CN115725733B - 一种znf135基因甲基化检测试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ZNF135基因甲基化检测试剂及其应用，所述ZNF135基因甲基化检测试剂包括：序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；和/或序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物。本发明方案制备得到的ZNF135基因甲基化检测试剂，扩增得到的目标序列短，扩增效率高，可准确检出10ng DNA背景下1％的甲基化比率，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。

Description

一种ZNF135基因甲基化检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ZNF135基因甲基化检测试剂及其应用。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的身体健康，并造成沉重的社会负担和经济负担。

高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papilloma virus,hrHPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要因素，宫颈癌的发生和发展是一个缓慢的过程，通常需要持续数十年的时间，这给宫颈癌的筛查和防治提供了绝佳的时间窗口。通过筛查早期宫颈癌前病变，其治愈率为100％。宫颈癌的主要病因现已明确，99.7％由高危型HPV感染导致，2015年ASCCP过渡指南已提出HPV作为初筛。HPV检测有着敏感性很高的特点，但HPV检测特异性普遍不足，从而容易导致持续阳性或假阳性，造成恐慌，导致医院阴道镜检量暴增，甚至过度医疗。

癌症基因检测已是世界趋势，早期诊断出癌症的风险与发生，提早介入与干预，能够大幅地提升癌症5年生存率与降低死亡率。全世界表观遗传学研究成为最先进癌症早期诊断的重要历程碑：肿瘤的特点之一是甲基化失衡，即癌变部位特定抑癌基因甲基化程度显著增高，表达下降甚至沉默，丧失抑癌功能，最终快速发展为癌症。因此特定基因甲基化状态可以被看做肿瘤发生与发展的重要指标。因此，基因甲基化检测是未来宫颈癌全分子检查的关键，评估在短期内进展为宫颈癌的风险。因此，急需寻找并开发一种高灵敏度、高特异性的检测宫颈癌的分子标志物甲基化检测试剂，为宫颈癌的早期诊断提供有力的帮助。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种ZNF135基因甲基化检测试剂。

本发明还提出一种上述ZNF135基因甲基化检测试剂的应用。

本发明还提出一种含有上述ZNF135基因甲基化检测试剂的试剂盒。

在本发明的第一方面，提出了一种ZNF135基因甲基化检测试剂，所述ZNF135基因甲基化检测试剂包括：序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；和/或序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化检测试剂还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：6所示的荧光探针序列；所述SEQ ID NO：3所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO：6所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物相匹配的荧光序列。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团；所述荧光基团为VIC、ROX、FAM、Cy5、HEX、TET、JOE、NED或TexasRed；所述淬灭基团为TAMRA、BHQ、MGB或Dabcyl。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化检测试剂用于检测ZNF135基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-MeC基本上不受影响的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐。

在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。其中，重亚硫酸盐转化试剂盒由CT Conversion Reagent干粉、M-Dissolving Buffer、M-Dilution Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesμLphonation Buffer、M-Elution Buffer和MagBinding Beads组成，重亚硫酸盐转化试剂的制备方法包括以下步骤：将CT ConversionReagent干粉加入水、M-Dissolving Buffer和M-Dilution Buffer，混匀至干粉完全溶解，-20℃保存待用。

在本发明的一些实施方式中，所述水为无菌无酶水。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化的检测试剂用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。

在本发明的一些实施方式中，ZNF135基因甲基化的检测试剂所针对ZNF135基因的检测区域为ZNF135基因或者其启动子区域。

在本发明的一些实施方式中，ZNF135基因甲基化的检测试剂所针对ZNF135基因的检测区域为ZNF135基因的CG富集区域或非CG富集区域。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化检测试剂所针对的检测区域为ZNF135基因的CG富集区域。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化检测试剂所针对ZNF135基因的检测区域为如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的序列。ZNF135基因检测区域的选择会对肿瘤的检测效能产生影响，根据ZNF135基因不同CG富集区域设计的引物对检测结果有明显的差异。

在本发明的一些实施方式中，ZNF135基因甲基化的检测试剂还含有内参基因的检测试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述内参基因为ACTB或GAPDH基因。

在本发明的一些实施方式中，所述内参基因为ACTB。

在本发明的一些实施方式中，所述含有内参基因的检测试剂含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的引物对，以及SEQ ID NO：9的探针。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化检测试剂的检测样本选自宫颈癌组织、血液、血清或血浆。

