CN85107267A - 制备茗萘酊的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于制备茗萘酊(Minactivin)的方法,茗萘酊是胞浆素原活化剂的天然蛋白质钝化剂,该种胞浆素原活化剂与侵入性的肿瘤有关,因此,茗萘酊是身体内防御肿瘤的入侵和转移的关键元素。在体外培养能生产茗萘酊的细胞,然后回收细胞的培养上清液,便可生产出茗萘酊。把培养的环境控制一下,便可生产出局部净化的蛋白质茗萘酊,该茗萘酊可作为诊断和治疗肿瘤之用。
Description
本发明是基于发现了在人类血液单核细胞的粘附单层的培养上清液中包括了茗萘酊,这是尿激酶类的胞浆素原活化剂的有效钝化剂。茗萘酊是这种胞浆素原活化剂的天然钝化剂,而这胞浆素原活化剂与侵入性的肿瘤有关,因此,茗萘酊是体内防御肿瘤的入侵和转移的关键元素。另外,茗萘酊亦有其他潜在的用途,可在人类的医药范围内作为临床的药剂,亦可为各类的癌症作离体和活体的诊断和治疗。茗萘酊亦可从巨噬细胞和源自单核细胞的转化细胞的培养中隔离和辨认出来。
按本发明的第一个目标,提供了一种充分地净化的产物,茗萘酊,这种茗萘酊是尿激酶类的胞浆素原活化剂的专性钝化剂。本发明亦提供了一种含有茗萘酊尿激酶类的胞浆素原活化剂的专门灭活剂)的培养上清液,该培养上清液是由生产茗萘酊的细胞离体地培养而得来的。本发明更进一步地提供一种由拥有茗萘酊的培养上清液而得来的产物,其中的茗萘酊至少是局部净化的。茗萘酊另外的特点在下面详细地描述。
本发明的另外一个目标是提供一个生产茗萘酊的方法,这方法包括离体地培养生产茗萘酊的细胞及回收培养上清液,可从培养上清液中回收至少局部净化的茗萘酊。可以培养而生产茗萘酊的细胞包括人血的单核细胞、某些巨噬细胞和转化的人类细胞系,以下会更详尽地透露这些细胞。拥有从细胞分泌出来的茗萘酊的培养上清液可以经过处理,以便将所含的茗萘酊浓缩,然后把上清液再处理,把培养上清液中其他组分移走,以便生产出至少局部净化的茗萘酊。这种的浓缩和净化可以靠例如在苯基-琼脂糖上的疏水交互作用色谱法或在在二乙基氨基乙醇-琼脂糖上的离子交换色谱法来达到,然后把所须产物洗提,这产物可在如西巴扩安蓝-琼脂糖(Cibacron Blue-Seph-arose)或羟基磷石灰上进行的亲合色谱法来净化,以便不含茗萘酊的产物中移去更多的杂质。
试验证实茗萘酊是一种蛋白质,其特征是其表观分子尺寸大约为60-70,000(用凝胶过滤色谱来测定),而它的抑制作用专门是对作Mr 52,000(HPA 52和36,000(HPA36)的胞浆素原活化剂(如尿激酶)特别有效,证据包括ⅰ)它可抑制依赖于胞浆素原的纤维蛋白溶解作用,ⅱ)它可在比色测定中抑制胞浆素原的活化作用,和ⅲ)在培养介质中预先培育后,会不逆地失去胞浆素原的活化作用(可用电泳现象来证明)。由茗萘酊和HPA36型的胞浆素原活化剂所形成的复合体可防洗涤剂,其特征是其Mr在70-75,000的范围内。
进一步显示出茗萘酊优先地抑制尿激酶类的胞浆素原活化剂,而不是胰蛋白酶、胞浆素或“组织”类的胞浆素原活化剂(HPA66 66,000Mr的活化剂)。
