CN105755107A - 用于预测和诊断大肠肿瘤和癌前病变的联合检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。本发明将两种不同生物学检测机制的检测手段结合在一起，在大肠肿瘤和癌前病变的判读和诊断中产生了协同作用，极大地提高了大肠肿瘤和癌前病变的检出率。

Description

用于预测和诊断大肠肿瘤和癌前病变的联合检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于疾病诊断领域，涉及一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途，尤其涉及一种检出率大幅度提高的用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途。

背景技术

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。虽然在正常和高危人群中开展大肠癌早期检测可以有效提高早期大肠癌的检出率和患者的生存率，但现有检测技术的局限性和缺陷导致我国大肠癌发病率和死亡率持续居高不下，给患者和家庭带来了巨大的精神痛苦和经济负担。

目前常用的诊断大肠癌的方法包括实验室检查、内镜检查以及活体组织检查和脱落细胞学检查。其中，实验室检查又主要包括检测血液中的肿瘤标识物和检测大便中的血液遗留成分。

目前常用的通过检测大便来诊断大肠癌的方法是检测肿瘤出血后留在大便中的血液成分，如血红素或血红蛋白。由于出血量少，不能用物理方法辨别，通常需采用检测大便潜血的方法来检测。大便潜血(亦称便隐血)是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。检测大便潜血(FIT)的方法主要有两种，传统的方法是用化学反应方法检测血红素。由于血红蛋白中的亚铁血红素具有类似过氧化物酶的作用，能催化过氧化物酶并释放出新生态氧，将无色的受体氧化为显色的物质。具体来说，其又分为邻甲苯胺法、匹拉米洞法、无色孔雀绿法和硫酸甲氨基酚法等。由于此类方法能非特异性地检测动物中的血红素或血红蛋白，检测前对受试者的动物蛋白食品的饮食限制和要求很高，受试者顺应性差，如受试者配合不够会导致检测结果不可靠。另一种检测大便潜血方法是用免疫化学的方法检测大便中的人血红蛋白。由于抗体能特异性区别人血红蛋白和动物血红蛋白，因此没有检测前对受检者的动物蛋白食品的饮食限制和要求。但是，由于大便中的潜血是大肠肿瘤出血留在大肠腔粪便中的结果。因此，该类诊断方法有效实施的前提条件是大肠肿瘤必须有出血存在才能被检测到。但事实上并不是每一大肠肿瘤都有出血，而且其他原因导致的出血也会出现在大便中，因此导致通过检测大便潜血的方法来诊断大肠癌的检出率偏低、准确性偏差。

血液中肿瘤标识物可分为两大类，蛋白质肿瘤标识物，如癌胚抗原(CEA)以及核酸类肿瘤标识物。癌胚抗原对检测大肠癌的灵敏性和特异性不尽如人意；较可靠的血液中的肿瘤标识物是核酸类肿瘤标识物，如近年来发现的甲基化的Septin9基因。血液中甲基化的Septin9基因是甲基化了的肿瘤抑制基因片段，其可以从大肠癌肿瘤细胞进入到血液中。在血液中检测到的甲基化的Septin9基因实际上反映的是大肠中有肿瘤的形成和存在。从分子生物学的机理来说，基因甲基化反应了在肿瘤发生的早期阶段基因水平的异常。肿瘤抑制基因被甲基化后，肿瘤抑制基因的功能受到影响，从而导致肿瘤的发生。肿瘤中Septin9基因的甲基化可能是大肠癌发生的主要机制之一。由于大肠癌中甲基化的Septin9基因可以经由非常复杂生物转运过程进入血液循环中，并可以通过分子检测方法检测到，所以检测血液中甲基化的Septin9基因的存在是一种检测早期大肠癌的方法。大肠癌血液中甲基化的Septin9基因检测也面临上述同样的问题，即并不是所有大肠癌都存在有甲基化的Septin9基因，也并不是所有大肠癌中的甲基化的Septin9基因可以经由非常复杂生物转运过程进入到血液中去，因此导致以检测血液中甲基化的Septin9基因的方法来诊断大肠癌的检出率也很有限。

