CN107012212A - 基于无细胞dna的癌症早期诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
基于无细胞dna的癌症早期诊断试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于无细胞DNA的癌症早期诊断试剂盒及其应用，属于医药生物检测领域。其包括具有提高人体免疫力的化合物或组合物以及定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂。所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物包括但不限于：树突细胞疫苗、免疫检查点抑制剂、具有提高人体内CD4+和CD8+T细胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增强作用的中药。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于无细胞DNA的癌症早期诊断试剂盒及其应用，属于医药生物检测领域。
背景技术
无细胞DNA又称循环DNA，是指一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中。随着生物技术的发展，肿瘤临床的早期诊断、鉴别诊断、有效观察及预后检测越来越受益于肿瘤分子标记的发现及其检测方法的完善。目前认为无细胞DNA是一种无侵袭性的潜在用途较大的肿瘤标志物。
目前关于无细胞DNA产生的生物学机制尚无定论，但是目前认为无细胞DNA可能来源于细胞凋亡或坏死后释放的DNA片段，这些片段通过毛细血管壁或淋巴管管壁渗透到血循环中；也可能来源于有核细胞裂解释放的DNA片段，外周血中存在结构完整的肿瘤细胞，肿瘤细胞裂解后产生的DNA片段占游离DNA片段的大部分。研究表明各种肿瘤患者体内的循环血中均存在肿瘤细胞，但这些细胞不是转移的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞在外周血中在吞噬细胞的作用下裂解释放出DNA片段，即无细胞DNA。
无细胞DNA检测包括：突变位点检测、常甲基化检测以及杂合性缺失检测等，但是这些检测均需要较为复杂的分子生物学手段才能获得结果，并且这些结果准确度较差。一般来讲，直接定量人体体液中无细胞DNA是一种较好的检测手段，但是由于无细胞DNA以低浓度(0.2至200ng/ml)存在于血清、血浆和其它体液(即尿、腹水等)且高度降解(Wang等，2003，Cancer Res.，63(14)：3966-8)，因此本领域中很难通过常规手段直接定量无细胞DNA而获得相关检测结果，尤其是对于患有早期癌症的患者来说，目前的检测手段很难通过定量无细胞DNA将正常个体与患有早期癌症的患者区别开。
发明内容
出人意料的是，本发明发现当对人体施用一定量的化合物或组合物后，患有早期肿瘤的患者体液中源于肿瘤的无细胞DNA含量会急剧升高，而正常个体的无细胞DNA含量却无明显变化。
本发明的目的之一是提供一种基于无细胞DNA定量检测的癌症早期诊断试剂盒，其包括具有提高人体免疫力的化合物或组合物以及定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂。
在一个实施方案中，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物包括但不限于：树突细胞疫苗、免疫检查点抑制剂、具有提高人体内CD4+和CD8+T细胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增强作用的中药。进一步地，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物为免疫检查点抑制剂。
在另一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、PD1阻断剂、抗PD1抗体、LAG-3抑制剂、PD-L1阻断剂、抗PD-L1抗体、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂和/或TIM3抑制剂。
在一个具体地实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(MDX-D010)；所述PD1阻断剂是尼沃鲁单抗(nivolumab)、兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)、CT-011和/或AMP-224；PD-L1阻断剂是BMS-936559；所述LAG-3抑制剂是IMP321；所述B7-H3抑制剂是MGA271。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是一种下调T细胞活化路径的免疫检查点蛋白(Fong等人,Cancer Res.69(2):609-615,2009；Weber Cancer Immunol.Immunother,58:823-830,2009)。经显示，阻断CTLA-4可增进T细胞活化和增殖。CTLA-4抑制剂包括抗CTLA-4抗体。抗CTLA-4抗体结合到CTLA-4并且阻断CTLA-4与它在抗原呈递细胞上表达的配体CD80/CD86的相互作用，并由此阻断由这些分子相互作用引起的免疫反应的负面下调。抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号：5811097、5811097、5855887、6051227、6207157、6682736、6984720及7605238中。一种抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(替西木单抗(ticilimumab)，CP-675206)。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(又称10D1，MDX-D010)，一种结合到CTLA-4的完全人类单克隆IgG抗体。伊匹单抗是以YervoyTM的名称销售并且已经被批准用于治疗无法切除或转移性黑色素瘤。
另一种免疫检查点蛋白是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)。PD1在针对感染的发炎性反应时限制周围组织中的T细胞活性，并且为了限制自体免疫性，体外PD1阻断响应于特异性抗原靶或混合淋巴细胞反应中的异体细胞的攻击而增进T细胞增殖和细胞激素产生。在PD1阻断情况下，PD1表达与反应之间显示出强相关性(Pardoll,Nature Reviews Cancer,12:252-264,2012)。PD1阻断可以通过多种机制实现，包括了结合PD1或其配体PDL1的抗体。PD1和PDL1阻断剂的实例描述于以下各案中：美国专利号7488802、7943743、8008449、8168757、8217149；以及PCT公开的专利申请号WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400及WO2011161699。在某些实施方案中，PD1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在某些其它实施方案中，PD1阻断剂包括抗PD1抗体及类似结合蛋白，如尼沃鲁单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO4538)，一种结合PD-1并通过其配体PD-L1和PD-L2阻断PD-1活化的完全人IgG4抗体；兰伯丽珠单抗(MK-3475或SCH 900475)，一种针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，一种结合PD1的人源化抗体；AMP-224，一种B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于阻断PD-L1(B7-H1)的BMS-936559(MDX-1105-01)；以及阿特朱单抗(atezolizumab)。
