CN106367490A - 利用循环dna对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法 - Google Patents

利用循环dna对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法 Download PDF

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Abstract

一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，利用特定的游离小片段DNA提取试剂盒对癌症患者血浆中的肿瘤DNA片段进行分离提取。以得到的肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定。该检测方法作为一种方便、非侵入性、可重复性和高敏感性的“液体活检”技术，可应用于各种肿瘤易感基因及癌症，是一种先于临床肿瘤标志物检测的重要癌症治疗效果、耐药性及复发风险评估手段。

Description

利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法
技术领域
本发明属于临床辅助检测应用型技术，尤其涉及利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法。
背景技术
循环肿瘤DNA(circulating tumor，ctDNA)是一类来源于肿瘤细胞的DNA片段，大小在100-300bp之间，是由机体细胞释放到外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。早在1947年Mandcl和Metals就发现了血液中游离的小片段DNA，1977年Leon等人研究发现肿瘤患者血液循环中游离DNA水平显著高于正常人。Domirguez等对膀胱癌患者血浆DNA和肿瘤组织DNA分别进行检测，结果发现在27例膀胱癌患者中有17例患者这两者变化十分相似，Szymanska等人对29例肝癌患者进行血浆DNA与肿瘤DNA检测时发现，两者变异一致性高达88.5％。此外，大量研究表明，外周血循环DNA信息与肿瘤细胞基因组信息具有一致性，因此对外周血循环肿瘤DNA进行定量分析将为临床肿瘤的早期诊断、治疗方案的确定、疗效观察、预后评估、转移风险分析、复发监测等方面提供巨大的临床参考价值。
近年来，有关循环肿瘤DNA水平变化与抗肿瘤疗效预测方面的研究显著增多。MuLcahy等人对21例胰腺癌患者的循环肿瘤DNA进行检测，发现17例患者K-ras基因发生突变,其中有4例该基因突变患者最初被诊断为胰腺炎,之后一年陆续发展为胰腺癌。Banki等人对食管癌术后患者进行跟踪随访时发现，术后循环肿瘤DNA水平降至正常的患者，在中位生存期复查时病情稳定，无明显复发、转移征象，而术后循环肿瘤DNA水平上升的患者则出现了疾病的复发。国内也有系统性研究发现，肺癌、结肠癌等发生复发转移时循环肿瘤DNA的含量明显增高。而Peeters等人发现在原发性结直肠癌患者血浆中通常不存在61号密码子突变的N-ras和K-ras DNA片段，但在使用EGFR阻滞剂治疗并产生抗性后，约有46％患者体内可检测到两种突变基因表达量显著升高。这些变化的数据可以作为中间数据，以辅助诊断。但是目前的对这些中间数据的检测方法及效果均不理想。
发明内容：
发明目的：本发明提供一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其目的是解决以往所存在的问题，其通过对肿瘤易感基因在ctDNA中的拷贝数检测，利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线以作为中间参考数据。
技术方案：
一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：利用特定的游离小片段DNA提取试剂盒对癌症患者血浆中的肿瘤DNA片段进行分离提取。以得到的肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定。绘制动态曲线，观察易感基因拷贝数变化是否出现升高或下降趋势，进而提示患者体内癌症细胞总数变化。包括以下步骤：人体血浆制备及循环DNA提取、肿瘤循环DNA提取、设计肿瘤易感基因个性化分子探针、QPCR检测、绘制动态曲线并提示肿瘤患者治疗效果、耐药性及对复发风险进行评估。已经罹患癌症的患者中，建议术前及术后两周分别对易感基因拷贝数进行检测，之后每半个月或1个月复查一次，并根据医生建议开始化疗。在对该基因进行检测的同时，绘制基因拷贝数变化曲线。若该基因拷贝数与术前相比有下降趋势，建议继续保持现有的治疗方法，并继续跟踪该基因拷贝数变化。若该基因拷贝数与术前或与相近几次检测结果相比并无明显差异，且2到3次检测结果相似，则说明癌细胞没有得到明显抑制或应更换治疗方案。若该基因拷贝数与术前或相近几次检测结果相比有上升趋势，说明患者已经对该治疗方案产生免疫或化疗药物对患者产生毒害性，建议及时更换治疗措施并继续跟踪该基因拷贝数变化。利用肿瘤易感基因拷贝数的变化，基因拷贝数降低则意味着现有治疗方法可行有效；基因拷贝数升高则意味着对现有药物产生耐药性或现有的治疗方案无效，复查后拷贝数仍持续升高则建议应该更换治疗方案。检测结果如果始终维持在同一水平，则意味着暂无复发风险，病情较为稳定；若检测结果与前一次或前几次检测结果相比有上升趋势或持续上升，则意味着复发风险较高或已经复发。