茗萘酊不只从人类的单核细胞中生产出来,还可以用某种巨噬细胞和巨噬细胞谱系的转化细胞来生产。特别是把腹膜和骨髓的巨噬细胞培养于粘附单层的培养中,这些巨噬细胞可生产和分泌出相当大量的茗萘酊。当培养于地塞米松时,人类的巨噬细胞系(U937)亦可生产出茗萘酊。在本发明在这方面的进一步发展中,粘附单层培养的血液单核细胞的茗萘酊的生产可受到细胞的活化所刺激或增强,这是由于采用了胞壁酰基二肽(辅助肽)、细菌的脂多糖或活化的人类淋巴细胞的含淋巴激活素的培养上清液。
当加在人类结肠癌细胞系,COL0394的培养时,茗萘酊专门地把浆胞素原活化剂灭活,这可从比色测定和电泳现象中见到。另外,茗萘酊亦可专门地抑制从外科切除所得的人类肿瘤组织的匀浆中浆胞素原活化剂的活动。曾经有人用实验说明出,在肿瘤组织中的浆胞素原活化剂比在相应的结肠中普通组织的浆胞素原活化剂为高。其他的研究者从很多的实心肿瘤中亦记录了相似的观测结果。
因此,由于茗萘酊对尿激酶类的胞浆素原活化剂的专一性和在肿瘤组织内的胞浆素原活化剂含量大大地增强,这产物亦可在组织标本和活体中探置和确定肿瘤的界限,因此,茗萘酊可以活体地描绘肿瘤,特别是在生产胞浆素原活化剂的实心肿瘤如乳房、前列腺、结肠和肺的肿瘤可用茗萘酊来确定。虽然这类癌症通常会受外科的干预而矫正,但茗萘酊是特别有用于辨认外科干预后才形成的细小的转移癌症。由由茗萘酊是一种天然的产物,它的优点是没有抗原性,以及可避免体内的清除作用。当活体地描绘这种肿瘤时,可用标记的茗萘酊〔例如用适当的放射性同位素(如锝99)〕,当施用后,用茗萘酊所描绘的肿瘤的位置和界限可用众所周知的放射性同位素步骤测定。
在组织标本中测定肿瘤的位置和确定界限时,茗萘酊可以如上述一样与放射性同位素结合,亦可用标准的方法,用适当的酶(或其他适当的试剂)用结合法来把茗萘酊标记。当茗萘酊和酶的复合体与组织标本接触时,该茗萘酊会与尿激酶在其分泌处起作用,加上高的尿激酶浓度,因此可以辨认出肿瘤的界限。要在尿激酶高浓度的地方探测出茗萘酊和酶的复合体,可用众所周知的方法,例如加上酩的基质,跟着加上一种指示剂,以便测定酶在基质上的作用。
除了用来描绘肿瘤外,茗萘酊亦可用来减低肿瘤的胞浆素原活化剂的活动,以直接治疗肿瘤,由于在肿瘤侵略周围的组织的过程中亦牵涉到这种活动,因此,茗萘酊可控制并防止肿瘤的侵入。
以下是各附图的简单描述:
图1
用血液中单核细胞培养来生产茗萘酊,粘附的单核细胞是培养于:对照介质△-△中,加上脂多糖(0.1μg/ml)0-0或胞壁酰基二肽(10μg/ml)口……口。A,取得培养上清液,并用尿激酶来测定,每隔24小时换上新鲜的介质。B,溶胞产物中的茗萘酊含量。
图2
茗萘酊的活动对培养中单核细胞数目的关系曲线。把培养了24小时的上清液在以下的情况下测定(并显视了细胞的数目):未稀释的△-△,稀释至1.5口……口,1∶10 0-0或1∶20-。
图3
用人类的腹膜巨噬细胞培养来生产和分泌茗萘酊。粘附的巨噬细胞是生长于对照介质△-△或胞壁酰基二肽(10μg/ml)口-口中。下面的两条曲线代表溶胞产物,而上面的两条线叫上清液。
图4
在次培养中用人类骨髓的巨噬细胞来生产和分泌茗萘酊,条件跟图3的一样。
图5
茗萘酊对纤维蛋白溶酶的影响。
