CN105026580A - 重亚硫酸盐转化的核苷酸序列的检测 - Google Patents

重亚硫酸盐转化的核苷酸序列的检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测靶重亚硫酸盐转化的甲基化的核苷酸序列的改进组合物和方法。

Description

重亚硫酸盐转化的核苷酸序列的检测
背景
重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing)是使用重亚硫酸盐来测定DNA的甲基化模式的方法。DNA甲基化是涉及对胞嘧啶或腺嘌呤DNA核苷酸添加甲基的生物化学过程。当细胞分裂且由胚胎干细胞分化成特定组织时，DNA甲基化稳定地改变细胞中的基因表达。在重亚硫酸盐测序（也称为重亚硫酸盐转化(bisulfite conversion)）中，靶核酸首先用重亚硫酸盐试剂进行处理，所述重亚硫酸盐试剂将未甲基化的胞嘧啶特异性转化为尿嘧啶，而对甲基化的胞嘧啶没有影响。一个不希望的重亚硫酸盐转化结果是原始靶的双链构象由于序列互补性的丧失而被破坏。靶序列在样品制备和分析或诊断测试期间作为两条分开的单链DNA存在。靶核酸序列通常还以极低浓度存在。这是对于循环肿瘤DNA例如SEPTIN 9（mS9）的情况尤其重要的考虑。因此，需要的是在重亚硫酸盐转化后的靶核酸序列的增强检测的试剂和方法。
发明概述
本发明涉及用于在重亚硫酸盐转化（也称为重亚硫酸盐测序或重亚硫酸盐处理）后的靶核酸的增强检测的试剂和方法。本发明通过提供用于靶核酸的增强检测的试剂和方法来解决该需要。本发明还教导了本文教导的方法的一般应用的策略。
本发明的测定设计策略是确保由于通过重亚硫酸盐处理引起的化学转化而形成的两条核酸链均充当分析测试的靶。合适的分析测试的实例是靶扩增和/或信号扩增。极低浓度的核酸的检测通过靶向在未甲基化的胞嘧啶至尿嘧啶转化后的两条链得到改进，与现有技术中常用的单链检测相反。
在本发明的一个实施方案中，提供了对于甲基化的SEPTIN 9基因（mS9）特异性的引物。在这点上，本发明还涉及也提供用于扩增来自人的核酸样品中的mS9的一组引物。引物组包含选自下述的至少一种引物：
（a）在其3'末端处包含核苷酸序列 的寡核苷酸，
（b）在其3'末端处包含核苷酸序列 的寡核苷酸，
（c）在其3'末端处包含核苷酸序列 的寡核苷酸。
本发明考虑了检测用重亚硫酸盐试剂处理的包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基的核苷酸序列的方法，其包括：提供i）怀疑包含靶核酸的样品，ii）对于重亚硫酸盐转化的核酸有义链特异性的一种或多种引物，iii）对于重亚硫酸盐转化的核酸反义链特异性的一种或多种引物；扩增样品中存在的任何靶核酸的有义链和反义链两者；且检测任何经扩增的核酸。
本发明并不限于任何具体样品或样品类型。例如，样品材料可以包括体液，包括血浆、血清、血液、脊髓液、精液、阴道分泌液、痰和唾液、脑脊液、淋巴液和消化液。其他样品材料可以包括分离或富集的细胞群体和组织。样品可以是新鲜的或固定的（保存的）。固定的样品可以是包埋的（例如石蜡包埋的）。进一步地，样品可以得自考古发掘，即史前组织例如骨可以产生可以通过本发明的方法富集或分离的核酸。某些样品类型可能需要预处理，以例如浓缩样品（通过例如悬浮细胞的离心）或破碎(break apart)大的样品来源（例如骨的研磨或组织的消化性分解）。此类预处理主要是获得可更容易地通过本发明的方法操作的原材料。就组织而言，核酸可以来源于组织、痰、粪便、尿或脑脊液。
进一步考虑样品怀疑包含mS9。进一步地，考虑样品得自筛选结肠直肠癌的主体和/或怀疑患有结肠直肠癌的主体和/或对结肠直肠癌进行治疗的主体。进一步考虑所述样品中的扩增核酸与先前取自相同主体的一种或多种样品相比较。
附图简述
图1显示了在重亚硫酸盐处理前和后的原始和互补序列的序列。处理破坏处理后的两条链的互补性。“C”是甲基化的胞嘧啶。
图2显示了其中仅靶向一条链（mO1）的现有技术方法。
图3显示了其中靶向两条链（mO1和mO2）的本发明的进步。
发明详述
定义
下述定义与本公开内容有关：
术语“约”指与所述值大约+/-10%的变化。应当理解此类变化始终包括在本文提供的任何给定值内，无论是否对其做出具体提及。
术语“重亚硫酸盐试剂”指包含重亚硫酸盐（bisulfite）、焦亚硫酸盐（disulfite）、亚硫酸氢盐（hydrogen sulfite）或其组合的试剂，其如本文公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。
在本公开内容的背景下的术语“等位基因特异性引物”指与靶序列杂交的引物（参见“引物”），使得引物的3'端，通常为3'核苷酸与目的位点例如mS9序列对齐，并且在目的靶核酸的密码子处与野生型等位基因或突变体等位基因确切互补。等位基因特异性引物的使用允许基于在核酸例如DNA扩增期间的延伸产物的差异形成来区别等位基因。
术语“可检测寡核苷酸”指在合适的条件下与靶核酸选择性杂交并且可以被检测的寡核苷酸。
术语“高亲和力核酸类似物”指与互补核酸例如脱氧核糖核酸（DNA）杂交的经修饰的核酸，其亲和力高于具有相同碱基序列的未经修饰的核酸。高亲和力核酸包括但不限于锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）、己糖醇核酸（HNA）、氨基磷酸酯等。
