CN105603061A - 一种基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒，方法包括：将待测DNA模板、PCR引物、可检测标记物及PCR预混液混合，制备数字PCR混合液；制备PCR微反应液滴；对PCR微反应液滴进行PCR扩增；对扩增后产物进行信号收集，判断是否含甲基化人Septin9基因及其数量和含量，其中可检测标记物为SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示的TaqMan探针或EvaGreen荧光染料，所述PCR引物包括SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示的正向引物和SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示的反向引物。本发明的方法和试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、依从性高。

Description

一种基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测人Septin9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其女性结直肠癌的发病率12.7％(居女性肿瘤的第二位)，男性结直肠癌的发病率为13.2％(居男性肿瘤的第三位)(Ferlay,J.,etal；2013,Europeanjournalofcancer49,1374-1403)。2012世界卫生组织(WHO)发表报告指出：2012年CRC新增病例为136万，死亡病例为69400；并且着重指出近年来中国和东欧国家CRC的发病率迅速增加(GLOBOCAN2012:EstimatedCancerIncidence,MortalityandPrevalenceWorldwidein2012)。在我国，近年来在宫颈癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌死亡率明显下降的同时，CRC的发病率和死亡率明显上升，总体增加36.7％(陈竺.全国第三次死因回顾抽样调查报告)。截止至2009年，我国CRC为发病率为29.4/10万，约占当年确诊肿瘤患者的10％左右(Wang,etal；2013,ChinaCancer22,515-520)。
CRC发展过程大部分均有明确的癌前病变，经息肉、腺瘤或扁平腺瘤过渡并癌变发展为进展性癌甚至远处扩散，从腺瘤发展到早期癌需5～10年时间，从早期癌发展到进展期癌约2～5年时间，总病程可达20余年(Jones,S.,etal；2008,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerican105,4283-4288)。CRC的发生是一个多因素、多步骤的过程，是遗传学与表观遗传学共同作用的结果，其机制尚不清楚。目前研究证实主要与癌基因/抑癌基因突变及表观遗传学改变有关(Coppede,F.,etal；2014,Cancerletters342,238-247)。遗传学调控是指核苷酸序列的变化，包括基因的突变、缺失、插入、重组等；而表观遗传学调控主要通过DNA甲基化和组蛋白修饰等方式来影响基因转录活性，但DNA序列不发生改变。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共价结合到DNA分子的胞嘧啶(C)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而并不改变DNA的序列。在人类基因组DNA中，大约有70％CpG会发生甲基化修饰，可被甲基化修饰的CpG二核苷酸通常处于基因的启动子区域或者5’端非翻译区和第一个外显子区。越来越多的研究表明人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。
研究表明：在结肠癌活检组织、激光显微切割的上皮细胞和间质中，随着疾病从腺瘤进展到不典型增生再到癌，组织中Septin9基因mRNA的表达进行性减少，而且CRC组织中的Septin9表达量显著低于健康对照组，这个研究表明Septin9基因启动子的甲基化造成的Septin9基因表达的减少，可能是结肠组织中良性病变进展为恶性病变的原因。
近年来，国外已开发出基于实时定量PCR技术(quantitativereal-timePCR，qPCR)的外周血人Septin9基因甲基化检测方法和相应的试剂盒。同FOTB和CEA肿瘤标志物相比，基于qPCR方法的外周血Septin9基因甲基化检测不仅有较高的灵敏度和特异性，而且对于左侧病变和右侧病变没有任何灵敏度方面的差异(Toth,K.,etal；2011,Pathologyoncologyresearch:POR17,503-509)。
