CN110596383A - 基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒 - Google Patents

基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法：(1)制备通用桥连磁珠：a)制备磁珠‑链霉亲和素交联物；b)制备生物素‑Ab2交联物；c)制成通用桥连磁珠：将磁珠‑链霉亲和素交联物与生物素‑Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠；(2)制备特异捕捉磁珠：将通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1混合，即得；(3)将待测样品与特异捕捉磁珠混合、孵育，磁分离洗涤，得到免疫磁珠分离物；(4)加入脱磁液孵育，磁分离，取上清涂片，加细菌染液或真菌染液，检测观察菌体着色状况。还公开了一种试剂盒，包括前述的特异捕捉磁珠、脱磁液、细菌染液和\或真菌染液。能够对样本中多种病原同步。

Description

基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及体外生物检测诊断技术领域，具体涉及一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒。
背景技术
微生物学检测是判定病原感染、卫生状态的确证性方法，检测结果关乎临床选药及卫生决策。检测过程主要包括病原分离、鉴别、药敏试验三大环节。其中病原分离是基础，是后续检测的前提；病原鉴别是关键，可避免选药的盲目性；药敏性测试是目的，利于个性化精准用药。病原微生物的分离方法主要包括划线分离、免疫磁珠分离、微流控分离等，以划线分离培养法为主。
划线分离培养法是借助划线将标本中混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使单个菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种菌的目的。需经后续培养观察是否出现目的菌的单个菌落才能确认，耗时长，单个菌落出现有随机性，不能代表感染病原菌的总体状况；微流控分离快速、准确，可分离出感染病原菌总体，但需特殊装置及试剂，成本高，难于临床普及；免疫磁珠分离具备微流控分离的优点，且设备要求不高，易于自动化，耗材成本低，有利于临床普及。
常规用于病原菌鉴别的分析技术包括生化代谢谱、酶谱、质谱等，这些技术需要的目的菌量大，需将分离的目的菌培养扩增后方可进行，而培养扩增耗时长，无法实现快速诊断及早期、及时、精准选药。荧光染色鉴别需要目的菌量极少，具有快速、直观、灵敏、可自动化等优点，可用于免疫磁珠分离病原菌的直接鉴别。吖啶橙是一种水溶性的核酸荧光染料，与DNA结合时发出黄绿色荧光，与RNA结合时发出橙色荧光，与碘化丙啶组合使用可区分细胞的活性状态。羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯具有亲脂性，本身不发出荧光，在活细胞内能被酯酶分解生成羧基荧光一种新型的活细胞荧光显色剂。荧光增白剂28能与真菌几丁质特异结合而发出荧光，使整个真菌菌体着色，常用于真菌鉴别。
随着磁分离免疫技术的应用，近年人们对病原菌的免疫磁珠分离方法进行的多种尝试，并得出以下结论：纳米级磁珠比微米级磁珠对病原菌的分离效果更好；可用病原特异的多克隆抗体或单克隆抗体偶联到磁珠表面制成免疫磁珠；可用直接法或用间接法将特异抗体与磁珠偶联；在生物素与抗体间增加长链物质，可解决抗体结合病原菌时的空间位阻问题。
但直至目前，通过免疫磁珠法分离病原菌仍未获得认可和普及，主要原因为：1)分离一种病原就需特制一种专用免疫磁珠，而免疫磁珠制备过程复杂、技术难度大、抗体活性在偶联过程中损失大、偶联抗体量不足，质量很难保证；2)病原分离的纯度仅达到“富集”水平，为获得纯目的菌仍需划线分离培养，既不省时也不省力，反而增加了检测成本；3)无法对样本进行多种病原的同步化、自动化分离。在免疫磁珠与荧光染色结合的方法上也存在一些限制应用的问题，主要有：1)如何突破检测一种病原需要一种荧光标记抗体的局限；2)如何使荧光染料快速进入菌体内，实现快速染色鉴别；3)如何使病原菌表面结合的纳米磁珠脱落，以便观察菌体胞内荧光。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒。