在上面两行中,蛋白酶溶液(10μl)用茗萘酊培养上清液(10μl)预先培育,在最下的一行则没有加入茗萘酊培养上清液。在补充有胞浆素原的纤维蛋白/琼脂糖的凝胶中开一些小井,并把5μl的混合物加在小井内。所采用的酶和加在每20μl预先培育液中混合物的分量是:2·胰蛋白酶,100ng;3·胞浆素,600ng;4·CUK〔加州生化(Calbiochem)尿激酶〕,50MPU;5·SUK(σ尿激酶),100MPU;和6·未稀释的黑素瘤培养上清液。对照的小井1和7分别载有测定缓冲液和茗萘酊的上清液。该凝胶于37℃温育20小时。
图6
用茗萘酊预先培育后再经(十二烷基硫酸钠)SDS-PAGE
从CUK(30MPU,第1和第2行),一月桂胺MLA144(30μl未稀释的培养上清液,第3和第4行)、人类的黑素瘤(20μe培养上清液,第5和第6行)和老鼠13762的肿瘤(20μl1%的匀浆,第7和第8行)中得到的胞浆素原活化剂用茗萘酊培养上清液(30μl)预先培养(双数),单数的是没有加入茗萘酊培养上清液,跟着就加于SDS-PAGE,于37℃温育20小时,便可在涂敷有纤维素的凝胶上形成很多带。
图7
预先用茗萘酊培育以钝化CUK
等分的尿激酶(4MPU)用单核细胞的培养上清液(6μl)于23℃预先温育,温育的时间如图所示,然后如测试所述的比色测试。上面的一条曲线是用缓充液预先培育。
图8
用茗萘酊来漏定CUK
等分的尿激酶(4MPU)用茗萘酊上清液(20μl)的稀释液预先培育,然后如文中所述的比色测试。
图9A
蛋白酶抑制剂控制茗萘酊对CUK的钝化作用等分的尿激酶(20MPU)用以下的蛋白酶抑制剂预先培育:第1行是缓冲液作为对照;第2行是抑肽酶(0.2mg/ml);第3行是σ抗胰蛋白酶(16μg/ml);第4行是4-氨甲基环己烷羧酸(Tranexamic acid)(3mM);第5行是碘乙酰胺(3mM);第6行是乙二胺四乙酸;第7行是黄豆的胰蛋白酶抑制剂(0.16mg/ml);第8行是十二烷基硫酸钠(0.6%);第9行是苯甲脒(3mM);而第10行是茗萘酊的培养上清液(20μl)。
图9B
在有蛋白酶抑制剂的情况下把CUK钝化
重覆图9A所述的预先培育,但在每个有蛋白酶抑制剂的预先培育中(第2至第9行)同时加入茗萘酊的培养上清液(20μl)。
图10
没有加上白朊为添加物的2.5ml的茗萘酊培养上清液的洗提分布图-(测量了尿激酶的抑制)及1.0ml无限的RPMI加上1%人血血清清蛋白-(测量了蛋白质)。该柱装满了塞弗夸尔(Sephacryl)S300(95×1.5cm),然后用含0.15M Nacl的50mM甘氨酸(PH7.8)以6ml/hr的流率来洗提。箭嘴代表孔隙体积和床体积。
图11
对蛋白酶的抑制的径向扩散纤维素凝胶测定
A排是含HPA66的人体黑素瘤细胞系的上清液;B排是含HPA52和HPA36的尿激酶;C排是胰蛋白素,而D排是胞浆素。第1和第2行分别包括了人体腹膜巨噬细胞的培养上清液和血液单核细胞的培养上清液,而第4-6行分别包括骨髓巨噬细胞的溶胞产物、腹膜巨噬细胞的溶胞产物和血液单核细胞的溶胞产物。第3和7行分别代表包含培养介质和溶胞作用的缓冲剂的对照。
图12
对蛋白酶的抑制的径向扩散纤修素凝胶测定
A排是作为对照缓冲液;B排是从单核细胞来的用苯基-琼脂糖净化过的茗萘酊;C排是从U937细胞来的用苯基-琼脂糖净化过的茗萘酊;D排是胎盘抑制剂(加州生化)。