本专利属于临床辅助检测应用型专利，本专利涉及的检测方法主要提供一种高效、准确的循环DNA肿瘤易感基因检测手段，主要应用于癌症患者治疗、耐药性及复发风险的评估，其只是一种中间数据的检测，并不能作为最终诊断结果。本专利涉及到的检测手段及理念归本公司所有，以该检测手段及理念衍生出的其他检测方法均在本专利权利保护范围内。
该方法的步骤如下：
(一)血浆中ctDNA提取
EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血；
上下颠倒混匀，4℃运输；
静脉血放入离心机，1600g，4℃，离心10min；
吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；
16000g，4℃，离心10min；
吸上清至新的无菌2.0ml离心管中；
向2ml EP管中加入1ml血浆样本，再加入1ml lysis buffer，30μl蛋白酶K和60μl纳米颗粒吸附磁珠。充分颠倒混匀5min。
将混匀样品放入离心机，12000rpm，常温离心3min，吸弃上清(如向获取更多的ctDNA，则重复步骤1、2)；
向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer I，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer II，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。
放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
离心管开盖状态下，于56℃水浴中加热3min，以挥发掉未能吸尽的wash bufferII。
加入50～70μl EB缓冲液，充分悬浮管底的bead沉淀，盖紧管盖，于56℃水浴15min；
取出离心管于14000rpm离心3min；
所得上清即为DNA溶液，用移液枪将其移入新管即可；
DNA置于-20℃保存备用。
(二)引物设计
在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用引物设计专用的软件进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间。
(三)QPCR检测
以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变位点分子探针，对ctDNA中肿瘤易感基因进行检测。利用QPCR检测结果得到的CT值计算出每毫升血浆中该基因拷贝数。
(四)检测结果说明
利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线，根据曲线趋势评估患者治疗效果，当基因拷贝数明显下降或有下降趋势时，说明当前治疗效果有效；当基因拷贝数无明显变化或连近几次的结果相差不大时，说明患者对当前药物产生耐药性，仍可继续治疗，但必须按期复检；当基因拷贝数出现上升趋势时，说明当前治疗效果无效或患者已经对现有药物产生耐药性，建议更换治疗措施并继续观测基因拷贝数变化。
优点效果：
综上所述，ctDNA作为“液体活检”突破了肿瘤异质性的限制，不仅具有肿瘤早期诊断能力，在患者耐药性及复发风险的评估方面也具有重要意义。对于正在接受肿瘤治疗的患者应持续监测ctDNA动态变化，如果ctDNA持续升高，治疗方案应重新拟定，而ctDNA持续下降的患者则说明其处于缓解期，治疗方案可行。
该检测方法所得数据可应用于癌症患者治疗效果、耐药性及复发风险的评估上，通过检测肿瘤易感基因在ctDNA中的拷贝数，绘制动态曲线，根据曲线趋势评估患者治疗效果。其只是一种辅助的中间参考数据，当基因拷贝数明显下降或有下降趋势时，说明当前治疗方案有效，可继续治疗；当基因拷贝数无明显变化或连续几次检测值差异不大时，说明患者产生耐药性，仍可按原方案继续治疗，但必须按期复检；当基因拷贝数出现上升趋势时，说明当前治疗效方案无效或患者已经对现有药物产生强烈耐药性，建议更换治疗方案并继续监测基因拷贝数变化。该检测方法作为一种方便、非侵入性、可重复性和高敏感性的“液体活检”技术，可应用于各种肿瘤易感基因及癌症，是一种先于临床肿瘤标志物检测的重要癌症治疗效果、耐药性及复发风险评估手段。
附图说明：
图1为一组检测曲线图；
图2为另一组检测曲线图；
图3为再一组检测曲线图。
具体实施方式：
以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明：一、以两位患者为例，对其进行详尽的治疗效果跟踪。第一例为乳腺癌患者，第二例为非扩散性小细胞肺癌患者。
1.血浆分离
1)血液吸入到无菌离心管中；
2)立即开始离心，4℃，1600g离心10min；
3)离心后，吸上清至新的离心管中；
4)4℃，16000g离心10min；
5)吸上清至2ml无菌离心管中；
6)-20℃保存。
2.ctDNA提取
1)向2ml EP管中加入1ml血浆样本，再加入1ml lysis buffer，30μl蛋白酶K和60μl纳米颗粒吸附磁珠。充分颠倒混匀5min。
2)将混匀样品放入离心机，12000rpm，常温离心3min，吸弃上清(如向获取更多的ctDNA，则重复步骤1、2)；
3)向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer I，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