但qPCR技术也有其局限性，具体表现在：灵敏度不高、精准度不高、重复性不好(Church,T.R.,etal；2014,Gut63,317-325)。这些局限性是由qPCR技术本身的瓶颈所造成的。在qPCR技术中，需要通过三个参数(荧光信号-Cq值-DNA模板起始浓度)间的关系，确定靶标基因相对于外部参照(标准曲线或对照样本)的含量。然而，许多因素如设备、操作者、模板的起始浓度、标准物质等都会影响Cq值和PCR的扩增效率，继而影响qPCR的定量结果。更重要的是，当样本中靶标的拷贝数少或丰度低时，qPCR检测的灵敏度和精密度受到限制(Whaleetal.,2012,Nucleicacidsresearch40,e82)。同时，对一些样品如miRNA，由于标准曲线难以制备，很难对其进行定量(Maetal.,2013,Biomarkerinsights8,127-136)。国内外不同研究者用同样的已商业化的基于qPCR技术的人Septin9基因甲基化检测试剂盒开展的CRC回顾性检测研究中，其检测结果差异性比较大，灵敏度从68％变化到95.6％(Potter,N.T.,etal；2014,Clinicalchemistry60,1183-1191&Toth,K.,etal；2011,Pathologyoncologyresearch:POR17,503-509)。因此，本领域迫切需要建立新的具有高灵敏度、高特异性、高稳定性、依从性好的人Septin9基因甲基化的检测技术。
数字式PCR(digitalPCR，dPCR)是新近发展起来的第三代PCR技术，主要包括大规模集成微流控芯片数字PCR(chamberbaseddigitalPCR，cdPCR)和微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)，这两种方法都是在PCR扩增前将待测DNA样本随机分配形成微反应液滴，每个微反应液滴中或者不含待测的核酸靶分子，或者至少含有一个待测的核酸靶分子，且每个微反应液滴都是一个独立的PCR反应器。经过PCR扩增后，检测器对每个微反应液滴进行检测，有荧光信号的就判定为“1”，没有荧光信号的就判定为“0”，最终根据泊松分布原理和阳性微滴的比例，直接计算出待测样本中靶序列的拷贝数或浓度。
目前，已有研究报道采用数字PCR技术用于病原微生物、儿童遗传性疾病、肿瘤突变和拷贝数变异的检测，但还没有应用数字PCR技术检测人类基因甲基化水平的相关文献。
发明内容
为了解决基于qPCR技术的人Septin9基因甲基化检测方法中所存在的CRC检测灵敏度不高、重复性和精密度不好、不能绝对定量的技术瓶颈，本发明提供了一种基于数字PCR技术的人Septin9基因甲基化检测的方法及其试剂盒，本发明另外还提供了用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的TaqMan探针和PCR引物及其应用。
本发明提供的基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的方法，包括以下步骤：(1)将待测的DNA模板、PCR引物、可检测标记物以及PCR预混液混合，制备数字PCR混合液；(2)利用所制备的数字PCR混合液，通过微滴发生器或微流体制备系统制备可独自进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴；(3)对所制备的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；(4)对经PCR扩增反应的产物进行信号收集，根据荧光信号的有无判断待测样品中是否含甲基化的人Septin9基因及其数量和含量；其中，所述可检测标记物为TaqMan探针或EvaGreen荧光染料，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示；并且所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
上述TaqMan探针连接的报告荧光基团可以是FAM、HEX、VIC、TAMRA、TexasRed、ROX、Cy5中的一种或多种，所述淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、DABCYL中的一种或多种。
上述PCR预混液由1mMdNTPs、0.1U/μlDNA聚合酶(热启动酶)、5mM氯化镁、10mM的Tris·Cl组成，步骤(3)中PCR扩增反应的反应体系的终浓度组成为：PCR预混液、0.1～1μMPCR引物、0.001～10ng/μl待测的DNA模板、0.1～1μM可检测标记物，上述中PCR扩增反应的扩增条件为：95℃～97℃预变性5～30分钟，95℃～97℃变性10～50秒，50℃～65℃退火10～30秒，共进行35～60个循环。
在本发明的通过非入侵检测人Septin9基因甲基化的方法中，通过提取待测者血液或者粪便中DNA来完成检测(或者结合两者)。待测DNA样本来源于外周血细胞DNA、外周血游离DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。优选的是外周血循环游离DNA(circulatingcell-freetumorDNA,cfDNA)、外周血中循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)、外周血循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)DNA和排泄物中肿瘤细胞或其DNA。
本发明还提供一种用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的TaqMan探针，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示。
本发明还提供一种用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
