KR20060029276A

KR20060029276A - Ｄｎａ 중의 알킬화 사이토신의 검출방법

Info

Publication number: KR20060029276A
Application number: KR1020067000229A
Authority: KR
Inventors: 알리슨 벨리안 토드; 캐롤린 제인 푸어리; 타냐 린 애플리게이트
Original assignee: 존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드
Priority date: 2003-07-04
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2006-04-05
Also published as: WO2005003381A1; EP1644519B1; DE602004018776D1; MXPA05014238A; CA2530506A1; EP1644519A4; IL172910A0; EP1644519A1; ATE419392T1

Abstract

본 발명은 알킬화 사이토신 및 사이토신을 차별적으로 변형시키는 하나 이상의 효소를 사용하여, 이중가닥 DNA 중의 알킬화 사이토신을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 DNA의 적어도 하나의 영역은 단일가닥 DNA로 전환되고, 상기 효소는 상기 단일가닥 DNA의 표적영역과 반응한다. 표적영역의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준은 상기 효소에 의한 상기 표적영역의 효소적 변형의 수준을 결정하여 검출된다.

알킬화 사이토신, 사이토신, 메틸화,

Description

ＤＮＡ 중의 알킬화 사이토신의 검출방법 {METHOD FOR DETECTION OF ALKYLATED CYTOSINE IN DNA}

본 발명은 DNA 중의 알킬화 사이토신 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 알킬화 사이토신과 사이토신을 차별적으로 변형시키는 효소를 사용한다. DNA 중의 알킬화 사이토신의 존재는 DNA를 하나 이상의 상기 효소와 인큐베이션 한 후, 효소에 의해 변형된 DNA의 수준을 평가하여 결정한다. 상기 DNA 중의 알킬화 사이토신의 검출은 진단 및 기타의 목적에 유용하다.

원핵, 진핵, 박테리오파지 및/또는 바이러스 유전체에서 최소한 7개의 상이한 공유결합성 염기 변형이 발견되었다 (1). 고등 진핵생물에서 공유결합에 의해 가장 흔히 변형되는 염기는 CpG 디뉴클레오타이드의 구아노신의 5'에 위치한 5-메틸사이토신이다. 메틸화 양상은 유전자 전사, X 크로모좀 불활성화, 유전자 각인, 세포분화 및 암 발생에서 기능을 하는 것으로 생각돼왔다 (2).

암세포의 비정상적 표현형은 질적 및/또는 양적인 변화에 기인한다. 서열에 기본을 둔 질적인 변화(유전적 돌연변이)는 유전체 DNA에 보존되며, 이는 그 검출 및 특성규명을 용이하게 한다. 유전자 발현을 기본으로 하는 정보의 유전은 후생유전학(epigenetics)으로 공지되어 있다. 핵산 중의 사이토신 염기의 메틸화는 유 전자의 발현 변경 및 세포 분열을 통한 DNA 메틸화 양상의 전달에 의해 후생적 유전에 영향을 미칠 수 있다. 암세포는 많은 경우, 유전적 및 후생유전적 돌연변이 모두를 갖고 있는 것으로 나타났다.

종양성 세포는 메틸화 양상과 관련된 다수의 이상(abnormality)을 동시에 갖는다. 이들은 많은 경우 광범위하게 퍼져있는 유전체 저메틸화와 아울러, 더 많은 부위의 과메틸화 현상을 갖는다 (1). 유전자의 프로모터 내에 위치한, 정상적으로는 비메틸화된 CpG 아일랜드의 지역적 메틸화는 상응하는 유전자의 하향발현과 연관된 것으로 나타났다. 이러한 과메틸화는 종양억제유전자의 불활성화를 위한 코딩 영역의 돌연변이화에 대한 대안적 기전을 제공할 수 있다. 인간 종양과 관련되어 CpG 아일랜드의 과메틸화를 갖는 유전자의 예는 pl6 (폐, 유방, 대장, 전립선, 신장, 간, 방광, 및 두경부암), E- 카드헤린(유방, 전립선, 대장, 방광, 간암), VHL (von Hippel Lindau) 유전자 (신장세포암), BRCA1 (유방암), pl5 (백혈병, 버킷림프종), hMLH1 (대장암), ER (유방, 대장, 폐암; 백혈병), HIC1 (뇌종양, 유방, 대장, 신장암), MDG1 (유방암), GST-π (전립선암), O⁶-MGMT (뇌종양), 칼시토닌(암종, 백혈병), 및 myo -D (방광암) (1,3)를 들 수 있다.

역의 경우도 또한 보고되었으며, 여기에서, CpG 저메틸화는 종양의 진행에 기여하는 것으로 나타났다.

예를 들면, 유로키나제의 CpG 아일랜드는 초기 단계의 비전이성 유방암 세포에서는 과메틸화되어 있지만, 매우 전이성이 큰 유방암세포에서는 저메틸화되어 있 음이 발견되었다(4). 유사하게, 전이와 연관된 S100A4 유전자내의 일정 영역의 저메틸화가 대장선암종 세포주에서 유전자 활성의 기전인 것으로 가정되었다(5).

수개의 변형된 방법과 함께 최소한 8개의 상이한 방법으로 DNA 유전체 중의 5-메틸사이토신 또는 관련된 변형 염기의 검출이 가능하다(2). 각 방법은 특이성, 해상력, 민감도 및 잠재적 작위적 결과에 있어 장점 및 단점이 있다.

유전체의 총 핵산의 염기 조성은 DNA를 화학적 또는 효소적 방법으로, 그의 뉴클레오타이드 성분으로 가수분해한 후, 조성을 표준방법에 의해 분획하고, 분석 (크로마토그래피, 전기영동 및 고압액상크로마토그래피)하여 결정할 수 있다. 이러한 접근법은 유전체 중에 존재하는 변형된 염기를 정량하지만, 상기 유전체 중의 어느 부분이 원래 변형되었는가에 대한 어떤 정보도 주지못한다. 디뉴클레오타이드 조성 및 빈도는 최근린 분석법 (nearest-neighbour analysis)으로 결정될 수 있으나, 이도 역시 제한된 서열정보만를 제공할 뿐이다. 상기 어느 방법도 유전체 특이적이지 않으며, 바이러스 및 기타 내부 기생체 유래의 DNA로 인한 감염으로 인해 오해를 불러일으키는 잘못된 결과를 가져올 수 있다.

유전체의 서열 중의 정확히 어느 부분에 변형된 염기가 존재하는 지에 대한 데이터를 제공할 수 있는 보다 특이적 방법이 존재한다. 유전체 DNA는 메틸화에 민감한 제한효소로 분석할 수 있다. 이러한 방법은, 그러나, 메틸화 민감성 제한효소에 의해 인식되는 서열의 수에 의해 검사할 수 있는 부위의 수에 제한을 받는다. 염기서열분석은 서열 특이적 정보를 제공할 수 있으나, 메틸화 양상이 PCR 동안, 또는 진핵 DNA가 유전공학적 클로닝을 통하여 박테리아세포에서 증폭될 경우에 보존되지 않는다.

메틸화 특이적 방식으로 염기를 차별적으로 변형하여, 메틸화-특이적 변화가 염기서열 분석 동안에 유지되는 변형된 서열을 생산하는 것이 필요하다. 현재 차별적 염기 변형의 분석에 의존하는 세 가지의 프로토콜이 있다. 상기 모든 프로토콜은 DNA를 화학적으로 처리하여 유도된 DNA의 변형 후에, DNA 서열 분석을 포함한다. 하이드라진 (N₂H₄), 과망간산염(Mn0₄ ^-), 및 중아황산염(HS0₃ ^-)은 모두 유전체 DNA 중의 사이토신 염기의 메틸화 상태에 따라서, 유전체 DNA중의 사이토신 염기를 차별적으로 변형시킨다.

하이드라진은 사이토신 또는 티민보다 5-메틸사이토신에 대한 활성이 낮다. DNA를 하이드라진과의 인큐베이션 후에, 상기 DNA를 염기서열분석 젤에서 전기영동을 한다. 하이드라진으로 처리된 DNA를 기타의 염기-특이적 화학적 절단용 화합물로 처리된 DNA와 비교하여 상기 DNA의 서열을 결정할 수 있다. 하이드라진 처리된 DNA 시료에서, 5-메틸사이토신-함유 서열의 위치는, 유전체 DNA의 서열반응물인 사이토신 및 사이토신 + 티미딘 특이적 밴드 사다리와 비교하여 밴드가 없거나 그 강도가 약화되어 있다. 따라서, 상기 하이드라진 프로토콜에 있어서, 5-메틸사이토신의 존재는 음성결과를 가져온다. 명확한 5-메틸사이토신의 규명은 양성 신호의 생성을 필요로 한다. 5-메틸사이토신의 규명에 있어 상기 하이드라진 방법의 추가의 단점은 ㎍ 단위의 DNA 주형이 필요하다는 것이다.

과망간산칼륨은 약한 산성 pH 및 실온에서, 티민 및 5-메틸사이토신과 선택 적으로 반응하며, 사이토신 및 구아닌과는 단지 약하게만 반응한다. DNA의 과망간산칼륨과의 인큐베이션 후에, 상기 DNA를 염기서열분석 젤에서 전기영동 한다. 과망간산염 처리된 DNA를 기타 염기 특이적 화학적 절단용 화합물로 처리된 DNA와 비교하여 상기 DNA의 서열을 결정할 수 있다. 그러므로, DNA의 과망간산염 산화는 그러므로 사이토신과 5-메틸사이토신을 구분하는데 사용할 수 있다(6). 비록 과망간산염 프로토콜은 양성 결과를 가져오고 이로 인해, 하이드라진 프로토콜에 대하여 장점은 있지만, 과망간산염은 사이토신과 약하게나마 반응하기 때문에 사이토신 대 5-메틸사이토신간의 구별은 염기서열분석 젤 상의 이들 밴드의 강도의 차이에 의존하여야 한다. 과망간산염 변경법의 추가의 단점은 역시 ㎍ 단위의 DNA 주형이 필요하다는 것이다.

유전체 DNA의 중아황산염으로의 처리는 핵산 주형의 비메틸화 사이토신 염기를 탈아미노화시켜 유라실로 만들며, 반면, 5-메틸사이토신은 탈아미노화에 내성이 있다. 중아황산염은 이중가닥 DNA의 사이토신 염기에는 거의 작용을 하지 않으며, 그 결과 유전체의 이중가닥 DNA를 바람직하게는 단일가닥으로 변성시켜야 한다. 표준 중아황산염 변형 프로토콜은 알칼리(NaOH) 중에서의 인큐베이션을 통하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시킨다(7). 중아황산염은 사이토신을 서서히 탈아미노화하기 때문에, 모든 사이토신의 완전한 탈아미노화 및 장시간의 인큐베이션으로 인한 DNA의 단편화 간의 절충을 위해 인큐베이션 시간을 절충해야한다. 중아황산염 변형 프로토콜에서, 중아황산염 중에서의 인큐베이션 시간은 일반적으로 4 내지 20시간 범위이다.

Grunau et al (8)는 중아황산염-매개된 사이토신의 탈아미노화의 최적 조건 연구를 통하여 55℃에서 4시간의 인큐베이션으로 사이토신의 99%를 탈아미노화 할 수 있다는 것을 발견하였으나, 이러한 조건에서 DNA의 84 내지 94%가 분해되어 후속 단계에 필요한 수율을 낮추었다. 나아가, 5-메틸사이토신은 열에 의하여 사이토신보다 빠른 속도로 탈아미노화된다. 예를 들면 60℃에서 5-메틸사이토신의 탈아미노화 속도는 사이토신 보다 1.5배 빠르다(9). 낮은 온도에서의 중아황산염 중의 인큐베이션으로 인한 DNA 절단화는 감소시킬 수 있었지만, 인큐베이션 시간은, 사이토신의 완전한 탈아마노화를 위해서는 14 내지 20시간으로 연장되어야만 한다. 중아황산염 변형은 PCR을 기본으로 하는 방법을 사용한 후속적 분석용으로 대략 10ng의 DNA를 필요로 한다.