由此可见，目前存在的诸多大肠癌诊断方法都存在检出率和准确性有待于进一步提高的问题，亟需提供一种检出率和准确性更高的用于大肠肿瘤和/或癌前病变的预测和/或诊断的手段。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本申请提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测方法、试剂盒及其用途。相对于已有的大肠肿瘤和/或癌前病变的预测和/或诊断手段而言，本发明将两种不同生物学检测机制的检测手段结合在一起，在大肠肿瘤和/或癌前病变预测和/或诊断过程中产生了协同作用，极大地提高了大肠肿瘤和/或癌前病变的检出率。

具体地，本发明提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测方法，该方法包括检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因和检测来自受试者大便样本中的血红素和/或血红蛋白。

优选地，在上述方法中，所述检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因包括以下步骤：

1、采集受试者的血液样本并制备血浆；

2、抽提血浆中DNA并亚硫酸盐转化；

3、采用PCR方法扩增甲基化的Septin9基因的DNA；

4、采用甲基化的Septin9基因序列的特异性荧光素探针测定甲基化的Septin9基因序列。

更优选地，在上述方法的步骤3中，所述PCR方法采用针对Septin9基因序列中不含CpG双碱基的区域来设计的PCR引物；

更优选地，在上述方法的步骤3中，所述PCR方法采用针对Septin9基因序列中不发生甲基化而被亚硫酸盐转化的区域设计的阻断剂。

更优选地，在上述方法的步骤4中，还包括通过计算机判读测定结果。

本发明采用的PCR方法是在对常规的PCR方法的基础上进行优化得到的，优化后的PCR反应中采用了阻断剂，通过PCR反应中的阻断剂和探针能区分甲基化和非甲基化的序列。本发明提供的甲基化的Septin9基因的检测方法及试剂盒能检测Septin9基因V2区域发生甲基化的CpG岛中的bisDNA序列，以及内对照ACTB基因的部分区域中全部bisDNA。针对Septin9基因序列中不含CpG双碱基的区域设计PCR引物；以及针对Septin9基因序列中在不发生甲基化而被亚硫酸盐转化的区域设计阻断剂，这样就让被转化的甲基化序列得到优先扩增。针对发生了甲基化的Septin9基因序列设计的特异性荧光素探针可以在PCR反应中专一地检测出甲基化的序列。

优选地，在上述方法中，所述检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白包括以下步骤：

采用胶体金免疫层析法检测大便样本中血红蛋白。

更优选地，在上述方法中，采用胶体金免疫层析法检测大便样本中血红蛋白包括以下步骤：

1、采集粪便周围水样置于样品采集卡上；

2、将胶体金免疫层析法检测试纸插入采集卡，滴加工作缓冲液，重新水化样品，根据试纸显色结果判断大便样本中是否含有血红蛋白。

本发明还提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。

优选地，在上述试剂盒中，所述检测来自受试者的血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具包括：抽提血浆中DNA的试剂和工具、三磷酸脱氧核糖核苷、PCR引物、甲基化的Septin9基因序列的特异性荧光素探针、阻断剂、水生栖热菌脱氧核糖核酸聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、阴性对照和阳性对照。

优选地，在上述试剂盒中，所述检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具包括：采样器、样品采集卡、胶体金免疫层析法检测试纸。

本发明还提供了上述试剂盒在制备预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测装置中的用途。

优选地，所述联合检测装置包括用于判读所述试剂盒测定结果的计算机软件和硬件。

优选地，所述大肠肿瘤为早期大肠癌，例如0期大肠癌或I期大肠癌。

优选地，所述大肠癌前病变为大肠腺瘤。

本发明所述方法、试剂盒及其用途适用于高危人群大肠癌的早检和门诊伺机检测人群的检测和诊断，其检测流程如图1所示，可同时采用Septin9和FIT进行检测，也可以根据情况先采用Septin9或FIT检测，根据结果再采用另外一种检测。