本发明还提供上述TaqMan探针和PCR引物在制备用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种用于基于数字PCR技术检测结直肠癌Septin9基因甲基化状态的试剂盒，其包括：可检测标记物、PCR扩增引物以及阴性质控品和阳性质控品，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。
上述可检测标记物可以是TaqMan探针或者可以是EvaGreen荧光染料，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列可以如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示。上述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列可以如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列可以如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
本发明首次将数字PCR技术和DNA甲基化检测的亚硫酸氢盐修饰技术相结合，通过优化数字PCR引物和探针、优化DNA提取和制备方法、优化数字PCR反应体系和条件，成功建立了基于数字PCR技术的人Septin9基因甲基化检测方法，并研制了相应的检测试剂盒。同已有的基于qPCR技术的人Septin9基因甲基化检测方法相比，本发明所提供的检测方法和试剂盒具有更高的灵敏度、更好的精准性和重复性，同时还可实现绝对定量，可以对结直肠癌患者Septin9基因甲基化进行定量和定性检测，从而对肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控，可以作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。
附图说明
图1是通过检测样本中的人Septin9基因甲基化水平来进一步验证本发明提供的检测方法和试剂盒可以监控CRC患者治疗后的复发和转移状况的统计数据图表。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书的公开内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所采用的技术是数字PCR技术结合亚硫酸氢盐修饰法，通过设计特异性的人Septin9基因启动子甲基化检测的引物和探针，扩增经亚硫酸氢盐修饰并经微滴化制备的待测DNA样本，根据PCR扩增的阳性微滴数来确定待测样本中人Septin9基因启动子是否发生了甲基化以及甲基化数量，从而判断待测样本是否发生CRC及其所处的分期。
本发明提供基于数字PCR技术结合亚硫酸盐修饰法来检测人Septin9基因甲基化的试剂盒，该试剂盒包括特异性探针和/或引物，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示；所述的配对引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4/SEQIDNo：5或者SEQIDNo：6/SEQIDNo：7所示。在本发明中，根据数字PCR扩增的DNA片段长度远大于qPCR扩增的DNA片段长度的特点优化了数字PCR的引物和探针，在保持特异性的前提下，提高了灵敏性。
在一个优选实施例中，所述的探针为TaqMan可携带有可检测标记物。所述的TaqMan探针优选的核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2和SEQIDNo：3的任何一种；TaqMan探针是可连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，两者的荧光基团类型不同。优选的，报告荧光基团选自FAM、HEX和VIC，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或MGB。
在一个优选例中，所述的可检测标记物是荧光标记物，利用SEQIDNo：4/SEQIDNo：5和SEQIDNo：6/SEQIDNo：7中的任何一对PCR扩增引物以及上述探针进行数字PCR法检测，从而获得人Septin9基因的甲基化情况。
在本发明中，根据数字PCR在扩增中不受肝素、SDS、亚硫酸氢盐等在DNA提取过程中残留物的干扰，本发明优化了DNA提取和纯化流程，从而显著提高了DNA的回收率，简化了制备流程、缩短了制备周期并易标准化，从而提高了检测方法的重复性。
在本发明的示例性实施例中，数字PCR采用微滴PCR技术(dropletdigital，PCR)。其主要特征是将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴后进行PCR扩增。PCR扩增反应后，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有发生甲基化的人Septin9基因的DNA目标分子，同时确定发生甲基化的人Septin9的目标DNA分子的数量和含量。通过相应的已经商品化的软件(如QuantaSoft，Bio-Rad)进行数据分析，计算待测样品中发生甲基化的人Septin9基因的DNA目标分子的拷贝数和含量。