중아황산염 변형에 의해 생산된 변형된 센스 및 안티센스 가닥은 더이상 상보적이지 않기 때문에 PCR을 이용한 후속적 증폭은 가닥 특이적으로 고안된 프라이머로 수행하여야 하며, 즉 상기 프라이머는 상기 변형된 센스 또는 변형된 안티센스 가닥에 상보적이다. 관심 있는 DNA 영역을 PCR로 증폭할 경우, 우리실(기존의 사이토신)은 티민으로 전환되고, 5-메틸사이토신은 사이토신으로 전환된다

(7). PCR 산물 (증폭산물)은 표준 DNA 서열분석법 또는 메틸화-특이적 PCR (10) 또는 REMS-PCR(36)과 같은 서열 정보를 생산하는 기타 PCR-기재의 기술, 및 제한효소로의 분석 (3) 또는 메틸화-특이적 프로브(11)를 이용하여 후속적으로 분석될 수 있다.

비록, 중아황산염 방법이 사용의 편리성 및 민감도면에서 다른 기존의 프로 토콜과 비교하여 장점이 있지만, 잠재적 오인성 결과(2), 즉 모든 사이토신이 유라실로 전환되는 것은 아니며, 적은 %의 5-메틸사이토신이 티민으로 전환되는 (12)(DNA 중합효소는 티민과 유라실을 구분하지 못한다)결과를 초래하여 장시간의 인큐베이션으로 야기된 DNA 절편화로 인한 DNA 손실 및 비-생리적인 완충액이 필요하다(8)는 단점이 있다. 완전한 프로토콜은, 결과를 수득하기 위해, 2 내지 3일의 실험 조작 및 최소 4 내지 20시간의 중아황산염 중에서의 인큐베이션을 포함하는, 시간이 오래 소요되며, 손이 많이 가는 방법이다. 모든 후생유전적 연구에서 속도-제한 단계는 중아황산염 변형 프로토콜을 사용한 시료준비이다.

정상 및 암조직, 파라핀 함몰 조직 및 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 유형의 시료에서 추출된 DNA는, 중아황산염 처리 및 PCR-기재 방법의 조합을 사용하여 분석한 결과 비정상적 메틸화 서열을 포함하는 것으로 나타났다 (4,13,14).

사이토신 염기를 탈아미노화 할 수 있는 능력을 갖는 다양한 효소가 기술되었다. 사이티딘 탈아미노효소 (EC 3.5. 4.5.)는 사이티딘을 유리딘으로 전환하며 원핵 및 진핵세포에 광범위하게 분포되어 있다. 사이토신 탈아미노효소 (EC 3.5.4.1)은 사이토신을 유라실로 전환시킨다. 데옥시사이티딘 탈아미노효소 (EC 3.5. 4.14.)는 데옥시사이티딘을 데옥시유리딘으로 전환시키며 데옥시시티딜레이트 탈아미노는 데옥시사이티딘-5-포스페이트를 데옥시유리딘-5-포스페이트로 전환시킨다. 이들 효소는 효소의 기원에 따라 상이한 정도의 기질 특이성을 나타낸다. 사이티딘 탈아미노효소 및 사이토신 탈아미노효소의 기질로서, 각각 5-메틸사이토신 및 그의 비메틸화 유사체를 구분하는 능력은 종 특이적이다. 인간 유래의 사이티 딘 탈아미노효소는 다양한 효능으로, 사이토신, 데옥시사이티딘, 및 5-메틸사이티딘을 포함하는 다수의 사이티딘 유도체를 탈아미노화 할 수 있다(15,16). 슈도모나스 유래의 사이토신 탈아미노효소는 5-메틸사이토신을 이용할 수 있지만(17), 반면 창자세균에 의해 생산된 효소는 단지 사이토신만을 기질로서 사용할 수 있다. 곰팡이 아스퍼질러스 푸미개터스(Aspergillus fumigatus) 유래의 사이토신 탈아미노효소 및 이스트 효소도 기질로서 5-메틸사이토신을 이용할 수 있다(18, 19).

아포리포단백질 B mRNA 에티팅 효소(ApoBRe)는 RNA 에디트솜 (editsome)의 중심 성분으로서의 이의 생리적 기능은 위장관 조직에서 특이적으로 apoBmRNA의 위치 #6666의 사이토신 염기를 유라실로 탈아미노화하여 이른(premature) 종결코돈을 생산한다는 것이다(20,21). 사이티딘 탈아미노 활성을 갖는 촉매 성분은 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소 촉매성 폴리펩타이드 1(APOBEC1)으로 불린다. 비록 mRNA가 이러한 효소의 생리적 기질이지만, 이들은 생체내에서 DNA에도 활성이 있다는 증거가 있다. 트렌스제닉 마우스에서의 잘못된, 아포리포단백질 B mRNA 에티팅 효소의 발현은 쥐를 암에 걸리기 쉽게 하며(22), E. coli에서의 인간 아포리포단백질 B mRNA 에티팅 효소의 발현은 UNG-결여 균주의 다양한 좌위에서 수천 배 증가된 빈도의 돌연변이 유발을 초래하였다.

UNG는 자연발생적 사이토신의 탈아미노화로 야기된 U:G 미스매치의 수리에 관여하는 효소로, 상기 효소가 결여되면 세포는 유전체의 탈이미노화된 사이토신을 수리할 수 없게 된다(23). DNA의 서열분석에 의해 DNA의 돌연변이는 사이토신의 유라실로의 전환에 의해 촉발되는 것으로 나타났다. 본 모델에서 연구된 짧은 길 이의 DNA는 5'쪽 인접부분이 피리미딘이어야 하는 요구조건을 갖기 때문에 어느 정도의 주변서열 특이성이 있는 것으로 보인다(23). 이러한 사실은 생리적 RNA 기질에서 상기 효소에 의한 탈아미노화에 있어 독점적 표적인 사이토신 염기(#6666)는 5'쪽 인접 퓨린(아데노신)을 갖는다는 것과 반대되는 것이다. 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소에 의한 5'쪽 인접 피리미딘을 갖는 사이토신의 탈아미노화는 E. coli 모델에서는 없었던 인자를 요구할 수 있다.

Petersen-Mahrt & Neuberger는 최근 시험관내 실험에서의 DNA 기질상의 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소의 탈아미노화 활성을 연구하였다(24). 이 연구를 통해 그들은, 정제되지 않은 효소 추출물을 사용한 120분간의 인큐베이션 실험 결과 상기 효소가 이중가닥 DNA에는 활성이 없었으나, 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA에는 세 개의 사이토신 염기에 대하여 57%의 탈아미노화의 효율로 사이토신 염기를 용이하게 탈아미노화 할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 효소의 이러한 활성은 RNA 분해효소로 처리시 약간 높은 것으로 보였다. 상기 저자들은 정제되지 않은 효소추출물 중의 한 분자의 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소가 10분내에 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 기질의 하나의 사이토신 염기를 탈아미노화할 수 있는 것으로 계산하였다. 이들은 이러한 느린 속도의 탈아미노화를 그들이 사용한 분석 조건이 최적 조건에 미달하였기 때문이라고 하였다. 이러한 현상은 E. coli 숙주에서는 발현되지 않지만 효소의 활성에 필요한 기타 인자의 결여, E. coli에서의 인간 효소의 적절한 구조 불형성, 및 E. coli 숙주가 효소의 활성에 요구되는 번역후 변형을 제공할 수 없기 때문인 것으로 생각되었다.

활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소(AID 또는 AICDA로 공지)는 B-세포 특이적 단백질이다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 발현은 클래스-전환 재조합, 면역글로불린의 이소타입 전환 매개 과정, 및 면역글로불린 가변영역 유전자로 많은 점돌연변이의 도입을 포함하는 체세포 과돌연변이에 있어 필수적 전제조건이다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 작용 방식은 알려지지 않았다. 현재의 이론은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소 및 사이티딘 탈아미노효소와 서열 모티브 상동성을 갖는다는 사실에 촛점을 맞추고 있다.

활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 작용 방식에 대한 초기의 이론은 상기 효소의 가정된 RNA-에디팅 기능은, 클래스-전환 재조합 및 체세포돌연변이에 필수불가결한 단백질을 코딩하는 mRNA의 에디팅에 관여할 수 있음을 제시하였다. 가장 많은 실험으로 뒷받침되는 이론은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 DNA-특이적 사이티딘 탈아미노효소로서 작용함을 제시한다. 상기 모델은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 체세포 과돌연변이 빈발부위 서열의 사이토신 염기를 탈아미노화하여 G: U 미스매치를 생산하며, 이들 미스매치는 다른 방식으로 해결되어 체세포 과돌연변이 및 클래스 전환 재조합을 발생시킨다는 것을 제시하였다 (25). 후자의 이론에 대한 증거는 체세포 과돌연변이가 통상적 유형의 DNA 손상에 의해 개시되며, 특이적으로 dC/dG쌍을 표적으로 하는 과발현 돌연변이의 제1상이 있다는 제시를 포함한다. 이는 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 DNA에 대한 사이티딘 탈아미노효소 활성을 요구할 것이다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미 노효소에 관한 발표된 모든 문헌은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 체세포 과돌연변이 및 면역글로불린의 이소타입 전환에 있어서의 역할을 규명하기 위하여, 그 생체내 기질을 결정하는데 중점을 두어왔다.

많은 연구소의 연구결과에 따르면 인간 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 시험관내에서 단일가닥 DNA상의 사이토신을 탈아미노화할 수 있으나(26-29), 단일가닥 RNA에는 작용할 수 없음(26, 27)을 보여주었다. 시험관내에서 이중가닥 DNA에 대한 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 활성은 전사인자와 연계되어 있는 DNA로 한정된다. 전사는 안정한 R 고리 및 기둥 고리와 같은 단일가닥 DNA 기질을 제공하는 이차 구조를 생성함으로써 이중가닥 DNA의 탈아미노화를 가능하게 하는 것으로 가정되었다(28). 이러한 이차 구조는 시험관내에서, 상보적 영역의 이중가닥 DNA 사이에 있는 중앙에 위치한 단일가닥의 비상보적 영역 DNA의 버블 또는 고리 모양의 형성을 통하여 재현할 수 있다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 이렇게 생성된 방물모양의 DNA의 사이토신을 탈아미노화 시킨다. 탈이미노화의 효능은 단일가닥의 버블모양의 DNA의 길이에 의존한다. Bransteitter et al. (27) 는 5분의 인큐베이션 시간 내에 탈아미노화된, 화학적으로 합성된 이중가닥 DNA의 백분율을 측정하여, 버블 길이가 1개인 뉴클레오타이드 기질은 탈아미노화되지 않으며, 3개인 뉴클레오타이드는 5% 탈아미노화되고, 4개인 뉴클레오타이드는 8% 탈아미노화되고, 5개인 뉴클레오타이드는 35% 탈아미노화되며, 9개인 뉴클레오타이드는 56% 탈아미노화되는 것을 보여주었다.

과도한 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소 활성은 세포에게 해롭기 때문 에, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소 활성은 생리적 표적(면역글로불린 좌위)에만 한정될 것으로 가정되었다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 탈아미노 활성은 서열특이적이라는 제시(30)가 있었으며, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 체세포 과돌연변이 빈발 부위 서열 RGYW(면역글로불린 유전자의 가변영역에서 공통적으로 돌연변이되는 서열)상에서 가장 큰 활성을 보일 것으로 가정되었다. Bransteitter et al. (27)는 시험관내에서 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 비빈발부위 서열과 비교하여 두 개의 빈발부위 서열에서 3배가 더 높은 활성을 갖는다는 것을 보여주었다. 역으로, Dickerson et al. (26)은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 탈아미노효소 활성은 서열 특이적이기는 하지만, 비빈발부위 서열(면역글로불린 유전자의 가변영역의 서열 중에서 생체내에서 한 번도 돌연변이가 발견되지 않은 부위)도 빈발부위 서열과 동일하게 탈아미노화되며, 일부 빈발부위 서열은 단지 배경 값 정도로만 탈아미노화 되는 것을 발견하였다.

Pham et al. (31)는 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 시험관내에서 사이토신 염기를 탈아미노화하는 것을 능력을 큰 단일가닥 DNA 주형을 사용하여 테스트하였다. 이러한 실험에서, 단일가닥 DNA 주형은, 365-뉴클레오타이드인 단일가닥의 갭이 있는 영역의 일부로서 lacZα 리포터 서열인 230-뉴클레오타이드 표적을 포함하는 파아지 원형 DNA이었다. 500ng의 이중가닥 파아지 DNA 기질을 1 mM EDTA 및 1 mM 디티오쓰레이톨을 포함하는 10 mM TRIS 완충액 (pH 8.0) 중에서 40배 초과의 효소와 37℃에서 20분 동안 인큐베이션 하였다. 돌연변이의 스펙트럼은 돌연변이된 파아지(흰색 또는 흐린 파란색의 플라크를 나타냄)를 UNG-결여 E. coli에 트렌스펙션한 후, 후속적으로 서열분석을 하여 평가하였다. 이러한 테스트 조건하에서, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 탈아미노 활성은 주변서열에 따라 변하는 것으로 나타났으며, 상기 저자들은 이러한 결과가 상기 효소가 단일가닥 DNA에서 움직이면서 연속적으로 사이토신 분자를 탈아미노화하는 동적인 분자임을 나타내는 것이라고 가정하였다.