术语“杂交”指通过两条单链核酸之间的互补碱基配对形成双链体结构。杂交可以在确切互补的核酸链之间或含有少数错配的互补核酸链之间发生。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、可检测寡核苷酸和寡聚物，与长度无关，并且包括多脱氧核糖核苷酸、多核糖核苷酸以及任何其他经修饰的/未经修饰的嘌呤/嘧啶碱基的N-糖苷。实例包括单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）。此类分子可以包含磷酸二酯键或经修饰的键，包括但不限于磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酯（acetamidate）、氨基甲酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯或砜键及其组合。此类分子可以包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶，以及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。可替代地或另外地，此类分子可以包含一个或多个经修饰的糖部分。
术语“肽核酸（PNA）”指其中正常磷酸二酯主链替换为N-(2-氨乙基)甘氨酸链的合成DNA类似物。它的核碱基以相同的A-T（U）和G-C方式互补DNA或RNA（Nielsen等人，Science 254: 1497-1500（1991）；Hanvey等人，Science 258: 1481-1485（1992）；和Egholm等人，Nature 365: 566-568（1993））。人工主链致使PNA对核酸酶抗性。PNA可以依照本领域已知的方法合成（参见例如Hyrup等人，Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23（1996）；国际专利申请公开号WO 92/20702和92/20703；和美国专利号5,539,082，所述参考文献全部的内容关于这点的教导通过引用并入本文）。两个重要的特点使得PNA成为用于特异性等位基因的优良PCR夹。它不能充当聚合的引物。它不能充当通过Taq聚合酶的核酸外切酶活性的底物。另外，完全匹配的PNA-DNA双链体的解链温度高于相同长度的DNA-DNA双链体的那种；因此，PNA-DNA双链体更稳定。PNA-DNA杂交物中的单个错配引起约10-18℃的解链温度下降（Kyger等人，Anal. Biochem. 260: 142-148（1998））。因此，在适当的温度范围上，PNA可以特异性阻断在完全匹配的模板上的引物/可检测寡核苷酸退火或链延长，而不干扰在具有错配碱基的模板上的反应（Sun等人，Nat. Biotechnol. 20: 186-189（2002）；Thiede等人，Nucleic Acids Res. 24: 983-984（1996）；和Taback等人，Int. J. Cancer 111: 409-414（2004）），其被称为PNA介导的PCR钳夹(clamping)（Orum等人，Nucleic Acids Res. 21: 5332-5336（1993））。完全匹配和错配杂交物之间的解链温度中的大差异使得PNA成为点突变的良好感应器（参见例如Karadag等人，Nucleic Acids Res. 32: e63（2004）；Taback等人（2004），同上；Hancock等人，Clin. Chem. 48: 2155-2163（2002）；Takiya等人，Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: 360-368（2004）；Kirishima等人，J. Hepatol. 37: 259-265（2002）；和Ohishi等人，J. Med. Virol. 72: 558-565（2004））。美国专利申请公开号2004/0014105公开了用于选择性富集多核苷酸的方法，所述多核苷酸以低丰度存在于样品中。该方法使用无法酶促延伸的核碱基寡聚物（例如PNA）作为PCR夹，以选择性阻断对多核苷酸的聚合酶活性（所述多核苷酸以高丰度存在于样品中），从而导致样品中较不丰富的种类的富集。“PNA”可以包括PNA夹。钳夹通过PNA和DNA引物或探针之间就共同靶位点的物理竞争操作，从而干扰引物延长。
术语“聚合酶链反应（PCR）”是制备DNA序列的拷贝的方法。该方法采用热循环（即分别为加热和冷却用于DNA的变性（或解链）和复制的循环）。作为含有与待拷贝DNA序列互补的序列的短DNA片段的引物，以及热稳定的DNA聚合酶，例如被称为Taq聚合酶的来自栖热水生菌（Thermus aquaticus）的酶，用于选择DNA序列且拷贝它（参见例如美国专利号4,683,195；4,800,195和4,965,188，所述专利全部关于这点的教导通过引用并入本文）。伴随重复循环，制备的拷贝用作生成进一步拷贝的模板（即链反应）。PCR技术包括但不限于标准PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、热启动PCR、序列间特异性PCR、反向PCR、连接介导的PCR、甲基化特异性PCR、微型引物PCR、嵌套PCR、重叠延伸PCR、实时PCR、逆转录PCR、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR。
如本文使用的，术语“引物”指起始模板依赖性核酸合成的寡核苷酸。在核酸模板、核苷三磷酸前体、聚合酶和辅因子的存在下，在合适的温度和pH条件下，引物可以通过经由聚合酶添加核苷酸在其3'末端处延伸，以产生引物延伸产物。引物可以在长度中改变，取决于采用的特定条件和扩增目的。例如，用于诊断目的的扩增的引物通常长度为约15至约35个核苷酸。引物必须与所需模板具有足够的互补性，以引发所需延伸产物的合成。换言之，引物必须能够与所需模板链退火，其方式足以提供以适当并列的引物的3'羟基基团，用于起始通过聚合酶的合成。引物不一定是所需模板的确切互补体。例如，非互补的核苷酸序列可以存在于在其他方面互补的引物的5'末端处。可替代地，非互补的碱基可以插入寡核苷酸引物内，条件是引物序列与所需模板链的序列具有足够的互补性，以提供用于合成延伸产物的模板-引物复合物。