在本发明中待测DNA样本包括：外周血细胞DNA、外周血游离DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。优选的是外周血循环游离DNA(cfDNA)、外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)、外周血循环肿瘤细胞(CTCs)DNA和排泄物中肿瘤细胞或其DNA。
实施例1：用于人Septin9基因甲基化检测的特异性引物和探针的设计
本发明所提供的人Septin9基因甲基化的数字PCR探针和引物，是依据人Septin9基因V2启动子区域经过亚硫酸氢盐修饰后的序列，经申请人反复试验和推敲获得的特异性和灵敏度都最好的数字PCR探针和引物。其中探针核苷酸序列如下：
探针Ⅰ：5'-TTAACCGCGAAATCCGAC-3'(SEQIDNo：1)
探针Ⅱ：5'-CGCGTTAACCGCGAAATCCGAC-3'(SEQIDNo：2)
探针Ⅲ：5'-TACGCGTTAACCGCGAAATCCGACA-3'(SEQIDNo：3)
全部探针5'端连接的报告荧光基团可以是FAM、HEX和VIC中的任何一种；全部探针3'端连接的荧光淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2或MGB的任何一种。
引物核苷酸序列如下：
正向引物Ⅰ：5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'(SEQIDNo：4)
反向引物Ⅰ：5'-GATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'(SEQIDNo：5)
正向引物Ⅱ：5'-CCACCTTCGAAATCCGAAAT-3'(SEQIDNo：6)
反向引物Ⅱ：5'-GTTGTTTTTTCGCGCGATTC-3'(SEQIDNo：7)
实施例2：DNA样本的提取和制备
本发明优化了DNA提取和纯化流程，从而显著提高了DNA的回收率，简化了制备流程、缩短了制备周期并易标准化，从而提高了检测方法的灵敏度和重复性。本发明检测的DNA模板可以来源于提取待测者外周血中的循环游离DNA(cfDNA)、外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)或通过提取外周血中的循环肿瘤细胞的DNA；或通过提取粪便中的DNA或脱落的CRC肿瘤细胞DNA来完成检测。比较优选的是通过提取外周血中的循环游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和粪便中的DNA。具体操作详述如下。
1.DNA模板的提取
本发明提供的DNA模板的提取流程包括：
(1)裂解：采用高浓度的蛋白酶K裂解液，快速从细胞或蛋白质、脂类中完全释放DNA，提高了DNA模板的回收率，缩短了提取的时间；
(2)DNA结合：释放后的DNA特异性结合到过饱和的二氧化硅上，提高了DNA特异性结合的容量；
(3)洗杂：用改良的高盐缓冲液洗脱通过非特异性吸附到二氧化硅上的蛋白质、脂类等残留杂质；
(4)洗脱：用改良的高PH缓冲液将特异性吸附到二氧化硅上的DNA洗脱下来。
2.DNA模板的鉴定
通过DNA凝胶电泳或分子杂交对制备的DNA进行鉴定，以便保证后续PCR检测的质量。鉴定方法在本发明中未详细阐述的，可以参考相关文献和手册(分子克隆实验指南，第三版J.萨姆布鲁克等编著，科学出版社)。
通过本发明提供的DNA提取和制备方法，可以提高DNA模板的回收率，比目前广泛采用的商品化的DNA制备试剂盒如QIAampCirculatingNucleicAcidKit和QIAampDNAStoolKit等提高10～20％。同时，DNA模板的纯度为OD260/OD280>1.8，整个提取周期简捷快速，比上述试剂盒缩短了近30％时间。
实施例3：结肠癌患者和正常人Septin9基因甲基化的检测
1.人Septin9基因甲基化检测试剂盒中的数字PCR探针和引物
用于人Septin9基因甲基化检测的探针可选用本发明提供的探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ中的一种；可选用本发明提供的正向引物Ⅰ/反向引物Ⅰ，或正向引物Ⅱ/反向引物Ⅱ，特别优选正向引物Ⅰ/反向引物Ⅰ。
2.外周血中样本DNA的提取
取80例经临床确诊的结直肠癌患者和50例健康人外周血各5ml，离心收集血浆，-80℃贮存待用。将3ml血浆中加入300μl蛋白酶K裂解缓冲液，60℃消化10min后转移至高密度二氧化硅离心柱中，冰上孵育5分钟(min)后3000转/分钟(rpm)离心1min，弃收离心管中的滤液；在高密度二氧化硅离心柱中加入1ml高盐洗杂缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液；重复洗杂步骤1次；甩干离心柱中残留液体(12000rpm离心2min)；向高密度二氧化硅离心柱内的膜中央加入100μl高PH值的DNA洗脱液，室温放置1min后，12000rpm离心2min，所得样本即为DNA样本。通过紫外分光光度法对模板DNA浓度进行测定。
3.粪便中样本DNA的提取