第1行是60μg/ml的猪的胞浆素(σ);第2行是含有HPA52和CUK的5PU/ml尿激素;第3行是含有HPA36和SUK的5PU/ml尿激素;第4行是含有HPA66的人体黑素瘤细胞系的上清液(MM170);第5行是老鼠的尿激酶和稀释至1/10的老鼠尿。
图13
U937和从单核细胞得来的茗萘酊的电泳迁移率
样本在6-16%变化率的不变性(没有SDS)的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,并用10毫升的1PU/ml SUK于23%温育1小时,然后铺在纤维素/琼脂糖的凝胶上,再显影一夜。亦电泳了相同的样本,然后用考马斯蓝来染色。第4行是分子量的标准;第3行是用苯基-琼脂糖净化过的U937茗萘酊;第2行是用苯基-琼脂糖净化过的单核细胞的茗萘酊;第1行则和第3行一样。
图14
单核细胞的茗萘酊在苯基-琼脂糖上的净化分布图
一柱的苯基-琼脂糖(床体积为110毫升)首先与含有2M Nacl的50mM的甘氨酸缓冲液(PH7.8)均衡。然后加进与2M Nacl相匹配的单核细胞上清液,接着用另外的甘氨酸-Nacl冲洗。在甘氨酸缓冲液中Nacl梯度下降时,出现结合的茗萘酊的洗提。痕量是:蛋白(在Lowdy实验条件下OD750nm)Nacl浓度-并且尿激酶的茗萘酊抑制(转化高峰)-。
图15
单核细胞的茗萘酊的活体标记
粘附的单核细胞如中文所述的,在有胞壁酰基二肽的情况下培养,并加入35S-甲硫氨酸(1mci,800Ci/mmol,阿默森(Amersham)。在3日的期间内,在图示的时间中把等分的上清液移走,然后如文中所描述的用苯基-琼脂糖把茗萘酊从上清液中澄清出来。用森特康30(Centricon 30)〔阿米康(Amicon)〕把每等份浓缩50倍,然后把其中的30μl用SDS-PAGE在5-15%的丙烯酰胺梯度上分析。用放射性同位素示踪的蛋白质可用莹光图照相术来测定〔放大。阿默森(Amerham)〕,然后把凝胶在柯达0-MAT X光底片上暴光10天。第2至第6行是在显示的时间中移去的样本,第7行是用苯基-琼脂净化而制备的茗萘酊,第1是高分子量的标准,而图8则是低分子量的标准。
图16
活体标记的单核细胞茗萘酊的净化和尿激素合成物的形成
这里的条件是跟图15和文中所述的一样,先把每种样本浓缩10倍,然后才把其中的30μl加载在凝胶上,暴光的时间为18月。A行是用苯基-琼脂糖净化过的茗萘酊;B行是用蓝琼脂糖净化过的茗萘酊;C行是与B行相同,所不同的地方是在电泳之前在样本中加入0.1%的2-巯基乙醇。在每种样本本都标明了有(+)或没有(-)用27PU SUK于23℃预先温育90分钟。外面的两行是分子量的标准。
图17
白明胶对制备茗萘酊的影响
U937细胞(1.3×106细胞/毫升)如文中所述的在不含血清的介质中加上地塞米松来培养,有些是在有0.7%白明胶的介质中培育(×-×),有些则在没有白明胶的介质中培育(°-°)。
图18
用阶式PH洗脱法的苯基-琼脂糖色谱法
该色谱法如例1所述的方法来进行。在A位置中,换上了50mM柠檬酸,PH5.0,0.5MNacl的脱液,在B位置中,则换上了50mM甘氨酸(PH7.8)的洗脱液。
图19
用阶式PH洗脱法的二乙基氨乙基-琼脂糖色谱法
含上清液的茗萘酊如例3所述的净化过程,在二乙基氨乙基-琼脂糖凝胶柱中分馏。空心的立柱代表了茗萘酊的活性,而蛋白质则用-A275来代表。
