CN106967792B - Dkk-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子诊断领域,具体涉及一种DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。本发明的DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂体系,包括检测DKK‑3基因启动子区甲基化的探针序列SEQ ID NO.1和检测DKK‑3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQ ID NO.2。本发明同时提供了含有以上所述的试剂体系的DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂盒。同时,还提供了以上试剂体系或者试剂盒在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。通过检测DKK‑3基因启动子区甲基化水平有效的指导宫颈癌的早期诊断、治疗和评估预后。而且可以实现及时、特异、便捷的诊断。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域,涉及一种用于宫颈癌诊断、治疗和预后评估的试剂体系,具体涉及一种DKK-3(Dipkkopf相关蛋白3)基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其在宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,高居女性恶性肿瘤的第二位。据世界范围内的统计,每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例,占所有癌症新发病例的5%,其中80%的病例发生在发展中国家。全世界每年死于宫颈癌的患者约24万人。我国每年宫颈癌的新发病例数约为13 万,死亡约5万例,尽管近年来宫颈癌的诊断和治疗技术取得了巨大的进步,宫颈癌仍然是一种严重威胁妇女健康的疾病。
肿瘤的发生是一个复杂的过程,包括了多阶段、多基因的改变,由宫颈上皮内瘤变、早期浸润癌、到浸润癌的连续发展是宫颈癌的发生过程。肿瘤的发生、发展经历了由量变到质变,渐变到突变的过程。手术治疗为主,辅以放化疗仍是目前宫颈癌的治疗手段,然而这些治疗方式具有极大的副作用,并不是所有患者都能适应。所以目前宫颈癌治疗研究的重点转向了新型的,副作用小的治疗。减少宫颈癌发病率的关键是对宫颈病变早期进行及时高效的筛查和正确的处理。
宫颈癌的病因一直受到国内外学者所广泛研究,其中人类乳头状瘤病毒 (HPV)感染是主要病因之一。虽然宫颈病变患者几乎都能检测到人类乳头状瘤病毒(HPV)感染,但HPV的检出率在宫颈正常的妇女中也较高。HPV感染的人群中即使感染了HPV高危亚型者最终仅有不足5%的发展为宫颈上皮内瘤变,仅有0.5%-1%的患者最终发展成宫颈浸润癌。由此可见HPV感染是宫颈癌发生发展的必须原因,但却不是充分的原因,还需其他辅助因素参与其发生发展的过程。
DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一,国内外在近年来的研究中发现在宫颈癌的发生发展过程中出现多种基因的甲基化,而且宫颈癌的病变程度与这种表观遗传学的改变呈现一定的相关性。随着人们对DNA甲基化在肿瘤发生相关基因表达的影响的重视程度不断提高,对各类肿瘤疾病DNA甲基化的分析已经成为当前肿瘤分子生物学的一个研究热点,然而目前报道的癌症相关基因众多,基于DNA甲基化的疾病检测方法往往涉及众多基因,造成成本过高,难以普及。
Dipkkopf相关蛋白3(DKK-3)是新近发现的抑癌基因,属于DKK基因家族成员之一,经典的DKK家族被认为是Wnt信号传导通路的调控因子,但目前对DKK-3的功能尚未完全清楚,大多数研究表明其具有促进细胞凋亡和肿瘤血管产生的作用,在多种肿瘤细胞中表现为低表达状态其甲基化沉默时导致失去对细胞周期的调控而发生癌变,与肿瘤的发生、进展与转归紧密相关。其基因启动子区甲基化在多种肿瘤中可反映病情及预后,成为肿瘤基因水平的标志物。
为了提高宫颈癌的诊疗效率,提高宫颈癌患者的生存率,寻找一种有效的用于宫颈癌早期诊断的方法是十分必要的,而DKK-3基因启动子区的甲基化检测则具有重要的研究价值及应用前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题为:弥补现有技术对于宫颈癌诊疗的不足,提高宫颈癌的诊疗效率。
本发明的目的在于提供一种可用于宫颈癌早期诊断的分子靶标。与传统的诊断方法相比,采用分子标记物来诊断宫颈癌具有及时性,特异性,便捷性的优点,从而使患者在疾病早期能够预知疾病风险,并针对疾病具体特征采取特异性的治疗措施。
具体而言,本发明提供了如下技术方案:
一方面,本发明提供了一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂体系,所述试剂体系包括检测DKK-3基因启动子区甲基化的探针序列SEQ ID NO.1 和检测DKK-3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQ ID NO.2。
优选的,所述试剂体系还包括特异性扩增DKK-3基因启动子区部分片段的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
优选的,所述DKK-3基因包括如下序列:
(a)编码蛋白序列SEQ ID NO.6所示的基因;
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQ ID NO.6活性的由SEQ ID NO.6衍生的蛋白质。
优选的,所述DKK-3基因启动子区原始序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的,所述引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4用于扩增SEQ ID NO.5序列的第403-507位。