4)向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer II，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。
5)放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
6)离心管开盖状态下，于56℃水浴中加热3min，以挥发掉未能吸尽的wash bufferII。
7)加入50～70μl EB缓冲液，充分悬浮管底的bead沉淀，盖紧管盖，于56℃水浴15min；
8)取出离心管于14000rpm离心3min；
9)所得上清即为DNA溶液，用移液枪将其移入新管即可；
10)DNA置于-20℃保存备用。
1.引物探针
乳腺癌患者：APC(肿瘤DNA片段)
非扩散性小细胞肺癌患者：APC(肿瘤小片段DNA)、CK(肺癌特异性
DNA片段)
(1)APC引物序列：
Forword：CAGCACTCCACAACATCATT
Reverse：CAACAGGTTTCACAGTAAGCG
(2)CK引物序列(利用基因检测技术对C-kit基因进行检测，发现肺癌组织中该基因第910位碱基发生改变c.910A>G，导致第304位氨基酸由Thr突变为Ala)
Forword：GACTATCAGTTCAGCGAGAG
Reverse：CTTTATCTACTACTTCCAAGGC
4.QPCR检测
1)根据Nanodrop法测定的ctDNA的浓度为标准，将模板ctDNA质量统一定至100ng；
2)QPCR反应体系：
(以TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq为例)
3.QPCR反应程序：
5.基因拷贝数计算
1)利用标准品绘制标准曲线:以CT值为Y轴，以标准品ctDNA质量为X轴绘制标准曲线，并计算出公式，Y＝-0.3002x+36.775
2)将待测样本CT值带入到公式中，求得x值；
3)计算达到阈值时该基因的拷贝数：拷贝数＝10x
4)计算原血浆中该基因的拷贝数：拷贝数＝(a×10x)/b×2ml
其中：a：从2ml血浆中提取的ctDNA总体积；
b：QPCR时模板体积
10x：达到阈值时该基因的拷贝数
c：表示提取ctDNA的血浆体积为2ml
6.动态曲线
根据两位患者(分别为乳腺癌及肺癌)在不同时期APC或C-Kit基因拷贝数检测结果绘制动态曲线：以不同时期作为横坐标，以基因拷贝数log2作为纵坐标，结果见附图说明。
7.检测结果说明
第一例乳腺癌患者：
该患者于2015年11月初在沈阳医大一院接受I期化疗，并于同期在本公司进行第一次ctDNA检测，检测结果表明，患者体内APC检测值处于正常水平，说明I期化疗后效果较好，使用由表柔比星+环磷酰胺药物化疗后效果明显，公司专家建议其继续接受治疗，并定期进行复检。该病患于II期化疗前进行第二次ctDNA检测，检测值有升高趋势，专家建议其按I 期化疗方案继续治疗，化疗后复检。病患在接受II期化疗后进行第三次ctDNA检测，检测值无明显变化，说明其极有可能对该治疗方案产生耐药性，专家建议继续观察。该患者继续接受化疗，并在随后两个月内每月进行一次ctDNA检测，两次结果均没有明显变化，说明该患者确实对该治疗方案产生耐药性，专家建议其更换治疗方案，但病患依旧使用原治疗方案。在第六次ctDNA检测中发现，病患检测结果有升高趋势，说明耐药性促使其体内癌细胞开始增长，因此本公司专家强烈建议该患者更换治疗方案，随后患者听从专家建议更换治疗方案，改用多西他赛药物进行化疗。病患第七次ctDNA检测结果显示，检测值明显下降，说明该治疗方案有效，病患可继续进行化疗。该患者于今年5月份进行第八次ctDNA检测，检测结果明显升高，本公司专家通过与病患亲属沟通得知，患者已经自行停止服用降糖药，空腹血糖保持在9.0左右，专家强烈建议其将血糖控制在3.9-6.1的正常范围内，并于2周后复检。复检结果表明，病患血糖得到进一步控制后，ctDNA检测值有下降的趋势，说明在控制血糖的同时按照该方案进行治疗，效果较为明显。
第二例非扩散性小细胞肺癌患者：
该患者于2015年在沈阳一大医院确诊为非扩散性小细胞肺癌，做切除手术前决定在本公司进行ctDNA检测。第一次检测结果表明，手术前患者体内APC检测值明显高于正常水平，公司专家建议其两周后复检并对其肿瘤组织进行基因检测从而制定个性化精准治疗方案，得到患者同意。该患者于一期化疗前，进行第二次ctDNA检测，检测结果表明，患者体内APC检测值明显下降，但与正常人相比依旧偏高，说明手术效果较好，但仍需在化疗后进行复检。在基因检测未出结果前，患者进行一期化疗，采用铂类药物进行治疗，同时进行第三次ctDNA检测。检测结果表明患者体内APC检测值持续下降，说明化疗效果较好，但副作用大，患者拒绝接受进一步化疗。本公司于同期得到基因检测结果，该结果表明，患者基因组中C-kit基因发生突变，该基因是肺癌热点突变基因，与肺癌发病密切相关，因此针对该基因突变位点设计特异性探针CK，利用该探针对患者前三次检测样品补做ctDNA检测，检测结果表明，其检测值小于APC，趋势与APC一致，说明该探针特异性较好，精准度高，在后续治疗中可以对APC及C-kit基因同时进行监测，判断患者治疗效果。同时通过基因组分析得知铂类药物对该患者毒性较大，不能继续作为化疗药物。该患者在停止治疗两周后，进行第四次ctDNA检测，检测结果表明，两个基因检测值均明显升高，专家建议在患者抵制化疗的情况下采用免疫增强剂及非传统(中药)药物治疗。患者听从建议进行药物治疗，治疗一个疗程后，进行第五次ctDNA检测，检测结果表明，检测值明显下降，说明该药物有效，可继续坚持治疗。