图20
初步的不变性的凝胶电泳
用苯基-琼脂糖净化过的茗萘酊,如例4所述的净化过程,用不变性的凝胶电泳再进一步分馏。空心的立柱代表了从凝胶片洗脱出来的茗萘酊的活性,下面显示的是相等长度的凝胶,用银的染色法染色。
图21
用盐的洗脱法的二乙基氨乙基-塞弗西尔(sephacel)色谱法
含上清液的茗萘酊如例6所述的净化方法在一个二乙基氨乙基-塞弗西尔的柱上分馏。空心的立柱代表了生物的活性;……是代表A275;-是代表Nacl的浓度。
图22
用PH梯度的二乙基氨乙基-塞弗西尔色谱法
含上清液的茗萘酊如例7所述的净化方法来分馏。空心的立柱代表在物的活性,实心的立柱代表蛋白质的含量;……代表A275,而-则代表PH。
图23
把从二乙基氨乙基-塞弗西尔中得出来的部分经过SDS-PAGE
把图22所显示的二乙基氨乙基-塞弗西尔色谱法所得的各部分汇集,从中移去相等于70μg蛋白质的等分,然后如琳利(Laemm-li)(26)所述的用SDS-PAGE来分析:第1行是分子量的标记;第4行是第30至40的部分;第5行是第40至50的部分;第6行是第50至60的部分;第7行是第60至70的部分;第8行是第70至80的部分;第9行是第80至90的部分;第10行是第90至100的部分。
图24
羟基磷灰石色谱法
含上清液的茗萘酊如例8所述的净化方法分馏。空心的立柱代表生物活性;实心的立柱代表蛋白质的含量;……代表A275;-则代表磷酸钠的浓度。
图25
从羟基磷灰石色谱法的部分经SDS-PAGE
把图24所显示的羟基磷灰石色谱法所得的部分选择性地汇集,再从中移去相等于70μg蛋白质的等分,然后如琳利(Laemmli)(26)所述的方法用SDS-PAGE来分析。第8行是第70至80的部分;第9行是第80-90部分;第10行是第90-100部分。
图26
以下是频率分布的矩形图显示出在人体结肠粘膜的匀浆内的胞浆素原活化剂的比色分析。该种胞浆素原的基质包含了少许的胞浆素,因此所得的结果包括了酶原和活性的酶的总和。该活性可以表示为在412nm的吸收度。在同一个测量环境下,4mpu工业用的尿激素可在412nm下产生0.9的吸收度。
图27
15个结肠肿瘤样本的胞浆素原活化剂的活性(条纹的矩形)与同一结肠中正常的组织的胞浆素原活化剂的活性(实心的矩形)。该些样本从左至右的排列次序是按肿瘤:正常组织的比率(T/N)的增加而定的。
图28A
在SDS-PAGE后涂上纤维素琼脂糖,可以显示出在正常结肠粘膜的典型匀浆中所含的胞浆素原活化剂的种类。第1行代表未经处理的样本,第2-4行显示出于37℃用人体的胞浆素原把该匀浆分别温育30,60和120分钟的影响。裂解的范围包括a)Mr110,000的胞浆素原活化剂;b)Mr96,000的胞浆素原活化剂;c)Mr85,000的胞浆素;d)Mr66,000的HPA66。
图28B
在SDS-PAGE后涂上纤维素琼脂糖可显示出典型的结肠癌样本的胞浆素原活化剂的种类。第1行代表未经处理的样本,第2-4行代表于37℃用人体胞浆素原分别温育30,60和120分钟A至D的范围跟正常的结肠一样,E的范围是Mr52,000的HPA52,而下的的范围是Mr33-36,000的HPA33-35。
图29A