众所周知，现有技术中存在诸多的用于诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的检测手段，其检测样品的来源、检测机理都不一样，单独使用均具有各自的局限性，使预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的灵敏性和特异性都大打折扣。本申请发明人在对上述诸多检测方法的研究中，意外地发现尽管检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因和检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白两者是检测不同来源的样品，但所得到的检测结果能从不同的角度来反映肿瘤的存在情况，即两者的检测结果有互补的关系。更重要的是，两种检测手段的结合还意外地使得大肠肿瘤和/或癌前病变的检出率得到了出乎意料的提高。

具体来说，Septin9与FIT的联合检测可以以互补的方式提高大肠癌的检出率，联合检测针对大肠癌的灵敏度与特异性分别为94％与93％。Septin9与FIT联合检测针对进展期腺瘤(高危腺瘤)的灵敏度高达43％，可用于大肠癌前病变检测，使大肠癌检测的端口迁移。Septin9与FIT联合检测针对上表中肠道疾病的灵敏度为61％，可提高结肠镜的有效干预率。

附图说明

图1为本发明的检测流程的示意图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，其对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或是等同替代均包括在本发明的保护范围内。

实施例1：

一、Septin9检测方法：

1.血样的收集和存储

血样的收集和存储按以下步骤执行：抽血用K2EDTA10ml采血管或9mlPotassium-EDTA采血管。按照生产厂家说明进行采血，血样应该立即处理。在制备血浆前，血液保存在2-8℃下，不超过24小时，不要冰冻血样。

另外，8.5mlCPDA管也可以用于抽血。按照生产厂家说明采血，血样应该立即处理。在8.5mlCPDA管中的血样可以保存在15-25℃下，不超过72小时，不要冰冻血样。

2.血浆样本的制备和保存

离心装有血样的采血管12分钟，转速1350±150rcf。参考离心机操作手册将rpm换算为rcf。禁止使用离心机的刹车功能，以防止血细胞层的破坏。

从离心机中取出采血管；用一个新鲜的15cm一次性移液管把血浆转移到聚丙烯材质的圆锥底15ml离心管中；离心血浆12分钟，速度1350±150rcf；用新的长为22.5cm一次性移液管或者血清移液管把3.5ml的血浆加入标记好的圆锥底的离心管中；血浆样本可以保存在-15至-25℃下，不超过4周；当使用K2EDTA10ml管时，血浆样本可以存放在2至8℃，不超过18小时。

3.血浆中DNA的抽提和亚硫酸盐的转化

(1)血浆样品、阴性对照和阳性对照的融化

把一个阴性对照和一个阳性对照置于室温(15-30℃)，融化30分钟；如果是冰冻的血浆样本，也置于室温(15-30℃)，融化30分钟；上述样本必须在融化60分钟内进行裂解程序。

(2)裂解

注意：在使用之前，快速摇晃裂解吸附液，并且从外观上看是否存在沉淀物。如有沉淀物，将其置于37℃水浴锅中60分钟，然后轻轻的摇晃，直到沉淀物完全溶解。在使用前，使之与室温一致。

按下列顺序在分别事先标记的15ml离心管中加入3.5ml血浆样本、阳性对照或阴性对照；以及3.5ml裂解吸附液；盖紧离心管盖，然后涡流混匀；把离心管在室温(15-30℃)中放置10±1分钟。

(3)DNA结合

注意：在使用磁珠时，确保磁珠均匀悬浮。磁珠数目差异会导致错误结果。为了保证正确的磁珠浓度，在移液前需彻底混匀，用涡流混匀器混匀，直到瓶底见不到沉淀物。同时，在移液步骤中，也要保证磁珠均匀悬浮。

将下列试剂添加到15ml离心管中：90μl磁珠(新鲜悬浮)，2.5ml无水乙醇(分子生物学使用，纯度≥99.5％)。盖紧离心管盖，颠倒混匀5-6次，把离心管置于轮状旋转混匀器上，室温中速(大约10-20rpm)旋转45±5分钟，旋转角度大约35-45°。