Pham et al. (31)은 또한 전사적으로 활성 형태의 파아지 기질 중에서 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 탈아미노 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 1 mM EDTA 및 10 mM MgCl₂을포함하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 30nM의 이중가닥 파아지 DNA 기질을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이에는 T7 RNA 중합효소 및 rNTP를 포함하여, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 보다 접근용이한 기질인 전사적으로 활성인 DNA를 제공한다(27). 상기 실험결과는 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소에 의해 매개된 비-전사 가닥의 탈아미노화는 RNA 중합효소(전사가 일어남)를 필요로 하며 상기 전사되는 가닥의 탈아미노화는 "보호된" RNA-DNA 혼성체로서 대략 15배 낮은 속도로 일어남을 보여주었다. 상기 실험은 또한 빈발부위의 모티브에서 선택적인 탈아미노화가 일어남을 보여주었다.

생체내에서의 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 이소성(ectopic) 발현을 포함하는 모델은, 면역글로불린 유전자의 가변영역 이외의 유전자의 탈아미노화인 표적화되지 않은 사이토신의 탈아미노화를 보여주었다. 예를 들면, 명백히 인간 면역글로불린 표적 유전자가 결여된, E. coli에서 발현된 인간 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 돌연변이를 스크리닝한 유전자에서 주변서열 특이적 탈아미노화를 나타냈다(30). 이러한 주변서열 특이적 탈아미노화의 이유는 시험하지 않았다.

Bransteitter et al. (27)는 최근에 인간 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소를 시험관내에서 다양한 화학적으로 합성된 핵산 기질과 인큐베이션하였다. 상기 연구는, 매우 간단한 모델에서, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 5-메틸사이토신 염기보다 10-배 더 높은 특이적 활성으로 사이토신 염기를 탈아미노화 할 수 있음을 보여주었다. 상기 모델은 1 또는 2 사이토신 염기를 포함하며, 상보적 DNA가 존재하지 않는 27 또는 33 뉴클레오타이드를 갖는, 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 분자를 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소와 인큐베이션 하는 것을 포함한다. 이러한 인위적 기질은 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 농도보다 2배 많은, 100nM의 고농도로 존재하였다. 센스 및 상보적인 안티센스 가닥이 존재하며, 상이한 주변서열 중에 포함된 다수의 사이토신 염기를 갖는 다수의 메가베이스 길이의 단편이 존재하는, 개체에서 추출한 유전체 DNA의 복잡한 혼합물 중에서, 5-메틸사이토신에는 거의 또는 전혀 활성이 없으면서, 차별적으로 사이토신 염기만을 유라실 염기로 전환하는 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 능력은 전혀 고려되지도 시험되지도 않았다.

활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소의 탈아미노화 활성은 강력한 킬레이터인 1,10- 펜안트롤린에 의해 억제되지만, 약한 킬레이터인 EDTA에 의해서는 억제되지 않는다. 이는 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소가 탈아미노 활성을 위하여, 강하게 결합된 금속 이온, 가능하게는 아연을 필요로 한다는 것을 암시한다 (27,29). 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 50 내지 150 mM의 염농도에 걸쳐 탈아미노 활성을 유지하며 중간 정도의 EDTA (5 내지 10 mM)농도를 견딜 수 있으며, 광범위한 pH (7.6 내지 9.0 시험됨)에서 작용하며, 실온 내지 37℃ 에서 다양한 효율로 작용할 수 있다(26). 이러한 조건은 유전체 DNA를 절단하지 않으면서 유전체의 완전성을 유지하기에 알맞은 조건이다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는 65℃에서 30분 동안 가열한 후에도 여전히 활성이 있다(26).

돌연변이 형태의 효소도 자연에 존재할 수 있으며(예를 들면 대립유전 변이체 및 생체내 돌연변이로부터 유래되는 것) 또는 인위적으로 생성될 수 있다. 돌연변이 단백질을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(39). 돌연변이는 특정한 아미노산의 치환, 결실 또는 부가와 같은 정상적인 방법에 따라 또는 무작위로 생성될 수 있으며, 상기 돌연변이 형태의 단백질을 목적하는 활성에 대해 테스트할 수 있다.

DNA를 변형하는 효소는 단지 몇 시간의 인큐베이션 시간을 필요로 한다. 정제된 효소는 예를 들면 단지 최적의 조건에서 1 시간의 인큐베이션으로 이중가닥 DNA를 완전히 자른다. Bransteitter et al. (27)은 16분 내에 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 기질에서 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소에 의하여, 95%의 사이토신이 유라실로 전환되는 것을 측정하였으며, 9개 뉴클레오타이드의 단일가닥 버블모양을 갖는 합성 기질 DNA에서는 5분의 인큐베이션 후 56%의 사이토신이 유라실로로 전환되는 것을 측정하였다. 따라서, 이는 빠른 반응이다. 그러나, 상이한 반응조건을 사용한, 다른 그룹의 연구에 의하면, 활성화-유발성 탈아미노효소와의 30분간의 인큐베이션 후에, 하나의 사이토신을 포함하는 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 기질의 단지 10% 만이, 유라실로 전환되는 것으로 나타났다 (26).

발명의 요약

본 발명의 한 양태에서, 개체 유래의 유전체 또는 미토콘드리아의 이중가닥 DNA 시료에서 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) 개체로부터 이중가닥 DNA 시료를 수득하는 단계;

(b) 상기 이중가닥 DNA의 적어도 한 영역을 단일가닥 DNA로 전환하는 단계;

(c) 단계 (b)의 상기 단일가닥 DNA의 표적영역을 알킬화 사이토신 및 사이토신을 차별적으로 변형시키는 하나 이상의 효소와 반응시키는 단계; 및

(d) 상기 효소에 의한 표적영역의 효소에 의한 변형 수준을 결정하는 단계.

일반적으로 효소가 사용되는 반응 조건은 효소가 실질적으로 단지 알킬화 사이토신 또는 사이토신 중 하나와만 반응하며, 이들 둘 모두와는 반응하지 않는 조건일 것이다.

바람직하게, 효소는 실질적으로 알킬화 사이토신 또는 사이토신 중 단지 하나하고만 실질적으로 반응할 수 있을 것이다.

바람직하게, 이중가닥 DNA 영역의 단일가닥 DNA로의 전환은 두 가닥을 적어도 부분적으로 분리하는 것을 포함한다. 가닥의 분리는 예를 들면 DNA의 가열 변성 또는 가닥 교체성 프로브의 사용으로 달성될 수 있다. 사용할 수 있는 다른 기술은 이중가닥 DNA의 화학적 또는 효소적 변성을 포함한다. 상기 방법은 또한 일단 이중가닥 DNA가 분리된 후에는 각 DNA 가닥이 다시 어닐링하는 것을 억제하여 효소가 상기 단일가닥 DNA의 표적영역에 접근하는 것을 용이하게 하는 것을 포함할 수 있다.

이중가닥 DNA 각 가닥과 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브는 분리된 가닥의 어닐링을 방해하는데 사용될 수 있다. 복수의 프로브가 사용되는 경우, 상기 프로브(들)는 단지 한 가닥과만 혼성화할 수 있거나, 또는 하나 이상의 프로브는 한 가닥의 DNA와 혼성화할 수 있으며, 나머지 프로브 또는 프로브(들)은 나머지 가닥과 혼성화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법은 이중가닥 DNA를 분리한 후에, 하나 이상의 프로브를 상기 이중가닥 DNA의 한 가닥과 혼성화하고, 분리된 각 가닥이 다시 어닐링하는 것을 방해함으로써, 효소가 단일가닥 DNA의 표적영역에 용이하게 접근하게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

각 프로브는 통상적으로는 올리고뉴클레오타이드일 것이며, 센스프로브, 표적영역에의 효소의 접근을 위한 단일가닥 DNA의 고리 형성을 위한 고리형성 프로브, 안티센스프로브, 및 그 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

더욱 일반적으로는, 프로브는 이중가닥 DNA의 한 가닥의 하나의 연속적 영역과 혼성화할 수 있거나, 또는 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준이 평가되는 가닥의 표적영역의 양쪽에 인접해 있는, DNA 가닥 상의 별개의 상방 및 하방 영역과 혼성화할 수 있다.

전자의 경우, 두 개 이상의 상기 프로브가 사용될 수 있으며, 여기에서 하나의 프로브는 표적영역의 하방에 있는 DNA 가닥의 영역과 혼성화하며, 추가의 프로브는 표적영역 상방의 가닥과 혼성화하여, 상기 이중가닥 DNA의 다른 가닥의 표적영역에의 혼성화가 방해된다.

후자의 경우, 프로브는, DNA 가닥과 혼성화할 경우, 일정간격으로 떨어져 있는 상방 및 하방 영역을 서로 가까이 끌어당겨, 표적영역을 혼입하는 고리 또는 버블을 형성하게 하는 서열을 가질 수 있다. 프로브는 예를 들면 DNA 가닥과 혼성화하는 반대편에 있는 말단 영역을 가지며, DNA 가닥의 표적영역과 혼성화하지 않는 비상보적 서열의 중간영역을 갖기 때문에, 상기 표적영역을 혼입하는 고리 또는 버블을 형성하며 이중가닥 DNA의 나머지 가닥의 표적영역과의 혼성화는 방해된다. 고리 또는 버블의 형성을 용이하게 하기 위하여, 상기 프로브의 중간영역에, DNA 가닥과 프로브와의 혼성화후에 서로 혼성화할 역반복 서열을 포함시킬 수 있다.

효소와 반응하는 단일가닥 DNA의 표적영역의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준의 검출을 위해, 전형적으로 표적영역을 증폭할 것이며, 수득한 증폭산물(들)에 대하여, 표적영역에 있어, 효소적 변형으로부터 유래된 서열변형을 분석할 것이다. 그러므로, 본 발명의 방법은 증폭된 산물을 수득하기 위하여 열주기 및 프라이머를 포함하는 방법을 사용하는 단계; 및 효소와 반응한 단일가닥 DNA의 표적영역을 증폭하며; 단일가닥 DNA의 표적영역의 알킬화 사이토신의 존재와 일치하는, 증폭 산물의 서열 변이에 대하여 분석하는 단계를 추가로 포함한다.

알킬화 사이토신의 수준 결정은 점돌연변이와 같은 서열 변형의 검출이 가능한 임의의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 상기와 같은 기술은 이로 제한되는 것은 아니지만, 핵산 서열 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술, 제한효소 절단, 및 서열핵산에 특이적으로 결합하는 프로브의 사용을 포함하는 기술을 포함한다. 상기 측정은 단일가닥 DNA의 표적영역의 알킬화 사이토신 함량에 대한 정량 및/또는 정성적 분석을 포함한다. 특히, 과메틸화 또는 저메틸화, 더욱 특히는 DNA의 사이토신 알킬화 양상을 본 발명의 방법으로 검출할 수 있다.

평가되는 DNA는 유전자 또는 그 영역 및 바람직하게는 5'비코딩영역과 같은 유전자의 조절성 비코딩영역을 포함할 수 있다. 상기 5'비코딩영역은 유전자의 프로모터 또는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 전형적으로 이중가닥 DNA는 유전체 DNA일 것이다.

따라서, 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명은 개체 유래의 유전체 DNA 시료의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) 개체로부터 유전체 DNA 시료를 수득하는 단계;

(b) 유전체 DNA의 적어도 한 영역을 단일가닥 DNA로 전환하는 단계;

(c) 단계(b)의 상기 단일가닥 DNA의 표적영역을 알킬화 사이토신 및 사이토신을 차별적으로 변형하는 하나 이상의 효소와 반응시키는 단계; 및

(d) 상기 효소에 의한 표적영역의 효소적 변형수준을 결정하는 단계.

본 발명의 추가의 양상에서, 본 발명은 개체 유래의 유전체 DNA 시료의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준의 검출을 포함하는 개체에서의 질환 또는 증상의 진단방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) 개체로부터 유전체 DNA 시료를 수득하는 단계;

전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 효소는 탈아미노효소일 것이다. 상기 검출된 알킬화 사이토신은 일반적으로 5-알킬사이토신 및 통상적으로 5-메틸사이토신일 것이다. 5-메틸사이토신의 존재는 많은 증상 및 질환 상태에서 상향 또는 하향 조절되는 유전자 발현의 유용한 표지이다. 5-메틸사이토신 존재의 검출은 돌연변이 및 후생유전적 다형성 분석에 또한 용이하다. 따라서, DNA 중의 5-메틸사이토신의 검출은 진단 및 기타 분야에 상당한 응용가능성이 있다.