一种组织上正常的结肠样本,显示出异常的HPA52的活性,这图显示出茗萘酊对该结肠匀浆内的胞浆素原活化剂的影响。第1行显示出用对照来处理的样本;第2行显示于23℃用茗萘酊预先温育60分钟的影响;第3行代表于37℃用胞浆素原预先温育30分钟,然后于23℃用对照的缓冲剂预先温育60分钟后的影响;在第4行中;该匀浆用胞浆素原于37℃预先温育30分钟,然后于23℃暴露于茗萘酊60分钟。裂解的范围包括:A-Mr85,000的胞浆素;B-Mr66,000的HPA66;C-Mr52,000的HPA52和D-Mr33-36,000的HPA33-36。
图29B
如图29A一般处理的结肠肿瘤匀浆。
图30
将人体的尿激素的比色活性用茗萘来滴定
该尿激酶用茗萘酊于23℃预先温育90分钟,然后再稀释至适合于测量的范围内。该3条曲线由左至右分别代表1000mpu、100mpu和10mpu的尿激素。
图31
从结肠细胞和组织得来的胞浆素原活化剂的比色活性用茗萘酊来滴定。该3条曲线由左至右分别代表正常粘膜的提取液(大约0.5mpu)和结肠肿瘤的提取液(大约10mpu),后者后来被积为酶原。
图32
茗萘酊对肿瘤细胞培养中胞浆素原活化剂的影响
第1行是没有加上任何额外物质的培养;第2行是加入了胞浆素原;第3行是加入了胞浆素原和茗萘酊;第4行是加入了胞浆素原、抑肽酶和茗萘酊。
图33
把图32相同的实验中的培养上清液用比色法来测定。
茗萘酊的一般特性:
茗萘酊在高于56℃的温度下是不耐热的,但在-20℃下冻结和熔化则仍能保持稳定(在一个循环后失去0-5%的活性)。在清毒情况下收集的含上清液的茗萘酊,可在有艮他霉素和4℃的环境下储藏两个月而没有显著地减低其活性。
虽然离子的强度对胞浆素原的活化作用有逆向的影响(19),但茗萘酊与胞浆素原活化剂的相互作用似乎跟离子强度是无关的。虽然尿激素的活性在比色测试中大大地受到盐的浓度的增加所抑制,但茗萘酊对于减低尿激酶的活性的影响亦在比例上相同。
茗萘酊在5至9的PH范围内和4℃下是比较稳定的。丙醇和甲醇(大过10%)可完全地消除茗萘酊的活性。
把茗萘酊在塞弗西尔S300〔法马西亚(pharmacia)〕上和有盐的情况下经过凝胶过滤,这显示出茗萘酊的表观分子尺寸跟标准的血清清蛋白相同,即是在60-70,000之间(图10)。在这柱上涂上SDS-PAGE-纤维素(如上文所述)可分析出浓缩茗萘酊的专一性,所得的结果跟图6中从单核细胞培养所得的茗萘酊上清液的结果一样。不过,所观察到对尿激酶的钝化作用并不是血清清蛋白的特性,这是由于(a)人体的血清清蛋白对尿激酶的比色测试没有影响,(b)在蓝琼脂糖凝胶(法马西亚)做固定相的清蛋白亲合色谱柱中,不能保持茗萘酊的活性不变,(C)人体血清清蛋白的基质浓度不会受上述的实验中胞壁酰基二肽或细胞种类的影响而转变,(d)没有加入清蛋白或血清添加物的单核细胞培养亦可生产茗萘酊。
以下是茗萘酊对于诊断和治疗肿瘤的作用:
在很多种人类的重要癌症中,尿激酶型的胞浆素原活化剂(HPA52)比正常组织的为高。最近马克斯和他的同事进行了广泛的研究,研究的范围包括肺肿瘤,前列腺的肿瘤、乳房的肿瘤和结肠的肿瘤(30-32),特别注意到酶的含量和种类,以及在短期的培养中组织分离块的分泌率(34-35)。人们进一步确定HPA52是一种不同的基因产物(36),不能从随遇地存在于布满血管的组织(37)(如结肠内皮细胞)中的组织型胞浆素原活化剂经过蛋白水解或其他的变化而得出HPA52。很清楚地知道在人体结肠癌的发展过程中,在上皮细胞中发生的基因表达的转变,引致更高的HPA52。