(4)DNA洗涤

注意:在洗涤步骤之前，预设恒温振荡孵育器于80±2℃用于后续洗脱和亚硫酸氢铵转化步骤。

将15ml离心管放置于DynaMag^TM-15磁性试管架上吸附5-10分钟；小心倒掉上清(注意不要倒掉磁珠，倒掉上清时保持15ml离心管放置于DynaMag^TM-15磁性试管架上)；加入1.5ml洗涤液A(聚乙二醇辛基苯基醚-100和异硫氰酸胍)；涡流混匀确保磁珠彻底重悬；用22.5cm长的一次性移液管将悬浮磁珠移至标记的2.0ml的微量离心管中；用移液管吸取残留磁珠悬浮液并将其转移至2.0ml的微量离心管中；将2.0ml的微量离心管放置于DynaMag^TM-2磁性试管架上吸附2-6分钟；用15cm的一次性移液管尽量除去液体，注意不要吸取磁珠(除去上清时保持2.0ml的微量离心管放置于DynaMag^TM-2磁性试管架上)；短暂离心2.0ml的微量离心管；放置2.0ml的微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上重新吸附2-6分钟；保持2.0ml的微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用10-100μl枪头尽量除去残余液体。

(5)洗脱

将微量离心管移至无磁性试管架上；涡流混匀洗脱液；加入100μl洗脱液至各个管中；盖紧微量离心管；涡流混匀重悬磁珠；将离心管放置于恒温振荡孵育器中，转速设为1,000±100rpm，温度设为80±2℃，震荡10±1分钟；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架架上2-6分钟；保持2.0ml的微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，将全部洗脱液移至新的2.0ml微量离心管中(约100μlDNA洗脱液)；丢弃装有磁珠的2.0ml微量离心管。

(6)DNA的储存

注意：如果提取的DNA不立即使用，可将其置于2-8℃储存不超过24小时。不能冰冻提取的DNA。

(7)亚硫酸氢盐转化

注意：亚硫酸氢盐溶液对氧气敏感。只能使用未开封的亚硫酸氢盐溶液，丢弃剩余溶液！

加入以下试剂到含有DNA洗脱液(约100μl)的2.0ml微量离心管中：150μl亚硫酸氢铵溶液；25μl保护液(6-羟基-2-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸，四氢糠醇)；盖紧微量离心管后，涡流混匀亚硫酸盐反应液；短暂离心微量离心管；将微量离心管置于恒温振荡孵育器中，80℃恒温孵育45±5分钟，不要振荡。45±5分钟后，立即将微量离心管取出；将恒温振荡孵育器温度调至23±2℃待后续使用。

(8)结合步骤

注意：充分混匀磁珠是试验成功的关键因素，磁珠数目的差异将导致错误结果。为了确保一致的磁珠浓度。在移液前，应充分混匀磁珠，用涡流混匀器混匀，至瓶底无明显沉淀物。同时在移液过程中，也要保证磁珠的均匀悬浮。

暂短离心上述反应后的2ml微量离心管；加入下列液体至微量离心管中：1000μl洗涤液A；20μl混匀(新鲜重悬)的磁珠。涡流混匀；等待恒温振荡孵育器到23±2℃；将微量离心管置于23±2℃的恒温振荡孵育器中，转速调为1000±100rpm，孵育45±5分钟；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架2–6分钟；保持微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用一次性15cm移液管尽量去除上清(注意不要吸取磁珠)。

(9)第一次洗涤

将样品从磁力架上取下，加入800μl洗涤液A；涡流混匀重悬磁珠；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架2–6分钟；保持微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用一次性15cm移液管尽量去除上清(注意不要吸取磁珠)。

(10)第二次洗涤

将样品从磁力架上取下，加入800μl洗涤液B(无核酸酶的水和乙醇)；涡流混匀重悬磁珠；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架2–6分钟；保持微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用一次性15cm移液管尽量去除上清(注意不要吸取磁珠)。