본 발명의 또다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 방법에 사용되는 키트를 제공하며, 상기 키트는 상기 방법을 수행하는 하나 이상의 시약 및 사용안내서를 포함한다. 상기 시약 및 시약들은 예를 들면, 효소, 완충액, PCR 용 프라이머 및 사용되는 이중가닥 DNA의 각 가닥의 분리용 프로브로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 그 범위에 인간 및 인간이 아닌 동물, 박테리아, 이스트, 곰팡이 및 바이러스를 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에 언급한 모든 문헌을 참고하였다. 본 명세서에 포함된 문서, 양상, 물질, 장치, 문헌 등에 관한 어떤 논의도 단지 본 발명의 이해를 돕기 위한 것을 목적으로 하는 것이다. 본 발명은 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 존재하는 것이기 때문에, 상기 언급한 임의 또는 전부가 선행기술의 일부를 구성하거나, 또는 본 발명과 관련된 기술분야의 일반적 상식을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에서, 용어 "포함한다" 또는 이의 변형형태인 "포함하는"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 군, 정수들 또는 단계들을 포함하는 것을 의미하는 것이지, 임의의 기타 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소의 군, 정수 또는 단계를 배제하는 것은 아니다.

본 발명의 범위에 포함되는 방법의 특징 및 장점은 하기 본 발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예로부터 보다 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

일반적으로, 본 발명에 사용되는 효소는 사이티딘 또는 사이토신 탈아미노화 활성을 가질 것이며, 유전체 DNA의 어떠한 5-메틸사이토신 염기도 실질적으로 탈아미노화하지 않으면서, 사이토신 염기를 유라실로 탈아미노화 할 수 있다. 상기 효소는 열친화성 유기체 유래의 열안정성 사이티딘 또는 사이토신 탈아미노효소일 수 있다.

상기 효소는 예를 들면 활성화 유도된 사이티딘 탈아미노효소 (AID) (GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_020661 ; Genbank 인간 단백질 서열 #NP_065712. 1), 사이티딘 탈아미노효소 (사이티딘 아미노하이드롤라제 EC 3.5. 4.5로도 공지됨), 사이토신 탈아미노효소 (사이토신 아미노하이드롤라제 EC 3.5. 4.1로도 공지됨), 데옥시사이티딘 탈아미노효소 (데옥시사이티딘 아미노하이드롤라제 EC 3.5. 4.14로도 공지됨), 데옥시시티딜레이트 탈아미노효소 (데옥시시티딜레이트 아미노하이드롤라제로도 공지됨), 아포리포단백질 B mRNA 에디팅 효소 (ApoBRe) 및 그 촉매성 단편, 상동체 및 변이체로부터 선택될 수 있다. 촉매성 단편이란 완전한 효소의 촉매활성의 전부 또는 일부를 갖는 효소단편을 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 사용된 효소 단편은 완전한 효소와 실질적으로 동일한 효소활성을 가질 것이다. ApoBRe의 촉매성 단편은 APOBEC1 (촉매성 폴리펩타이드 1, 전사 변이체 1: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_001644, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_001635. 1; 촉매성 폴리펩타이드 1, 전사 변이체 2: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_005889, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_005880.1)을 포함한다. APOBEC1의 상동체는 APOBEC2 및 APOBEC3A 내지 APOBEC3G를 포함하며, 하나 이상의 상기 상동체도 또한 본 명세서에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 이러한 상동체의 서열 데이터는 또한 National Center for Biotechnology Information, Rockville Pike, Bethesda, MD, USA의 GenBank database로부터 공중의 이용이 가능하다 (APOBEC2: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_006789, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_006780. 1; APOBEC3A: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_145699, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_663745. 1; APOBEC3B: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_004900, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_004891.3; APOBEC3C: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_014508, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_055323. 2; APOBEC3D: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_152426, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_689639. 1; APOBEC3E: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NG_002331 ; APOBEC3F: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_145298, Genbank 인간 단백질 서열 #NP 660341. 2; APOBEC3G: GenBank 인간 mRNA Ref. 서열 #NM_021822, Genbank 인간 단백질 서열 #NP_068594. 1).

사용되는 효소는 또한 상기 야생형 효소 또는 그 촉매성 단편 또는 상동체의 돌연변이 형태일 수 있으며, 이는 사이티딘 또는 사이토신 탈아미노효소 활성을 갖는다. 상기의 돌연변이 효소는 천연에서 분리될 수 있거나, 또는 당업계에 알려진 국지적 또는 무작위 돌연변이 방법을 사용하여 분리될 수 있다 (e. g. Twyman R. M. Recombinant DNA and molecular cloning. Chapter 24. In: Advanced Molecular Biology: A Concise Reference. BIOS Scientific Publishers Limited (39) 참조). 목적하는 활성을 갖는 상기 모든 돌연변이 형태의 효소도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 나아가, 단일 효소가 본 발명의 방법에 사용될 수 있으나, 예를 들면 야생형 효소, 및 그 변이체, 상동체, 변형체 및 돌연변이체, 및 촉매단편으로부터 독립적으로 선택되는 목적하는 활성을 갖는 상이한 효소의 조합이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

사이토신 탈아미노화 활성을 갖는 효소는 B-세포 림프구 및 예컨대 E. coli 및 곤충세포와 같은 형질전환된 발현 시스템을 포함하는 다수의 기원으로부터 정제될 수 있다. AID는 예를 들면 곤충세포의 바큘로바이러스 시스템에서 GST 융합 단백질로서 발현된 후 친화성 컬럼으로 정제될 수 있다 (Bransteitter 2003, PNAS 100:4102).

유전체 DNA가 일반적으로 본 발명의 방법에 사용될 것이며 적절한 임의의 세포 또는 생물학적 시료로부터 추출될 수 있다. 표준 방법에 의해 추출된 유전체 DNA는 다양한 정도로 단편화되며 대게는 이중가닥이다. 활성화 유도된 사이티딘 탈아미노효소 및 기타 사이티딘 탈아미노효소 활성을 갖는 효소는 전형적으로 단일가닥 DNA 또는 이중가닥 DNA의 단일가닥 고리 영역에 대하여 가장 높은 활성을 갖는다(27). 이중가닥 DNA는 열변성, 화학변성, 단백질 결합 및 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 단일가닥으로 될 수 있으며, 임의의 상기 방법이 사용될 수 있다.

열변성화는 단일가닥 DNA의 생성에 통상적으로 사용되는 것으로 PCR과 같은 방법에 사용된다. 화학적 변성은 알칼리(7,32) 또는 포름아미드(32)와 같은 화학물질 중에서의 인큐베이션을 포함한다. 예컨대 박테리오파지 T4 유전자 32 단백질 (및 분절된 형태의 상기 단백질)과 같은 단일가닥 DNA에 결합하는 단백질과의 인큐베이션은 유전체 DNA의 이중나선을 불안정화시켜 이차 구조를 감소시킨다 (33,34). 이중나선 DNA의 3'-하이드록시 말단으로부터 모노뉴클레오타이드의 3'에서 5' 방향으로의 제거를 촉매하는 E. coli 유래의 엑소뉴클레아제 III와 같은 엑소뉴클레아제와의 인큐베이션에 의하여 이중가닥 DNA의 한 가닥을 선택적으로 효소 분해하는 것을 포함하는 효소적 변성을 또한 사용할 수 있다. 엑소뉴클레아제 III는 다이데옥시 서열분석용(35), MALDI-TOF 질량분광분석기를 사용한 직접 서열분석 (32) 및 단일가닥 입체형태 다형성 분석 (32)에 있어서의 단일가닥 DNA 기질 (도 3A-3C 참조)의 제조에 사용돼 왔다.

뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 펩타이드 핵산 (PNA) 및 고정핵산 (LNA)은 높은 서열 특이성 및 친화성을 갖고 RNA 및 DNA에 모두에 결합한다. 유사체 DNA 이중나선은 DNA:DNA 결합보다 더욱 안정하며, 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 가닥 침투 효과를 나타낸다. 예를 들면, PNA 프로브는 안정한 PNA₂:DNA 삼중가닥 (후구스틴 및 왓슨/크릭 염기쌍)의 생성 및 가닥 치환을 통하여 이중가닥 DNA를 침투하는 능력을 갖는다. PNA 프로브는 시험관내(단일 뉴클레오타이드 다형성 검출(40)) 및 생체내 (예컨대 T7 RNA 중합효소, 전사활성인자, 핵산분해효소, 제한효소 및 메틸화효소와 같은 효소의 접근을 막음(41))에서 모두 유용성이 있음이 증명되었다. 따라서, 관심있는 안티센스 가닥에 상보적인 가닥 치환 프로브 (즉, 표적의 센스가닥과 동일한 서열)는 표적 센스가닥을 단일가닥으로 만들 수 있어, 사이토신 탈아미노효소 활성에 대한 표적으로서 사용될 수 있게 한다.

가닥 교체성 프로브는 이중나선, 삼중나선 침투 또는 비-침투성 삼중나선 형성을 통하여 결합하도록 디자인할 수 있으며 (42,43), 이의 사용은 DNA를 미리 변성화하는 단계를 불필요하게 만들 수 있다. 가닥 치환 프로브의 결합 역동학 및 특이성은 반응조건 및 이의 디자인의 변형에 의해 향상/변경될 수 있다. 가닥 치환 프로브의 디자인은 모노-PNA, bis-PNA(이는 dsDNA에 결합시 P-고리를 형성함), bis-PNA 개방기(44), 양이온성 잔기, 예컨대 리신의 첨가 및 슈도이소사이토신(J-염기)(45)의 혼입을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 명백히 PNA 및 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체로 구성되거나 또는 이를 포함하는 핵산 유사체 프로브를 적어도 부분적으로 이중가닥 DNA를 분리하는데 사용하는 용도까지 포함한다.

유전체 DNA 가닥의 분리에 의해 생성된 단일가닥의 어닐링을 방해하고, 이에 의해 관심있는 표적영역으로의 효소의 접근을 가능하기 위해, 단일가닥 DNA와의 혼성화에 사용되는 프로브는 일반적으로 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 핵산 유사체 프로브일 것이다. 더욱 특히는, 상기 프로브는 독립적으로 DNA 프로브 또는 그 유사체 예컨대 RNA, PNA, 또는 LNA 프로브, 또는 뉴클레오타이드 유사체로 구성되거나 또는 이를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 기타 핵산 유사체일 수 있다. 더욱이, 프로브(들)는 센스프로브, 안티센스 프로브, 고리형성 프로브, 및 그 조합으로부터 선택될 수 있다. 프로브는 전형적으로 프라이머로서는 작용할 수 없어 PCR 동안에 연장될 수 없을 것이다. 프로브는 일반적으로 길이가 약 10 염기이며, 통상적으로 약 10 내지 약 50 염기이며, 바람직하게는 약 17 내지 약 30 염기일 것이다. 그러나, 더 긴 프로브를 배제하는 것은 아니며, DNA 가닥상에 복수의 제한효소 반응부위를 갖는 제한효소의 반응을 용이하게 하기 위해, 분석되는 DNA 가닥의 길이를 따라, 복수의 고리 또는 버블의 생성에 사용될 수 있다 (도 3A- 3C 참조). 프로브로서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 유사체는, 이로 한정하는 것은 아니지만, 하기에 열거된 유사체를 포함한다.