优选的,所述探针序列为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列,其中,所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种,优选为FAM;所述的淬灭基团选自BHQ。
本发明还提供了一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂盒,所述试剂盒包括以上任一项所述的试剂体系。
优选的,所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂体系和/或DNA甲基化检测试剂体系。
优选的,所述DNA甲基化试剂体系包括亚硫酸氢盐修饰试剂。
本发明还提供了以上任一项所述的试剂体系或者以上任一项所述的试剂盒在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。
优选的,所述用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂包括检测和/或诊断宫颈癌患病的试剂,检测和/或诊断宫颈癌病理类型的试剂,检测和/或诊断肿瘤最大径的试剂,检测和/或诊断细胞学分级的试剂,检测和/或诊断临床分期的试剂,检测和/或诊断淋巴结转移的试剂,以及检测和/或诊断脉管癌栓的试剂。
优选的,所述试剂的使用方法包括如下步骤:
(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组 DNA;
(2)利用DNA甲基化检测试剂体系,对步骤(1)得到的全基因组DNA 进行亚硫酸氢盐修饰;
(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQ ID NO.1,引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平;利用非甲基化探针序列SEQ IDNO.2,引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。
本发明所取得的有益效果为:首次公开了DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其在宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用,根据DKK-3基因启动子区甲基化与宫颈癌发生,肿瘤大小,细胞系分级以及临床分期之间的相关性,通过检测DKK-3基因启动子区甲基化水平有效的指导宫颈癌的早期诊断、治疗和评估预后。与传统检测方法相比,本基因诊断更及时、更特异、更便捷,能够实现宫颈癌的早期诊断,从而能够更早的采取针对性治疗措施,降低动脉血栓病症的死亡率。
具体实施方式
如上所述,本发明提供了检测DKK-3基因启动子区甲基化水平的试剂体系、试剂盒在宫颈癌早期诊断中的应用。
其中,本发明所提到的试剂体系、试剂盒等包括:通过标本采集、基因组 DNA提取,定量PCR等过程检测宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子区甲基化水平以诊断宫颈癌的各种试剂、试剂盒等相关产品。
进一步,所述标本采集试剂体系包括液基薄层细胞学检测工具;所述基因组DNA提取试剂体系包括基因组DNA提取试剂盒;所述定量PCR检测DKK-3 基因启动子区甲基化水平的试剂体系包括:DNA甲基化检测试剂盒,特异性扩增DKK-3基因启动子的引物,特异性检测甲基化DKK-3基因启动子的探针以及特异性检测非甲基化DKK-3基因启动子的探针。
本发明的具体实施方案中,所述定量PCR检测DKK-3启动子区甲基化水平的产品至少包含一对特异性扩增DKK-3基因部分片段的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,一条检测甲基化DKK-3基因的探针序列如SEQ ID NO.1所示和一条检测非甲基化DKK-3基因的探针序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种通过检测DKK-3基因启动子区甲基化水平制备宫颈癌诊断试剂的方法,从而用于宫颈癌的诊断和治疗,为临床医生提供参考,为被检人群预测风险性。
进一步,所述方法的过程包括宫颈脱落细胞标本的采集、脱落细胞基因组 DNA的提取、定量PCR检测DKK-3基因启动子区甲基化水平和甲基化水平的表示与数据处理。
其中,所述宫颈脱落细胞标本采集方法为液基薄层细胞学检收集系统,所述脱落细胞基因组DNA提取方法中所用试剂包括基因组DNA提取试剂盒或试剂,所述定量PCR检测DKK-3基因甲基化过程所用试剂包括DNA甲基化试剂盒或试剂、特异性检测DKK-3基因启动子区甲基化水平的引物和探针。
其中,所述DNA甲基化试剂盒包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂。
所述引物应能完成对目的片段特异性扩增,优选的,所述引物避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构,以18到24bp为宜。
所述探针的需要能完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,其长度没有具体限制。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,优选的,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对。自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
在本发明的上下文中,所述“DKK-3”包括DKK-3基因以及DKK--3基因的任何功能等同以及编码相同功能蛋白质的多核苷酸。
通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。