在本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述ZNF135基因甲基化检测试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液为TaqMan mμLtiplex qPCR master mix。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SiHa细胞株、Caski细胞株、ME-180细胞株等(所述细胞株为经Sanger测序验证在本发明检测的基因区域发生高度甲基化的细胞株)的gDNA，所述阴性对照为HEK293或C-33A细胞株等(经Sanger测序验证在本发明检测的基因区域未发生甲基化或甲基化程度很低的细胞株)的gDNA。

在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为ME-180细胞株的gDNA，所述阴性对照为HEK293细胞株的gDNA。

在本发明的第三方面提供了上述ZNF135基因甲基化的检测试剂或上述试剂盒的应用，所述应用为在制备宫颈癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备宫颈癌癌前诊断产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒用于检测ZNF135基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-MeC基本上不受影响的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐试剂。

在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。其中，重亚硫酸盐商用试剂盒由CT Conversion Reagent干粉、M-Dissolving Buffer、M-Dilution Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesμLphonation Buffer、M-Elution Buffer和MagBinding Beads组成；重亚硫酸盐转化试剂的制备方法包括以下步骤：将CT ConversionReagent干粉加入水、M-Dissolving Buffer和M-Dilution Buffer，混匀至干粉完全溶解，-20℃保存待用。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF135基因的检测区域为ZNF135基因或者其启动子区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF135基因的检测区域为ZNF135基因的CG富集区域或非CG富集区域或CTCF(CTCF-binding sites)区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对的检测区域为ZNF135基因的CG富集区域或CTCF(CTCF-binding sites)区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF135基因的检测区域为如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的序列。ZNF135基因检测区域的选择会对肿瘤的检测效能产生影响，根据ZNF135基因不同CG富集区域设计的引物对检测结果有明显的差异。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

S2、利用上述检测ZNF135基因的甲基化的检测试剂对步骤S1经修饰的待测样品进行ZNF135基因甲基化情况检测。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中的检测采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行。

在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为：

92-97℃ 8-12min

92-97℃ 13-17s 40-50cycles

56-64℃(收集荧光)0.5-1.5min 40-50cycles

16-22℃ 0.5-1.5min。

在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为；

95℃ 10min

95℃ 15s 45cycles

60℃(收集荧光)1min 45cycles

20℃ 1min。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF135基因甲基化情况检测的判断标准为当△Ct值≤3时为阳性，当△Ct值>3时为阴性。

根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案制备得到的ZNF135基因甲基化检测试剂，扩增得到的目标序列短，扩增效率高，可准确检出10ng基因组DNA背景下1％的甲基化比率，检出率高，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例7中的阳性对照ME180细胞株的PCR扩增图；

图2为本发明实施例7中的正常宫颈细胞的PCR扩增图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1 ZNF135基因甲基化的检测试剂

ZNF135基因甲基化的检测试剂的制备方法为：通过癌症基因组图谱数据库(TheCancer Genome Atlas,TCGA)宫颈癌的甲基化数据和基因表达数据进行生物信息分析和挖掘，设置90％宫颈癌组织甲基化Beta Value＞0.5，正常组织甲基化Beta Value＜0.2做数据初筛，然后挑选宫颈癌组织和正常组织中差异大的位点，寻找在宫颈癌组织和正常组织中甲基化水平有显著差异的CpG位点，经过分析筛选，挑选得到多个差异显著的甲基化位点；采用亚硫酸盐处理后的Sanger测序技术对宫颈癌细胞株ME180、SiHa以及15例宫颈癌阳性样本和20例正常人群的样本进行验证这些甲基化位点的情况，发现经重亚硫酸盐转化后的ZNF135基因位于区域chr19:58570389-58570541的CpG位点在宫颈癌阳性细胞株或者样本中高度甲基化，但在正常人群的样本中，上述CpG位点未甲基化或少部分CpG位点低程度的甲基化。

区域chr19:58570389-58570541的负义链原始序列如下(5’-3’)：

AGCTCTCAGTGCTGCTGGAGCTGGAGTGACTGGGCCTGGTGAAACAGGGCGCGCGGGGTGCCTGGGCATCAACGCGGGATAAGTGCCGCTTGGAACGCCGTGAGCTCCCGGCGCGACCACACGGGCTTTCGTGTTGGAAACTCTACCGTCAGT(SEQ ID NO:12)。

1、检测区域的选择

由于同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，发明人经过反复的研究和比较后，筛选得到ZNF135基因区域chr19:58570389-58570541，再从ZNF135基因区域chr19:58570389-58570541筛选得到检测ZNF135基因甲基化最好的2个靶区域，靶区域经重亚硫酸盐处理后的序列(区域1和区域2)如表1所示：