약칭	명칭
ac4c	4-아세틸사이티딘
chm5u	5-(카르복시하이드록실메틸) 유리딘
Cm	2'-0-메틸사이티딘
cmnm5s2u	5-카르복시메틸아미노메틸 티오유리딘
D	디하이드로유리딘
Fm	2'-O-메틸슈도유리딘
Galq	β,D-갈락토실퀘오신
gm	2'-O-메틸구아노신
I	이노신
I6a	N6-이소펜테닐아데노신
mla	1-메틸아데노신
mlf	1-메틸슈도유리딘
mlg	1-메틸구아노신
ml1	1-메틸이노신
m22g	2,2-디메틸구아노신
m2a	2-메틸아데노신
m2g	2-메틸구아노신
m3c	3-메틸사이티딘
m5c	5-메틸사이티딘
m6a	N6-메틸아데노신
m7g	7-메틸구아노신
mam5u	5-메틸아미노메틸유리딘
mam5s2u	5-메톡시아미노메틸-2-티오유리딘
manq	β,D-만노실메틸유리딘
mcm5s2u	5-메톡시카르보닐메틸유리딘
mo5u	5-메톡시유리딘
ms2l6a	2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
ms2t6a	N-((9-β-리보퓨라노실-2-메틸티오퓨린-6-일) 카르바모일)트레오닌
mt6a	N-((9-β-리보퓨라노실퓨린-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌
mv	유리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르
o5u	유리딘-5-옥시아세트산 (v)
osyw	위부톡소신
p	슈도유리딘
q	퀘오신
s2c	2-티오사이티딘
s2t	5-메틸-2-티오유리딘
s2u	2-티오유리딘
s4u	4-티오유리딘
t	5-메틸유리딘
t6a	N-((9-β-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)카르바모일) 트레오닌 2'-O-메틸-5-메틸유리딘
um	2'-O-메틸유리딘
yw	위부토신
x	3- (3-아미노-3-카르복시프로필) 유리딘,(acp3)u
araU	β,D-아라비노실
araT	β,D-아라비노실

단일가닥 유전체 DNA를, 5-메틸사이토신이 아닌 사이토신을 선택적으로, 탈아미노화시키는 능력을 갖는 효소와의 인큐베이션은 사이토신 잔기 대신에 유라실을 갖는 서열을 초래할 것이며, 5-메틸사이토신은 실질적으로 변하지 않을 것이다. DNA의 선별된 탈아미노효소와의 반응의 최적 반응 조건은 사용하는 하나 이상의 반응 조건을 변경함으로써 결정될 수 있다.

직장암세포주 SW480 유래의 유전체 DNA는 P16 유전자의 프로모터 영역의 CpG 아일랜드내의 CpG 부위에 존재하는 사이토신이 모두 5-메틸화된 것으로 나타났다. 상기 유전자의 상기 영역내의 DNA는 또한 비메틸화 사이토신도 포함한다. 그러므로 상기 세포주 유래의 유전체 DNA는 모델기질을 제공하며, 이를 이용하여, 사이티딘 탈아미노효소 활성을 갖는 효소에 의한 탈아미노화용 기질로서, DNA로 혼입된 5-메틸사이토신과 사이토신간의 최대 변별을 위한 최적의 조건을 결정하기 위한 다양한 반응변수를 시험할 수 있다.

최적 반응조건의 결정을 위해, 유전체 DNA를 표준방법을 사용하여 SW480 세세포로부터 추출할 수 있다. 상기 세포유래의 DNA는 이어서, 바람직하게는 열변성을 사용하여 단일가닥 DNA로 전환된다. 분리된 가닥의 어닐링은 상술한 프로브를 사용하여 억제될 수 있다. 복수의 CpG 부위를 갖는, 세 개의 CpG 아일랜드를 포함하는 E-카드헤린 유전자의 프로모터 영역은 반응조건의 최적화 또는 본 발명에 사용되는 AID 및 기타 탈아미노효소와 같은 효소의 평가를 위해 또한 사용될 수 있다.

알킬화 사이토신 및 사이토신을 차별적으로 변형하는 효소의 능력은 효소를 단일가닥 DNA에 넣고, 예를 들면, DNA 농도, 효소의 농도, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도, 완충성 이온의 조성 및 농도(통상적으로 사용되는 완충액은 TRIS, HEPES, MOPS & 이미다졸을 포함한다), 완충액의 pH(pH 4.0 내지 10.0), 염의 농도 및 유형 (통상적으로 사용되는 염은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 염화칼륨, 아세트산 칼륨, 설페이트의 염, 암모늄의 염을 포함한다), 다양한 양이온 금속의 농도 (예를 들면, 마그네슘, 망간, 납, 및 칼슘), 다양한 단백질 안정화제의 농도 (예를 들면 디티오쓰레이톨 (DTT)과 같은 환원제), 기타 단백질 (예컨대 소혈청알부민(BSA) ), 당 (예컨대 슈크로스, 말토스, 글루코스, 트레할로스, 글리세롤 및 프럭토스), 계면활성제 (예컨대 Triton

X-100 및 Tween-20), 및 공-용매 (예컨대 프롤린, 베아틴, 포름아미드, DMSO, 알콜 및 폴리올)로부터 선택되는 다양한 범위의 변수하에서 인큐베이션하여 시험할 수 있다. 상기 변수의 상이한 조합을 사용하여 수득한 사이토신과 5-메틸사이토신의 분별도는 이어서 하기에 추가로 기술한 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있다. 기술분야의 당업자라면 상기와 같이 나열한 반응조건 변수가 전부는 아니며, 효소의 반응속도 및 기질 특이성을 향상 또는 변경하는 추가의 시약 및 조건의 예가 입수가능한 공지된 문헌에 있다는 것을 인식할 것이다.

PCR 산물 및 유전체 DNA이외에, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드도 선별된 효소의 최적의 반응조건의 결정에 사용될 수 있으며, 5-MeC 염기가 있거나 또는 없이 만들 수 있다. 상기 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥 DNA 또는 이중가닥 DNA (화학적으로 합성된 안티센스 가닥에 어닐링)로서 효소의 기질로 제공될 수 있다. 후자는, 최대의 활성을 위해 단일가닥 기질을 요구하는 예컨대 AID와 같은 탈아미노효소에 대한 접급성을 최대화하기 위해, 이중가닥 기질은 단일가닥으로 만드는 반응조건 및 최적화 방법에 유용하다. 더욱이, PCR 산물 중의 사이토신 뉴클레오타이드는 메틸전이효소 예컨대 서열 5'.. CG.. 3'의 사이토신을 메틸화하는 MssI, 및 서열 5'.. CCGG.. 3'의 내부 사이토신을 메틸화하는 HpaII중에서의 인큐베이션을 통해 메틸화될 수 있다. 세포주 및 정상 인간 공여자 유래의 유전체 DNA는 또한 효소-매개된 사이토신 탈아미노화의 최적화를 위한 기질로서 제공될 수 있다. 상기 임의의 기질 (화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드, PCR 산물 또는 유전체 DNA) 중의 사이토신 뉴클레오타이드의 메틸화 상태는 통상의 중아황산염 변형 및 서열분석법으로 평가할 수 있다.

시험 DNA의 효소와의 인큐베이션 후에, DNA의 관심 표적영역은 전형적으로 PCR로 증폭될 것이다. 일반적으로, 효소는 PCR의 개시 전에 열변성 될 것이다. PCR에서, 주형으로서 변형된 DNA를 사용하여 증폭된 서열 (증폭산물)은 본래 서열의 사이토신 대신에 티미딘 잔기 및 5-메틸사이토신 대신에 사이토신을 가질 것이다. 따라서, 효소에 의한 사이토신 염기의 유라실로의 전환 후, PCR에 의한 티민으로의 전환은 본래 DNA 주형 중의 사이토신의 메틸화 상태와 연관된 서열의 차이를 갖는 변형된 DNA를 생성한다.

이러한 서열 변이는 티미딘 및 사이토신 염기를 구별할 수 있는, 예컨대 직접적 서열분석(e. g. Herman et.al (10) 참조), PCR 증폭산물의 제한효소로의 절단, 메틸화 특이적 PCR(10), 제한핵산 내부가수분해효소 매개된 선별적 PCR (REMS-PCR) (e.g. (37); 국제특허출원 PCT/AU96/00213) 및 메틸화 특이적 프로브와의 혼성화(11)를 포함하는 임의의 프로토콜을 사용하여 검출될 수 있다. 메틸화 특이적 PCR은 효소에 의한 전환 후, 메틸화와 비메틸화 영역 간의 서열차이의 특성을 이용하는 프라이머에 의존한다. 상기 모든 방법은 분석되는 시험 DNA의 표적영역내의 사이토신의 메틸화 상태에 대한 정보를 줄 것이다.

REMS-PCR 방법에 의한 증폭의 선별적 특징은 정상 서열 배경 중의 종양 서열, 또는 모서열의 배경 중의 태아 서열과 같은 드문 유전적 변이의 분석에 REMS-PCR 방법이 적합하다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법은, 변경되거나 또는 비정상적 사이토신 메틸화 양상으로 특징되는 서열변이체의 존재에 대하여 체액을 분석하는, 최소로 침습적인 분석법의 근간을 형성할 수 있다.

본 발명의 방법은 인간 종양 예컨대 예를 들면 p16 유전자 프로모터내의 CpG 아일랜드의 과메틸화와 같은 유전자의 프로모터 영역내의 과메틸화 서열의 검출에 사용될 수 있다. 상기 영역의 과메틸화는 상술한 바대로 방광암, 유방암, 위암, 두경부암, 식도암, 대장암, 폐암 및 간암에서 검출되었다. 인간 종양과 관련된 CpG 아일랜드 과메틸화를 갖는 유전자의 다른 예는 E- 카드헤린(유방암, 전립선암, 대장암, 방광암, 및 간암), von Hippel Lindau (VHL) 유전자(신장세포암), BRCA1(유방암), pl5 (백혈병, 버킷 림프종), hMLH1 (대장암), ER (유방암, 대장암, 폐암 및 백혈병), HIC1 (뇌종양, 유방암, 대장암 및 신장암), MDG1 (유방암), GST-π (전립선암), O⁶-MGMT (뇌종양), 칼시토닌 (암종 및 백혈병), 및 myo -D (방광암) (1,3)을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법은 또한 유전자, 예를 들면 암의 유로키나제 또는 S100A4 유전자의 전사활성과 관련된 예컨대 저메틸화 영역과 같은 영역의 규명에 사용될 수 있다.

따라서, 변경된 메틸화 양상은 종양세포의 표지로서 사용될 수 있다. 상기와 같은 표지를 사용하는 특이적 응용은 종양 또는 암의 초기진단 또는 최소한으로 침습적인 스크리닝, 림프절의 미세전이 또는 전이성 질환의 검출, 종양의 경계 또는 기타 잔류 질환에서 절제되지 않은 종양의 검출을 포함하며, 또는 재발 예측 도구로서의 사용을 포함한다. 부가하여, 별개의 유전자 좌위에서의 5-메틸사이토신 염기의 양상에 있어서의 차이는 태아 DNA의 표지 또는 유약 X 증후군 및 변경된 유전자 각인상태와 같은 질환 상태의 표지로서 사용될 수 있다. 5-메틸사이토신의 존재는 바이러스, 박테리아 또는 기타 이와 같은 미생물 또는 병원균과 연관된 내인성 또는 외인성 DNA의 표지를 제공할 수 있으며, 그 결과 또한 병원균, 또는 미생물 감염 검출, 또는 병원균 또는 미생물의 동정 수단을 제공할 수 있다.

DNA 단일가닥화 및 상이한 효소의 조합을 위한 완충액, 이온강도, pH 및 기타 반응조건의 최적화는 본질적으로 DNA의 중의 모든 표적염기의 총 탈아미노화를 가능하게 한다. 그러나, 총 탈아미노화가 메틸화 분석의 절대 요구사항은 아니다. 예를 들면, 메틸화 사이토신의 존재는 내부대조군에 대한 표적영역에서의 탈아미노화 속도(정도)의 비교로 검출될 수 있다. 내부대조군은 비메틸화된것으로 공지된 유전체 DNA내의 부위일 수 있으며, 또는 반응 동안에 넣은 합성 비메틸화 DNA일 수 있다. 두 개의 표적영역(표적영역 및 내부대조군)에서의 탈아미노화 속도의 정량은 예를 들면 실시간 정량 메틸화 특이적 PCR(MSP)(11, 46) 법, COBRA 분석에서의 절단 백분율의 비교(4), 또는 밴드의 강도를 서열분석용 젤 (8)의 방법으로 비교함으로써, 달성될 수 있다.

합성 내부 대조군의 생성에 사용될 수 있는 한가지 방법은 도 1에 예시되어 있다. 더욱 구체적으로, 내부대조군의 제조를 위해, 유전체 DNA 주형의 단편을, 3' 말단이 상기 유전체 DNA와 상보적이며, 비상보적인 5'tag을 갖는 프라이머로 증폭한다 (A). 유전체 DNA를 이어서, 내부 대조군 단편은 증폭하지 않지만, 유전체 DNA에 특이적인 바깥쪽 프라이머를 사용하여 증폭한다 (B). 유사하게, 내부 대조군 단편은, 유전체 DNA는 증폭하지 않는, 내부 대조군 단편에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭한다(C).