(11)第三次洗涤

将样品从磁力架上取下，加入400μl洗涤液B；涡流混匀重悬磁珠；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架2–6分钟；保持微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用一次性15cm移液管尽量去除上清(注意不要吸取磁珠)；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架2–6分钟；

保持微量离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用10-100μl枪头尽量除去残余液体(注意不要吸取磁珠)。

(12)干燥

注意：不要增加干燥时间和温度。过度干燥，会降低回收率。

打开微量离心管管盖；将微量离心管放置于恒温振荡孵育器中；23±2℃静置10分钟，待沉淀干燥，不要震荡。

(13)洗脱

将离心管移至无磁性试管架上；加入60μl洗脱液；盖好微量离心管；涡流混匀重悬磁珠；将微量离心管放入恒温振荡孵育器中，23±2℃，1000±100rpm，孵育10分钟；暂短离心微量离心管；将微量离心管置于DynaMag^TM-2磁性架2–6分钟；用10-100μl枪头将洗脱液转(约60μl)移至96孔板后，用封膜器将粘性薄膜密封96孔板；

4.检测方法：

以ABI7500PCR设备进行PCR方法。

4.1PCR设置

注意：每个亚硫酸氢盐转化的DNA样本：病人样本、阳性对照、阴性对照必须实行三重平行测试。

注意：使用聚合酶之前，需1000rcf短暂离心10-20秒，以去除瓶盖上的液体。

4.1.1PCR预反应液的准备

根据病人和对照组样本量，融化1到2管PCR反应液(见表1)；涡流混匀PCR反应液10-15秒，暂短离心；按表1的比例加相应体积PCR反应液和PCR聚合酶至2.0ml的微量离心管中；涡流混匀PCR预反应液；轻甩离心微量离心管，将管壁液滴离下来。

注意：立即使用配制的PCR预反应液，不要储存。PCR反应液和PCR聚合酶使用完毕立即复冻。注意：一个PCR反应需要16μlPCR反应液和0.8μl聚合酶。

表1：PCR预反应液(PCRMasterMix)的准备

4.2分析使用AppliedBiosystems7500Fastand7500FastDxPCR仪

4.2.1软件要求

产品已经通过SDSv1.4软件中的21CFRPart11模块的验证。

4.2.2PCR反应板准备(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

建立PCR96孔板；将15μlPCR预反应液(PCRMasterMix)加至选定好96孔板孔中；将存贮有bisDNA的96孔存储板，离心1分钟，转速1000rcf；加15μl的bisDNA至PCR板对应的孔中；用OpticalAdhesiveFilm胶膜密封；1000±100rcf离心1分钟。注意:密封后的PCR板可在2-8℃最多放置4小时。

4.2.3PCR反应板加载(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

注意:PCR预反应液(PCRMasterMix)中不包含ROX或其它染料，因此PassiveReference设置必须为“none”。注意:推荐PCR模板储存格式为*.Sdt。点击SDSv1.4软件；加载特定的试验模板文件或创建新的文件。

表2ABI7500Fast/DastDx热循环程序

4.2.4分析程序设置(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

注意：仅适用于SDSv1.4版本

在完成PCR反应后，点击“OK”；

选择标签“Results”，然后选择标签“AmplificationPlot”；

设置“AnalysisSetting”，检测septin9按以下进行设置；

OManualCt,Threshold:50000(appearsas“5.0e+004”)；

OManualbaseline,Start(cycle):10；

OManualbaseline,End(cycle):22；

设置“AnalysisSetting”，检测ACTB按以下进行操作：

OManualCt,Threshold:25000(appearsas“2.5e+004”)；

OManualbaseline,Start(cycle):10；

OManualbaseline,End(cycle):22；

点击“Analyze”；

点击“Save”；

然后，septin9Ct值和ACTBCt值会自动计算；

选择待分析的孔；

扩增曲线会在“AmplificationPlot”选项卡中显示；

Ct值会在“Report”选项卡中显示。

注意：每个扩增曲线应该能够肉眼可见。由于前后矛盾数据点(噪音峰)或者是线性曲线导致扩增曲线与阈值线的交叉，被认为是阴性结果。

4.2.5用对照样品(EpiproColonControls)验证PCR反应的有效性(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

