CN115725734B - Znf781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ZNF781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。本发明方案将ZNF781基因用于制备宫颈癌诊断试剂，扩增得到的目标序列短，扩增效率高，可用于准确检测宫颈癌，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。

Description

ZNF781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ZNF781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

背景技术

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，排在乳腺癌之后，其发病进程由正常宫颈细胞且发病率呈现年轻化趋势。99％的宫颈癌患者的宫颈脱落细胞中检测到人类乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)，因此宫颈高级病变和宫颈癌作为病因明确的疾病，可做到早预防、早干预；在HPV感染中，91％的HPV病毒为一过性感染可被自身免疫系统清除，正常的宫颈细胞经过癌前病变发展到浸润癌有5-10年的潜伏期，因此早发现、早诊断、早治疗是预防宫颈癌的重要手段。

宫颈癌筛查以早期发现高级别癌前病变并进行阻断性治疗为目标，尽早筛查、及时发现和适当治疗是防治宫颈癌的重要手段。宫颈癌的筛查技术经历了几十年的发展，目前用于宫颈癌筛查的主要分为三种，一种是目测法，直接用肉眼观察经化学处理后细胞的变化，一种是采集宫颈脱落细胞，观察细胞形态学的变化，还有一种检测高危型HPV病毒。

目前临床上应用的宫颈癌筛查手段为女性健康做出了巨大贡献，同时也存在其不可避免的缺陷：首先，传统的细胞学筛查手段，包括巴士涂片及液基细胞学(TCT)，因为其整个过程包括取样、抹片制备、观察、结果判读等多个环节受人为因素影响较大，造成漏检几率较高。其次，近年兴起的病原学筛查HPV-DNA检测技术，因其检测的仅是HPV病原存在与否，而HPV病毒的存在大部分是一过性的，也意味着这些被自身免疫清除掉的HPV感染者也会被判定为阳性，从而导致过度医疗。发明人期望挖掘出能与癌前病变紧密相关的分子指标，以弥补目前我国临床上应用的宫颈癌筛查手段中的不足。DNA的异常甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件，寻找和研究疾病特异性的新甲基化标志物，可以为宫颈癌筛查、诊断和治疗提供新的思路。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出ZNF781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

本发明还提出一种ZNF781基因甲基化的检测试剂。

本发明还提出一种含有上述ZNF781基因甲基化检测试剂的试剂盒。

本发明还提出一种上述ZNF781基因甲基化检测试剂或试剂盒的应用。

在本发明的一个方面，提出了ZNF781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因为经甲基化的ZNF781基因。

在本发明的第二方面，提出了一种ZNF781基因甲基化的检测试剂，所述ZNF781基因甲基化检测试剂包括：序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物，和/或序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因甲基化检测试剂还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9所示的荧光探针序列。所述SEQ ID NO：3所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO：6所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO：9所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO：7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物相匹配的荧光序列

在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团；所述荧光基团为VIC、ROX、FAM、Cy5、HEX、TET、JOE、NED或TexasRed；所述淬灭基团为TAMRA、BHQ、MGB或Dabcyl。

在本发明的一些实施方式中，ZNF781基因甲基化的检测试剂还含有内参基因的检测试剂；优选地，所述的内参基因为ACTB或GAPDH。

在本发明的一些实施方式中，所述的内参基因为ACTB。

在本发明的一些实施方式中，所述含有内参基因的检测试剂含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的引物对，以及SEQ ID NO:12的探针。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂的样本选自宫颈癌组织、宫颈癌脱落细胞、血液、血清或血浆。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因甲基化的检测试剂用于检测ZNF781基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-MeC基本上不受影响的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)、或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐试剂。

在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。其中，重亚硫酸盐商用试剂盒由CT Conversion Reagent干粉、M-Dissolving Buffer、M-Dilution Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesμLphonation Buffer、M-Elution Buffer和MagBinding Beads组成；重亚硫酸盐转化试剂的制备方法包括以下步骤：将CT ConversionReagent干粉加入水、M-Dissolving Buffer和M-Dilution Buffer，混匀至干粉完全溶解，-20℃保存待用。

在本发明的一些实施方式中，所述水为无菌无酶水。

在本发明的一些实施方式中，所述的ZNF781基因甲基化的检测试剂检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。