대안적으로, 대조군은 별도의 반응으로 할 수 있다. 예를 들면, 유전체 DNA를 상술한 바와 같이 실시간 정량 MSP, 중아황산염 처리된 메틸화 유전체 DNA(M 표준), 중아황산염 처리된 비메틸화 유전체 DNA(U 표준), 및 비처리된 비메틸화 유전체 DNA(W 표준)을 사용하여 구축된 세 개의 표준곡선을 사용하여 분석할 수 있다. 이어서 메틸화 지수 (% MI)은 % MI=M+(M + U) x 100로서 계산할 수 있다. 상기 계산된 % MI는 중아황산염 처리 (배경값)에 의한 C에서 U로의 전환되지 않은 DNA의 백분율(% W)은 고려하지 않았으며, % W =W+(W+M+U) x 100로 계산된다. M, U 및 W 각 값을 각각의 표준곡선을 참조하여, 시험 DNA 시료에 대하여 측정한다 (46). % MI로부터 배경값의 제거를 위해, 하기와 같은 계산을 할 수 있다: % MI (- 배경값) = % MI x (1- (% W÷100)). 상기 식은 그러므로, 사이토신에서 유라실로의 전환이 100% 미만인 서열 분석된 유전체 DNA 시험에서 메틸화된 사이토신의 실제량의 측정을 가능하게 한다.

반응조건의 최적화 또는 효소변형의 효능을 평가하기 위한, 공지된 사이토신 메틸화 상태에 대한 대조군 DNA 서열은 플라스미드, dCTP 대신에 ^methy5-dCTP (38)를사용하여 생성한 PCR 단편, 및 시판되는, 모든 유전자에 대하여 보편적으로 메틸화된 인간 유전체 (CpGenome^TM Universally methylated DNA, Intergen Company, Cat. No. S7821)를 포함한다. 부가하여, 메틸화 상태가 알려진 세포주로부터 추출된 세포주 DNA를 또한 양성 및 음성 대조군으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, p16 유전자의 프로모터 영역의 CpG 아일랜드의 CpG 디뉴클레오타이드는 폐암세포주 H157 및 U1752에서는 완전히 메틸화되어 있으며, 폐암세포주 H249 및 H209에서는 비메틸화되어 있다 (10). 유전체 DNA는 기술분야의 표준 방법에 의해 세포주로부터 추출될 수 있다.

분석되는 시험 DNA의 사이토신 염기의 효소적 변형은 일반적으로 사용되는 효소에 의한 DNA 사이토신 염기의 변형에 필요한 최소의 인큐베이션 시간 및 과도한 DNA 절편을 초래하지 않는 조건을 사용하여 수행될 것이다. 유리하게는 상기 프로토콜은 기술분야에 공지된 전형적인 종전의 DNA 변형 방법보다 신속할 것이다.

본 발명의 특성을 더욱 자세히 이해하기 위해서, 본 발명의 바람직한 형태를 하기의 비제한적인 실시예를 들어 기술한다.

도 1은 본 발명의 방법의 구현예에서의 사용을 위한 합성 내부 대조군 DNA의 생성 방법론을 나타낸다.

도 2A-2C는 E- 카드헤린 DNA에서 효소 매개된 탈아미노화를 위한 프라이머 연장분석법을 나타낸다.

도 3A는 표적서열에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오타이드 (고리형성 프로브)를 사용한 유전자의 표적영역의 "고리형성" 개요를 나타낸다.

도 3B는 DNA의 상보적 가닥에의 결합에 의한 표적유전자 일부 영역의 고리를 형성함에 있어, 비표적 서열에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오타이드 (안티센스 프로브)를 사용하는 개요를 보여준다.

도 3C는 위치 #972 (GenBank Accession # L34545) 둘러싸는 E- 카드헤린 프로모터 서열의 비-표적 가닥을 엑소뉴클레아제 III을 사용하여 선별적으로 절단하기 위한 제한효소의 선택을 나타낸다.

실시예 1: p16 ( INK4a ) 유전자 프로모터에서 CpG 아일랜드의 메틸화 상태를 검출하기 위한, 활성화- 유발성 사이티딘 탈아미노효소 를 이용한 유전체 DNA 의 효소적 변형

먼저 당업계에 공지된 표준 추출 방법으로 각각의 혈액 또는 조직 시료로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 모든 유전자가 전반적으로 메틸화된 인간 유전체 DNA(CpGenome^TM Universally Methylated DNA)를, p16 유전자 프로모터의 CpG 아일랜드내 5-메틸사이토신을 검출하기 위한 양성 대조군으로 사용하였다.

이중가닥 유전체 DNA를 열 변성시켜 단일가닥 DNA로 만들었다. 수득한 단일가닥 DNA는, 이후 DNA의 5-메틸사이토신 염기가 아닌 사이토신 염기의 탈아미노화를 촉진시키는 조건에서, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소와 함께 두었다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소는, 활성화된 B 세포의 미정제 추출물로서(28), 그리고 정제를 용이하게 하기 위한 융합 단백질 발현(26, 27)을 포함한 여러가지 방법으로 제조할 수 있다.

p16 프로모터(GenBank Accession No. X94154)의 CpG 아일랜드 주변의 관심 영역을 PCR로 증폭하였다. 프라이머는 메틸화 빈발부위(hot-spot)가 아닌 영역에서 선택하여, 메틸화에 의존적인 증폭 가능성을 감소시킨다. 적합한 프라이머 서열은 Herman 등(10)에 의해 개시되어 있다. PCR 산물은, 주형인 유전체 DNA에 사이토신이 메틸화되지 않은 상태에서는 티미딘 염기를 포함하고 있으며, 주형인 유전체 DNA에 5-메틸사이토신 염기가 존재하는 상태에서는 사이토신 염기를 포함하고 있다. 이후, p16 유전자 프로모터 영역의 CpG 아일랜드의 메틸화 상태는, 공지의 참조 서열과의 비교하여, 전술한 적절한 방법으로 평가한다. p16 유전자 프로모터 영역의 CpG 아일랜드의 메틸화 상태를 검출하여, 방광, 유방, 위, 두경부, 식도, 결장, 폐 또는 간을 포함한 여러 기관의 종양 표지로서 사용할 수 있다.

실시예 2: p16 ( INK4a ) 유전자 프로모터 CpG 아일랜드( CpG island )의 각 CpG 두 개의 뉴클레오타이드의 메틸화 상태를 용이하기 검출하기 위한, 활성화- 유발성 사이티딘 탈아미노효소를 이용한 유전체 DNA 의 효소적 변형

실시예 1과 같이, 먼저 당업계에 공지된 표준적인 추출 방법으로 각각의 혈액 또는 조직 시료로부터 유전체 DNA를 추출하였고, 모든 유전자가 전반적으로 메틸화된 인간 유전체 DNA(CpGenome^TM Universally Methylated DNA)를, p16 유전자 프로모터(CDKN2 유전자, GenBank Accession No. X94154)의 CpG 아일랜드내 5-메틸사이토신을 검출하기 위한 양성 대조군으로 사용하였다.

p16 프로모터의 CpG 아일랜드내 특정 부위는, 분석되는 CpG 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA의 가운데 고리 또는 서열과 DNA 프로브가 혼성화를 형성하도록, 분석되는 CpG 서열 주변에 상보적인 부위를 가지고 있는 DNA 합성 프로브를 이용함으로써, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소에 의한 효소적 변형에 표적이 된다. 상기 DNA 프로브를 유전체 DNA와 함께 혼합하고, 유전체 DNA에 열을 가하여 변성시키고, 이후 프로브 융점미만의 온도로 냉각시킴으로써, DNA 프로브를 유전체 DNA와 혼성화시킨다. 여러가지 방법들에서, 유전체 DNA내 여러 관심 부위를 표적으로 하기 위해, 상기 DNA 프로브 다수 개가 유전체 DNA와 혼성화될 수 있다. 또다른 방법에서, 상기 프로브는 PNA 또는 LNA와 같이 변형된 DNA 염기를 함유할 수도 있다.

유전체 DNA는 DNA 프로브와 혼성화한 후, 효소에 의해 유전체 DNA내 5-메틸사이토신 염기가 아닌 사이토신이 탈아미노화되는 조건하에서, 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소와 함께 인큐베이션하였다.

p16 프로모터의 CpG 아일랜드 주변의 관심 영역을 PCR로 증폭하였다. PCR 산물은, 주형 유전체 DNA의 고리에 사이토신이 메틸화되지 않은 상태에서는 티미딘 염기를 포함하고 있으며, 주형인 유전체 DNA에 5-메틸사이토신 염기가 존재하는 상태에서는 사이토신 염기를 포함하고 있다. 이후, p16 유전자 프로모터 영역의 CpG 아일랜드의 메틸화 상태를 실시예 1에서와 같이 분석하였다.

메틸화 특이적 PCR은, 중아황산염과 같은 물질에 의해 변형한 후, 메틸 및 비메틸화된 영역간의 서열 상이성을 이용한 프라이머에 의해 결정된다. 활성화-유발성 사이티딘 탈아미노효소에 의한 효소적 변형에 표적이 되는 CpG 디뉴클레오타이드를 메틸화 특이 PCR로 검출하기 위하여, 상기 부위에 대한 메틸화 특이 프라이머를 제작하였다.

실시예 3: 단일가닥 DNA 의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화

A. 기질 준비

E-카드헤린 프로모터 영역(GenBank Accession #L34545)의 920에서 999번째 뉴클레오타이드 염기를 가지는 메틸화되지 않은 80 bp의 올리고뉴클레오타이드(Ecad80)를 50 mM NaCl에 4 μM로 희석하였다. Ecad80의 서열은 다음과 같다: 5' cgc tgc tga ttg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tca gcg gta Cgg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg 3'. 상기 서열에서 52번째 뉴클레오타이드 염기(상기에서 C)는 프라이머 3ECAD11b를 이용하여 하기 D에 기재된 주기성 서열분석 프라이머 연장(cycle sequencing primer extension) 분석으로 스크리닝하였고, 이는 E-카드헤린 프로모터 영역(GenBank Accession # L34545)의 972번째 염기에 해당된 다.

B. 트랩 DNA 어닐링

상보적인 올리고뉴클레오타이드 AA1(tgt ttt ggg tgt gta tgg ttt ggg tgt) 및 AA2(aca ccc aaa cca tac aca ccc aaa aca)를 20 mM NaCl에 각각 30 μM로 희석하고, 이를 95 ℃에서 5분간 열처리한 다음, 상온에서 서서히 냉각시켜 상보적인 가닥이 어닐링되도록 하였다. 얻어지는 이중 가닥 "트랩 DNA" 주형은 하기 20 ㎕ AID 반응 혼합물에서 엑소뉴클레아제 활성에 대한 유인제로 사용하였다.

C. AID 매개성 사이티딘 탈아미노화 반응

20 ㎕ AID 반응 혼합물은, 50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 24 pmole 트랩 DNA(AA1/AA2), 4 pmole Ecad8O 기질, 200 ng RNase A, 및 100 nM 천연형 AID를 포함한다. 효소 혼합물은 37 ℃에서 반응시키고, 15분후 페놀:이소아밀알콜:클로로포름(25:24:1, Amresco #0883-lOOml)을 첨가하여 중지시켰다. 기질을 포함하고 있는 수상을 EppendorfPhase Lock Gel^TM 튜브(Light, O.5 m1 Cat. #0032 005.004)를 이용하여 페놀:클로로포름 상에서 분리하였다. 상기 수상은 이후 BioRad Micro Bio-spin 6 크로마토그래피 컬럼(Cat. #732-6200)를 이용하여 시료를 용출시켜 정제하였다.

D. 프라이머 연장에 의한 주기성 서열분석을 이용한 AID 매개성 사이토신 탈아미 노화 스크리닝

³²P-표지 프라이머를 이용한 주기성 서열분석 프라이머 연장법으로 사이토 신의 탈아미노화 정도를 측정한다. DNA 기질의 C를 포함하고 있는 영역에 대한 ddA 병합은, C가 U로 탈아미노화되었음을 나타내는 것이다. 이는 도 2 및 하기에서 더욱 구체적으로 설명된다.