为了实现本发明目的本发明采用的技术方案是：
一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法，包括如下步骤：
(1)制备通用桥连磁珠：
a)制备磁珠-链霉亲和素交联物：取粒径为10～50nm的羧基磁珠,活化后与链霉亲和素结合，并封闭残余活性基团。
b)制备生物素-Ab2交联物：取生物素进行活化，再与Ab2(二抗)偶联；或者，用商品化的水溶性生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯与Ab2直接偶联；Ab2如果选择使用抗血清，抗血清可先行辛酸-硫酸铵分离纯化并测定抗体蛋白含量。
c)制成通用桥连磁珠：将磁珠-链霉亲和素交联物与生物素-Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠，洗涤去除游离的Ab2；因1个亲和素分子可结合4个生物素分子，间接连接了4个Ab2分子，实现了四倍放大效应。
(2)制备特异捕捉磁珠：将前面制备得到的通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1(一抗)混合，即可获得特异捕捉磁珠，洗涤去除游离Ab1。Ab1若为单抗腹水，需预先纯化并测定蛋白含量。
(3)将待测样品与特异捕捉磁珠混合、孵育，磁分离洗涤，得到免疫磁珠分离物；
特异捕捉磁珠表面的Ab1与待检测样品中的特定病原菌结合，形成“磁珠包裹病原”；磁分离器分离“磁珠包裹病原”，进一步分离得到病原，进行纯化和鉴别。因Ab2将鼠源性Ab1视为抗原，两者属于生物性结合，结合后Ab1功能不变，不存在抗体活性损失；Ab2的长臂作用可避免Ab1结合病原时的位阻效应；因1个Ab2可结合2个Ab1，磁珠表面的Ab1量比直接偶联法多8倍，比亲和素-生物素介导的间接偶联法多2倍。
(4)在得到的免疫磁珠分离物中加入脱磁液孵育，磁分离，取上清涂片，加细菌染液或真菌染液，观察菌体着色状况；所述脱磁液为采用PB溶液溶解二硫苏糖醇的溶液，所述细菌染液为吖啶橙溶液或羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯溶液，所述真菌染液为荧光增白剂28溶液。
在上述技术方案中，所述羧基磁珠的活化方法为碳二亚胺法或者改良碳二亚胺法或者混合酸酐法。
在上述技术方案中，所述生物素为长链生物素，活化方法为碳二亚胺法或者改良碳二亚胺法或者混合酸酐法。
在上述技术方案中，所述Ab2为兔抗鼠IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体，其亲和力强、特异性高、活性稳定。
在上述技术方案中，所述脱磁液用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解二硫苏糖醇制成，二硫苏糖醇的浓度为50mM。用二硫键还原剂将抗体二硫键还原，抗原-抗体解离，磁珠自动脱落，磁分离后取上清染色。
在上述技术方案中，所述细菌染液包含w/v为0.1％的吖啶橙、w/v为0.2％的triton-X100，用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解制成；所述真菌染液包含w/v为0.2％的荧光增白剂28，w/v为1％的伊文斯兰，用质量比15％的KOH溶解制成。
一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别试剂盒，包括上述方法制备得到的特异捕捉磁珠以及前述的脱磁液、细菌染液和\或真菌染液。
可以对特异捕捉磁珠捕捉到的病原体进行进一步纯化培养：
a)病原体捕捉
i.样本预处理：粘性样本(如痰等)应用胰酶消化液做均值化处理；组织细胞样本应做胞内病原释放处理；含抗体变性剂(如消毒剂、蛋白酶、重金属)样本应做中和化处理；必要时进行离心沉淀富集，在用生理盐水或PBS重悬；