表1

2.分别针对2个区域设计引物探针序列：

针对区域1设计筛选得到正向引物ZNF135-F1，反向引物ZNF135-R1，探针序列ZNF135-P1，针对区域2设计筛选得到正向引物ZNF135-F2，反向引物ZNF135-R2，探针序列ZNF135-P2，以及针对内参基因ACTB设计得到的的正向引物ACTB-F，反向引物ACTB-R、探针ACTB-P，序列如表2所示。将针对区域1或区域2设计得到的引物探针组合作为ZNF135基因甲基化检测试剂进行后续研究。

表2

实施例2引物探针退火温度的优化

人工合成表2中的引物序列，按照引物探针使用说明书进行溶解、稀释定量，分别于不同的退火温度(Tm为52℃、56℃、60℃)下，分别测试针对区域1设计的探针组合和针对区域2设计的引物探针组合在样本中的检测效果。PCR扩增体系为：ZNF135靶标的TaqMan探针(10μM)各0.5μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，内标ACTB的TaqMan探针(10μM)各0.5μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，经重亚硫酸盐转化的样品DNA 5μL(20ng)，含有Taq酶的qPCR mix(购自诺唯赞)12.5μL，补充无酶无菌水至25μL。PCR筛选条件为：预变性95℃10min；最后扩增95℃15sec，60℃60sec(其中，为了得到最优退火温度，发明人同时在52℃和56℃条件下分别进行对比测试)，共45个循环，20℃1min仪器降温，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。不同退火温度下分别检测5例阳性样本和空白对照(无菌水，NTC)，单独对比ZNF135不同引物探针组合，CT值越小，说明组合扩增效率越高，优选退火温度60℃进行后续研究。不同退火温度下针对ZNF135不同区域设计的引物探针组合的结果如表3所示。

表3

注：检测结果为NoCt时，表示△Ct＞3，判为阴性。

退火温度的筛选结果如表3所示，从表中可以看出，CT值越小，说明组合扩增效率越高，当退火温度为60℃时，效果最佳，因此优选退火温度60℃进行后续研究。

实施例3引物探针浓度的优化

分别将针对区域1设计得到的引物探针组合(SEQ ID NO：1-3)、将针对区域2设计得到的引物探针组合(SEQ ID NO：4-6)组合、针对内参基因设计得到的引物探针组合(SEQID NO：7-9)，分别配制不同引物探针组合浓度(浓度分别为50nM、100nM、200nM、300nM和400nM)，检测5份临床宫颈高度病变的脱落细胞样本(来自长沙市妇幼保健院)，对比CT值在不同引物探针浓度条件下的变化趋势，分析出不同引物探针组合的最优引物探针组合浓度，进行后续测试。

PCR扩增体系为：ZNF135靶标不同引物探针组合或者ACTB引物探针混合物1.5μL(混合物中引物探针的浓度分别为50nM、100nM、200nM、300nM和400nM)，经重亚硫酸盐转化的样品DNA 5μL(20ng)，含有Taq酶的qPCR mix(购自诺唯赞)12.5μL，补充无酶无菌水至25μL。PCR筛选条件为：预变性95℃10min；最后扩增95℃15sec，60℃60sec，共45个循环，20℃1min仪器降温，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

表4

结果如表4所示，从表中可以看出，ZNF135靶标和内标基因ACTB的最优引物探针组合的浓度为200nM，因此，后续采用200nM进行测试。

实施例4参考品的选择

本实施例采用宫颈癌阳性细胞株ME180、SiHa和正常人肾上皮细胞株HEK293作为参考品(均购自中国上海中科院细胞库)的备选材料。采用由人和未来医疗器械有限公司提供的基因组DNA提取试剂盒对上述细胞株分别进行核酸提取，提取操作过程严格按照试剂盒操作说明书进行，提取后的DNA进行浓度测定，置于-20℃冻存备用。

将上述细胞株的gDNA进行重亚硫酸盐转化，将转化后的DNA(简称BS DNA)作为PCR扩增的模板，扩增体系如表5所示：

表5

PCR扩增条件为：预变性95℃10min；最后扩增95℃15sec，60℃60sec，共45个循环，20℃1min仪器降温，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。最后根据检测结果分析决定是否进行Sanger测序验证。对上述3个细胞株平行检测2次的检测结果见表6。

