CN114231604A - Dkk-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，涉及基因甲基化技术领域。DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化，该DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，敏感性高，待测DNA中5‑甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。
Description
技术领域
本发明涉及基因甲基化技术领域，特别涉及DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。
背景技术
DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。
现有的DKK-3基因甲基化诊断试剂盒无法达到敏感性高以及转换效率高，因此我们提出了DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供DKK-3 基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：DKK-3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
亚硫酸氢盐测序法
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率。
高分辨率熔解曲线法
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛，若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。
许多基因，尤其是管家基因的启动子区，其中通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”(CpGisland)。研究碱基G和C在整个基因组内的含量和分布有十分重要的意义。例如在人类基因组内，GC的含量大约为40％；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60％以上，而在另一些区域则只有33％左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；在大多数染色体上，平均每100万碱基含有5～15个 CpG岛，其中有1.8万多个CpG岛片段的GC含量为60％～70％。通常，这些CpG 岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。例如，除定位于失活X染色体上的基因、印迹基因和非表达的组织特异基因 (奢侈基因)外，正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系试剂盒，生物体内DNA的CpG位点被亚硫酸氢盐修饰后，其GC比例发生改变，基于亚硫酸氢盐修饰，DNA的甲基化检测方法包括MSP、BSP、HRM和DNA甲基化芯片，用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不变，从而导致基因组DNA碱基比例发生改变。
敏感性高，待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。独特的保护剂最大限度地避免DNA降解，保障了后续的检测实验的需求。优化的缓冲液体系能最大限度的提高处理后的DNA回收效率。
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系的应用，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取及浓度测定，设计引物时要求所扩增的片段中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证检测可以正常进行。
S2：基因组DNA进行化学修饰，主要采用亚硫酸氢钠修饰，注意温度和时问的掌握，修饰后的DNA单链比较脆弱，操作应轻柔，避免剧烈振荡，增加亚硫酸氢钠的浓度，同时适当减少基因组DNA的量可防止假阳性的出现。
S3：以修饰后的基因组DNA为模板，分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，可选用热启动酶或者采用降落PCR等方法提高PCR扩增的特异性。
S4：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳以判断结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)、该DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，敏感性高，待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。独特的保护剂最大限度地避免DNA降解，保障了后续的检测实验的需求。优化的缓冲液体系能最大限度的提高处理后的DNA回收效率。
具体实施方式
在本发明的描述中，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
实施例一：
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
亚硫酸氢盐测序法
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率。
高分辨率熔解曲线法
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛，若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。
许多基因，尤其是管家基因的启动子区，其中通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”(CpGisland)。研究碱基G和C在整个基因组内的含量和分布有十分重要的意义。例如在人类基因组内，GC的含量大约为40％；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60％以上，而在另一些区域则只有33％左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；在大多数染色体上，平均每100万碱基含有5～15个 CpG岛，其中有1.8万多个CpG岛片段的GC含量为60％～70％。通常，这些CpG 岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。例如，除定位于失活X染色体上的基因、印迹基因和非表达的组织特异基因(奢侈基因)外，正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系试剂盒，生物体内DNA的CpG位点被亚硫酸氢盐修饰后，其GC比例发生改变，基于亚硫酸氢盐修饰，DNA的甲基化检测方法包括MSP、BSP、HRM和DNA甲基化芯片，用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不变，从而导致基因组DNA碱基比例发生改变。
敏感性高，待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。独特的保护剂最大限度地避免DNA降解，保障了后续的检测实验的需求。优化的缓冲液体系能最大限度的提高处理后的DNA回收效率。
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系的应用，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取及浓度测定，设计引物时要求所扩增的片段中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证检测可以正常进行。
S2：基因组DNA进行化学修饰，主要采用亚硫酸氢钠修饰，注意温度和时问的掌握，修饰后的DNA单链比较脆弱，操作应轻柔，避免剧烈振荡，增加亚硫酸氢钠的浓度，同时适当减少基因组DNA的量可防止假阳性的出现。
S3：以修饰后的基因组DNA为模板，分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，可选用热启动酶或者采用降落PCR等方法提高PCR扩增的特异性。
S4：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳以判断结果。
本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (3)
1.DKK-3基因甲基化诊断试剂体系，其特征在于：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化；
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率；
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛，若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。
2.DKK-3基因甲基化诊断试剂体系试剂盒，其特征在于，包括生物体内DNA的CpG位点被亚硫酸氢盐修饰后，其GC比例发生改变，基于亚硫酸氢盐修饰，DNA的甲基化检测方法包括MSP、BSP、HRM和DNA甲基化芯片，用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不变，从而导致基因组DNA碱基比例发生改变。
3.DKK-3基因甲基化诊断试剂体系的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取及浓度测定，设计引物时要求所扩增的片段中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证检测可以正常进行；
S2：基因组DNA进行化学修饰，主要采用亚硫酸氢钠修饰，注意温度和时问的掌握，修饰后的DNA单链比较脆弱，操作应轻柔，避免剧烈振荡，增加亚硫酸氢钠的浓度，同时适当减少基因组DNA的量可防止假阳性的出现；
S3：以修饰后的基因组DNA为模板，分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，可选用热启动酶或者采用降落PCR等方法提高PCR扩增的特异性；
S4：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳以判断结果。
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