如本文使用的，术语“特异性杂交”指给定核酸例如引物或可检测寡核苷酸与另一核酸特异性结合的能力。
术语“严格的”或“序列特异性的”杂交条件指在其下确切互补的核酸链优先杂交的条件。严格杂交条件是本领域众所周知的。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将不同。一般地，严格条件选择为比在限定的pH和离子强度的条件下特定序列的热解链温度（Tm）低约5℃，在所述Tm下50%的碱基对解离。
术语“基本上互补”指除了较小错配区之外互补的序列。通常，长度为约15个核苷酸的核酸中的错配总数目为约3个核苷酸或更少。
术语“靶序列”和“靶区域”指待检测、或待检测且分析，并且包含目的多态性位点的核酸区域，即作为在本公开内容的背景下的一个实例的mS9。
术语“结肠直肠癌”和“结肠癌”在本文中可互换使用，以指结肠（包括直肠）的任何癌性瘤形成，如由美国癌症协会（American Cancer Association）、美国医学协会（American Medical Association）或本领域普通技术人员已知的其他医疗机构认可的。
术语“甲基化状态（methylation state）”或“甲基化状态（methylation status）”指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处的5-甲基胞嘧啶（"5-mCyt"）的存在或不存在。在DNA序列内的一个或多个特定CpG甲基化位点（各自具有两个CpG二核苷酸序列）处的甲基化状态包括“未甲基化的”、“完全甲基化的”和“半甲基化的”。
术语“半甲基化（hemi-methylation）”或“半甲基化（hemimethylation）”指其中仅一条链是甲基化的双链DNA的甲基化状态。
术语“高甲基化”指相对于在正常对照DNA样品的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt量，对应于在测试DNA样品的DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处增加的5-mCyt的存在的平均甲基化状态。
术语“低甲基化”指相对于在正常对照DNA样品的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt量，对应于在测试DNA样品的DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处减少的5-mCyt的存在的平均甲基化状态。
DNA甲基化
DNA甲基化是首个发现的表观遗传标志。表观遗传学研究通过除基本DNA序列中的变化外的机制引起的基因表达或细胞表型中的变化。甲基化占优势地涉及对二核苷酸CpG 的胞嘧啶残基的碳-5位置添加甲基，并且与转录活性的阻遏或抑制相关。
DNA甲基化可以以两种方式影响基因转录。首先，DNA自身的甲基化可以物理上阻碍转录蛋白质与基因的结合，并且其次且可能更重要的是，甲基化的DNA可以通过称为甲基CpG结合结构域蛋白质（MBD）的蛋白质结合。MBD蛋白质随后将另外的蛋白质召募至基因座，例如组蛋白脱乙酰基酶及其他可以修饰组蛋白的染色质重建蛋白质，从而形成称为异染色质的致密失活染色质。DNA甲基化和染色质结构之间的这种联系非常重要。特别地，甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）的丧失已牵涉Rett综合征；并且甲基CpG结合结构域蛋白质2（MBD2）介导癌症中的高甲基化基因的转录沉默。
DNA甲基化是基因转录的重要调节物，并且大量证据已证实在其启动子区中具有高水平的5-甲基胞嘧啶的基因是转录沉默的，并且DNA甲基化在长期基因沉默后逐渐累积。DNA甲基化是胚胎发育期间必需的，并且在体细胞中，DNA甲基化模式一般以高保真度传递给子细胞。异常DNA甲基化模式 - 与正常组织相比较的高甲基化和低甲基化 - 已与大量人恶性肿瘤相关。参见Veersteeg, R. 1997. Aberrant methylation in cancer. American Journal of Human Genetics. 60:751-754。高甲基化通常在启动子区中的CpG岛处发生，并且与基因失活相关。总体低甲基化已也牵涉通过不同机制的癌症发生和进展中。
甲基化的DNA的检测因此可以用于诊断某些癌症，并且潜在地用于跟踪治疗功效。
其中重亚硫酸盐测序已证明有用的一个癌症实例是用于筛选结肠直肠癌，其中甲基化的Septin 9（mS9）的检测用作生物标志物。用于重亚硫酸盐转化的其他靶序列实例是食道鳞状细胞癌（Baba等人，Surg. Today, 2013, Jan 5 ePub）、乳腺癌（Dagdemir等人，In vivo, 2013, 27（1）:1-9）、前列腺癌（Willard和Koochekpour, Am. J.. Cancer Res. 2012, 2（6）:620-657, ePub Nov 20, 2012）、非何杰金淋巴瘤（Yin等人，Front Genet, 2012, 3:233, ePub Nov 8, 2012）、口腔癌（Gasche和Goel, Future Onocol, 2012,8（11）:1407-1425）等。本领域普通技术人员应当理解，本发明的方法可应用于且容易地适合于这些及其他癌症的改进检测，所述其他癌症已知至少部分通过靶基因序列的高甲基化或低甲基化体现。同样地，伴随本发明的方法的应用，本领域技术人员已知的其他医学状况（其中高甲基化和/或低甲基化是已知病因学的一部分）将具有改进的检测。
