，所述SEPT9Taqman探针为SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12和SEQID No：13中的一种或多种。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有内参扩增引物、PCR反应试剂、细胞基因组DNA提取试剂和甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理试剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，内参扩增引物为β-肌动蛋白上游引物和β-肌动蛋白下游引物；所述β-肌动蛋白上游引物的序列如SEQ IDNo：5所述，所述β-肌动蛋白下游引物的序列如SEQ ID No：6。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中还含有所述β-肌动蛋白Taqman探针；所述β-肌动蛋白Taqman探针的序列如SEQ ID No：7所示。
9.权利要求1所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
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