其它免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂，如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone等,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。其它免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，如B7-H3和B7-H4抑制剂。确切地说，抗B7-H3抗体MGA271(Loo等人,2012,Clin.Cancer Res.(18)3834)。还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等,2010,J.Exp.Med.207:2175-86；及Sakuishi等,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。
在本发明试剂盒中，所述免疫检查点抑制剂是以包含一种或多种其它组分(如生理上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂)的组合物形式施用。这些组合物可以包含一种或多种物质，这些物质选自由以下各物组成的组：缓冲剂；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽(如具有少于10个氨基酸的那些)；蛋白质；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合剂，如EDTA；谷胱甘肽；稳定剂；及赋形剂。中性缓冲生理盐水或混有特定血清白蛋白的生理盐水是适当稀释剂的实例。根据适当工业标准，还可以添加防腐剂，如苯甲醇。所述组合物可以使用适当赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂配制成冻干产物形式。适合的组分在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是在20mM Tris HC1、0.1M氯化钠、0.1％w/v的甘露糖醇、0.1mM三胺五乙酸、0.01％w/v的聚山梨醇酯80(pH 7.0)中以5mg/ml配制的伊匹单抗。
在又一个实施方案中，所述具有免疫激活或免疫增强作用的中药选自人参、黄芪、熟地黄、醋龟甲、女贞子、红景天、薏苡仁、桑椹、栀子、三七、灵芝、枸杞子、灵芝、猴头菇、竹荪、香菇、玄参、党参、丹参、决明子、银杏以及决明子中一种或多种。
在本发明中，所述定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂包括提取以及纯化人体体液无细胞DNA的试剂以及用于精确定量DNA的试剂。例如，市售的用于提取纯化人体体液的无细胞DNA试剂盒QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN USA)，以及用于精确定量DNA浓度的picogreen。
所述试剂盒的检测方法如下：
(1)给受试者施用具有提高人体免疫力的化合物或组合物；
(2)抽取受试者血清或血浆，离心制备无细胞血清或血浆，提取其中的无细胞DNA；
(3)测定无细胞DNA的浓度。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
术语“抗体”包括提到的任何同型或子类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白，或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区，包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物、抗体偶联物、单链抗体、抗体衍生物、抗体类似物及其对应的片段。还包括抗体的免疫片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv)，不管此类抗体是经由免疫法，通过重组技术，借助于体外合成手段还是其它方法整体或部分产生的。因此，如本文中所使用，术语“抗体”包括那些通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体在内，如(a)从关于人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)或由人免疫球蛋白基因制备的杂交瘤分离的抗体；(b)从被转染以表达抗体的宿主细胞(例如由转染瘤(transfectoma))分离的抗体；(c)从重组的组合抗体库分离的抗体；及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些抗体具有源自于两个不同动物种类的生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这些抗体可以经历体外诱变(或，当使用关于人免疫球蛋白序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，并因此，这些抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是尽管源自于特定物种(例如人类)的生殖系VH和VL序列并且与之相关，但可能并非在体内天然存在于所述物种的抗体生殖系谱系内的序列。除非另作指示，否则术语“抗体”除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段及突变蛋白。在一些情形中，“抗体”可包括较少链，如在骆驼中天然存在的可能仅包含重链的抗体。
术语“患者”或“受试者”可互换使用，并且意思指哺乳动物，包括但不限于，人类或非人类哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊或猫。优选地，患者是人类。
实施例1受试者体液无细胞DNA的提取及DNA定量
随机从医院收取200例早期癌症患者血液样本和100例正常人的血清样本，在200例早期癌症患者中，其中肺癌患者27例、白血病患者32例、卵巢癌患者25例、子宫癌患者21例、胰腺癌患者33例、胃癌患者35例和肝癌患者27例。在给药前分别抽取200例患者和100例正常人的血液样本，然后静脉注射方式给予200例患者和50例正常人阿特朱单抗(atezolizumab，Genentech，USA)0.1mg/kg；另外50例正常人静脉注射等量生理盐水作为对照，注射2天后再次抽取200例患者和100例正常人血液样本。
然后将这些血样放进含5毫升EDTA的离心管，用离心机3000G常温10分钟离心，抽取上清液。QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN USA)按厂家程序说明提纯cell-freeDNA。部分提纯后的DNA用Quant-iTTM dsDNA Assay Kit(ThermoFisher，USA)定量其浓度。
具体结果如下：
1、总样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 早期癌症患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 10.4±2.9 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 19.2±3.7*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
*＊表明经统计学检验患者组与其他组相比，P<0.01