在本发明的一些实施方式中，ZNF781基因甲基化的检测试剂所针对ZNF781基因的检测区域为ZNF781基因或者其启动子区域。

在本发明的一些实施方式中，ZNF781基因甲基化的检测试剂所针对ZNF781基因的检测区域为ZNF781基因的CG富集区域或非CG富集区域。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因甲基化检测试剂所针对的检测区域为ZNF781基因的CG富集区域。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因甲基化检测试剂所针对ZNF781基因的检测区域为如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的序列。ZNF781基因检测区域的选择，会对肿瘤的检测效能产生影响，根据ZNF781基因CG富集区域设计的引物，不同区域设计的引物对检测结果有明显的差异。

在本发明的第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述ZNF781基因甲基化检测试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液为1×HieffTaqMan mμLtiplex qPCR master mix。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SiHa细胞株、Caski细胞株、ME-180细胞株等(所述细胞株为经Sanger测序验证在本发明检测的基因区域发生高度甲基化的细胞株)的gDNA，所述阴性对照为HEK293或C-33A细胞株等(经Sanger测序验证在本发明检测的基因区域未发生甲基化或甲基化程度很低的细胞株)的gDNA。

在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为ME-180细胞株的gDNA，所述阴性对照为C-33A细胞株的gDNA。

在本发明的第四方面提供了上述ZNF781基因甲基化的检测试剂或试剂盒的应用，所述应用为在制备宫颈癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备宫颈癌癌前诊断产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒用于检测ZNF781基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-MeC基本上不受影响的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐试剂。

在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。其中，重亚硫酸盐商用试剂盒由CT Conversion Reagent干粉、M-Dissolving Buffer、M-Dilution Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesμLphonation Buffer、M-Elution Buffer和MagBinding Beads组成；重亚硫酸盐转化试剂的制备方法包括以下步骤：将CT ConversionReagent干粉加入水、M-Dissolving Buffer和M-Dilution Buffer，混匀至干粉完全溶解，-20℃保存待用。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF781基因的检测区域为ZNF781基因或者其启动子区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF781基因的检测区域为ZNF781基因的CG富集区域或非CG富集区域或CTCF(CTCF-binding sites)区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对的检测区域为ZNF781基因的CG富集区域或CTCF(CTCF-binding sites)区域。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF781基因的检测区域为如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的序列。ZNF781基因检测区域的选择会对肿瘤的检测效能产生影响，根据ZNF781基因不同CG富集区域设计的引物对检测结果有明显的差异。

在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

S2、利用上述检测ZNF781基因的甲基化的检测试剂对步骤S1经修饰的待测样品进行ZNF781基因甲基化情况检测。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中的检测采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行。

在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为：

92-97℃8-12min

92-97℃13-17s 40-50cycles

56-64℃(收集荧光)0.5-1.5min 40-50cycles

16-22℃0.5-1.5min。

在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为；

95℃10min

95℃15s 45cycles

60℃(收集荧光)1min 45cycles

20℃1min。

在本发明的一些实施方式中，所述ZNF781基因甲基化情况检测的判断标准为当△Ct值≤9时为阳性，当△Ct值>9时为阴性。

根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案将ZNF781基因用于制备宫颈癌诊断试剂，制备得到的宫颈癌诊断试剂扩增得到的目标序列短，扩增效率高，可用于准确检测宫颈癌，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例2中的引物探针组合一致性的分析结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1ZNF781基因甲基化的检测试剂

1、检测区域的选择

由于同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，发明人经过反复的研究和比较后，筛选得到ZNF781基因区域chr19:38183015-38183302，再从ZNF781基因区域chr19:38183015-38183302筛选得到检测ZNF781基因甲基化最好的3个靶区域(区域1、区域2和区域3)，靶区域经重亚硫酸盐处理后的序列如表1所示：

表1

2.分别针对3个区域设计引物探针序列：

ZNF781特异性甲基化引物是参考NCBI人类全基因组序列进行设计，使用引物软件Primer Premier3.0和Methyl Primer Express v1.0进行设计，针对区域1设计筛选得到正向引物1，反向引物1，探针序列1，针对区域2设计筛选得到正向引物2，反向引物2，探针序列2，针对区域3设计筛选得到正向引物3，反向引物3，探针序列3以及针对内参基因ACTB设计得到的的正向引物4，反向引物4、探针4，序列如表2所示。将针对区域1、区域2或区域3设计得到的引物探针组合作为ZNF781基因甲基化检测试剂进行后续研究。