ii.加样：特制容器为双排无菌塑料双排微孔板，每种目的菌设2个平行孔，各孔均加预处理样本；
iii.捕捉：在特定病原菌分离微孔中加入特异捕捉磁珠，孵育，磁珠通过Ab1将病原菌包裹，形成“磁珠包裹病原”；
b)病原体分离：通过磁分离器将“磁珠包裹病原”分离；
c)病原体纯化：通过反复洗涤、微孔滤膜过滤、分子筛层析、弱选择培养基接种等实现高度纯化。
病原体培养可采用的方法是：
a)原孔培养法：在分离纯化微孔中加注培养基后恒温培养，加注的培养基类型依目的菌种类而定。例如：酵母菌应加注沙保弱肉汤，沙门菌可加注伊红美兰培养基、麦康凯肉汤、SS肉汤等；
b)转种培养法：将微孔中高度纯化的“磁珠包裹病原”转种到适合的液体培养管或固体培养板中培养，转种用的培养基依目的菌种类而定。例如：酵母菌应加注沙堡弱肉汤，沙门菌可加注伊红美兰培养基、麦康凯肉汤等。
本发明的有益效果是：1)可解决病原菌的快速分离鉴别问题，利于临床现症感染的快速精准诊断，使临床医师能根据病原类型规范选药，最大程度避免盲目用药而延误治疗；2)可综合解决在病原捕捉磁珠制备中，特异抗体偶联技术复杂、偶联过程抗体活性受损、磁珠表面特异抗体密度低、抗体结合病原时出现位阻等技术问题，实现了病原菌快速分离用的免疫磁珠制备简易化、性能最优化、易实现自动化；3)本技术方案中，只要有特异抗体，就可轻易制备出特异捕捉磁珠，可促进磁珠免疫分析技术、磁微粒化学发光免疫分析技术的普及应用，促进相关试剂及设备的产业化发展；4)可实现直接从标本中快速分离出单一目的菌，且纯度达到分离培养水平，使病原菌分离由耗时数日缩短为仅需数小时；5)采用荧光染液和脱磁液可以实现病原体的快速鉴别，分离操作完成后即可对分离物进行快速鉴别，不需等待数天的培养扩增；两种荧光染液即可进行所有病原菌的鉴别，极大程度降低检测成本，提高工作效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1通用桥连磁珠的制备
一、配制如下试剂
反应缓冲液：0.05mol/L的MES，pH5.0；
洗涤液:0.02mol/L的HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)，pH7.4；
稀释液：0.01mol/L、pH8.0的PB(磷酸盐缓冲液，由NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O配制)；
封闭液：1mol/L的NH4Cl；
EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化液：浓度为20mg/ml，用前述的反应缓冲液配制；
NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化液：浓度为20mg/ml，用前述的反应缓冲液配制；
保存液：0.1％BSA(牛血清白蛋白)、0.02％叠氮钠、0.1％吐温-20，用0.02mol/L的HEPES配制；
链霉亲和素液：浓度为0.35mg/ml，采用0.01mol/L、pH8.0的PB溶解链霉亲和素配制；
BNHS(N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯)溶液：浓度为38mg/ml，采用二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
Ab2液：浓度为6mg/ml，采用前述的稀释液稀释兔抗鼠IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体配制。
二、磁珠活化，按照如下步骤操作：
a)取10mg/ml、直径30nm的羧基磁珠0.5ml，加洗涤液9.5ml混匀，进行磁分离洗涤，重复3次；第4次加10ml的反应缓冲液洗涤；
b)加入EDC活化液290ul，NHS活化液325ul，混匀，活化1小时；
c)加洗涤液混匀，磁分离洗涤3次，用于下一步的磁珠链霉亲和素交联。
三、磁珠-链霉亲和素交联，按照如下步骤操作：
a)在前面活化后的磁珠中加链霉亲和素液1ml，37℃反应2小时；
b)乙醇胺溶液封闭2小时；