结果表明，在没有给予免疫检查点抑制剂之前，早期癌症患者和正常人血液样本中的cfDNA含量相比，虽然略有升高，但是统计学并不存在差异，而在给药后早期癌症患者的cfDNA含量接近提高了1倍，而正常人却没有明显改变。有趣的是，本发明对多种不同通路的免疫检查点抑制剂(例如，伊匹单抗，尼沃鲁单抗，替西木单抗等等)进行了测试，均发现了类似的结果。这提示免疫检查点抑制剂和cfDNA联合应用具有极佳的癌症早期诊断价值。并且在后续的随访观察中，在上述剂量下的阿特朱单抗对患者及正常人健康没见任何影响。
2、肺癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 肺癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 10.9±3.1 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 20.6±3.9*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
3、白血病患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 白血病患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 9.6±2.4 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 18.3±3.2*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
4、卵巢癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 卵巢癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 11.1±3.2 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 21.2±4.1*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
5、子宫癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 子宫癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 10.6±2.9 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 19.9±3.8*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
6、胰腺癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 胰腺癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 9.3±2.3 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 18.2±3.2*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
7、胃癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 胃癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 9.1±2.1 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 18.3±3.3*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
8、肝癌患者样本分析
| cfDNA(ng/ml) | 肝癌患者 | 正常组 | 对照组 |
| 给药前 | 10.3±2.8 | 8.4±2.4 | 8.1±2.6 |
| 给药后 | 19.1±3.6*＊ | 8.6±2.3 | 8.2±2.1 |
实施例2临床研究
在医院肿瘤科收集200例随机样本(在检查前，患者患癌情况未知)，给药前抽取患者血液，然后静脉注射给予阿特朱单抗(atezolizumab，Genentech，USA)0.1mg/kg，2天后再次抽取患者血液，按照实施例1的方法提取及定量cfDNA并计算患癌风险系数，对单一患者而言，患癌风险系数＝给药后cfDNA含量/给药前cfDNA含量；当患癌风险系数>2时即判定患者有极大的患癌风险，需要进一步地临床检查。
结果表明，在200例样本中，本发明发现42例患者患癌风险系数>2，在后续的临床医学检查中进行了确诊，无一假阳性情况出现。但是在患者患癌风险系数<2的样本中，有1例在后续的检查中确诊患癌。虽然如此，鉴于癌症早期诊断的困难性，因此这并不影响本发明试剂盒在癌症早期诊断中的应用。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (9)
1.一种基于无细胞DNA定量检测的癌症早期诊断试剂盒，其包括具有提高人体免疫力的化合物或组合物以及定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂。
2.根据权利要求1所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物包括但不限于：树突细胞疫苗、免疫检查点抑制剂、具有提高人体内CD4+和CD8+T细胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增强作用的中药。
3.根据权利要求2所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物为免疫检查点抑制剂。
4.根据权利要求3所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、PD1阻断剂、抗PD1抗体、LAG-3抑制剂、PD-L1阻断剂、抗PD-L1抗体、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂和/或TIM3抑制剂。
5.根据权利要求4所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(MDX-D010)；所述PD1阻断剂是尼沃鲁单抗(nivolumab)、兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)、CT-011和/或AMP-224；PD-L1阻断剂是BMS-936559；所述LAG-3抑制剂是IMP321；所述B7-H3抑制剂是MGA271。
6.根据权利要求2所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述具有免疫激活或免疫增强作用的中药选自人参、黄芪、熟地黄、醋龟甲、女贞子、红景天、薏苡仁、桑椹、栀子、三七、灵芝、枸杞子、灵芝、猴头菇、竹荪、香菇、玄参、党参、丹参、决明子、银杏以及决明子中一种或多种。
7.根据权利要求1所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂包括提取以及纯化人体体液无细胞DNA的试剂以及用于精确定量DNA的试剂。
8.根据权利要求7所述的癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂可以为用于提取纯化人体体液的无细胞DNA试剂盒QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN USA)，以及用于精确定量DNA浓度的picogreen。
9.权利要求1-8任一项所述试剂盒在癌症早期诊断中的应用。
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