患者在服用药物两个疗程后进行第六次ctDNA检测，检测结果表明，检测值明显下降，并且已下降到正常水平，说明该药物效果明显，可继续坚持治疗，专家建议两周后进行复检。两周后患者进行第七次ctDNA检测，检测值明显上升，专家与患者沟通了解到，患者已经自行停止用药，专家建议继续用药，并于2周后复检。患者听从建议继续进行药物治疗，并在两周后进行第八次ctDNA检测，检测值有上升趋势，疑似患者对该类药物产生耐药性，专家建议继续服药，并于2周后复检。患者于两周后进行第九次ctDNA检测，检测结果持续上升，专家确定患者对该药物产生耐药性，建议更换治疗方案，采用其他药物治疗。患者更换药物一月后进行第十次ctDNA检测，检测值明显下降，说明新药物有效，可继续使用。患者持续服用新药物，并进行第十一次ctDNA检测，检测值有下降趋势，但下降速度减慢，专家建议2周后复检，并考虑再次更换新的药物。
结果与分析
综上所述，本技术利用特定的游离小片段DNA提取试剂盒对癌症患者血浆中的肿瘤DNA片段进行分离提取；设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测；根据曲线趋势评估患者体内肿瘤细胞总数变化趋势，当基因拷贝数明显下降或有下降趋势时，说明当前治疗效果有效；当基因拷贝数无明显变化或连近几次的结果相差不大时，说明患者对当前药物产生耐药性，仍可继续治疗，但必须按期复检；当基因拷贝数出现上升趋势时，说明当前治疗效果无效或患者已经对现有药物产生耐药性，建议更换治疗措施并继续观测基因拷贝数变化。该检测方法可应用于APC，C-KIT，KRAS等所有肿瘤易感基因，操作简单、快速、灵敏度高，而且其结果的判读非常明确、直观，尤其对大量不同实际患者的样品重复检测，(定性)结果均准确，表明该可靠性高，价格合理，可以大规模推广。
基因序列
C-kit原序列：
ACAGAACGGGAAGCCCTCATGTCTGAACTCAAAGTCCTGAGTTACCTTGGTAATCACATGAATATTGTGAATCTACTTGGAGCCTGCACCATTGGAGGGCCCACCCTGGTCATTACAGAATATTGTTGCTATGGTGATCTTTTGAATTTTTTGAGAAGAAAACGTGATTCATTTATTTGTTCAAAGCAGGAAGATCATGCAGAAGCTGCACTTTATAAGAATCTTCTGCATTCAAAGGAGTCTTCCTGCAGCGATAGTACTAATGAGTACATGGACATGAAACCTGGAGTTTCTTATGTTGTCCCAACCAAGGCCGACAAAAGGAGATCTGTGAGAATAGGCTCATACATAGAAAGAGATGTGACTCCCGCCATCATGGAGGATGACGAGTTGGCCCTAGACTTAGAAGACTTGCTGAGCTTTTCTTACCAGGTGGCAAAGGGCATGGCTTTCCTCGCCTCCAAGAATTGTATTCACAGAGACTTGGCAGCCAGAAATATCCTCCTTACTCATGGTCGGATCACAAAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAGAGACATCAAGAATGATTCTAATTATGTGGTTAAAGGAAACGCTCGACTACCTGTGAAGTGGATGGCACCTGAAAGCATTTTCAACTGTGTATACACGTTTGAAAGTGACGTCTGGTCCTATGGGATTTTTCTTTGGGAGCTGTTCTCTTTAGGAAGCAGCCCCTATCCTGGAATGCCGGTCGATTCTAAGTTCTACAAGATGATCAAGGAAGGCTTCCGGATGCTCAGCCCTGAACACGCACCTGCTGAAATGTATGACATAATGAAGACTTGCTGGGATGCAGATCCCCTAAAAAGACCAACATTCAAGCAAATTGTTCAGCTAATTGAGAAGCAGATTTCAGAGAGCACCAATCATATTTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAACCGACAGAAGCCCGTGGTAGACCATTCTGTGCGGATCAATTCTGTCGGCAGCACCGCTTCCTCCTCCCAGCCTCTGCTTGTGCACGACGATGTCTGA
c-kit突变序列：
ACAGAACGGGAAGCCCTCATGTCTGAACTCAAAGTCCTGAGTTACCTTGGTAATCACATGAATATTGTGAATCTACTTGGAGCCTGCACCATTGGAGGGCCCACCCTGGTCATTACAGAATATTGTTGCTATGGTGATCTTTTGAATTTTTTGAGAAGAAAACGTGATTCATTTATTTGTTCAAAGCAGGAAGATCATGCAGAAGCTGCACTTTATAAGAATCTTCTGCATTCAAAGGAGTCTTCCTGCAGCGATAGTACTAATGAGTACATGGACATGAAACCTGGAGTTTCTTATGTTGTCCCAACCAAGGCCGACAAAAGGAGATCTGTGAGAATAGGCTCATACATAGAAAGAGATGTGACTCCCGCCATCATGGAGGATGACGAGTTGGCCCTAGACTTAGAAGACTTGCTGAGCTTTTCTTACCAGGTGGCAAAGGGCATGGCTTTCCTCGCCTCCAAGAATTGTATTCACAGAGACTTGGCAGCCAGAAATATCCTCCTTACTCATGGTCGGATCACAAAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAGAGACATCAAGAATGATTCTAATTATGTGGTTAAAGGAAACGCTCGACTACCTGTGAAGTGGATGGCACCTGAAAGCATTTTCAACTGTGTATACACGTTTGAAAGTGACGTCTGGTCCTATGGGATTTTTCTTTGGGAGCTGTTCTCTTTAGGAAGCAGCCCCTATCCTGGAATGCCGGTCGATTCTAAGTTCTACAAGATGATCAAGGAAGGCTTCCGGATGCTCAGCCCTGAACACGCACCTGCTGAAATGTATGACATAATGAAGACTTGCTGGGATGCAGATCCCCTAAAAAGACCAACATTCAAGCAAATTGTTCAGCTAATTGAGAAGCAGATTTCAGAGAGCACCAATCATGTTTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAACCGACAGAAGCCCGTGGTAGACCATTCTGTGCGGATCAATTCTGTCGGCAGCACCGCTTCCTCCTCCCAGCCTCTGCTTGTGCACGACGATGTCTGA
APC基因序列
TGGTACTCATGATAAGGATGATATGTCGCGAACTTTGCTAGCTATGTCTAGCTCCCAAGACAGCTGTATATCCATGCGACAGTCTGGATGTCTTCCTCTCCTCATCCAGCTTTT ACATGGCAATGACAAAGACTCTGTATTGTTGGGAAATTCCCGGGGCAGTAAAGAGGCTCGGGCCAGGGCCAGTGCAGCACTCCACAACATCATTCACTCACAGCCTGATGACAAGAGAGGCAGGCGTGAAATCCGAGTCCTTCATCTTTTGGAACAGATACGCGCTTACTGTGAAACCTGTTGGGAGTGGCAGGAAGCTCATGAACCAGGCATGGACCAGGACAAAAATCCAATGCCAGCTCCTGTTGAACATCAGATCTGTCCTGCTGTGTGTGTTCTAATGAAACTTTCATTTGATGAAGAGCATAGACATGCAATGAATGAACTAGGGGGACTACAGGCCATTGCAGAATTATTGCAAGTGGACTGTGAAATGTATGGGCTTACTAATGACCACTACAGTATTACACTAAGACGATATGCTGGAATGGCTTTGACAAACTTGACTTTTGGAGATGTAGCCAACAAGGCTACGCTATGCTCTATGAAAGGCTGCATGAGAGCACTTGTGGCCCAACTAAAATCTGAAAGTGAAGACTTACAGCAGGTTATTGCGAGTGTTTTGAGGAATTTGTCTTGGCGAGCAGATGTAAATAGTAAAAAGACGTTGCGAGAAGTTGGAAGTGTGAAAGCATTGATGGAATGTGCTTTAGAAGTTAAAAAGGAATCAACCCTCAAAAGCGTATTGAGTGCCTTATGGAATTTGTCAGCACATTGCACTGAGAATAAAGCTGATATATGTGCTGTAGATGGTGCACTTGCATTTTTGGTTGGCACTCTTACTTACCGGAGCCAGACAAACACTTTAGCCATTATTGAAAGTGGAGGTGGGATATTACGGAATGTGTCCAGCTTGATAGCTACAAATGAGGACCACAGGCAAATCCTAAGAGAGAACAACTGTCTACAAACTTTATTACAACACTTAAAATCTCATAGTTTGACAATAGTCAGTAATGCATGTGGAACTTTGTGGAATCTCTCAGCAAGAAATCCTAAAGACCAGGAAGCATTATGGGACATGGGGGCAGTTAGCATGCTCAAGAACCTCATTCATTCAAAGCACAAAATGATTGCTATGGGAAGTGCTGCAGCTTTAAGGAATCTCATGGCAAATAGGCCTGCGAAGTACAAGGATGCCAATATTATGTCTCCTGGCTCAAGCTTGCCATCTCTTCATGTTAGGAAACAAAAAGCCCTAGAAGCAGAATTAGATGCTCAGCACTTATCAGAAACTTTTGACAATATAGACAATTTAAGTCCCAAGGCATCTCATCGTAGTAAGCAGAGACACAAGCAAAGTCTCTATGGTGATTATGT TTTTGACACCAATCGACATGATGATAATAGGTCAGACAATTTTAATACTGGCAACATGACTGTCCTTTCACCATATTTGAATACTACAGTGTTACCCAGCTCCTCTTCATCAAGAGGAAGCTTAGATAGTTCTCGTTCTGAAAAAGATAGAAGTTTGGAGAGAGAACGCGGAATTGGTCTAGGCAACTACCATCCAGCAACAGAAAATCCAGGAACTTCTTCAAAGCGAGGTTTGCAGATCTCCACCACTGCAGCCCAGATTGCCAAAGTCATGGAAGAAGTGTCAGCCATTCATACCTCTCAGGAAGACAGAAGTTCTGGGTCTACCACTGAATTACATTGTGTGACAGATGAGAGAAATGCACTTAGAAGAAGCTCTGCTGCCCATACACATTCAAACACTTACAATTTCACTAAGTCGGAAAATTCAAATAGGACATGTTCTATGCCTTATGCCAAATTAGAATACAAGAGATCTTCAAATGATAGTTTAAATAGTGTCAGTAGTAGTGATGGTTATGGTAAAAGAGGTCAAATGAAACCCTCGATTGAATCCTATTCTGAAGATGATGAAAGTAAGTTTTGCAGTTATGGTCAATACCCAGCCGACCTAGCCCATAAAATACATAGTGCAAATCATATGGATGATAATGATGGAGAACTAGATACACCAATAAATTATAGTCTTAAATATTCAGATGAGCAGTTGAACTCTGGAAGGCAAAGTCCTTCACAGAATGAAAGATGGGCAAGACCCAAACACATAATAGAAGATGAAATAAAACAAAGTGAGCAAAGACAATCAAGGAATCAAAGTACAACTTATCCTGTTTATACTGAGAGCACTGATGATAAACACCTCAAGTTCCAACCACATTTTGGACAGCAGGAATGTGTTTCTCCATACAGGTCACGGGGAGCCAATGGTTCAGAAACAAATCGAGTGGGTTCTAATCATGGAATTAATCAAAATGTAAGCCAGTCTTTGTGTCAAGAAGATGACTATGAAGATGATAAGCCTACCAATTATAGTGAACGTTACTCTGAAGAAGAACAGCATGAAGAAGAAGAGAGACCAACAAATTATAGCATAAAATATAATGAAGAGAAACGTCATGTGGATCAGCCTATTGATTATAGTTTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCACAGAAACAGTCATTTTCATTCTCAAAGAGTTCATCTGGACAAAGCAGTAAAACCGAACATATGTCTTCAAGCAGTGAGAATACGTCCACACCTTCATCTAATGCCAAGAGGCAGAATCAGCTCCATCCAAGTTCTGCACAGAGTAGAAGTGGTCAGCCTCAAAAGGCTGCCACTTGCAAAGTTTCTTCTATTAACCAAGAAACAATACAGACTTATTGTGTAGAAGATACTCCAATATGTTTTTCAAGATGTAGTTCATTATCATCTTTGTCATCAGCTGAAGATGAAATAGGATGTAATCAGACGACACAGGAAGCAGATTCTGCTAATACCCTGCAAATAGCAGAAATAAAAGAAAAGATTGGAACTAGGTCAGCTGAAGATCCTGTGAGCGAAGTTCCAGCAGTGTCACAGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAGACTGCAGGGTTCTAGTTTATCTTCAGAATCAGCCAGGCACAAAGCTGTTGAATTTTCTTCAGGAGCGAAATCTCCCTCCAAAAGTGGTGCTCAGACACCCAAAAGTCCACCTGAACACTATGTTCAGGAGACCCCACTCATGTTTAGCAGATGTACTTCTGTCAGTTCACTTGATAGTTTTGAGAGTCGTTCGATTGCCAGCTCCGTTCAGAGTGAACCATGCAGTGGAATGGTAAGTGGCATTATAAGCCCCAGTGATCTTCCAGATAGCCCTGGACAAACCATGCCACCAAGCAGAAGTAAAACACCTCCACCACCTCCTCAAACAGCTCAAACCAAGCGAGAAGTACCTAAAAATAAAGCACCTACTGCTGAAAAGAGAGAGAGTGGACCTAAGCAAGCTGCAGTAAATGCTGCAGTTCAGAGGGTCCAGGTTCTTCCAGATGCTGATACTTTATTACATTTTGCCACGGAAAGTACTCCAGATGGATTTTCTTGTTCATCCAGCCTGAGTGCTCTGAGCCTCGATGAGCCATTTATACAGAAAGATGTGGAATTAAGAATAATGCCTCCAGTTCAGGAAAATGACAATGGGAATGAAACAGAATCAGAGCAGCCTAAAGAATCAAATGAAAACCAAGAGAAAGAGGCAGAAAAAACTATTGATTCTGAAAAGGACCTATTAGATGATTCAGATGATGATGATATTGAAATACTAGAAGAATGTATTATTTCTGCCATGCCAACAAAGTCATCACGTAAAGCAAAAAAGCCAGCCCAGACTGCTTCAAAATTACCTCCACCTGTGGCAAGGAAACCAAGTCAGCTGCCTGTGTACAAACTTCTACCATCACAAAA。

Claims (8)

1.利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：该方法以肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定，绘制动态曲线，观察易感基因拷贝数变化是否出现升高或下降趋势，进而提示患者体内癌症细胞总数变化，具体包括以下步骤：人体血浆制备、肿瘤循环DNA提取、设计肿瘤易感基因个性化分子探针、QPCR检测、绘制动态曲线并对肿瘤患者体内肿瘤细胞数目变化进行监测。
2.根据权利要求1所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：