本发明通过设计特异性探针序列以及特异性引物序列,作为检测或者测定被试者DKK-3基因甲基化水平的试剂,从而用来制备检测或者测定被试者宫颈癌患病的试剂。
本发明的具体实施方案中,其实施过程为:采用新柏式液基薄层细胞学检收集系统采集宫颈脱落细胞标本,用基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA,之后用DNA甲基化试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐修饰,采用定量PCR 检测DKK-3基因启动子甲基化水平。PCR扩增时以正常脱落细胞DNA作正常对照,以等量去离子水代替模板DNA作阴性对照,之后采用甲基化分值 (methylation score,MS)来表示甲基化水平,从而为宫颈癌的临床诊断提供参考。
具体地,甲基化分值表示方式为
MS=甲基化的DNA模板浓度/(甲基化的DNA模板浓度+非甲基化的DNA 模板浓度)
本发明的具体实施方案中,所述定量PCR检测DKK-3启动子区甲基化水平的产品至少包含一对特异性扩增DKK-3基因部分片段的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,一条检测甲基化DKK-3基因的探针序列如SEQ ID NO.1所示和一条检测非甲基化DKK-3基因的探针序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明的具体实施方案中,所述DKK-3基因编码的蛋白序列是SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在本发明的上下文中,宫颈癌的检测或者诊断既包括检测或者诊断是否患有宫颈癌,也包括检测或者诊断宫颈癌的病理类型,肿瘤最大径,细胞学分级,临床分期,有无淋巴结转移以及有无脉管癌栓等特征。
下面利用以下实施例对本发明做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明条件的试验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和分数按质量计算。所用到的碱基序列按照本领域技术人员的常规表达方式,即按照5’到3’的书写方式进行描述。
实施例一
1.标本来源
选择2013年1月至2014年12月间博兴县人民医院50例宫颈癌患者为研究对象(宫颈癌组),经临床表现、体格检查、影像学检查、细胞学和病理组织学检查确诊,年龄29-70岁,平均年龄44岁。宫颈癌临床分期:I期6例、II期32例、 III期12例。鳞状细胞癌42例、腺癌8例。鳞状细胞癌组细胞学分级G1-G228例、G314例。所有标本均术前未接受放化疗。同时选择同期参加体检的健康女性为正常宫颈组,年龄25-65岁,平均年龄40岁。
2.标本采集
采用新柏式液基薄层细胞学检收集系统采集标本。采集方法:拭去宫颈表面粘液,将宫颈刷在子宫颈外口与颈管交界处刷转,收集子宫颈脱落细胞,将收集的细胞洗入保存液中。宫颈刷搅拌约10次,使细胞充分进入保存液。旋紧瓶盖,做好标本标识,置于4℃冰箱保存。
采用定量PCR检测DKK-3基因启动子甲基化测定宫颈癌脱落细胞和正常宫颈脱落细胞中DKK-3基因启动子区甲基化水平。
3.定量PCR检测
将收集的标本置于离心管内,8000rpm离心15min,弃上清,按基因组 DNA提取试剂盒(DP304-02/03,购自北京天根生化科技有限公司)说明书中记载的步骤提取脱落细胞基因组DNA。
然后按照DNA甲基化检测试剂盒(D5005,购自北京天漠科技开发有限公司)说明书对DNA进行亚硫酸氢盐修饰,修饰后的DNA置于-20℃冰箱保存。经亚硫酸氢盐处理基因组DNA后,未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后利用不同的探针序列来检测未甲基化和甲基化的模板DNA,从而用来区分甲基化和未甲基化的模板DNA。需要说明的是,无论是接下来利用引物序列扩增DKK-3启动子区序列,还是利用探针序列对启动子区基因序列进行甲基化检测时,因为在此步模板DNA利用亚硫酸氢盐处理,所以引物序列和探针序列并不会与启动子区原始序列即SEQ ID NO.5匹配。
其中,检测DKK-3基因启动子区甲基化和/或非甲基化的定量PCR引物和探针序列如表1所示:
表1检测DKK-3基因启动子甲基化和/或非甲基化定量PCR引物和探针序列
其中,探针序列SEQ ID NO.1序列的5’端连接有FAM荧光基团,3’端连接有BHQ淬灭基团,探针序列SEQ ID NO.2序列的5’端连接有HEX荧光基团,3’端连接有BHQ1淬灭基团。通过荧光定量PCR的方法分别检测甲基化模板DNA浓度和非甲基化模板DNA浓度,因为在PCR扩增的指数增长时期,模板的Ct值和模板的起始拷贝数存在线性关系,从而实现甲基化模板DNA和非甲基化模板DNA的定量检测。
荧光定量PCR扩增反应体系见表2。按照表2中的反应体系,利用上下游引物SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4以及甲基化探针序列SEQ ID NO.1扩增和检测甲基化模板DNA的浓度;特异性扩增DKK-3基因部分片段的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4以DKK-3启动子区基因序列SEQ ID NO.5为模板,扩增 SEQ ID NO.5序列的第403-507位,产物大小为105bp,甲基化探针序列SEQ ID NO.1用来检测甲基化的模板DNA的浓度。注意此时的模板SEQ IDNO.5序列已经经过亚硫酸氢盐修饰。
同样地,按照表2中的反应体系,利用上下游引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4以及非甲基化探针序列SEQ ID NO.2扩增和检测非甲基化模板DNA的浓度。注意除了所用到的探针序列不同之外,甲基化模板DNA的扩增以及浓度的检测与非甲基化模板DNA的扩增以及浓度检测应在相同条件下进行。