表6

结果如表6所示，从表中可以看出，ZNF135的两个引物探针组合在阳性细胞株ME180和SiHa中均有扩增，在HEK293中无扩增，进一步地，将扩增后的产物委托上海生工进行克隆测序分析，测序验证分析结果与上述扩增结果想相符，ME180和SiHa在靶区域范围内高度甲基化，在HEK293中无甲基化。因此，可选择细胞株ME180和SiHa作为阳性参考品，HEK293作为阴性参考品。

实施例5引物探针组合的筛选

本实施例选择上述阳性参考品ME180作为靶区域100％甲基化的对照品，HEK293作为0％甲基化的对照品，配制不同的甲基化比率的样品(0％甲基化、5％甲基化、10％甲基化和50％甲基化)对靶区域引物探针组合和内参基因的引物探针以及配套的扩增体系进行性能研究，确定靶区域的最优引物探针组合。

将ME-180和HEK293的gDNA先稀释成10ng/μL的溶液，再按照不同的比例进行倍比稀释成不同甲基化比率的参考品，具体甲基化比率参考品配制见下表(表8)。将配制好的不同甲基化比率的样品经重亚硫酸盐转化后，作为扩增模板进行扩增测试。扩增体系如表7所示，扩增条件同实施例4一致。

表7

表8

表9

具体检测结果如表9所示，从表9中可以看出，针对ZNF135基因区域1设计得到的SEQ ID NO：1-3引物探针组合的灵敏度和特异性最优。因此选择SEQ ID NO：1-3引物探针组合进行后续测试。

实施例6

本实施例制备了一种用于宫颈癌分子标志物ZNF135基因甲基化检测的多重荧光PCR试剂盒，包括实施例5筛选得到的引物探针组ZNF135-F1、ZNF135-R1和ZNF135-P1(SEQID NO：1-3引物探针组合)、内参基因的引物探针组ACTB-F、ACTB-R和ACTB-P(SEQ ID NO：7-9引物探针组合)、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

引物探针在最终反应体系中的终浓度均为0.2μM。ZNF135基因的PCR反应液还包括：无酶无菌水(购自北京索莱宝科技有限公司)、有Taq酶的qPCR mix(购自诺唯赞)；阳性对照为细胞株ME-180gDNA(购自中国上海中科院细胞库)，阴性对照为细胞株HEK293 gDNA(购自中国上海中科院细胞库)，浓度均为10ng/μL。

实施例7多重荧光PCR试剂盒在宫颈癌诊断中的应用

本实施例测试了实施例6制备的多重荧光PCR试剂盒在宫颈癌诊断中的应用，具体过程为：

1生物样本的获取

本发明中所有样本均为2021年04月-2021年10月期间在长沙市妇幼保健院收集的148例宫颈脱落细胞标本，其中健康人群69例，高度鳞状上皮内病变(HSIL)标本36例，低度鳞状上皮内病变(LSIL)级标本20例，宫颈癌CA标本23例，子宫内膜癌3例，卵巢癌3例。

2样本提取

本发明所有宫颈脱落标本的提取均采用购自人和未来生物科技(长沙)有限公司的核酸提取纯化试剂盒，具体操作步骤如下。

(1)取1mL宫颈脱落细胞保存液于1.5mL离心中，16000rpm离心3min，弃上清；

(2)加入200μL去离子水，加入300μL Lysis buffer、10μL Proteinase K(蛋白酶K)，充分涡旋混匀，于55℃水浴60min，期间每15min混匀一次；

(3)取出离心管，加入300μL结合缓冲液和20μL磁珠，颠倒混匀10min，瞬离；

(4)将离心管置于磁力架上，使管内磁珠吸附，弃掉管内液体；

(5)加入500μL清洗缓冲液Ⅰ，涡旋混匀，置于磁力架上1min，弃上清，取下离心管；

(6)加入500μL清洗缓冲液Ⅱ，涡旋混匀，置于磁力架上1min，去上清，取下离心管；

(7)加入500μL清洗缓冲液Ⅱ，涡旋混匀，置于磁力架上1min，去上清；

(8)用移液枪吸取去除管内的残余上清后，加入50μL洗脱液，重悬，55℃金属浴10min，其间轻轻晃动；

(9)置于磁力架上1min，转上清至新的离心管，即为待检测的样本DNA。

3DNA亚硫酸氢盐转化及纯化。

采用的甲基化转化试剂盒为EZ-96DNA Methylation-Gold MagPrep(购自ZymoResearch)对提取得到的样本的核酸进行转化和纯化，严格按照试剂盒操作说明书进行操作，经过处理后，DNA中发生了甲基化的CpG岛上的C碱基仍然保持为C碱基，而没有发生甲基化的C碱基则变成了U碱基，这样就造成了甲基化的DNA和非甲基化的DNA的序列差异。