该方法的步骤如下：
(一)、取已提取的血浆中ctDNA；
(二)、引物设计：
在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用引物设计专用的软件进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间；
(三)、QPCR检测：
以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变位点分子探针，对ctDNA中肿瘤易感基因进行检测，利用QPCR检测结果得到的CT值计算出每毫升血浆中该基因拷贝数。
3.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：基因拷贝数计算方法如下：收集正常非肿瘤患者50例，分别提取ctDNA，并利用以上方法进行QPCR检测，检测结果得到的CT值作为Y值带入到模板制备获得的计算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即为模板上样量2ul ctDNA中所含的该基因拷贝数，利用新公式(10x×a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数，其中a为ctDNA总体积；b为QPCR上样模板体积。
4.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：QPCR检测后进行检测结果说明：利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线。
5.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：
血浆中ctDNA提取的步骤如下(ctDNA提取试剂盒采用我公司自主研发设计的血浆中游离小片段DNA提取试剂盒进行提取)：
1)EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血；
2)上下颠倒混匀，4℃运输；
3)静脉血放入离心机，1600g，4℃，离心10min；
4)吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；
5)16000g，4℃，离心10min；
6)吸上清至新的无菌2.0ml离心管中；
7)向2ml EP管中加入1ml血浆样本，再加入1ml lysis buffer，30μl蛋白酶K和60μl纳米颗粒吸附磁珠。充分颠倒混匀5min。
8)将混匀样品放入离心机，12000rpm，常温离心3min，吸弃上清(如向获取更多的ctDNA，则重复步骤1、2)；
9)向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer I，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
10)向含有沉淀的管中加入1ml wash buffer II，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。
11)放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。
12)离心管开盖状态下，于56℃水浴中加热3min，以挥发掉未能吸尽的wash bufferII。
13)加入50～70μl EB缓冲液，充分悬浮管底的bead沉淀，盖紧管盖，于56℃水浴15min；
14)取出离心管于14000rpm离心3min；
15)所得上清即为DNA溶液，用移液枪将其移入新管即可；
16.DNA置于-20℃保存备用。
6.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：已经罹患癌症的患者中，建议术前及术后两周分别对易感基因拷贝数进行检测，之后每半个月或1个月复查一次，并根据医生建议开始化疗。在对该基因进行检测的同时，绘制基因拷贝数变化曲线。若该基因拷贝数与术前相比有下降趋势，建议继续保持现有的治疗方法，并继续跟踪该基因拷贝数变化。若该基因拷贝数与术前或与相近几次检测结果相比并无明显差异，且2到3次检测结果相似，则说明癌细胞没有得到明显抑制或应更换治疗方案；若该基因拷贝数与术前或相近几次检测结果相比有上升趋势，说明患者已经对该治疗方案产生免疫或化疗药物对患者产生毒害性，建议及时更换治疗措施并继续跟踪该基因拷贝数变化。
7.根据权利要求1所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：利用肿瘤易感基因拷贝数的变化，基因拷贝数降低则意味着现有治疗方法可行有效；基因拷贝数升高则意味着对现有药物产生耐药性或现有的治疗方案无效，复查后拷贝数仍持续升高则建议应该更换治疗方案。
8.根据权利要求1所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：检测结果如果始终维持在同一水平，则意味着暂无复发风险，病情较为稳定；若检测结果与前一次或前几次检测结果相比有上升趋势或持续上升，则意味着复发风险较高或已经复发。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978486A (zh) * 2017-03-24 2017-07-25 刘长胜 无细胞dna作为癌症免疫药物疗效评价的分子靶标及其应用
