CN1737011A - 抗hla－dr10的淋巴瘤特异性嵌合单抗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗HLA－DR10的特异性嵌合单抗，编码该抗体的DNA序列，构建含该DNA序列的真核细胞表达载体，筛选并保存稳定高表达该抗体的宿主细胞株，纯化该抗体的工艺方法，以及含该抗体的药物组合物。本发明的抗体具有特异性结合HLA－DR10抗原的特性，HLA－DR10位于大多数非何杰金氏淋巴瘤和一部分慢性淋巴细胞白血病患者的B淋巴细胞表面。通过该抗体对恶性B淋巴细胞的靶向作用，将抗体偶联的放射性核素带到肿瘤部位，发挥特异性杀伤作用，因此该抗体可用于恶性B细胞淋巴瘤的治疗。

Description

抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性嵌合单抗

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性嵌合单克隆抗体，编码该抗体的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该抗体的工艺方法，以及该抗体在治疗肿瘤等疾病中的应用。

背景技术

目前的肿瘤治疗方案中最重要的是手术治疗、化疗和放疗。这三大常规疗法尽管可以大大延长肿瘤患者的生存期，但是患者仍然会因为肿瘤复发或转移而死亡，或者因为化疗、放疗导致的骨髓抑制发生继发性感染或出血而死亡。为此，人们不断尝试各种生物疗法以弥补目前三大常规治疗方法的不足，例如基因治疗、免疫治疗等。

淋巴瘤的发病率位居肿瘤发病率第五位，市场前景广阔。开发淋巴瘤的免疫治疗药物一直为研究者梦寐以求。目前虽然已经获得了一些针对淋巴瘤的抗体，但是这些抗体对淋巴瘤的特异性和亲和力往往不够，或者人体使用后副作用过大。

因此，为了更有效地治疗肿瘤患者，尤其是传统治疗方式无能为力的患者，本领域迫切需要开发对淋巴瘤特异性高、副作用低的药物。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的对淋巴瘤特异性高、副作用低的药物，它是一种嵌合单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供编码所述抗体的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种抗HLA-DR10的特异性嵌合单克隆抗体，它包括：

(a)抗体重链元件，该抗体重链元件含有人抗体重链的恒定区，抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

(b)抗体轻链元件，该抗体轻链元件含有人抗体轻链的恒定区，并且抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

其中所述的抗体重链元件和抗体轻链元件通过二硫键连接。

在另一优选例中，所述抗体重链恒定区为γ类型；而抗体轻链恒定区为κ类型。

在另一优选例中，所述抗体是由保藏号为CCTCC C200405的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym产生的。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述所述的DNA分子。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有上述的载体，更佳地该宿主细胞是小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym，保藏号为CCTCC C200405。

在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明所述抗体的方法，它包括步骤：

在表达所述抗体的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的抗体；和分离所述的抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，包括安全有效量的本发明所述的特异性嵌合单克隆抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。

在本发明的第七方面，提供了本发明所述的特异性嵌合单克隆抗体的用途，它被用于制备治疗恶性B细胞淋巴瘤的药物或用于制备诊断恶性B细胞淋巴瘤的试剂。

在本发明的第八方面，提供了一种偶联物，它由本发明所述的抗体以及与所述抗体偶联的放射性核素构成，所述的放射性核素选自：¹³¹I、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y或⁶⁷Cu。

在本发明的第九方面，提供了一种抗体重链多肽，它具有重链恒定区和重链可变区，所述的重链恒定区是人抗体重链的恒定区，并且抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。还提供了一种抗体轻链多肽，它具有轻链恒定区和轻链可变区，所述的轻链恒定区是人抗体轻链的恒定区，并且抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