Septin 9
Septin是在真核生物中发现的一组高度保守的GTP结合蛋白。尽管本发明并不受理论限制，但人细胞中的最近研究提示septin构建在细菌病原体周围的‘笼’，固定有害微生物且阻止其侵入其他健康细胞。Septin-9是在人中由SEPT9基因编码的蛋白质。与正常结肠粘膜相比较，SEPT9启动子的v2区已显示在结肠直肠癌组织中是甲基化的。www.transatlantic-symposium.de/content/_docs/doc1241003872263.pdf。使用高度灵敏的实时PCR测定，在结肠直肠癌患者的血液中检测到甲基化的SEPT9。癌症样品中的这种交替甲基化模式提示与正常组织样品相比较，基因的异常活化或阻遏。Grutzmann, Robert等人，（2008年11月）. Najbauer, Joseph.编辑"Sensitive Detection of Colorectal Cancer in Peripheral Blood by Septin 9 DNA Methylation Assay". PLoS ONE 3（11）: 1–8；deVos T等人，（2009）. "Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer". Clin Chem. 55（7）: 1337–1346。基于PCR的商业测试目前可用于筛选SEPT9高甲基化的患者（ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT）。然而，这些测试具有如上文就灵敏度和特异性而言所述的局限性。
结肠直肠癌
结肠瘤形成或结肠直肠癌是位于结肠中或来源于结肠的任何癌性或癌前期生长。结肠是肠道的一部分，长度大致三英尺，从小肠端伸展到直肠。在横截面中察看，结肠由以在称为腔的内部空间周围的同心环排列的四个可区分层组成，消化的材料穿过所述腔。按从腔向外的次序，层被称为粘膜、粘膜下层、固有肌层和浆膜下层。粘膜包括上皮层（与腔邻近的细胞）、基膜、固有层和粘膜肌层。一般而言，结肠的“壁”意指粘膜下层和粘膜下层外的层。“衬里(lining)”是粘膜。
癌前期结肠瘤形成被称为腺瘤或腺瘤性息肉。腺瘤通常是在结肠衬里上的小蘑菇样或疣样生长物，并且不侵入结肠壁内。腺瘤可以通过诸如结肠镜或柔性乙状结肠镜的装置进行显现。几项研究已显示经历腺瘤筛选和摘除的患者具有减少的结肠癌死亡率。为此及其他原因，一般公认腺瘤是绝大多数结肠癌的专性前体。当结肠瘤形成侵入结肠的基膜内时，它视为结肠癌，如术语“结肠癌”在本文中使用的。与所有癌症一样，结肠癌以1 – 4的编号系统分级，其中更高的数目指示更晚期的疾病。
重亚硫酸盐转化
在本文中，除非另有说明，否则术语“重亚硫酸盐转化”、“重亚硫酸盐测序”和“重亚硫酸盐处理”是同义的。
重亚硫酸盐转化是使用重亚硫酸盐试剂处理DNA，以测定其甲基化模式。用重亚硫酸盐处理DNA将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但留下5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此，重亚硫酸盐处理在DNA序列中引入特异性变化，其取决于各个胞嘧啶残基的甲基化状态。可以对改变的序列进行多种分析，以获得该信息。该分析的目的因此是区别产生于重亚硫酸盐转化的单核苷酸多态性（SNP）。美国专利号7,620,386和美国专利申请公开2006/0134643两者均通过引用并入本文，举例说明了就检测由于重亚硫酸盐转化而改变的序列而言本领域普通技术人员已知的方法。进一步地，由Grunau等人公开的工作提供了就重亚硫酸盐转化和检测由于转化而改变的残基的方法而言，本领域普通技术人员已知的方法的另外范例。另外，Paul C.L.和Clark, S.J.（1996）Cytosine methylation: quantitation by automated genomic sequencing and GENESCAN™ analysis. Biotechniques, 21, 126–133；Gonzalgo M.L.和Jones, P.A.（1997）Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension（Ms-SNuPE）. Nucleic Acids Res., 25, 2529–2531；Herman J.G.等人（1996）Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 9821–9826，均提供了在本发明时，就重亚硫酸盐转化和检测由于转化而改变的残基而言，本领域普通技术人员具有的知识的进一步范例。