表2

实施例2引物探针组合的筛选

本实施例对实施例1制备的3组引物探针组合进行了筛选，具体步骤如下：

1生物样本的获取

由宫颈刷刷落的宫颈脱落细胞(购自中国上海中科院细胞库)，保存于新柏氏细胞保存液中。

2样本提取

本发明所有宫颈脱落细胞的提取均采用购自金麦格生物技术有限公司的核酸提取纯化试剂盒，具体操作步骤如下。

(1)取1mL宫颈脱落细胞保存液于1.5mL离心中，17900g离心10min，弃上清；

(2)加入200μL去离子水，加入300μL Lysis buffer、10μL Proteinase K(蛋白酶K)，充分涡旋混匀，于55℃水浴60min，期间每15min混匀一次；

(3)取出离心管，加入300μL Binding buffer和20μL磁珠，颠倒混匀10min，瞬离；

(4)将离心管置于磁力架上，使管内磁珠吸附，弃掉管内液体；

(5)加入500μL Wash buffer I，涡旋混匀，置于磁力架上1min，弃上清，取下离心管；

(6)加入500μL Wash buffer II，涡旋混匀，置于磁力架上1min，去上清，取下离心管；

(7)加入500μL Wash buffer II，涡旋混匀，置于磁力架上1min，去上清；

(8)用移液枪吸取去除管内的残余上清后，加入50μL Elution buffer，重悬，55℃金属浴10min，其间轻轻晃动；

(9)置于磁力架上1min，转上清至新的离心管，即为待检测的样本DNA。3DNA亚硫酸氢盐转化及纯化；

采用的甲基化转化试剂盒为EZ-96DNA Methylation-Gold MagPrep(购自ZymoResearch生物科技公司)，严格按照试剂盒操作说明书进行操作，具体转化及纯化步骤如下：

试剂盒首次使用试剂的准备：CT Conversion Reagent：1管CT ConversionReagen干粉中加入9mL无菌无酶水，3mL的M-Dilution Buffer以及500μL的M-DissolvingBuffer，充分震荡混匀15min备用；M-Wash Buffer：加入288mL无水乙醇震荡混匀后备用。

1)待转化样本组成成分如表3所示。

表3

2)转化的PCR反应程序设置如表4所示。

表4

温度	时间
		98℃	10min
64℃	3h
		4℃	Hold(不超过20h)

3)转化后重亚硫酸盐纯化过程：

a、将上一步PCR反应液加入600μL M-Binding Buffer和10μL磁珠悬液(在使用前充分涡旋震荡混匀)，涡旋混匀30s后室温静置5min。

b、瞬离，置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。

c、加入400μL M-Wash Buffer，涡旋混匀30s，瞬离。置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。

d、加入200μL M-DesμLphontion Buffer，涡旋混匀30s，涡旋混匀30s，室温放置15min(期间颠倒混匀)，瞬离，置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。

e、加入400μL M-Wash Buffer，涡旋混匀30s，瞬离。置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。重复该步骤一次后吸弃残液。

f、金属浴55℃孵育5min(开盖)至磁珠干燥。

g、加入20-50μL M-Elution Buffer，悬浮磁珠后，金属浴55℃孵育4min(不开盖)，瞬离

h、置于磁力架上吸附至澄清，将上清转移至新的1.5mL离心管中，得到BS DNA溶液。

3QPCR扩增与结果判断

1)使用宏石全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S)，分别加入不同质量的模板BSDNA(6ng、30ng、60ng、300ng、600ng和1.2μg)，测试模板投入量对不同引物探针组合的影响，PCR反应体系25μL，配置见如表5所示。

表5

2)设置qPCR反应程序如表6所示。

表6

3)结果判读

阈值划定：FAM、HEX阈值均划定为0.12。

结果判读(△Ct＝FAMCt-HEXCt)如表7所示。

表7

表8

根据ZNF781和ACTB的引物扩增效率(E＝10^-1/a)和引物扩增一致性。比较3组不同引物探针组合的CT值、引物扩增效率、引物扩增效率一致性，从而选择最优ZNF781引物探针组合，扩增效率如表8所示，引物扩增一致性结果如图1所示，趋势线的斜率越接近0，说明不同模板投入量下，△Ct的一致性越好，即扩增效率一致性越高。从表8和图1中可以看出，ZNF781引物探针组合2在不同模板投入量下无论是靶标还是内参基因的CT值都要小于其余2组，ZNF781引物探针组合1和3虽然ZNF781和ACTB引物都处于高效扩增范围之内，但是靶标和内参的扩增效率不一致相差较大。因此优选ZNF781引物探针组合2进行实施例4的检测。

实施例3

本实施例制备了一种用于ZNF781基因甲基化检测的多重荧光PCR试剂盒，包括实施例2筛选得到的引物探针组2、实施例1制备的内参基因的引物探针组、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