附图说明

图1显示了本发明抗体重链可变区的序列。

图2显示了本发明抗体轻链可变区的序列。

图3显示了HLA-DR10单抗的亲和常数Ka的测定结果。

图4显示了静脉注射不同剂量¹³¹I-HLA-DR10单抗后对肿瘤组织的抑制作用。

图5显示了小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym的荧光原位杂交结果。一个杂交点表示一个chLym-1基因拷贝数。左图示间期核上有四个杂交点，右图为阴性对照。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，将一种高特异性的抗人HLA-Dr10的鼠源性单克隆抗体的可变区和人抗体恒定区基因融合在一起，产生的抗体既具有鼠源性抗体可变区的高特异性和高亲和力的特点，又具有人抗体恒定区的极低副作用的特点。在此基础上完成了本发明。

定义

如本文所用，术语“抗HLA-Dr10的特异性嵌合单抗”、“chLym抗体”等可互换使用，都指由嵌合的抗体重链元件的氨基酸序列和嵌合的抗体轻链元件的氨基酸序列构成的抗体。

如本文所用，术语“抗体重链元件”指在所述本发明抗体的重链。该抗体重链元件含有抗体重链的可变区和恒定区。对于重链可变区而言，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1的抗体重链。对于重链恒定区而言，它是来自人抗体的重链恒定区，较佳地是γ类型的重链恒定区。

如本文所用，术语“抗体轻链元件”指在所述本发明抗体的轻链。该抗体轻链元件含有抗体轻链的可变区和恒定区。对于轻链可变区而言，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2的抗体轻链。对于轻链恒定区而言，它是来自人抗体的轻链恒定区，较佳地是κ类型的轻链恒定区。

本发明还包括含上述轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。本领域技术人员通过用常规方法分析将本发明抗体的重链和轻链序列(SEQ ID NO：1和2)，可确定其CDR区。本发明还包括这些CDR区完全相同的抗体重链和抗体轻链，以及由所述重链和轻链构成的抗体。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用基因工程的方法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。因此，编码本发明抗体的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得抗体重链和或抗体轻链的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明抗体的DNA序列。

在获得了编码本发明新抗体的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的抗体。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS、NSO系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。

在本发明中，可选用本领域已知的各种哺乳动物表达载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明抗体的条件下培养该细胞，从而表达出抗体。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗既具有针对恶性B淋巴瘤细胞的特异亲和力，又具有副作用小的优点。

除了直接使用本发明的抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗之外，本发明的抗体还可与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)偶联，形成抗体-PEG偶联物。可以采用本领域中已知的各种形成PEG化蛋白的方法来制备这些抗体-PEG偶联物。

此外，本发明抗体还可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如本发明抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)或放射性物质(如¹³¹I、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y或⁶⁷Cu)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人淋巴瘤细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内、鞘内(intrathecal)、侧脑室(intracerebroventricular)、腹腔(intraperitoneal)以及肿内(intraparenchymal)或局部给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明抗体或其衍生物(如与放射性核素的偶联物)施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的抗体还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：各种细胞因子，如IFN、TNF、IL18等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。

本发明的主要优点如下：

(1)本发明抗体对B淋巴瘤细胞表面抗原有高特异性和高亲和力，是一种治疗肿瘤的新型药物。

(2)本发明抗体含有人源的恒定区序列，进入人体的免疫原性极小，因此副作用小。

(3)与其他化学偶联的单抗偶联药物相比，运用基因工程方法构建抗体(或者其片段)，并经表达系统表达产生的抗体具有均一性，同时由于蛋白质表达和工业化生产的进步，使得抗体的大批量生产成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

鼠源性抗淋巴瘤单克隆抗体的制备

提取Raji细胞(Burkitt′s淋巴瘤细胞，ATCC：CCL-86)的细胞核免疫Balb/c小鼠，在末次免疫四天后取小鼠脾脏制成单细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行融合。融合细胞在HAT培养基中进行筛选培养，经多次克隆后鉴定单克隆细胞培养上清对Raji细胞核的免疫荧光反应，阳性者为杂交瘤细胞株。结果发现一株杂交瘤的抗体与淋巴瘤有很高亲和力和特异性。

抽提阳性细胞克隆的总RNA，从总RNA分离纯化编码单抗的轻重链基因的mRNA。回收的mRNA，通过RT-PCR和PCR扩增技术获得抗体V_H和V_L基因cDNA片段，然后用常规方法对产生的V_H和V_L进行测序。