几种方法是本领域普通技术人员已知的，如下述综述论文中例示的。Fraga MF, Esteller M（2002年9月）. "DNA methylation: a profile of methods and applications". BioTechniques 33（3）: 632, 634, 636–49；El-Maarri O（2003）. "Methods: DNA methylation". Adv. Exp. Med. Biol. Advances in Experimental Medicine and Biology 544: 197–204；Laird PW（2003年4月）. "The power and the promise of DNA methylation markers". Nat. Rev. Cancer 3（4）: 253–66；Frommer M, McDonald LE, Millar DS等人（1992年3月）. "A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89（5）: 1827–31；Fürst, RW等人，A Differentially Methylated Single Cpg-Site Is Correlated With Estrogen Receptor Alpha Transcription. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012 May, 130（1-2）:96-104, Epub 2012 Feb 10。
用于检测核酸的重亚硫酸盐处理的示例性方法包括引物对（正向和反向）的使用。通过包括仅互补未转化的5-甲基胞嘧啶的序列，引物对自身设计为“甲基化特异性的”，或相反，通过包括互补由未甲基化的胞嘧啶转化的胸腺嘧啶的序列，引物对自身设计为“未甲基化特异性的”。甲基化通过特异性引物实现扩增的能力进行测定。
使用扩增的DNA的进一步方法分析使用解链曲线分析的产物。该方法以甲基化特异性和未甲基化特异性的引物扩增重亚硫酸盐转化的DNA，并且通过比较在解链曲线分析中生成的差异峰，来测定两种产物的定量比。高分辨率解链分析方法是本领域普通技术人员已知的，其使用实时定量和解链分析，特别用于低水平甲基化的灵敏检测。
重亚硫酸盐反应可以根据标准技术进行。例如和简言之，大约1微克基因组DNA（当使用显微解剖的DNA样本时，DNA的量可以更少）在45℃下用2N NaOH变性15分钟，随后在55℃下与0.1M氢醌和3.6M重亚硫酸钠（pH 5.0）一起温育12小时（适当范围为4-12小时）。随后使用标准（商购可得的）DNA小量制备柱，从反应混合物中纯化DNA，或用于DNA纯化的其他标准技术也是合适的。将纯化的DNA样品重悬浮于55微升的水中，并且加入5微升3N NaOH用于脱磺酸基反应，优选在40℃下进行5 -10分钟。在重悬浮于适当体积的水中且扩增之前，DNA样品随后进行乙醇沉淀且洗涤。
重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而对甲基化的胞嘧啶没有影响。该信息与表达研究结合是有用的，但转化对下游分析和诊断测试具有不利影响。例如，重亚硫酸盐转化破坏核酸的两条链之间的互补性。当现有技术方法提供第一链（例如有义链）的引物时，这导致阻止现在非互补的核酸链的扩增，因为靶序列在样品制备和分析或诊断测试期间作为两条分开的单链DNA存在。另外，靶核酸序列通常还以极低浓度存在，恶化这个问题。
通过提供用于靶核酸的增强检测的试剂和方法，本发明涉及用于重亚硫酸盐转化后的靶核酸的增强检测的试剂和方法。本发明的测定设计策略是确保由于通过重亚硫酸盐处理引起的化学转化而形成的两条核酸链均充当分析测试的靶（参见图3）。在这点上，提供了用于靶核酸的两条链的引物，确保两条链的扩增，且使生成的扩增核酸和/或生成的信号有效倍增。此外，本发明确保极低浓度的核酸的检测通过靶向在未甲基化的胞嘧啶至尿嘧啶转化后的两条链得到改进。呈现的试剂和方法提供了极大增强的靶检测，与现有技术常用的单链检测方法相反（参见图2）。图2和3示意性证实本发明超过现有技术方法的优点。通过提供例如引物muO2 FP/comp FP完全(full)和mu02 RP/comp RP近(near)加上muO1 RP和mu01-C FP，扩增重亚硫酸盐转化的靶核酸的两条链。图2和3中的阻断剂序列确保不发生未甲基化的链（uO1和uO2-C）的显著扩增。
核酸由其分离的样品可以来自任何合适的生物来源。例如，样品可以来源于体液（包括血液、血清和血浆）以及组织、痰、粪便、尿和脑脊液。进一步地，样品可以是保存的样本。
PCR
靶序列用本领域已知的技术进行扩增。选择的技术是聚合酶链反应（PCR）。PCR扩增可以通过标准PCR技术进行，遵循制造商的说明书。Abbott m2000系统是基于来自用户的输入自动化PCR反应的装置（Abbott, Abbott Park, Il）。
扩增反应可以包含且优选的确包含内部对照（IC）核酸和用于扩增IC核酸的一对引物。当扩增反应包含IC核酸时，促进扩增的条件也促进IC核酸的扩增。任何合适的序列均可用作IC。IC靶序列的实例包括下文范例部分中使用的那些。
任何合适的组织或体液样品均可用作核酸即DNA或RNA样品来源。通常，来源是来自转移部位或血液（或其组分）的肿瘤或细胞/组织。例如，可以使用血液、血浆、血清、淋巴和肿瘤活检样品。其他样品包括尿、脑脊液、胸膜液、痰、腹膜液、膀胱洗出液、分泌物（例如乳腺(breast)）、口腔洗出液、触摸制剂和细针抽吸物。例如，通过添加螯合剂例如乙二胺四乙酸（EDTA）或其盐例如二钠盐或钙二钠盐，可以保存血浆或全血。蛋白酶例如蛋白酶K可以加入样品中，以消化不需要的蛋白质。
组织样品一般可以作为福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的块进行保存。由此类组织块切割不同厚度例如5 µm的组织切片，并且或不固定或通过标准手段固定到固体支持物例如载玻片上。使用多种固定剂和/或染剂揭示组织样品的细胞形态，并且用显微镜显现。如果组织样品中的细胞例如癌细胞例如黑素瘤细胞的密度是足够的（大于约1%），则从载玻片上刮取切片，并且可以直接由总组织样品提取DNA，而无需进一步纯化。可替代地，如果组织样品中的细胞例如癌细胞例如黑素瘤细胞的密度低（小于约1%），则可以进行就黑素瘤细胞富集组织样品的另外操作。还可以从新鲜/冷冻组织、细针抽吸物或外周血中分离DNA。