c)加洗涤液混匀，磁分离洗涤3次，按磁珠质量用稀释液稀释成1mg/ml，即得磁珠-链霉亲和素交联物；
四、生物素-Ab2交联，按照如下步骤操作：
a)取Ab2液5ml，加入BNHS溶液80ul，搅拌混匀，室温反应4小时；
b)加封闭液48ul，混匀，孵育10分钟；
c)洗涤液中4℃透析过夜，得到生物素-Ab2交联物。
五、偶联成通用桥连磁珠，按照如下步骤操作：
a)将上述制得的磁珠-链霉亲和素交联物与生物素-Ab2交联物按体积比1:0.5混合，37℃反应2小时；
b)洗涤液磁分离洗涤3次；
c)洗涤后用保存液调制成5mg/ml的溶液，即得通用桥连磁珠，-20℃保存。
实施例2特异捕捉磁珠对甲型副伤寒沙门菌的分离纯化
一、制备甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠，按照如下步骤操作：
a)取实施例1制备的通用桥连磁珠，用洗涤液稀释成2mg/ml；再取用洗涤液稀释成1mg/ml的鼠源甲型副伤寒沙门菌单克隆抗体1ml，与1ml的2mg/ml的通用桥连磁珠进行混合，37℃反应1小时；
b)步骤a)反应完毕后用洗涤液磁分离洗涤3次，然后用洗涤液稀释成1mg/ml，即得特异捕捉磁珠。
二、甲型副伤寒沙门菌捕捉试验
按照如下步骤操作：
a)取新扩增甲型副伤寒沙门菌(ATCC9150)用无菌洗涤液调整至104CFU/ml；
b)取1ml上述菌液，加1mg/ml的甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠10ul；室温孵育1小时；
c)磁分离洗涤3次，获得“磁珠包裹甲型副伤寒沙门菌”；
d)用洗涤液对“磁珠包裹甲型副伤寒沙门菌”进行梯度稀释；
e)接种麦康凯平板培养24小时，按以下公式计算俘获率：
俘获率(％)＝(A1/A0)*100
式中：A1：磁珠组的菌落数(CFU/ml)
A0：对照组的菌落数(CFU/ml)
f)用普通大肠杆菌(ATCC2592)、变形杆菌(CMCC49027)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌株也采用甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠按以上方法进行试验，验证甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠的特异性。
结果如下表1所示：
表1甲型副伤寒沙门菌捕捉试验结果
菌株 甲型副伤寒沙门菌 普通大肠杆菌 变形杆菌 金黄色葡萄球菌
俘获率 96％ 0.01％ 0.05％ 0
实施例3四种病原同步分离
一、制备特异捕捉磁珠
a)取经洗涤液稀释成2mg/ml的实施例1的通用桥连磁珠，1ml/管，共4管；分别与1ml(浓度为均1mg/ml)的甲型副伤寒沙门菌单克隆抗体、痢疾志贺菌单克隆抗体、白色假丝酵母菌单克隆抗体、蜡样芽胞杆菌单克隆抗体混合，37℃反应1小时；
b)分别用洗涤液磁分离洗涤3次，再稀释成1mg/ml，制成特异捕捉磁珠。
二、同步分离试验：
a)混合试样制备：用甲型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、白色假丝酵母菌、蜡样芽胞杆菌制备混合菌液，用无菌洗涤液稀释，使得混合菌液中的甲型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、白色假丝酵母菌、蜡样芽胞杆菌的浓度均为104CFU/ml，将混合菌液按1ml/管分装成4管，做为试样；
b)在步骤a)的4管试样管中分别加入步骤一制备的甲型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、白色假丝酵母菌、蜡样芽胞杆菌特异捕捉磁珠10ul，室温孵育1小时；
c)分别用洗涤液进行磁分离洗涤3次，分别获得“磁珠包裹甲型副伤寒沙门菌”、“磁珠包裹痢疾志贺菌”、“磁珠包裹白色假丝酵母菌”、“磁珠包裹蜡样芽胞杆菌”；
d)用洗涤液对磁珠包裹病原菌进行梯度稀释；
e)接种对应培养基，培养24小时，按下表计算俘获率：
俘获率(％)＝(A1/A0)*100
式中：A1：磁珠组的菌落数(CFU/ml)