取50例经临床确诊的结直肠癌患者和15例健康人粪便各100～300mg，-80℃贮存待用。将粪便中加入1ml蛋白酶K裂解缓冲液，70℃消化15min，12000rpm离心2min，上清转移至高密度的二氧化硅离心柱中，冰上孵育5min，5000rpm离心1min，弃收离心管中的滤液；加入1ml洗杂高盐缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液；重复洗杂步骤1次；甩干离心柱中残留液体(12000rpm离心2分)；向高密度离心柱内的膜中央加入100μl高PH值的DNA洗脱液，室温放置1min后，12000rpm离心2min，所得样本即为DNA样本。通过紫外分光光度法对模板DNA浓度进行测定。
4.样本DNA的亚硫酸氢盐修饰(BisulfiteConversion)
取提取的100μl待测样本DNA转移至PCR反应管中，加入190μl的亚硫酸氢盐反应液，再加入30μl转化保护液；盖紧管盖后，振荡混匀，反应液短时离心，将反应液收集至管底；将反应管置于PCR仪中，按照下列程序进行重亚硫酸盐转化反应：99℃5分钟，50℃25分钟；99℃5分钟，50℃1小时25分钟；99℃5分钟，50℃4小时55分钟，保持20℃过夜，以保证转化的完全反应。转化反应后，对修饰后的DNA模板进行纯化，纯化程序如下：取出320μl经转化的模板DNA溶液移至1.5ml的离心管，加入1ml结合缓冲液和1μlpolyA。将反应管中的溶液转入纯化柱中，8000rpm离心1min，弃废液。加500μl洗涤液(第1次)至纯化柱中，8000rpm离心1min，弃废液。加500μl脱硫液至纯化柱中，室温放置15min，8000rpm离心1min，弃废液,重复上述洗杂步骤2次；将纯化柱转入新的收集管中，13000rpm离心1min，去除残留溶液。将纯化柱转入1.5ml离心管中，加30μlDNA洗脱液至膜的中央，室温放置3min，8000rpm离心1min，所得溶液用于后续数字PCR扩增。
5.人Septin9基因甲基化数字PCR检测体系
为了评价本发明提供的探针和引物可用于数字化PCR检测样本中人Septin9基因甲基化，将来源于同一样本的DNA模板分成6份，在T1～T6不同的数字PCR检测体系和扩增条件下完成其数字PCR的检测，数字PCR检测体系和条件如下表1所示：
表1数字PCR检测体系及条件
(1)数字PCR反应体系：在20μlPCR反应体系中，包含正向引物和反向引物各1μl，2×数字PCRSupermix10μl，探针0.5μl，1μl模板DNA，补足ddH2O至20μl。
(2)微滴PCR反应体系的制备与扩增：将上述每个20μl的PCR反应液加入已含有70μl微滴发生油的微滴发生卡上(Bio-Rad)并置于微滴发生器(Bio-Rad)上生成微滴，在2.5min生成2万个微滴，每个微滴可以独立进行PCR扩增。将生成的微滴转移至96孔板上进行PCR反应。
(3)信号检测和数据分析：PCR扩增结束后，将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器(Bio-Rad)，通过QuantaSoftanalysis(version1.3.2.0)软件分析计算出待测样本中甲基化的人Septin9基因的拷贝数和相应的浓度。
6.检测结果及分析
(1)外周血中人Septin9基因甲基化检测结果：
分别在T1～T6数字PCR检测体系中完成了80例结直肠癌确诊患者和50例健康人外周血中人Septin9基因甲基化检测(见表2-1～表2-6)。结果表明：在80例结直肠癌确诊患者中，所有的Ⅰ～Ⅳ期患者中共检出人Septin9基因甲基化阳性样本70～74例，检出率为88％～93％(所有检测条件下检测的总体灵敏度大于88％)，其中Ⅰ期灵敏度为83～87％，Ⅱ期灵敏度为84％～89％，远高于目前临床上使用的基于qPCR的人Septin9基因甲基化检测(35％～64％)，可以用于CRC分期的早期阶段的筛查。在50例健康人对照样本中，在T1、T3、T5和T6检测体系中只有1例高于设定的阈值(但其结果值显著低于阳性结肠癌的结果)，检测方法的特异性为98％；在T2和T4检测体系中，没有1例高于设定的阈值，检测方法的特异性为100％。上述结果表明：本发明提供的数字PCR检测方法的灵敏度高于基于qPCR的人Septin9基因甲基化检测方法，尤其是CRC分期的早期阶段(Ⅰ期和Ⅱ期)的检出率显著高于qPCR；两种检测方法的特异性相当。
表2-1外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T1)
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％) 检测体系
I期 19/23 83 T1
II期 16/19 84 T1
III期 20/22 91 T1
IV期 16/16 100 T1
所有期患者 71/80 89 T1
对照 1/50 2 T1
表2-2外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T2)
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％) 检测体系
I期 20/23 86 T2
II期 17/19 89 T2
III期 21/22 95 T2
IV期 16/16 100 T2
所有期患者 74/80 93 T2
对照 0/50 0 T2
表2-3外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T3)
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％) 检测体系
I期 19/23 83 T3