样品可以使用如本领域已知的任何合适方法制备用于测定。希望地，该方法提取且浓缩核酸。该方法还希望地制备对于扩增可接近的靶序列，且从提取物中去除潜在的扩增抑制剂。
使用例如来自Qiagen Inc.（Valencia, CA）的DNeasy DNA分离试剂盒、QIAamp DNA血液试剂盒或PAXgene血液DNA试剂盒，或本领域普通技术人员已知的其他方法，可以从外周血中分离DNA。来自其他组织样品的DNA还可以使用DNeasy DNA分离试剂盒来获得。还可以使用任何其他DNA提取和纯化技术，包括范围从苯酚-氯仿提取到自动化磁珠核酸捕获系统的液-液和固相技术。RNA可以进行分离且逆转录，并且可以扩增所得到的cDNA（例如如美国专利号5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864；和5,693,517中所述的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR））。
一旦已获得核酸，它就可以与引物接触，其导致突变体序列的特异性扩增，如果突变体序列存在于样品中。“特异性扩增”意指引物扩增特异性突变体序列，而不是其他突变体序列或野生型序列。参见例如PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification（Erlich, 编辑, Freeman Press, NY（1992））；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innis等人，编辑, Academic Press, San Diego, CA（1990））；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel, 1994-1999, 包括经2004年4月的补充更新）；和Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrook & Russell, 第3版，2001）。基于等位基因特异性扩增的方法或基于延伸的方法在国际专利申请公开号WO 93/22456以及美国专利号4,851,331；5,137,806；5,595,890；和5,639,611中描述，所有所述专利均关于这点的教导明确地通过引用并入本文。虽然可以使用诸如连接酶链反应、链置换测定和各种基于转录的扩增方法的方法（参见例如由Abramson和Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47（1993））的综述），但PCR特别是采用夹例如PNA夹的PCR是优选的。
多重等位基因特异性引物，例如多重突变体等位基因或野生型和突变体等位基因的各种组合，可以同时用于单一扩增反应中。扩增产物可以通过不同标记或大小进行区分（例如使用凝胶电泳）。
引物可以用标记进行可检测标记，所述标记可以通过例如光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段进行检测（参见例如Sambrook等人）。有用的标记包括染料例如荧光染料，放射性标记例如32P，电子致密试剂，酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶，生物素，或对于其可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。
可检测寡核苷酸可以例如用荧光素简单地进行标记。在这点上，如果引物用染料进行标记，并且可检测寡核苷酸用荧光素进行标记，并且设计为与染料相反的新生链结合，则可以发生跨越DNA螺旋的荧光共振能量转移（FRET）。其他可检测寡核苷酸包括分子探针、TAQMAN®探针、单链DNA探针、双链DNA探针等。
核酸扩增试剂包括具有聚合酶活性的酶（例如AmpliTaq Gold®）、一种或多种酶辅因子（例如MgCl2）和脱氧核苷酸三磷酸（dNTP；例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP）。
促进扩增的条件是促进引物退火和核酸序列延伸的那些条件。退火取决于各种参数，例如温度、离子强度、待扩增序列的长度、互补性和待扩增序列的G:C含量。例如，降低温度促进互补核酸序列的退火。高G:C含量和更长的长度稳定双链体形成。一般地，约30 bp或更少且具有高G:C含量的引物和可检测寡核苷酸良好工作。优选的扩增条件、引物和可检测寡核苷酸在本文中例示。
通过将反应混合物热循环约10至约100次，例如约20至约75次，例如约25至约50次，扩增可以重复任何合适的次数。
一旦扩增反应完成，就可以使用任何合适的方法检测扩增产物的存在。此类方法包括但不限于本领域已知的那些，例如含和不含荧光染料的凝胶电泳（取决于产物是否由染料标记的引物扩增），具有嵌入染料的解链曲线图（参见例如Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, 编辑, W. H. Freeman and Co., New York, 1992, 第7章），以及与内部可检测寡核苷酸杂交。其他方法的实例包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、电化学发光、反向斑点印迹、高压液相层析（HPLC）（参见例如Lazar, Genome Res. 4: S1-S14（1994）），并且还可以使用单链PCR产物的单链构象多态性分析（参见例如Orita等人，PNAS USA 86: 2766-2770（1989））。