A0：对照组的菌落数(CFU/ml)
三、结果如下表2所示
表2四种病原同步分离结果
菌株 甲型副伤寒沙门菌 痢疾志贺菌 白色假丝酵母菌 蜡样芽胞杆菌
培养基 麦康凯平板 麦康凯平板 沙堡弱琼脂平板 MYP平板
俘获率 96％ 95％ 98％ 96％
杂菌 无 无 无 无
实施例4
按照实施例2的方法对其它病原菌进行了检测，检测对象和结果如下表3所示：
表3不同病原菌检测结果
实施例5基于荧光染色的免疫磁珠对甲型副伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌的快速分离、鉴别、培养
一、配制荧光显示相关试剂
(1)染液
细菌染液：包含0.1％(w/v)的吖啶橙、0.2％(w/v)的triton-X100，用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解制成；
真菌染液：包含0.2％(w/v)的荧光增白剂28，1％(w/v)的伊文斯兰，用质量比15％的KOH溶解制成。
(2)脱磁液：50mM的二硫苏糖醇(DTT)，用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解制成。
二、甲型副伤寒沙门菌的分离、鉴别、培养
(1)分离
新扩增甲型副伤寒沙门菌(ATCC9150)、普通大肠杆菌(ATCC2592)分别用无菌洗涤液调整至2×104CFU/ml，等量混匀得到混合液，取聚苯乙烯塑料微孔平板，按200ul/孔在微孔平板的两个微孔(分别命名为A1孔、B1孔)中分别加入混合液，然后各加入实施例2得到的甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠10ul；室温孵育1小时；300ul洗涤液磁分离洗涤3次，获得甲型副伤寒杆菌免疫磁珠分离物。
(2)鉴别：在B1孔中加入脱磁液200ul，孵育10分钟，磁分离，取上清涂片，加细菌染液1滴染色，荧光显微镜观察菌体着色状况。
(3)培养：在A1孔加入麦康凯培养液200ul，吹打均匀后，在麦康凯琼脂平板上划线分离接种，培养观察纯化效果。
三、金黄色葡萄球菌的分离、鉴别、培养
金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌株按照前面甲型副伤寒沙门菌的方法在微孔平板的两个微孔(分别命名为A2孔、B2孔)进行试验(采用的是按照实施例2的方法制得的金黄色葡萄球菌特异捕捉磁珠)，在营养琼脂平板上划线分离接种，观察菌体着色状况及纯化效果。
四、结果
结果如表4：
表4
实施例6基于荧光染色的免疫磁珠对白色念珠菌的快速分离、鉴别、培养一、分离：新扩增白色念珠菌(ATCC90029)、热带念珠菌(ATCC13803)分别用无菌洗涤液调整至2×104CFU/ml，等量混匀，按200ul/孔加入聚苯乙烯塑料微孔平板的两个微孔中；然后在两个微孔中各加白色念珠菌特异捕捉磁珠(参照实施例2中甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠的制备方法)10ul；室温孵育1小时；300ul洗涤液磁分离洗涤3次，获得白色念珠菌免疫磁珠分离物；
二、鉴别：其中一个微孔中加入脱磁液200ul，孵育10分钟，磁分离，取上清涂片，加真菌染液1滴染色，荧光显微镜观察菌体着色状况；
三、培养：在另一个微孔中加入沙堡培养液200ul，吹打均匀后，接种环沾少许在TTC-沙保弱培养平板上划线分离，培养观察纯化效果；
四、结果如表5所示：
表5
实施例7四种病原菌用基于荧光染色的免疫磁珠同步分离并进行快速鉴别、培养
一、制备混合试样：用甲型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、白色假丝酵母菌、蜡样芽胞杆菌、普通大肠杆菌、热带念珠菌制备混合菌液，用无菌洗涤液稀释，使得混合菌液中的甲型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、白色假丝酵母菌、蜡样芽胞杆菌、普通大肠杆菌的浓度均为104CFU/ml；