II期 16/19 84 T3
III期 20/22 91 T3
IV期 16/16 100 T3
所有期患者 71/80 89 T3
对照 1/50 2 T3
表2-4外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T4)
表2-5外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T5)
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％) 检测体系
I期 20/23 86 T5
II期 16/19 84 T5
III期 20/22 91 T5
IV期 16/16 100 T5
所有期患者 72/80 90 T5
对照 1/50 2 T5
表2-6外周血中人Septin9基因甲基化检测结果(T6)
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％) 检测体系
I期 19/23 83 T6
II期 16/19 84 T6
III期 19/22 87 T6
IV期 16/16 100 T6
所有期患者 70/80 88 T6
对照 1/50 2 T6
为了保证检测的准确性，本研究所有纳入人群入组前均证实无放射、化学疗法治疗史，无其他部位恶性肿瘤，女性为非妊娠期，有效排除了甲基化的Septin9基因在进行去甲基治疗后呈可逆阴性结果。
为了评价本发明方法的精密度和重复性，任意挑选一份阳性标本按相同条件分别进行8次检测。本方法提供的检测方法及其试剂盒的批内差(CV)为5.2％，批间差8.6％，均在10％以内，表明本发明提供检测方法准确、可靠。
(2)粪便中人Septin9基因甲基化检测结果：
为了验证本发明提供的检测方法和试剂盒可以检测CRC患者粪便中的人Septin9基因甲基化水平，采用外周血检测中检测灵敏度最高的T2检测体系开展粪便中人Septin9基因甲基化检测(见表3)。结果表明：在50例结直肠癌确诊患者中，共检出Septin9基因甲基化阳性47例，检出率为94％(即检测的总体灵敏度为94％)，其中I期灵敏度为85％，II期灵敏度为88％，远高于目前临床上使用的FOBT检测的水平，可以用于CRC的早期检测和筛查。在15例健康人对照样本中，没有1例检测结果高于设定的阈值，检测方法的特异性为100％，本发明方法的特异性远高于目前临床上使用的FOBT检测方法。
表3粪便中人Septin9基因甲基化检测结果
CRC患者临床分期 检出样本数/检测样本数 检出率(％)
I期 6/7 85
II期 7/8 88
III期 18/19 95
IV期 16/16 100
所有患者 47/50 94
对照 0/15 0(特异性100％)
为了保证检测的准确性，本研究所有纳入人群入组前均证实无放射、化学疗法治疗史，无其他部位恶性肿瘤，女性为非妊娠期，有效排除了甲基化的Septin9基因在进行去甲基治疗后呈可逆阴性结果。
为了评价本发明方法的精密度和重复性，任意挑选一份阳性标本按相同条件分别进行8次检测。本方法提供的检测方法及其试剂盒的批内差(CV)为7.8％，批间差11.2％，均在15％以内，表明本发明提供的检测方法准确、可靠。
(3)CRC患者转移和复发的检测：
为了进一步验证本发明提供的检测方法和试剂盒可以通过检测人Septin9基因甲基化水平来监控CRC患者治疗后的复发和转移状况，本发明采用外周血检测中检测灵敏度最高的T2检测体系对CRC1、CRC22、CRC73三名治疗后发生转移和复发患者和治疗后1年内没有发生转移和复发的患者CRC56进行回顾性验证检测(即检测治疗后1个月～12个月的外周血中Septin9基因的甲基化水平)，检测结果如图1所示。
结果表明CRC1、CRC22、CRC73患者的外周血中Septin9基因的甲基化水平分别在治疗后第5月、第6个月和第4个月降到最低，随后又开始上升到第12个月达到最高；而CRC56患者的外周血中Septin9基因的甲基化水平一直进缓慢下降，在观察期没有发生上升。
实施例4：结直肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒
采用本发明提供的人Septin9基因V2启动子甲基化引物和探针，结合数字PCR检测法，开发出针对结直肠癌Septin9基因甲基化状态检测的试剂盒，可以快速、灵敏、特异地检测样本中人Septin9基因甲基化状态，可以对直肠癌患者Septin9基因甲基化进行定量和定性检测，从而对肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控，可以作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。
用于结直肠癌Septin9基因甲基化状态检测的试剂盒的探针可选用本发明提供的探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ中的一种；还可选用本发明提供的正向引物Ⅰ/反向引物Ⅰ，或正向引物Ⅱ/反向引物Ⅱ，特别优选正向引物Ⅰ/反向引物Ⅰ。
另外，在试剂盒中还可以加入阳性和阴性对照试剂(阳性和阴性质控品)，用于试剂盒的质量控制，使检测结果更加准确、可靠。所述阳性质控品可以是亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品可以是修饰的非甲基化人类基因组DNA。