扩增的核酸可以通过监控反应混合物中的双链DNA（dsDNA）总量中的增加进行检测（参见例如美国专利号5,994,056以及欧洲专利公开号487,218和512,334）。使用DNA结合染料例如SYBR Green。染料当与dsDNA结合时发荧光，并且荧光中的增加用于测定dsDNA中的增加。
基于双脱氧测序的方法和寡核苷酸长度产物的PyrosequencingTM也可以用于检测扩增的核酸。另一种测序方法由Kobayashi等人，Mol. Cell. Detectable oligonucleotides 9: 175-182（1995））描述。
当使用（issued）PCR时，检测可以在扩增完成后发生，例如在扩增期间使用标记的引物后，通过使用标记的引物作为扩增后的可检测寡核苷酸，或通过使用在序列中不同于引物的可检测寡核苷酸，在扩增后与扩增的靶序列杂交。标记的扩增产物随后可以通过其他手段进行分离且检测。
可替代地，扩增和检测可以组合到实时PCR测定中。当使用实时PCR时，混合物可以进一步包含核酸检测试剂，例如嵌入任何双链DNA的非特异性荧光染料，例如或序列特异性DNA可检测寡核苷酸，其允许仅在可检测寡核苷酸与其互补DNA靶杂交后的检测，从而实现同时扩增和检测。当可检测寡核苷酸在扩增期间存在于混合物中时，可检测寡核苷酸在促进扩增的条件下应是稳定的，不应干扰扩增，在扩增条件下应与其靶序列结合，并且仅在结合其靶序列后发出信号。在这点上特别适当的可检测寡核苷酸的实例包括分子信标可检测寡核苷酸、TAQMAN®可检测寡核苷酸、和线性可检测寡核苷酸，例如由Abravaya等人（美国专利申请公开号2005/0227257）描述的那些。可检测寡核苷酸可以单独或与分子信标的茎区的一部分进一步组合形成环区。可检测寡核苷酸还可以用作线性可检测寡核苷酸，其在一端上具有荧光团（例如FAM）和在另一端上具有高效猝灭剂，例如Black Hole Quencher（BHQ®；BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA）。
仅用于范例，大约1-2微升的重亚硫酸盐处理的DNA可以用作目的区中的链特异性PCR扩增的模板。在用于扩增靶sM9序列的部分的PCR反应概况中，例如，程序具有94℃3分钟的初始变性，随后为94℃30秒、68℃30秒、72℃30秒的循环，总计30个循环。PCR反应可以在25微升体积中在下述条件下进行：约50 ng重亚硫酸盐转化的DNA（对于显微解剖的样品更少）、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl、0.1%明胶/ml、100 µM每种dNTP、0.5 µM最终浓度的每种引物和1单位的Taq聚合酶。存在可以用于分离PCR扩增产物的许多层析技术。在一个举例说明性程序中，将大约10-25微升的扩增PCR产物装载到2%琼脂糖凝胶上且进行电泳。使用标准凝胶纯化程序来显现且分离条带。
试剂盒
考虑了包含本文描述的组合物或基于本文描述的本发明制备的组合物的试剂盒。此类试剂盒可以包括如就任何特异性靶核苷酸序列而言进行本发明所需的特异性引物、探针和阻断剂。进一步地，此类试剂盒考虑为具有如进行本发明所需的说明书、小瓶、溶液、标志物等，或列出任何所需项。本发明的试剂盒可以包括下文中范例部分中详述的引物、探针、阻断剂及其他序列中的任何和全部。然而，本发明的试剂盒并不限于这些序列，因为基于本说明书的教导，本领域普通技术人员可以测定检测靶高甲基化和低甲基化的序列所需的序列。
在这点上，试剂盒可以含有用于贮存组织或体液样品的容器或样品小瓶。引物例如引物对，具体为用于待检测的两条链的正向引物和反向引物，可以以有效允许检测突变体序列的量在组合物中。使用本文描述或本领域普通技术人员已知用于检测样品中的特定核酸分子的任何方法，来实现突变体序列的检测。试剂盒还可以包含缓冲液、核苷酸碱基及其他待用于杂交和/或扩增反应中的组合物。
试剂盒可以进一步包含dNTP。优选地，dNTP在具有参考染料的缓冲溶液中供应。
引物、可检测寡核苷酸和dNTP可以以不同配置包装。优选地，引物、可检测寡核苷酸和dNTP在单一容器中。容器优选还含有防腐剂，例如叠氮化钠和/或ProClin® 950。
试剂盒可以进一步包含DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶以及前述中的两种或更多种的混合物。可以使用任何合适的DNA聚合酶。优选的DNA聚合酶的实例是AmpliTaq Gold®（Life Technologies Corp., Carlsbad, CA）。同样地，可以使用任何合适的RNA聚合酶。优选的逆转录酶-DNA聚合酶的实例是rTth。聚合酶可以在缓冲溶液中供应，所述缓冲溶液任选含有且优选的确含有稳定剂。
试剂盒可以进一步包含在缓冲溶液中的活化试剂，例如氯化镁。缓冲溶液优选包括防腐剂，例如叠氮化钠和/或ProClin® 950。
试剂盒可以任选进一步包含IC。IC是证实过程已对于每种样品正确进行的无关DNA序列。任何合适的序列均可用作IC。IC靶序列的实例包括本文实施例中所示的那些。靶特异性可检测寡核苷酸和IC特异性可检测寡核苷酸不同地标记，使得可以区分靶DNA和IC DNA。用于IC特异性可检测寡核苷酸的标记的实例是Cy5。优选地，标记Cy5与猝灭剂BHQ-2组合使用。
说明书中提及的所有专利、专利申请公开、期刊论文、教科书及其他出版物指示公开内容所属领域的技术人员的技术水平。所有此类出版物均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物明确且单独地指出通过引用并入相同。