引物探针在最终反应体系中的终浓度均为0.2μM。ZNF781基因的PCR反应液还包括：无酶无菌水(购自北京索莱宝科技有限公司)、2×Hotstart HiTaq PCR mix(购自广东菲鹏生物股份有限公司)；其中，2×Hotstart HiTaq PCR mix在最终反应体系中的终浓度为1×；阳性对照为细胞株ME-180(购自中国科学院细胞库)gDNA，阴性对照为细胞株C-33AgDNA(购自中国科学院细胞库)，浓度均为10ng/μL。

实施例4多重荧光PCR试剂盒在宫颈癌诊断中的应用

本实施例测试了实施例3制备的多重荧光PCR试剂盒在宫颈癌诊断中的应用，包括：收集200例宫颈脱落细胞标本，其中健康人群80例，50例宫颈鳞癌样本；40例CIN2-CIN3样本；30例低度鳞状上皮内病变(CIN1)样本。按照实施例2的方法对200例宫颈脱落细胞样本进行检测，结果如表9所示，从表中可以看出，ZNF781基因在80例正常样本中均无甲基化，特异性为100％，随着宫颈癌病变程度加深，阳性检出率逐步增高，在CIN1样本敏感性为特异性为36.7％；在CIN2-CIN3(CIN2⁺)样本中敏感性为75％；在宫颈鳞癌样本中敏感性为100％。由上述结果可知，本发明提供的试剂盒可为宫颈癌及癌前高级别病变(CIN2-CIN3)的诊断提供有效的辅助手段。

表9

样本类型	样本数量	阳性样本数	阳性率
				宫颈鳞癌	50	50	100％
CIN2-CIN3	40	30	75％
				CIN1	30	11	36.7％
健康人群	80	0	0％

实施例5灵敏度测试

采用本发明实施例3制备的多重荧光PCR试剂盒对200ngDNA背景下不同比例的甲基化率进行检测，评估本发明的试剂盒在200ngDNA背景下检测的甲基化敏感度。

本发明选择细胞株ME-180作为100％甲基化样本，细胞株C-33A作为0％甲基化样本。两个细胞株均购自中国上海中科院细胞库。细胞株DNA的提取步骤同实施例2一致，提取的DNA经Qubit 2.0荧光定量仪(购自Thermofisher Scientific)测定DNA浓度。将ME-180和C-33A先稀释至浓度为10ng/μL，再按照不同的比例进行倍比稀释成不同甲基化比率的参考品，具体甲基化比率参考品配制如表10所示。

表10

不同比例甲基化比率参考品DNA重亚硫酸盐转化的步骤同实施例2的步骤3一致，DNA投入量按照200ng DNA的量进行投入。

转化后的BS-DNA作为模板，按照实施例3中的步骤4进行PCR检测，不同的是优选引物探针组合2进行PCR检测。参考实施例2中的结果判读方法进行结果分析和判读，具体的检测结果如表11所示。从表11中可以看出，本发明试剂盒可准确检测出200ng DNA背景下1％的甲基化比率。

表11不同甲基化比率参考品的检测Ct值及判读

注：FAM通道检测结果为NoCt时，表示△Ct＞9，判为阴性。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (12)

1.一种ZNF781基因甲基化的检测试剂在制备宫颈癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述ZNF781基因甲基化检测试剂包括：序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和序列如SEQID NO：5所示的反向引物，以及序列如SEQ ID NO：6所示的荧光探针序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZNF781基因甲基化检测试剂还包括内参基因的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的内参基因为ACTB或GAPDH。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的内参基因的检测试剂含有针对内参基因的引物和探针。

5.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1-4任一项中所述的ZNF781基因甲基化检测试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照选自SiHa细胞株、Caski细胞株和ME-180细胞株的gDNA中的一种，所述阴性对照为HEK293细胞株或C-33A细胞株的gDNA。

7.权利要求5或6所述的试剂盒在制备宫颈癌诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒用于检测ZNF781基因经转化试剂修饰后的序列。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，转化试剂为重亚硫酸氢盐。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒所针对ZNF781基因的检测区域为ZNF781基因启动子区域。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述所针对ZNF781基因的检测区域如序列SEQ ID NO:15所示。

12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌诊断试剂或试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

S2、利用权利要求1-4中任一项所述的ZNF781基因甲基化检测试剂或权利要求5或6所述的试剂盒对步骤S1经修饰的待测样品进行ZNF781基因甲基化情况检测。