结果表明，该鼠源的抗体重链可变区的序列的DNA序列如SEQ ID NO：9所示，推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(见图1)；抗体轻链可变区的序列如SEQ ID NO：10所示，推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(见图2)。

实施例2

抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗的制备

(1)重链可变区和轻链可变区的制备

取实施例1制备的杂交瘤细胞，用常规方法提取mRNA，-80℃保存。以抽提的mRNA为模板，用引物EP12，EP37合成cDNA。

EP12：TCG AAG TCG GTA CCA GAT GTT AAC TGC TCA CT(SEQ IDNO：3)

EP37：GGA CAG GGA TCC AGA GTT CCA(SEQ ID NO：4)

以合成的cDNA为模板，用引物EP261和EP255扩增重链可变区基因序列，用引物EP262和EP22扩增轻链可变区基因序列。为了方便构建克隆和表达系统，在上游引入Xba I酶切位点和Kozak序列，在下游引入Nhe I(重链可变区)和BsiW I(轻链可变区)酶切位点。

EP261：GC TCT AGA GCC GCC ACC ATG GCT GTC CTG GGG CTGCTT(SEQ ID NO：5)

EP255：TCG AAG TCG CTA GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA GT(SEQID NO：6)

EP262：GC TCT AGA GCC GCC ACC ATG GGT GTG CCC ACT CAG GTC(SEQ ID NO：7)

EP22：GAC GCC GCC GTA CGT TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC(SEQID NO：8)

(2)可变区基因与恒定区基因的融合

在本实施例中，重链恒定区序列为人的γ1链(pSK-γ1质粒)，轻链恒定区序列为κ链(pSK-κ质粒)。将步骤(1)中制备的PCR扩增的重链可变区片断(XbaI/Nhe I)和轻链可变区片断(Xba I/BsiW I)酶切后分别与酶切的pSK-γ1质粒和pSK-κ质粒连接，连接产物转化常规的大肠杆菌E.Coli XL-1。氨苄抗性菌落用PCR方法筛选阳性克隆，DNA测序证实。

(3)表达细胞种子细胞株的建立及其鉴定

宿主细胞为小鼠骨髓瘤细胞NS0，购自Celltech公司(Slough，England)。GS阴性。

将pEE12-HLA-DR10单抗-HL质粒用Sal I酶切线性化，电转化NS0细胞，以不含谷氨酰胺的培养基筛选阳性细胞株。具体方法简述如下：在电穿孔当天，离心收集对数生长期的NS0细胞，用冷的PBS洗细胞后配成1×10⁷/ml细胞悬液，冰浴保存。取40μg Sal I酶切线性化的pEE12-HLA-DR10单抗-HL放入无菌的电穿孔杯中(BioRad，Richmond，CA)，冰浴5分钟。将NS0细胞加入到上述电穿孔杯，轻轻混匀，冰浴5分钟。取出电穿孔杯，以1.5kV，6μF的设置条件进行电击(BioRad)。取出电穿孔杯再冰浴5分钟，然后将转染的NS0细胞加入到30ml非选择性培养基中。取其中的20ml以每孔50μl装入4块96孔板，余下的10ml用非选择性培养基稀释到40ml，以每孔50μl装入4块96孔板。余下的取10ml用非选择性培养基稀释到50ml，以每孔50μl装入4块96孔板。37℃，5％CO₂培养箱培养24小时，每孔加入150μl选择性培养基。放回培养箱中继续培养，大约3-4周后大部分细胞死亡，出现存活的细胞克隆。

从含有存活克隆的孔中取培养上清用ELISA法检测单克隆抗体分泌情况，纯化的NHS-76用做阳性对照和标准曲线制备。有115个克隆表达抗体，取其中OD值最高的10个克隆，用ELISA法检测24小时分泌抗体情况。