이러한 반응에서, AID 변형 기질 4 ㎕을 주기성 서열분석 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 구체적으로, 주기성 서열분석 반응물은, 1 x 써모시쿼나제 완충액(USB), 써모시쿼나제(USB) 3 unit, 67 nM ³²P-말단 표지된 프라이머 3ECAD11b(5' agc ccc gga gca ccg ccc 3'), ddATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각 80 μM, 및 미네랄 오일 20 ㎕을 함유하고 있다. 프라이머 3ECAD11b는 유전체 DNA의 E-카드헤린 프로모터 ㅇ영역(GenBank Accession # L34545)의 972번째 염기 또는 Ecad80의 52번째 염기를 스크리닝한다. 반응은 (95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 45초 및 72 ℃에서 5분)의 주기 7회로 이루어진 열 주기로 수행하였다. 반응은 95% 포름아미드, 10 mM EDTA, 0.1% 크실렌 시아놀 및 0.1% 브로모페놀 블루를 함유하고 있는 종결액 10 ㎕을 가하여 중지시키고, 2분 이상 95 ℃에서 변성시킨 후 바로 얼음위에 두었다. 이를 20% 폴리아크릴아미드 젤상에서 60 W로 3시간 전개시키고, 건조하여 반응 산물을 분리하였다. 밴드 강도를 정량하여 972번째 위치가 탈아미노화된 표적 주형의 %를 추산하였다.

E. 폴리아크릴아미드 결과 해석

폴리아크릴아미드 젤상의 밴드 패턴은, 주기성 서열분석에 사용한 주형의 서열을 나타낸다. 972번째 위치에서 사이토신의 AID 유도성 탈아미노화는, 하기와 같이 설명되는 밴드 패턴을 나타내는 프라이머 연장분석에서 ddA 병합 정도를 변경시킨다. 반응물에 AID가 함유되지 않은 경우, 주형 서열은 변화되지 않는다(도 2A). 이로 인해, 첫 T(E-카드헤린 프로모터 서열의 970번째, GenBank Accession # L34545 또는 Ecad80의 50번째 위치)까지 ddA 레인의 ³²P-표지된 프라이머의 연장이 이루어진다. 카드헤린 프로모터 서열의 972번째 위치 또는 Ecad80의 52번째에서, AID 매개성 사이토신이 유라실로 탈아미노화에 의해 상기 영역에 ddA가 병합되며, 이를 "양성" 밴드라고 한다(도 2B 및 2C). "양성" 밴드는 폴리아크릴아미드 젤에서 보다 빠르게 전개되는 작은 단편(주형에서 첫 T까지 진행한 상태에서 프라이머 연장 산물에 두 개의 여분의 염기가 첨가됨)이다. "양성 밴드"의 강도를 ImageQuant 소프트웨어(Molecular Dynamics, USA)로 측정할 수 있으며, 모든 밴드들과 강도를 비교하였다(종결지점을 지나 PCR이 연장 진행된 것으로 확인되었으며, 따라서 이는 주형의 972번째가 비변형된 것임을 의미함). 이러한 %는 AID에 의해 유라실로 탈아미노화되어진 기질의 각 위치에서의 사이토신%를 나타낸다.

F. 고찰

사이클 서열분석 반응에서, Ecad80 기질의 52번째 위치의 사이토신이 AID 매개에 의해 약 37% 탈아미노화된 것으로 나타난다(상기 E에서 측정). AID 무첨가 대조군에서는, "양성" 밴드가 4%인 백그라운드 수치를 나타내었다. 이는, 중합효소에 의해 백그라운드 수준으로 탈아미노화되었거나 또는 ddA가 잘못 병합된 결과일 수 있다. 이러한 배경 수치는 실험군 반응에서 대조군 반응을 제함으로써 계산 할 수 있다.

표 1: 화학 합성한 단일가닥 DNA 기질의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화

반응	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
대조군(AID 무첨가)	4
실험군(AID 첨가)	37

실시예 4: 비메틸화 및 메틸화 사이토신 간의 AID 차이

A. 기질 준비

하기 서열의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 화학 합성하였다: cgc tgc tga ttg gct gtg gcX₁ ggc agg tga acc ctc agc caa tca gX₂g gta X₃gg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg, 상기 X는 비변형(Ecad8O-모두 사이토신)된 형태이거나 또는 5'-메틸사이토신(5'-MeC) 변형된 것이다(Ecad80M3-X₁, X₂ 및 X₃ 영역에 3개의 5-MeC 염기를 함유함). Ecad8O 또는 Ecad8OM3을 (50 mM NaCl 존재하에서) 4 μM으로 희석하였다.

B. 트랩 DNA 어닐링

상보적인 올리고뉴클레오타이드 T1(att ata ttt aaa tat ata aaa tat ata tta ata aat) 및 T2(att tat taa tat ata ttt tat ata ttt aaa tat aat)를 20 mM NaCl 존재하에 각각 30 μM으로 희석하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 실시예 3에서와 같이, 어닐링되어 트랩 DNA로 작용한다.

C. AID 매개성 사이티딘 탈아미노화 반응

50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgC1₂, 24 pmole 트랩 DNA(T1/T2), 4 pmole 기질, 200 ng RNase A, 및 100 nM AID를 포함하는 AID 반응 혼합물 20 ㎕을 준비하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분간 두었다.

D. 주기성 서열분석 프라이머 연장법

실시예 3과 같이 연장법을 수행하였으며, 하기 열주기 조건을 사용하였다: 15회(95 ℃에서 2분, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분). 60 W에서 30분간 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하였고 분석 전에 1시간 동안 건조시켰다.

E. 결과

그 결과, 메틸화된 사이토신의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 감소가 확인되었다(표 2). 반응 15분 후, Ecad8O의 52 위치에서의 AID는 35%였으나, Ecad8OM3의 52번째 위치에서의 탈아미노화는 5%에 불과하였다.

표 2. AID는 사이토신 보다는 메틸화된 사이토신의 탈아미노화를 감소시킨다.

기질	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
비메틸화(Ecad80)	35
메틸화(Ecad80M3)	5

실시예 5: 유전체 DNA 의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화

A: 기질로서 유전체 DNA 준비

ATTC(American Type Tissue Collection, Rockville, Md, USA)에서 입수한 인간 세포주 SW480(#CCL-228)로부터 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(50)(Qiagen)를 제조사의 지침서에 따라 이용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 표준 중아황산염 및 시퀀싱 방법을 이용하여, SW480의 유전체 DNA에서 E-카드헤린 프로모터 영역(GenBank Accession #L34545)의 972번째가 메틸화되지 않았음을 확인하였다. 유전체 DNA는 멸균수에 10 ng/㎕로 희석하였다.

B: 유전체 DNA 에서 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 반응

모든 반응물은 50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 24 pmole 트랩 DNA (AA1/AA2, 실시예 3에서와 같이 제조됨), 5 ng 유전체 DNA, 200 ng RNase A 및 200 nM AID를 함유하고 있다. 반응물을 37 ℃에서 15분간 두었다. 실시예 3과 같이, 주기성 서열분석 프라이머 연장 및 폴리아크릴아미드 젤 분석을 수행하였다.

C: 결과

주기성 서열분석으로 유전체 DNA의 16%가 AID 매개성 탈아미노화에 의해 유라실로 변형된 것으로 나타났으며, AID 무첨가 대조군의 반응에서는 5%에 불과하였다.

표 3. 유전체 DNA의 AID 매개성 탈아미노화

기질	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
유전체 DNA(AID 무첨가)	5
유전체 DNA(AID 첨가)	16

낮은 수준의 유전체 DNA의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화는, 유전체 DNA 준비시 단일가닥 DNA가 소량 존재한 것이 원인일 수 있으며, 또는 이중가닥 유전체 DNA에서의 AID에 의한 사이토신 탈아미노화의 최초 증거일 수도 있다. AID는 이중가닥이 아닌 단일 가닥 기질에 작용하는 것으로 이미 확인된 바 있으며(27), 이는 이중가닥 유전체 DNA의 낮은 탈이미노화를 설명하여 준다.

실시예 6: 기질을 단일 가닥화하기 위한 고리 형성 프로브 및 안티센스 프로 브 사용에 의한 AID 매개성 사이토신 탈아미노화의 향상

A: 기질 준비

Ecad80과, Ecad8O의 안티센스 서열인 ASEcad8O 3배수를 50 mM NaC1에 4 μM로 희석하였다(ASEcad8O 서열: 5' cc agg tga gcc ccg gag cac cgc ccc ccg tac cgc tga ttg gct gag ggt tca cct gcc ggc cac agc caa tca gca gcg 3'). 혼합물을 5분간 95 ℃로 가온한 다음 상온에서 서서히 냉각시켜 상보적인 가닥이 어닐링되도록 하였다.

B: 올리고뉴클레오타이드 고리 형성 프로브 및 안티센스 프로브의 어닐링

표적 가닥에 어닐링하여 표적영역에 단일 가닥 고리를 형성하도록 제작한 과잉의 올리고뉴클레오타이드를 상기 A 단계에서 제조한 이중 가닥 주형에 첨가하였다. 화학적으로 합성한 고리 형성 프로브의 DNA 서열은 다음과 같다:

LP1O - 5' CGA CCG CCC CGA TTG GCT GAG G 3'(3'은 포스페이트임);

LP26 - 5' GCC CCG GAG CGA GGG TTC ACC TG 3'(3'은 포스페이트임); 및

LP26+1 - 5' GCC CCG GAG CGG AGG GTT CAC CTG 3'(3'은 포스페이트임).

이들 고리 형성 프로브는 각각 10, 26 및 26+1 염기로 이루어진 단일 가닥 고리를 형성한다. LP26+1는 유연성 증가를 위해 고리 개환 부위에 짝을 이루지 않는 뉴클레오타이드를 고리 형성 프로브상에 포함하고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 AS26 5' AGC CAA TCA GCG GTA CGG GGG GCG GT 3'(3'은 포스페이트임)를 화학 합성하였다. A526은 비표적 가닥과 매우 상보적으로 어닐링하여, 주형 가닥에 26 base의 고리를 형성한다. 프로브 및 기질 혼합물을 5분간 95 ℃로 가온하고 상온에서 서서히 냉각하였다.

C: 기질의 AID 변형

50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgC1₂, 24 pmole 트랩 DNA (AA1/AA2), 4 pmole 기질, 200 ng RNase A, 및 100 mM AID를 함유하는, AID 반응 혼합물 20 ㎕을 준비하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분간 두었다.

D: 주기성 서열분석 프라이머 연장법

실시예 4와 같이, 60 W에서 3시간동안 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하고 1시간 15분간 건조한 다음 분석하였다.

E: 결과

이중가닥 DNA를, 여러가지 크기(10, 26 또는 26+1 bp +/- 26bp 안티센스 프로브)의 단일 가닥 고리를 형성하도록 제작된 올리고뉴클레오타이드 프로브와 함께 반응시켜, 표 4의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화를 증가시킬 수 있다.

표 4: 고리 형성 프로브 및 안티센스 프로브와 함께 반응시킨 이중 가닥 DNA 기질의 AID 매개성 탈아미노화

	AID 매개성 탈아미노화 %
고리 형성 프로브	LP10	LP26	LP26+1
고리 형성 프로브 단독	17	22	22
고리 형성 프로브 + 안티센스 프로브(AS26)	테스트안함		29

실시예 7: 완충 이온 및 농도 변화에 의한 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 향상

하기 실시예의 수행으로, 선별된 효소에 대한 반응 조건의 최적화 방법 및 AID 매개성 사이토신 탈아미노화에 있어서, 완충 이온 및 농도의 여러가지 조건에 의한 효과를 확인하였다.

A: 기질 준비

Ecad8O(5' cgc tgc tga ttg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tca gcg gta Cgg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg 3')을 50 mM NaCl에 4 μM로 희석하였다.

B: 기질의 AID 매개성 사이티딘 의 탈아미노화

반응물은 하기 완충액 타입 및 농도를 포함한다: 0, 50 또는 100 mM의 Tris-HCl, Hepes, Pipes 또는 이미다졸 완충화 이온들. 모든 반응은 pH 7.5에서 수행하였으며, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 24 pmole 트랩 DNA(실시예 4에 따라 준비한 T1/T2), 4 pmol Ecad8O, 200 ng RNase A 및 100 nM AID를 함유하고 있다. 반응물은 37 ℃에서 15분간 두었다. 주기성 서열분석 프라이머 연장 및 폴리아크릴아미드 젤 분석을 실시예 3과 같이 수행하였다.

C: 주기성 서열분석 프라이머 연장법

프라이머 3ECAD11b는 상기 A에 기재된 Ecad80의 C를 검색한다. 이는 유전체 DNA의 E-카드헤린 프로모터 영역의 972번째 뉴클레오타이드 서열과 해당된다. 폴리아크릴아미드 젤에서 9 W로 9시간 전기영동하여 1시간 건조한 다음 분석하였다.