4.2.5.1如果对照样品全部三个平行重复PCR反应满足表3中所列标准，并且病人样本随同阴性和阳性对照样本在同一个PCR反应中测定,该PCR反应被验证为是有效的。

4.2.5.2如果任何一个阴性对照或阳性对照样本或两个都无效，则无法分析病人样本的结果，那么就要重复测定本实验中全部病人的样本。

表3：用对照样品验证PCR反应的有效性(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

*循环阈值(Cyclethreshold)

4.2.6对单个PCR反应结果的解释(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

单个PCR反应的结果解释根据表4所示。如果内对照ACTB显示单个中加入DNA的量足够的话(ACTBCt值见表4中)，那么septin9PCR结果视为本次PCR反应结果。如果ACTB的Ct值大于表4中所设的阈值，那么定义该PCR反应为“无效”。

表4：对单个PCR反应结果的解释(AppliedBiosystems7500Fast/FastDx)

Septin9检测结果	Septin9的Ct*	ACTB的Ct*
			阳性	Ct*<45	Ct*≦32.1
阴性	Ct*无判读(“Undetermined”)	Ct*≦32.1
			无效	任何情况	Ct*>32.1

*循环阈值(Cyclethreshold)

本实施例使用德国Epigenomics公司的Septin9基因甲基化检测试剂盒，操作按说明书。Septin9基因甲基化检测试剂盒由三个试剂盒组成，分别为：血浆提取试剂盒、PCR试剂盒(包含阻断剂)、质控品试剂盒。试剂盒主要组成成份见表5-7。

表5：试剂盒I：血浆提取试剂盒(M5-02-001)

表6：试剂盒II：PCR试剂盒(M5-02-002)

表7：试剂盒III：质控品试剂盒(M5-02-003)

二、大便潜血(FIT)检测方法：

FIT的检查方法有许多商品试剂盒。国内的供应厂家有万华普曼、蓝十字生物药业北京有限公司；国外的有临床基因组学公司的InSureFIT为代表。

本发明中均测试和使用了这些公司的FIT产品，相比之下，以临床基因组学公司的InSureFIT产品在多方面的优势为首选。FIT^TM产品采用免疫层析法原理，其样本采集的方法比目前常规的直接采取粪便的方法更为准确。由于受检者和检验者不直接接触粪便，更容易被接受，顺应性好。检测受试者排便后马桶中粪便周围水样中是否含有人血红蛋白。首先使用蓝色长柄刷涂刷粪便表面，使粪便中血液释放到周围水中，采集粪便周围水样，然后将水样转移到FIT^TM采集卡上。两次取样后，将采集卡邮寄或送到专业检验室。由于采样品方便和范围大，样品保存的稳定性好，检测结果更为灵敏和准确。检验技术人员需将一个免疫层析法检测试纸插入采集卡中，滴加运行缓冲液，重新水化样本，萃取血红蛋白，样本沿检测条流动，与重新水化的胶体金抗人血红蛋白结合。如果样本中存在血红蛋白，即可形成血红蛋白偶联的免疫复合物。复合物流经固定于膜条上的抗人血红蛋白抗体区域时，将被检测试纸捕获，形成可见的检测线(阳性结果)。样本中如不含人血红蛋白，检测线不显色(阴性结果)。未结合的胶体金复合物继续在检测试纸上流动，在包被有胶体金复合物特异性抗体的质控线区域被捕获而显色。此质控线功能是用于确认受检样本是否已经完成检测反应，检测实验是否有效。