CN107012212A (zh) * 2017-03-24 2017-08-04 刘长胜 基于无细胞dna的癌症早期诊断试剂盒及其应用
CN108929911A (zh) * 2018-08-13 2018-12-04 成都中珠健联基因科技有限责任公司 一种利用低深度全基因组测序检测癌症复发的系统
CN109112191A (zh) * 2017-06-23 2019-01-01 沈阳精准医疗技术有限公司 一种肿瘤ctDNA的信息统计方法
CN109385469A (zh) * 2018-10-09 2019-02-26 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
CN110240999A (zh) * 2018-03-09 2019-09-17 林云富 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN111684079A (zh) * 2018-02-13 2020-09-18 豪夫迈·罗氏有限公司 通过评价肿瘤遗传异质性来预测对治疗的应答的方法
CN113194716A (zh) * 2018-10-29 2021-07-30 因纽沃什公司 用于扩增人或动物循环肿瘤细胞的动物模型

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112086129B (zh) * 2020-09-23 2021-04-06 深圳吉因加医学检验实验室 预测肿瘤组织cfDNA的方法及系统
CN112599197B (zh) * 2020-12-23 2021-11-09 北京吉因加医学检验实验室有限公司 一种基于血浆dna片段分析评估患癌风险的方法和装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105518151A (zh) * 2013-03-15 2016-04-20 莱兰斯坦福初级大学评议会 循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途
CN105838777A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海张江转化医学研发中心有限公司 ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216775B (zh) * 2008-08-18 2014-04-16 马克斯·普朗克科学促进协会 对hsp90-抑制剂的易感性
CN105112400A (zh) * 2015-08-31 2015-12-02 臻和（北京）科技有限公司 一种提取游离dna的试剂盒
CN105420230B (zh) * 2016-01-14 2018-12-07 北京纳捷诊断试剂有限公司 一种磁珠法提取核酸的裂解液

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105518151A (zh) * 2013-03-15 2016-04-20 莱兰斯坦福初级大学评议会 循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途
CN105838777A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海张江转化医学研发中心有限公司 ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
齐帆: ""晚期乳腺癌维持治疗的优化及循环肿瘤DNA在临床应用的探索性研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978486A (zh) * 2017-03-24 2017-07-25 刘长胜 无细胞dna作为癌症免疫药物疗效评价的分子靶标及其应用
CN107012212A (zh) * 2017-03-24 2017-08-04 刘长胜 基于无细胞dna的癌症早期诊断试剂盒及其应用
CN109112191A (zh) * 2017-06-23 2019-01-01 沈阳精准医疗技术有限公司 一种肿瘤ctDNA的信息统计方法
CN111684079A (zh) * 2018-02-13 2020-09-18 豪夫迈·罗氏有限公司 通过评价肿瘤遗传异质性来预测对治疗的应答的方法
CN110240999A (zh) * 2018-03-09 2019-09-17 林云富 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN110240999B (zh) * 2018-03-09 2022-09-06 浙江品级基因科技有限公司 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN108929911A (zh) * 2018-08-13 2018-12-04 成都中珠健联基因科技有限责任公司 一种利用低深度全基因组测序检测癌症复发的系统
CN109385469A (zh) * 2018-10-09 2019-02-26 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
CN113194716A (zh) * 2018-10-29 2021-07-30 因纽沃什公司 用于扩增人或动物循环肿瘤细胞的动物模型

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