结果见表1，6号克隆的抗体分泌水平最高，用于进一步亚克隆培养。HLA-DR10单抗亚克隆细胞株中6-1、6-2，及6-6抗体分泌水平最高，抗体分泌率相似。选取6-2单克隆细胞株进行扩大培养。依次转移到T-15，T-75，T-150培养瓶培养，共收获1.2×10⁸细胞，存活率88％。将这些细胞以1×10⁷细胞/ml分装在12管含有10％DMSO的杂交瘤-SFM培养基中进行细胞冻存，每管1ml，命名为NS0-clym。

            表1HLA-DR10单抗细胞克隆抗体分泌率

HLA-DR10单抗克隆号	抗体分泌(ug/ml/106/24h)
		克隆1	2.5
克隆2	4.2
		克隆3	2.7
克隆4	4.8
		克隆5	2.1
克隆6	5.8
		克隆7	3.4
克隆8	5.2
		克隆9	4.4
克隆10	4.1

细胞株鉴定是用荧光原位杂交(FISH)检测HLA-DR10单抗基因在细胞核中的拷贝数。FISH是一种直观，快速，可靠的方法，可以检测细胞核中DNA拷贝数。本实验采用的探针为生物素标记的HLA-DR10单抗DNA探针。方法简述如下：

a.离心收集NS0-HLA-DR10单抗细胞和NS0细胞(阴性对照)，重悬在10ml低渗溶液中，37℃孵育20分钟，加固定液，-20℃固定过夜。

b.固定细胞用新鲜固定液洗两次。离心收集细胞，弃上清，重悬在0.5ml新鲜固定液中，在预冷的玻片上滴加0.1ml进行制片，空气干燥，56℃烘干过夜，取出备用。

c.用BioNick标记系统(Invitrogen，18247-015)对pEE12-HLA-DR10单抗-HL质粒进行生物素标记，标记后的探针用PD柱纯化后储存在-20℃。

d.取出制好的玻片，用RNase A(0.1mg/ml)37℃处理1小时，剃度乙醇溶液(70％、80％和95％)脱水。70％甲酰胺变性液中70℃变性2-3分钟，冷乙醇剃度脱水，空气干燥。

e.1.5μl生物素标记的探针和30μl杂交溶液(65％甲酰胺的2XSSC)混合，70℃变性10分钟，冰浴3分钟。在已变性的玻片上滴加变性的探针杂交液进行DNA杂交，37℃孵育过夜。

f.45℃洗液(含50％甲酰胺的2XSSC)洗玻片20分钟，37℃2XSSC洗液洗片两次。滴加亲和素-FITC溶液，室温孵育15分钟。磷酸缓冲液洗片3次。滴加抗亲和素抗体-FITC溶液，室温孵育15分钟。磷酸缓冲液洗片3次。

g.以DAPI/抗衰减剂负染，荧光显微镜观察。

h.结果：观察并计数60个无重叠的间期细胞核。细胞核上的杂交点为HLA-DR10单抗基因拷贝数。结果表明，拷贝数为1-6个不等，其中44个细胞核上有4个杂交点(73.3％)。图5显示了荧光原位杂交结果，阴性对照细胞NS0细胞核上无杂交点。

制得的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym于2003年7月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCC No.200405，该细胞株表达抗HLA-DR10的特异性嵌合单克隆抗体。

实施例3

HLA-DR10抗体的鉴定

将小鼠骨髓瘤细胞株NS0-clym接种于含10％血清、不含L-谷氨酰胺的SFM培养基置37℃，5％CO₂培养箱中培养，收集培养上清，分离并纯化抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗，并用以下方法进行鉴定。

(a)N端氨基酸序列测定

委托国家生物医学分析中心(中国，北京)完成。轻链N端测序得到15个氨基酸序列与预测的轻链序列完全一致。重链N端测序未检出明显色谱峰，推断其N末端可能被氨基末端封闭。

(b)肽图测定

委托国家生物医学分析中心完成，三批产品的肽图基本一致。

(c)分子量测定

委托国家生物医学分析中心完成，测得的分子量为146920道尔顿，与理论值基本一致。

实施例4

HLA-DR10单抗亲和常数测定

(a)、材料

活性Raji细胞(ATCC编号：CCL-86)