利用已知核苷酸序列的探针和引物制备检测试剂盒的技术已为本领域的技术人员所公知，因此对于本发明提供的结直肠癌Septin9基因甲基化状态检测的试剂盒的具体步骤在此不作赘述。
上述实施例表明：本发明提供的人Septin9基因甲基化检测方法和试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、依从性高等优点。本发明提供的检测方法和试剂盒的灵敏度、重复性要显著高于基于qPCR方法，不仅可用于检测外周血样本也可以用于检测粪便标本，是一种依从性高、安全的非入侵式检测方法；本发明提供的检测方法和试剂盒可以提供绝对定量结果；本发明提供的检测方法和试剂盒可以为CRC治疗后的预后、复发和转移提供可靠的检测方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测的DNA模板、PCR引物、可检测标记物以及PCR预混液混合，制备数字PCR混合液；
(2)利用步骤(1)所制备的数字PCR混合液，通过微滴发生器或微流体制备系统制备可独自进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴；
(3)对步骤(2)所制备的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；
(4)对经步骤(3)PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的有无判断待测样品中是否含甲基化的人Septin9基因及其数量和含量；
其中，所述可检测标记物为TaqMan探针或EvaGreen荧光染料，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示；
并且，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接的报告荧光基团为FAM、HEX、VIC、TAMRA、TexasRed、ROX、Cy5中的一种或多种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、DABCYL中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR预混液由1mMdNTPs、0.1U/μlDNA聚合酶(热启动酶)、5mM氯化镁、10mM的Tris·Cl组成，步骤(3)中PCR扩增反应的反应体系的终浓度组成为：PCR预混液、0.1～1μMPCR引物、0.001～10ng/μl待测的DNA模板、0.1～1μM可检测标记物，并且步骤(3)中PCR扩增反应的扩增条件为：95℃～97℃预变性5～30分钟，95℃～97℃变性10～50秒，50℃～65℃退火10～30秒，共进行35～60个循环。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测的DNA模板来源于人类基因组DNA、肿瘤细胞和组织的基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血游离DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA，优选的是外周血循环游离DNA(cfDNA)、外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)、外周血循环肿瘤细胞(CTCs)DNA和排泄物中肿瘤细胞或其DNA。
5.一种用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的TaqMan探针，其特征在于，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示。
6.一种用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
7.一种TaqMan探针在制备用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的试剂盒中的应用，其特征在于，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示。
8.一种PCR引物在制备用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的试剂盒中的应用，其特征在于，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
9.一种用于基于数字PCR技术检测结直肠癌Septin9基因甲基化状态的试剂盒，其特征在于，包括：可检测标记物、PCR扩增引物以及阴性质控品和阳性质控品，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物为TaqMan探针或EvaGreen荧光染料，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2或SEQIDNo：3所示。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：4或SEQIDNo：6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo：5或SEQIDNo：7所示。
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