牵涉到细胞的胞浆素原活化剂的生物作用,包括那些与侵入和组织破坏有关的生理作用,例如发炎和肿瘤的转移(38)。牵涉到胞浆素原活化剂,并与其作为肿瘤入侵的介体有关的特殊作用包括它对刺激细胞分裂能力(39)、致变细胞表面的能力(40)、增加细胞的迁移的能力(41)、消化包围在肿瘤周围的纤维素的能力(42)和活化胶原酶的能力(43)。
茗萘酊是尿激酶类胞浆素原活化剂(HPA52和HPA33)的有效而专性的钝化剂,另外,茗萘酊亦有很多其他的用途,可作为临床的药剂及诊断慢性发炎和各类型的癌症,亦可用于治疗这些情况。在体内,专性地调节HPA52的活性后,茗萘酊不会对组织型的胞浆素原活化剂(HPA66)在维持止血的作用中有任何影响。另外,由于茗萘酊是一种天然产物,它的优点是没有抗原性,并可避免体内的清除问题。
因此,茗萘酊可作为发炎状况的指数。目前,慢性发炎是用类固醇来治疗的,但通常都很难控制治疗的进度。如果采用一种茗萘酊的抗体,可以控制在体液和组织内的巨噬细胞的活化状态,因而控制治疗的进度。发炎或慢性溃疡和对粘膜表面的细胞层或上皮的损伤,引致大量的血液单核细胞渗入损伤的范围内。在这环境下,那些单核细胞可被刺激而生产茗萘酊,茗萘酊的产量与发炎的程度有关。
另外,茗萘酊亦可作为在组织样本和在体内辨认和定出肿瘤的范围的试剂。虽然实心的肿瘤通常可用外科手术矫正,但采用茗萘酊可以辨认出在手术后才产生的细小的转移了的癌。在分析组织样本时,茗萘酊(或它的抗体)可用一种同位素(如I131)来标记,亦可与适当的酶或其他的化学剂结合。当与组织的样本接触时,茗萘酊会在肿瘤型的胞浆素原活化剂的分泌处与该种胞浆素原活化剂结合,因此可辨认出肿瘤的范围。要把结合了的茗萘酊显影可用众所周知的方法来完成(44-47)。要在体内把肿瘤显影,可以先用一种适当的同位素(如锝)把茗萘酊标记,用施用后,再把众所周知的放射性同位素法(47-50)来测定肿瘤的位置和范围。另外,由于茗萘酊只与活性形态的胞浆素原活化剂结合,因此茗萘酊会把正在生长或入侵期的肿瘤细胞作为目标。
除了诊断的作用之外,茗萘酊亦可直接地治疗肿瘤。茗萘酊是肿瘤侵入周围的组织时所牵涉到的酶的专性抑制剂,因此可控制并防止肿瘤的生长和转移。另外,茗萘酊亦可作为药物的输送系统,把外源凝集素或毒素直接输送至正在生长的肿瘤中,这样对专一性和有效的除瘤能力上有很多的优点。
以下的例子与附图进一步详细说明出茗萘酊的生产、净化及辨认的方法,但这些例子并不是用来局限本发明的范围。
例1
茗萘酊的生物辨认和特性鉴定
方法
1.胞浆素原活化剂的比色测定
科尔曼(Coleman)和格林(Green,12)的方法可用来测定多种胞浆素原活化剂的酶,所用的测定缓冲液是含0.1%三硝基甲苯(Triton)X-100和0.1%白明胶的50mM甘氨酸(PH7.8)。采用了稀释的方法,以便把活性在每一测定中维持于2-8mplough units(mpu)之间。把10μl酶、20μl胞浆素原(0.1mg/ml)和20μl测定缓冲液于37℃温育45min,然后加入1ml的胞浆素测定剂(参照参考文献12),再于37℃温育30分钟。该反应在加入20μl抑肽酶(0.3mg/ml)后停止了,而其吸收率控制于412nm。在单核细胞培养中用来补充RPMI的人体血清清蛋白(1%)对于用这方法来测定尿激酶是没有影响的。