便隐血胶体金检测试纸(FOB)是一个高灵敏度的三明治夹心免疫检验方法。采用单克隆和多克隆抗体，特异性地针对粪便样品中的人血红蛋白(Hb)，在不到五分钟的时间里，可以检出最低量为0.2μg/ml以下的血红蛋白。本方法不受饮食的限制，能准确检测无症状、少量、持续，肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血或铁剂等药物干扰。

检测试剂盒的使用方法大同小异，国内的供应厂家万华普曼产品的使用方法如下：

在使用本产品前，请先查看盒中所有物品。在未做好测试准备前，请不要提前撕开铝箔袋。

1.标本采集：

(1)用采便棒多点采取粪便(以全部覆盖采便器远端螺旋状沟槽为宜)；

(2)将采便棒放回采便容器内，将盖拧紧，充分混均；

2.检验步骤：

(1)取出检测板，平放在桌面上，折断采便器尖端，将2-3滴粪便混液滴入检测板的圆孔(S)中；

(2)取出试纸条，以标有MAX线的一端插入小试管中，液面的深度不得超过MAX线；

(3)五分钟内判读结果，五分钟后显示结果无效。

国外的临床基因组学公司的InSureFIT试剂盒的使用方法略有不同：

1.标本采集：

(1)用采便毛刷多点采取粪便

(2)将采便毛刷的液体滴在样品采集卡上。

2.检验步骤：

注意：避免试剂瓶接触检测试纸和采集卡。

取下采集卡的背板。在取出检测试纸时，不要触摸检测试纸的中心区域(硝酸纤维素膜)，使用时只能握住手持端部分。插入检测试纸，使其牢固卡在样本采集卡剪孔处。(注意检测试纸使用和储存注意事项)向两个试剂孔轮流滴加运行缓冲液，每个孔各滴加4滴(约150μl)。5分钟判读结果。

实施例二

本发明使用甲基化Septin9基因检测(S9检测)与便潜血检测(FecalImmunochemicalTest，FIT)技术进行BFCC(Blood-FecalTestforColorectalCancer)—血/便大肠癌联检。甲基化Septin9基因检测为无创外周血检测，获CFDA和CE认证(CFDA注册证号：国械注进20143405186)，可实现对大肠癌，特别是早期大肠癌(0-I期)的早期检测。FIT对大肠癌前病变发现具有重要意义，是目前最常用的早期大肠癌筛查方法，但由于FIT自身的性能缺陷，容易出现错简和漏检。BFCC联合检测结合S9检测与FIT分别对早期大肠癌与癌前病变具有高灵敏性的特点，将两种生物学机理不同的检测结合在一起进行联检，从基因甲基化和蛋白两个层面对大肠癌与癌前病变进行综合性的早期高效检测。检测结果总结于表8-9

表8：检测结果

表9：检测结果(详细)

S9检测与FIT联检以互补的方式提高大肠肿瘤与癌前病变的检出率，BFCC联合检测针对大肠癌的灵敏度与特异性分别为94％与93％。BFCC检测针对进展期腺瘤(高危腺瘤)的灵敏度高达43％，可用于大肠癌前病变检测，使大肠癌检测的关口前移。BFCC联合检测针对高危人群的肠道增生性疾病的灵敏度为61％，可提高结肠镜有效干预率。用Septin9和FIT用定量的方法及用编程软件来综合分析和判读结果，可以有助于腺瘤和早期癌的检出率。

Claims (7)

1.一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。

2.根据权利要求1所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测来自受试者的血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具包括：抽提血浆中DNA的试剂和工具、三磷酸脱氧核糖核苷、PCR引物、甲基化的Septin9基因序列的特异性荧光素探针探针、阻断剂、水生栖热菌脱氧核糖核酸聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、阴性对照和阳性对照。

3.根据权利要求1或2所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具包括：采样器、样品采集卡、胶体金免疫层析法检测试纸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述大肠肿瘤为早期大肠癌，例如0期大肠癌或I期大肠癌。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述大肠癌前病变为大肠腺瘤。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的联合检测试剂盒在制备预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的装置中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述联合检测装置包括用于判读所述试剂盒测定结果的计算机软件和硬件。