二、加样：取一块聚苯乙烯塑料微孔平板，用相邻的两行微孔做实验，上面那行命名为A行，下面那行命名为B行；A行取4个微孔做实验，4个微孔从左至右命名为A1、A2、A3、A4；B行上取与分别与A1、A2、A3、A4同列的孔做实验，4个微孔从左至右命名为B1、B2、B3、B4。按200ul/孔在A1--A4、B1--B4微孔中分别加入混合菌液。
三、分离：在前面8个微孔中加免疫磁珠10ul/孔，其中A1、B1孔加甲型副伤寒沙门菌特异捕捉磁珠，A2、B2孔加痢疾志贺菌特异捕捉磁珠、A3、B3孔加白色念珠菌特异捕捉磁珠、A4、B4孔加蜡样芽孢杆菌特异捕捉磁珠，室温孵育1小时；300ul洗涤液磁分离洗涤3次，获得四种菌的免疫磁珠分离物。
四、鉴别：B1--B4孔分别加脱磁液200ul，孵育10分钟，磁分离，取上清涂片，B1、B2、B4孔样本用细菌染液染色，B3孔用真菌染液染色，荧光显微镜观察菌体着色状况。
五、培养：A1--A4孔分别加洗涤液200ul分别混悬，A1、A2孔样本用麦康凯琼脂平板划线分离，A3孔用TTC-沙堡弱琼脂划线分离，A4孔用蜡样芽孢杆菌选择琼脂(PEMBA)划线分离，培养观察纯化效果。
六、结果如表6所示：
表6

Claims (7)

1.一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备通用桥连磁珠：
a)制备磁珠-链霉亲和素交联物：取粒径为10～50nm的羧基磁珠，活化后与链霉亲和素结合，并封闭残余活性基团；
b)制备生物素-Ab2交联物：取生物素进行活化，再与Ab2偶联；或者，用商品化的水溶性生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯与Ab2直接偶联；
c)制成通用桥连磁珠：将磁珠-链霉亲和素交联物与生物素-Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠，洗涤去除游离的Ab2；
(2)制备特异捕捉磁珠：将前面制备得到的通用桥连磁珠与待测病原微生物的Ab1混合，即可获得特异捕捉磁珠，洗涤去除游离Ab1；
(3)将待测样品与特异捕捉磁珠混合、孵育，磁分离洗涤，得到免疫磁珠分离物；
(4)在得到的免疫磁珠分离物中加入脱磁液孵育，磁分离，取上清涂片，加细菌染液或真菌染液，观察菌体着色状况；所述脱磁液为采用PB溶液溶解二硫苏糖醇的溶液，所述细菌染液为吖啶橙溶液或羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯溶液，所述真菌染液为荧光增白剂28溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述羧基磁珠的活化方法为碳二亚胺法或者改良碳二亚胺法或者混合酸酐法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物素为长链生物素，活化方法为碳二亚胺法或者改良碳二亚胺法或者混合酸酐法。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Ab2为兔抗鼠IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱磁液用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解二硫苏糖醇制成，二硫苏糖醇的浓度为50mM。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌染液包含w/v为0.1％的吖啶橙、w/v为0.2％的triton-X100，用pH7.2、0.01mol/L的PB溶解制成；所述真菌染液包含w/v为0.2％的荧光增白剂28，w/v为1％的伊文斯兰，用质量比15％的KOH溶解制成。
7.一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别试剂盒，其特征在于：包括采用权利要求1至4任一项所述的方法中制备得到的特异捕捉磁珠，以及权利要求1中所述的脱磁液、细菌染液和\或真菌染液。
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