D: 결과

완충 이온 종들이 AID 매개성 사이토신 탈아미노화율을 변이시키는 것으로 확인되었다. 이온 강도 감소는 하기 표 5에 기재된 바와 같이 AID 매개성 사이토 신 탈아미노화를 증가시킨다. 50 mM 농도에서. Tris-HC1은 동일 pH의 이미다졸, Pipes 또는 Hepes에 비해 AID 매개성 사이토신 탈아미노화를 보다 촉진하였다(표 5). 따라서, 완충성 이온의 종류 및 완충액의 이온 강도를 검사하여 AID의 사이토신 탈아미노효소 활성을 강화하는 조건을 찾을 수 있다.

표 5: 완충성 이온 및 농도는 AID 매개성 사이토신 탈아미노화에 영향을 미친다.

	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
이온( mM )	Hepes	Pipes	이미다졸	Tris - HC1
100	5	3	25	31
50	17	9	32	44
10	45	33	43	-

실시예 8: 반응 시간 증가에 의한 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 강화

A. 기질 준비

실험용 기질을 실시예 7과 같이 준비하였다.

B. 기질의 AID 변형

10 mM Tris-HC1 pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgC1₂, 24 pmole 트랩 DNA (실시예 4와 같이 준비한 T1/T2 서열), 4 pmol Ecad80, 200 ng RNase A 및 100 nM의 천연형 AID를 함유하고 있는 AID 반응 혼합물을 준비하였다. 효소 혼합물은 37 ℃에서 5 또는 30분간 두었다. 주기성 서열분석 프라이머 연장 및 폴리아크릴아미드 젤 분석을 실시예 3과 같이 수행하였고, 폴리아크릴아미드 젤에서 9 W로 9시간 전기영동하여 1시간 건조한 다음 분석하였다.

C: 결과

AID 반응 시간 증가시 표 6에 기재한 바와 같이 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 양이 증가된다는 것을 확인하였다. 예컨대, Ecad80의 AID 매개성 사이토신 탈아미노화는 인큐베이션 시간을 5에서 30분으로 늘리는 경우 24에서 44%로 거의 두배 증가되었다.

표 6: AID 매개성 사이토신 탈아미노화에 있어서 반응 시간의 영향

반응 시간(분)	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
5	24
30	43

실시예 9: 반응시 AID 함량 증가에 의한 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 강화

A. 기질 준비

실험용 기질을 실시예 7과 같이 준비하였다.

B. 기질의 AID 변형

10 mM Tris-HC1 pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgC1₂, 24 pmole 트랩 DNA (실시예 4와 같이 준비한 T1/T2 서열), 4 pmol Ecad80, 200 ng RNase A 및 100 nM 또는 200 nM의 AID를 함유하고 있는 AID 반응 혼합물을 준비하였다. 효소 혼합물은 37 ℃에서 20 또는 30분간 두었다. 주기성 서열분석 프라이머 연장 및 폴리아크릴아미드 젤 분석을 실시예 3과 같이 수행하였고, 폴리아크릴아미드 젤에서 9 W로 9시간 전기영동하여 1시간 건조한 다음 분석하였다.

C: 결과

표 7에 기재한 바와 같이, AID 농도 증가시 AID 매개성 사이토신 탈아미노화 양이 증가되는 것이 확인되었다.

표 7: AID 매개성 사이토신 탈아미노화에 있어서 AID 농도의 영향

	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
반응시간(분)	100 nM AID	200 nM AID
20	34	43
30	44	54

실시예 10: AFOBEC3G , 천연형 및 AID 돌연변이 R35E / R36D 를 이용한 효소 매개성 사이토신 탈아미노화

사이토신 탈아미노효소의 활성은 AID 및 APOBEC 상동체를 포함한 천연 효소에 의해 형성될 수 있다. 이들 단백질은 무작위 또는 국지적 돌연변이(rational mutation)에 의해 돌연변이 형태를 제조할 수 있으며, 돌연변이를 스크리닝하여 탈아미노화율이 보다 높으며 사이토신 및 5-메틸사이토신간의 식별율이 높은 단백질을 찾을 수 있다.

A. 기질 준비

실험용 기질을 실시예 7과 같이 준비하였다.

B. 기질의 효소 변형

10 mM Tris-HC1 pH 7.5, 1 mM DTT, 10 mM MgC1₂, 24 pmole 트랩 DNA (실시예 2와 같이 준비한 T1/T2 서열), 4 pmol 기질, 500 ng RNase A, 및 100 nM 천연형 AID, 100 nM APOBEC3G 또는 100 nM의 AID 돌연변이 R35E/R36D(Prof. Myron Goodman, Dept. of Molecular Biology and Chemistry, University of Southern California, USA)중 어느 하나를 함유하고 있는 AID 반응 혼합물을 준비하였다. 반응물은 37 ℃에서 15분간 두었다.

C: 주기성 서열분석 프라이머 연장 및 폴리아크릴아미드 젤 분석

실시예 4와 같이 주기성 서열분석 프라이머 연장을 다음의 열주기 조건으로 수행하였다: 20회(95 ℃에서 2분, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분). 9 W에서 9시간 동안 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하였고 분석전에 1시간 동안 건조시켰다.

D. 결과

그 결과는 표 8에 기재하였으며, 이는 AID 돌연변이인 R35E/R36D가 Ecad80의 52번째 뉴클레오타이드 염기의 탈아미노화에 있어서 천연형 AID에 비해 더 높은 활성을 가짐을 나타낸다. AID 돌연변이 R35E/R36D는 천연형 단백질처럼 거의 2배에 해당되는 많은 기질을 탈아미노화하였다. APOBEC3G는 낮은 사이토신 탈아미노 활성을 보였으나, 추가적인 반응 조건의 최적화를 통해(예, 완충액 종류, 완충액 농도, pH 및 효소 농도) APOBEC3G 매개성 사이토신 탈아미노화 비율을 향상시킬 수도 있다. 본 실험은 또한 사이토신 탈아미노효소 활성을 가지는 돌연변이 및 다수의 천연 효소의 활용가능성을 입증한다.

표 8: 효소 매개성 사이토신 탈아미노화

	AID 매개성 사이토신 탈아미노화 %
야생형 AID	32
AID 돌연변이R35E/R36D	60
APOBEC3G	22

본 발명은 다수의 바람직한 실시예를 참조하여 개시되지만, 본 발명의 사상 또는 범위내에서 수많은 변경 및 수정이 가능한 것으로 이해될 것이다. 따라서, 전술한 본 발명의 실시예는 예시하기 위한 것일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.

참조문헌

Claims

개체 유래의 유전체 또는 미토콘드리아의 이중가닥 DNA 시료 중의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준을 검출하는 방법에 있어서,

(a) 개체로부터 이중가닥 DNA의 시료를 수득하는 단계;

(b) 상기 이중가닥 DNA의 적어도 한 영역을 단일가닥으로 전환하는 단계;

(c) 단계 (b)의 상기 단일가닥 DNA의 표적영역을, 알킬화 사이토신과 사이토신을 차별적으로 변형시키는, 하나 이상의 효소와 반응시키는 단계; 및

(d) 상기 효소에 의한 상기 표적영역의 변형 수준을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단일가닥 DNA와 상기 효소와의 반응에 있어, 상기 효소는 실질적으로 단일가닥 DNA 중의 알킬화 사이토신 또는 사이토신과 단독으로 반응하지만, 이들 모두와는 반응하지 않는 조건하에서 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효소는 실질적으로, 상기 단일가닥 DNA 중의 알킬화 사이토신과 사이토신 중 하나와만 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA 영역을 단일가닥 DNA로 전환하는 단계는 상기 이중가닥 DNA의 두 가닥을 적어도 부분적으로 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA의 두 가닥을 적어도 부분적으로 분리하기 위해 하나 이상의 가닥 교체성 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 가닥 교체성 프로브는 독립적으로, 핵산 유사체 프로브, PNA 함유 프로브, LNA 함유 프로브, PNA 프로브 및 LNA 프로브로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA의 두 가닥이 서로 분리된 후, 상기 효소가 상기 표적영역에 용이하게 접근할 수 있도록, 상기 분리된 두 가닥의 어닐링을 방해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA의 두 가닥이 서로 분리된 후, 상기 이중가닥 DNA의 한 가닥과 하나 이상의 프로브를 혼성화함으로써, 상기 분리된 두 가닥의 어닐링을 방해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로브는 센스 프로브, 고리형 프로브, 안티센스 프로브 및 그 혼합물로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 두 개 이상의 상기 프로브를 상기 이중가닥 DNA의 가닥과 혼성화하며, 상기 프로브 중 하나를 상기 표적영역의 하방에 있는 영역과 혼성화하며, 그 외 프로브를 상기 표적영역의 상방에 있는 영역과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 표적영역을 포함하는 고리 또는 버블모양이 상기 가닥에 형성되도록, 상기 표적영역을 양쪽에서 둘러싸도록 상기 프로브를 상기 가닥의 상방 및 하방 영역에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 표적영역을 포함하는 고리 또는 버블모양이 상기 가닥에 형성되도록, 상기 프로브는 상기 표적영역의 양쪽에서 상기 이중가닥 DNA의 가닥과 혼성화하며, 상기 표적영역과 혼성화하지 않는 비상보적 서열의 중간영역을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 프로브의 중간영역은, 상기 프로브가 상기 이중가닥 DNA의 가닥과 혼성화 후에, 서로 혼성화되는 역반복부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소에 의한 상기 단일가닥 DNA의 변형 수준을 결정하는 단계는 상기 효소에 의한 상기 단일가닥 DNA의 표적영역에 대하여 효소적 변형에 기인하는 서열변이를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 효소에 의한 변형 수준을 결정하는 단계는, 상기 단일가닥 DNA의 표적영역에 대하여 프라이머 및 온도변화주기(thermal cycling)를 포함하는 증폭과정을 수행하여, 증폭된 산물을 수득하고, 상기 증폭된 산물에 대한 서열변이를 분석하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 증폭된 산물의 분석은, 증폭산물에 대하여, 핵산 서열분석, 중합효소연쇄반응 분석, 제한효소절단 분석 및 특이적 핵산서열에 결합하는 프로브의 사용을 포함하는 분석으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 증폭된 산물의 분석은, 증폭된 산물에 대하여 중합효소연쇄반응 분석을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소는 상기 단일가닥 DNA의 표적영역의 알킬화 사이토신 또는 사이토신을 탈아미노화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적영역 중의 알킬화 사이토신과 사이토신을 차별적으로 변형하기 위해, 상이한, 상기 효소의 조합이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 독립적으로 탈아미노효소 또는, 상기 효소의 탈아미노화 활성을 갖는, 촉매성 단편, 변이체, 상동체, 또는 변형체 또는 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 효소는 ApoBRe, AID, 및 AID 돌연변이 R35E/R36D로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 또는 유전자의 비코딩 영역, 또는 그 단편 중의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 유전자의 5'-비번역영역에서의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신의 수준은 과메틸화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신의 수준은 저메틸화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 유전자는 pl6 , E- 카드헤린, VHL 유전자, BRCA1, pl5, hMLH1, ER, HIC1, MDG1, GST-π, O⁶-MGMT, 칼시토닌, myo -D, 유로키나제 및 S100A4로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일가닥 DNA의 표적영역의 변경된 알킬화 사이토신의 수준 검출은 질환 또는 증상에 대한 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 질환 또는 증상은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 방광암, 간암, 두경부암, 전립선암, 신장세포암, 백혈병, 버킷 림프종, 뇌종양 및 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일가닥 DNA의 표적영역의 알킬화 사이토신의 수준 또는 존재를 근거로 개체에서의 질환 또는 증상의 진단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30 항에 있어서, 상기 질환 또는 증상은 폐암, 유방암, 대장암, 방광암, 간암, 두경부암, 전립선암, 콩팥세포암, 백혈병, 버킷 림프종, 뇌종양 및 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신의 수준 또는 존재는 태아 DNA의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신의 존재 또는 부재는 변형된 유전자 각인(imprinting) 상태의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신의 존재 또는 부재는 병원균 또는 미생물의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬화 사이토신은 메틸화 사이토신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 메틸화 사이토신은 5-메틸사이토신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA는 유전체 DNA 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른, 개체 유래의 유전체 또는 미토콘드리아 이중가닥 DNA 시료 중의 알킬화 사이토신의 존재 또는 수준의 검출 방법에 사용되는 키트로서, 상기 키트는 상기 방법의 수행에 필요한, 하나 이상의 시약 및 사용 안내서를 포함하는 키트.