表2荧光定量PCR反应体系
成分 | 体积(μL) |
2×LightCycler 480 Probes Master | 25.0 |
等量上下游混合引物(10μM) | 2.5 |
甲基化探针(5μM)或者非甲基化探针(5μM) | 2.5 |
R Nase-free water | 17.5 |
亚硫酸氢盐修饰过的DNA模板 | 2.5 |
循环扩增条件:95℃3min;94℃30s;50~55℃30s;72℃30s,45个循环;72℃10min;4℃保存待分析。
注意,为了增强实验的可靠性,减少实验误差,以正常的宫颈脱落细胞 DNA样本作正常对照,以等量去离子水代替模板DNA做阴性对照,以去离子水作为模板反应作为阴性对照,是为排除实验过程中溶剂对于实验本身的影响。然后利用已知起始拷贝数的标准品作出Ct值标准曲线,并通过样本CT值与标准曲线分别定量甲基化与非甲基化模板浓度。
4甲基化水平的表示方法
采用甲基化分值(methylation score,MS)来表示甲基化水平:
MS=100×甲基化的DNA模板浓度/(甲基化的DNA模板浓度+非甲基化的 DNA模板浓度)
5数据处理
采用SPSS 13.0统计包进行数据处理。计量资料以(x±s)表示,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
6结果
(1)两组甲基化分值(MS)比较
经过计算,宫颈癌组和正常宫颈组的DKK-3基因启动子区平均MS值分别为(53.3±15.5)和(10.6±4.3),差异有统计学意义(P<0.05)。因此,可以根据DKK-3基因启动子区甲基化分值水平可以初步对被测样本判定是否患有宫颈癌。
(2)宫颈癌病理特征与MS的关系
分别针对宫颈癌被测样本的各项病理特征,测定其各项MS值,研究宫颈癌各项病理特征与MS值的关系,结果见表3。从表3 的结果不难看出,就MS测定值来看,鳞癌的MS值要高于腺癌,II-III期者要显著高于I期者,肿瘤最大径大于≥4cm者高于肿瘤最大径<4cm者,G3高于G1-G2,淋巴结转移者高于无淋巴结转移者,脉管癌栓者高于无动脉管癌栓者,而且各项病理特征的差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。
表3宫颈癌病理特征与甲基化分值的关系
根据以上结果可知,通过样本DKK-3基因启动子区MS值的测定,可根据鳞癌的MS值高于腺癌的MS值,且参照其测定的MS值水平,即根据鳞癌的MS 值平均测定值水平在58左右,腺癌的平均测定值水平在28左右,初步判定宫颈癌患者的病理类型,从而为接下来的临床诊断和临床治疗提供参考。
根据II-III期患者的MS值显著高于I期患者,且参照II-III期患者的MS值平均测定值水平在56左右,I期患者的MS值平均测定水平在32左右,初步判断宫颈癌患者的临床分期,从而为医生的临床用药提供参考。
根据测定的肿瘤最大径大于≥4cm的患者的MS值高于肿瘤最大径<4cm 的患者的MS值,可以参照其测定值,即肿瘤最大径大于≥4cm的患者的MS值在63左右,肿瘤最大径<4cm的患者的患者的MS值在47左右,来判断患者的肿瘤最大径,从而为医生诊断患病程度和用药量提供参考。
根据测定的G3期的MS值高于G1-G2,淋巴结转移者的MS值高于无淋巴结转移者,脉管癌栓者的MS值高于无动脉管癌栓者,且参考各项指标给出的测定的MS平均水平,可以用来进行细胞学分级、有无淋巴结转移,有无脉管癌栓的判断。
同时,从表3的结果不难看出,MS值在不同年龄患者中差异无统计学意义 (P>0.05),说明MS值水平与宫颈癌的发病年龄没有明显的关联。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例,其说明只是用于理解本发明的方法及核心思想,并不用于限制本发明。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进、修饰和等同替换,这些改进和修饰也将落入本发明的权利要求的保护范围内。
Claims (21)
1. 一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂体系,其特征在于,所述试剂体系包括检测DKK-3基因启动子区甲基化的探针序列SEQ ID NO.1和检测DKK-3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQ ID NO.2;
所述试剂体系还包括特异性扩增DKK-3基因启动子区部分片段的引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。
2. 根据权利要求1所述的试剂体系,其特征在于,所述DKK-3基因包括编码SEQ IDNO.6所示的蛋白序列的基因。
3. 根据权利要求1所述的试剂体系,其特征在于,所述DKK-3基因启动子区原始序列如SEQ ID NO.5所示。
4. 根据权利要求2所述的试剂体系,其特征在于,所述DKK-3基因启动子区原始序列如SEQ ID NO.5所示。
5. 根据权利要求1所述的试剂体系,其特征在于,所述引物序列SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4用于扩增SEQ ID NO.5序列的第403-507位。
6. 根据权利要求2所述的试剂体系,其特征在于,所述引物序列SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4用于扩增SEQ ID NO.5序列的第403-507位。
7. 根据权利要求3所述的试剂体系,其特征在于,所述引物序列SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4用于扩增SEQ ID NO.5序列的第403-507位。