本文举例说明性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何要素或局限性的情况下进行实践。因此，例如，任何术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”在本文中的每种情况可以用另外两个术语中的任一替换。同样地，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数参考。因此，例如提及“方法”包括一种或多种类型的方法和/或步骤，其在本文中得到描述和/或在阅读公开内容后，对于本领域普通技术人员变得显而易见。
已采用的术语和表达用作描述性而不是限制性术语。在这点上，当某些术语在本文中限定，并且在“详述”中其他地方或本说明书其他地方在其他方面定义、描述或讨论时，所有此类定义、描述和讨论预期归于此类术语。也不存在此类术语和表达的使用排除所示且所述特点或其部分的任何等价物的意图。
认识到多种修饰在本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已在优选实施方案和任选特点的背景下具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化。此类修改和变化视为在如由所附权利要求限定的本发明范围内。
范例
实施例1
本实施例提供了本发明就引物、探针及其他寡核苷酸例如阻断剂用于靶核苷酸序列的改进检测而言的支持，所述靶核苷酸序列是重亚硫酸盐转化程序的主题。
图1显示了在重亚硫酸盐处理前和后的原始和互补序列的序列。两条链的互补性在处理后丧失。粗体有下划线的“C”是甲基化的胞嘧啶。
如本领域已知的目前的mS9寡核苷酸引物(oligo primer)显示于下表1中。
表1 - 目前的mS9寡核苷酸(oligo)设计在下表中详述（参见例如Warren等人，BMC Medicine, 2011, 9:133.）
注：Tm使用Vector NTI软件进行计算。非核酸标记在Tm计算中不予以考虑。正向引物序列中的“X”指示无碱基位点。
用于与上表1（原始）中相同的DNA链的新设计在下表2中详述。
表2
注：2种PNA阻断剂的Tm根据Nucleic Acids Symp Ser（Oxf）. 2004；（48）:131-2进行计算。
mS9测定程序中的重亚硫酸盐转化的一个后果是原始靶的双链构象由于序列互补性的丧失而被破坏。靶序列在样品制备和分析测试期间作为两条分开的单链DNA存在。进一步地，循环mS9序列也可以以极低浓度存在。与本领域的公认实践相反，认为测定检测由于重亚硫酸盐处理的两条DNA链（原始和互补链）将是有利的。这将改善测定灵敏度。该范例中的互补链的新设计在下表3中给出。
表3
注：对于comp FP完全，原始序列中的“T”替换为5-丙炔基dU（"u"）。原始Tm为54.2（使用vector NTI和如上所述的假定）。每个T-->u修饰使Tm增加1.7摄氏度（根据http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR17-12.html）。
注：关于2种PNA阻断剂的Tm根据Nucleic Acids Symp Ser（Oxf）. 2004；（48）:131-2进行计算。
注：关于MGB阻断剂的Tm使用Primer Express 2.0进行计算。
通过本领域技术人员已知的方法，对靶mS9序列实施重亚硫酸盐处理。使用上文给出的探针对所得到的转化序列实施PCR。对照使用如本领域标准的用于检测一条链的探针。实验结果在下文给出。
下表4中呈现的数据显示其中检测重亚硫酸盐转化的mS9靶核苷酸序列的两条链的本发明方法，导致相对于现有技术方法的极大改进的靶序列检测，所述现有技术方法仅检测重亚硫酸盐转化的mS9靶核苷酸序列的单链。
表4
PCR复制物的检测%
检测单链 200/447 = 45%
检测两条链 258/445 = 58%

Claims (10)

1.一种检测用重亚硫酸盐试剂处理的包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基的核苷酸序列的方法，其包括：
a. 提供i）怀疑包含靶核酸的样品，ii）对于重亚硫酸盐转化的核酸有义链特异性的一种或多种引物，iii）对于重亚硫酸盐转化的核酸反义链特异性的一种或多种引物；
b. 扩增所述样品中存在的任何靶核酸的有义链和反义链两者；和
c. 检测任何经扩增的核酸。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸来源于体液。
3.权利要求2的方法，其中所述体液是血清或血浆。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸来源于组织、痰、粪便、尿或脑脊液。
5.权利要求1的方法，其中所述样品怀疑包含mS9。
6.权利要求1的方法，其中所述样品得自筛选结肠直肠癌的主体。
7.权利要求1的方法，其中所述样品得自怀疑患有结肠直肠癌的主体。
8.权利要求1的方法，其中所述样品得自对结肠直肠癌进行治疗的主体。
9.权利要求8的方法，其中所述样品中的任何经扩增的核酸的所述检测与先前取自相同主体的一种或多种样品相比较。
10.一种组合物，其包含选自[SEQ ID NO: 10]、[SEQ ID NO: 11]和[SEQ ID NO: 12]的一种或多种引物。
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