¹³¹I标记HLA-DR10单抗(¹³¹I-HLA-DR10)(用常规的氯胺T法标记，见

实施例5)

0.015M磷酸缓冲液(PBS)pH7.0

含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液

(b)、方法

采用标记抗体直接制备法，活Raji细胞放射免疫分析。每个实验变量做双份，每个试管加入含106活Raji细胞悬浮液，此Raji细胞用磷酸缓冲液洗二次，吸干。细胞在5-110ng/ml放射性标记的HLA-DR10单抗和100ul的PBS溶液中室温振荡培育60分钟。然后用含1％BSA的PBS溶液1.5ml洗涤各管细胞，3000rpm离心5分钟，弃上清液，反复三次，去除未结合的抗体，并在γ计数器中测定计数。

(c)、结果

抗体结合量由每个试管内与细胞结合的放射性(cpm)和放射性标记抗体的比放(cpm/ng)确定，用Scatchard法绘图求出直线斜率。由斜率方程式Ka＝-(斜率/n)可算出亲和常数Ka，其中n为抗体的价数(对IgG价数为2)，由图3可见，HLA-DR10单抗的亲和常数Ka＝3.36×10⁸mol-1。

实施例5

¹³¹I标记的HLA-DR10的制备

采用氯胺-T碘化标记法或其他的标记方法，定量地将放射性核素¹³¹I标记到抗HLA-DR10的特异性嵌合单克隆抗体上，从而制得¹³¹I-HLA-DR10，放射性比活度为10mCi/mg。

实施例6

¹³¹I-HLA-DR10治疗肿瘤的药效学实验

在本实施例中，提供动物体中有关碘[¹³¹I]恶性淋巴瘤特异性人鼠嵌合单抗注射液(¹³¹I-HLA-DR10)(实施例5制备)药效学实验和结果。

(a)方法

在无菌条件下，将Raji细胞传代培养，培养液含164090％，血清10％，置于二氧化碳培养箱(5％CO₂)内。使用前1000g离心3min，用生理盐水洗涤一次，所得细胞悬液备用。用20号穿刺针把含有10⁶个细胞的悬液移植至裸小鼠近前肢背侧部，数周后待肿瘤长至直径为1cm左右，用于研究。

取荷人淋巴瘤裸鼠30只，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，分笼饲养。接受¹³¹I-HLA-DR10治疗前三天开始在饮水中加入复方碘溶液。根据预试验结果，设立4个剂量组(高、中、低、最低组)，分别尾静脉注射¹³¹I-HLA-DR10500μCi(1.85MBq)，350μCi(1.30MBq)，200μCi(0.74MBq)，和100μCi(0.37MBq)。第5组为空白对照组，尾静脉注射同等体积的生理盐水。每鼠注入的体积为0.02ml。

结果

1.尾静脉注入400uCi和500uCi¹³¹I-HLA-DR10注射液后，荷淋巴瘤裸鼠模型在30天内无一只死亡(n＝6)，而注入600uCi¹³¹I-HLA-DR10的荷淋巴瘤裸鼠模型在30天内全部死亡(n＝6)。

2.尾静脉注入¹³¹I-HLA-DR10注射液后，荷淋巴瘤裸鼠模型肿瘤组织/非肿瘤组织比(T/NT)在第一天已达1.3±0.2，其后T/NT值逐渐升高，第25至30天甚至高达8.3至21.0，显示肿瘤的明显放射性浓集。

3.注入100uCi、200uCi、350uCi和500uCi的¹³¹I-HLA-DR10注射液后，各组荷淋巴瘤裸鼠模型肿瘤生长抑制率分别为-2.4％、14.5％、30.1％和40.9％(如图4所示)。