8. 根据权利要求4所述的试剂体系,其特征在于,所述引物序列SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4用于扩增SEQ ID NO.5序列的第403-507位。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂体系,其特征在于:所述探针序列为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列,其中,所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种;所述的淬灭基团选自BHQ。
10.根据权利要求9所述的试剂体系,其特征在于,所述的荧光基团为FAM。
11.一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-10中任一项所述的试剂体系。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂体系和/或DNA甲基化检测试剂体系。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述DNA甲基化试剂体系包括亚硫酸氢盐修饰试剂。
14.权利要求1-10中任一项所述的试剂体系在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂中的应用。
15.权利要求11-13中任一项所述的试剂盒在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂中的应用。
16.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂包括检测和/或诊断宫颈癌患病的试剂,检测和/或诊断宫颈癌病理类型的试剂,检测和/或诊断肿瘤最大径的试剂,检测和/或诊断细胞学分级的试剂,检测和/或诊断临床分期的试剂,检测和/或诊断淋巴结转移的试剂,以及检测和/或诊断脉管癌栓的试剂。
17.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂包括检测和/或诊断宫颈癌患病的试剂,检测和/或诊断宫颈癌病理类型的试剂,检测和/或诊断肿瘤最大径的试剂,检测和/或诊断细胞学分级的试剂,检测和/或诊断临床分期的试剂,检测和/或诊断淋巴结转移的试剂,以及检测和/或诊断脉管癌栓的试剂。
18.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述试剂的使用方法包括如下步骤:
(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组DNA;
(2)利用DNA甲基化检测试剂体系,对步骤(1)得到的全基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰;
(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQ ID NO.1,引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平;利用非甲基化探针序列SEQ IDNO.2,引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。
19.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述试剂的使用方法包括如下步骤:
(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组DNA;
(2)利用DNA甲基化检测试剂体系,对步骤(1)得到的全基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰;
(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQ ID NO.1,引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平;利用非甲基化探针序列SEQ IDNO.2,引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。
20.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述试剂的使用方法包括如下步骤:
(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组DNA;
(2)利用DNA甲基化检测试剂体系,对步骤(1)得到的全基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰;
(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQ ID NO.1,引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平;利用非甲基化探针序列SEQ IDNO.2,引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。
21.根据权利要求17所述的应用,其特征在于,所述试剂的使用方法包括如下步骤:
(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组DNA;
(2)利用DNA甲基化检测试剂体系,对步骤(1)得到的全基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰;
(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQ ID NO.1,引物序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平;利用非甲基化探针序列SEQ IDNO.2,引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。
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