4PCR检测

本发明使用的荧光定量PCR仪器为宏石全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S)，PCR扩增体系及程序如下：

PCR扩增体系如表10所示。

表10

组分	体积(μL)
		有Taq酶的qPCR mix(购自诺唯赞)	12.5
SEQ ID NO：1-3引物探针组合(10μM)	1.5(终浓度均为200nM)
		SEQ ID NO：7-9引物探针组合(ACTB基因)(10μM)	1.5
BS DNA	5μL(10ng)
		ddH2O	补足25μL

上机检测按照各荧光PCR以说明书进行操作，设置PCR程序。

PCR反应程序如表11所示。

表11

结果如图1～2所示，其中图1为阳性对照(ME180细胞株)即宫颈癌细胞的PCR扩增图，图2为阴性对照(HEK293细胞株)即正常宫颈细胞的PCR扩增图，结果显示，在阳性对照和宫颈癌细胞中内参基因ACTB的CT≤32，且△CT≤3，为阳性。而在阴性对照和正常宫颈组织中CT≤32，△CT>3，为阴性。

5结果判读

阈值划定：FAM、HEX阈值均划定为0.12。

结果判读(△Ct＝FAMCt-HEXCt)如表12所示。

表12

6宫颈癌样本与正常样本在ZNF135基因的甲基化检测分布状况

使用上述方法和引物探针组检测宫颈癌样本与正常样本，结果如表13所示。结果显示，ZNF135基因甲基化在69例正常人样本中检出5例，在23例宫颈癌样本中检出23例，36例HSIL的样本中检出14例，20例LSIL的样本检出4例，对宫颈癌的敏感度100％，对HSIL的敏感度为38.89％，对LSIL和正常人群样本的特异性为91.01％，对子宫内膜和卵巢癌的检出为0，说明本发明所选甲基化标志物的癌种特异性好，可为临床宫颈癌进行辅助诊断。

表13

实施例8灵敏度测试

采用本发明的试剂盒对10ngDNA背景下不同比例的甲基化率进行检测，评估本发明的试剂盒在10ngDNA背景下检测的甲基化敏感度。

本发明选择细胞株ME-180作为100％甲基化样本，细胞株HEK293作为0％甲基化样本。细胞株DNA的提取步骤同实施例7一致，提取的DNA经Qubit 2.0荧光定量仪(购自Thermofisher Scientific)测定DNA浓度。将ME-180和HEK293先稀释至浓度为10ng/μL，再按照不同的比例进行倍比稀释成不同甲基化比率的参考品，具体甲基化比率参考品配制同实施例5一致。

不同比例甲基化比率参考品DNA重亚硫酸盐转化的步骤同实施例7的步骤3一致，采用转化后的BS-DNA作为模板，DNA投入量按照10ng DNA的量进行投入，检测5％或1％的阳性参考品，按照实施例7中的步骤4进行PCR检测，每个甲基化比例的样本重复检测20次，评价最低检测限。参考实施例7中的结果判读方法进行结果分析和判读，扩增结果如表14所示，从表14中可以看出，按照本试剂盒的判读标准，在5％的甲基化比率下均能检出，甲基化比率为1％时，20次检出18次，满足≥90％的检出率。因此，本试剂盒的最低检测限为10ng基因组DNA背景下1％的甲基化。

表10不同甲基化比率参考品的检测Ct值及判读

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上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种ZNF135基因甲基化检测试剂在制备宫颈癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述ZNF135基因甲基化检测试剂包括：序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物、序列如SEQ IDNO：2所示的反向引物和序列如SEQ ID NO：3所示的荧光探针；和/或序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物、序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物和序列SEQ ID NO：6所示的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZNF135基因甲基化检测试剂还包括内参基因的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的内参基因为ACTB或GAPDH。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的内参基因的检测试剂含有针对内参基因的引物和探针。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂用于检测ZNF135基因经转化试剂修饰后的序列。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，转化试剂为重亚硫酸氢盐。

8.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂所针对ZNF135基因的检测区域为ZNF135基因启动子区域。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述所针对ZNF135基因的检测区域为如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的序列。

10.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂的使用方法包括以下步骤：

S1、将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

S2、利用权利要求1-4任一项中所述的ZNF135基因甲基化检测试剂对步骤S1经修饰的待测样品进行ZNF135基因甲基化情况检测。