结论：

1.¹³¹I-HLA-DR10对淋巴瘤裸鼠动物模型的肿瘤组织具有亲和性，能很好定位于肿瘤组织且有较高的瘤/非瘤组织之比。

2.每裸鼠注入350uCi或350uCi以上剂量的¹³¹I-HLA-DR10治疗组具有确切疗效，肿瘤抑制率大于30％。

3.每裸鼠注入500uCi或500uCi以下剂量的¹³¹I-HLA-DR10治疗组被认为是安全的，超过此剂量会引起裸鼠生存期缩短，体重及生命体征下降。淋巴瘤裸鼠动物模型的初步药效学研究表明¹³¹I-HLA-DR10抗肿瘤作用确切。

实施例7

药物组合物

按制药领域中常用的混合法配制以下药物组合物。

配方：¹³¹I标记的抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗，溶于0.9％NaCl注射液(含4％人白蛋白)，放化纯≥95％，免疫活性≥50％，放射性浓度大约为10mCi/ml，无菌无热原。

适应症：恶性B细胞淋巴瘤。

实施例8

药物组合物

按制药领域中常用的混合法配制以下药物组合物。

配方：抗HLA-DR10的特异性嵌合单抗10-100mg，白蛋白4％，吐温800.1％，PBS。

适应症：静脉或皮下注射治疗恶性B细胞淋巴瘤。

经初步临床试验，结果表明，本发明抗体不仅对B细胞淋巴瘤有极高的特异性，而且不良反应少，安全有效，可多次应用并提高T/NT比值。

菌株保藏

本发明的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym于2003年7月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCC No.200405。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

<110>上海美恩生物技术有限公司

<120>抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性嵌合单抗

<130>041298

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65                  70                  75                  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ser His Tyr Gly Ser Thr Leu Ala Phe Ala Ser Trp Gly His Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

        115                 120

<210>2

<211>106

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Glu Thr Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Val Asn Ile Tyr Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

        35                  40                  45

Tyr Asn Ala Lys Ile Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Phe Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

tcgaagtcgg taccagatgt taactgctca ct                                    32

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ggacagggat ccagagttcc a                                                21

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gctctagagc cgccaccatg gctgtcctgg ggctgctt                              38

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

tcgaagtcgc tagctgcaga gacagtgacc agagt                                 35

<210>7

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gctctagagc cgccaccatg ggtgtgccca ctcaggtc                              38

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

gacgccgccg tacgttttta tttccaactt tgtccc                                36

<210>9

<211>360

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc    60

acatgcacca tctcagggtt ctcattaacc agctatggtg tacactgggt tcgccagcct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctggtagtg atatggagtg atggaagcac aacctataat    180

tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta    240

aaaatgaaca gtctccaaac tgatgacaca gccatatact actgtgccag tcactacggt    300

agtacccttg cctttgcttc ctggggccac gggactctgg tcactgtctc tgcagctagc    360

<210>10

<211>318

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc    60

atcatatgtc gagcaagtgt gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag    120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gccaaaatct tagcagaagg tgtgccatca    180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct    240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta cattcacgtt cggctcgggg    300

acaaagttgg aaataaaa                                                  318

Claims (10)

1.一种抗HLA-DR10的特异性嵌合单克隆抗体，其特征在于，它包括：

(a)抗体重链元件，该抗体重链元件含有人抗体重链的恒定区，抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

(b)抗体轻链元件，该抗体轻链元件含有人抗体轻链的恒定区，并且抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

其中所述的抗体重链元件和抗体轻链元件通过二硫键连接。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，抗体重链恒定区为γ类型；而抗体轻链恒定区为κ类型。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由保藏号为CCTCCC200405的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym产生的。

4.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的抗体。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，更佳地该宿主细胞是小鼠骨髓瘤细胞株NSO-clym，保藏号为CCTCC C200405。

7.一种产生权利要求1所述的抗体的方法，其特征在于，它包括步骤：

在表达所述抗体的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的抗体；和分离所述的抗体。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括安全有效量的权利要求1所述的抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。

9.权利要求1所述的抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗恶性B细胞淋巴瘤的药物或用于制备诊断恶性B细胞淋巴瘤的试剂。

10.一种偶联物，其特征在于，它由权利要求1所述的抗体以及与所述抗体偶联的放射性核素构成，所述的放射性核素选自：¹³¹I、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y或⁶⁷Cu。

Images