从汇集的新鲜血浆经亲合色谱法的两次循环在一座赖氨酸-琼脂糖(法马西亚)柱上(13)净化出人体的胞浆素原,该胞浆素原在测定时的最后浓度为0.3μM。两种在工业上可得到的人体胞浆素原活化剂是:加州拉乔拉加州生化贝林公司(Calbio chem-Behr-ing Corp La Jolla,CA·)出品的参考标准(第103285号,1700pu/瓶)的尿激酶;和σ尿激酶(第1017-05991号,大约40,000pu/mg蛋白质),在本说明书内,这两种分别积为CUK和SUK。SDS-PAGE和纤维涂敷的显影(参照下文)都显视出CUK和SUK是Mr52,000胞浆素原活化剂(HPA52)及其Mr36,000的蛋白水解产物的混合物。让老鼠的乳腺癌系13762的肿瘤由艾·拉姆肖士(Dr·I·Ramshaw),实验病理学系,JCSMR,所发现〕与含0.5%三硝基甲苯×-100的50mM甘氨酸(PH7.8)均匀。从σ尿激酶中可得到牛的胰蛋白酶(Ⅸ类)、牛的凝血酶(1级)和猪的血清。
2.茗萘酊的比色测定
于培养上清液和溶胞产物内的茗萘酊的数量可以用在尿激酶参考标准的比色测定所产生的抑制来测定的(12)。该些样本(20μl)与4mpu尿激酶(20μl)于23℃预先温育90分钟,然后再加入胞浆素原,把茗萘酊直接加在预成的胞浆素中来测定,从对照中可证明该抑制是在胞浆素原的活化的程度上,而不是单单抑制胞浆素。一单位的茗萘酊定义为抑制1pu尿激酶所须的分量。
3.径向扩散测定
纤维蛋白原(σⅩ型)、人体胞浆素原和凝血酶(σ1级)被安排于1.2毫米厚的1.25%琼脂糖(美国ME,罗克南(Roch-lard)FMC公司,诗普拉其(Sea Plague)凝胶基体上。于37℃凝结后,该凝胶再于4℃硬化,然后开了3毫米的小井,以便加入尿激酶和茗萘酊的混合物(5μl)。该凝胶在一个调湿的盒内于37℃温育20小时,然后用盐水彻底洗净,跟着再用酰胺黑来染色,以便增强该溶解作用。
4 胞浆素原活化剂的活性SDS-PAGE和纤维素涂敷的显影
加在SDS电泳凝胶上的样本包括了在测定缓冲液内的胞浆素原活化剂的酶或于23℃与培养上清液和/或蛋白酶抑制剂预先温育了90分钟的酶,再加上SDS样本缓冲液,使最终的体积为100μl所采用的蛋白酶抑制包括抑肽酶、α抗胰蛋白酶(σ)、黄豆的胰蛋白酶抑制剂(σ)、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、4-氨甲基环己烷羧酸〔奥尔德里奇药厂(Aldrich Chemica-ls),密尔沃基(Milwaukee)WI〕和苄脒。那些凝胶片是用11%聚丙烯酰胺造的,要在垂直的位置操作,可用三硝基甲苯X-100来清洗,然后按格雷拉尼-皮珀卢和赖克(13)(Granelli-piperno & Reich)的方法用一种纤维素/琼脂糖的凝胶的接触分解作用来显影。于37℃,纤维素分解的显影时间通常是5至8小时。要估计酶的分解谱带的分子重量,可以比较工业用的酶的位置和在聚丙烯酰胺凝胶上染色的标准蛋白质(法马西亚的低分子量全套元件)的位置。
5.形态学和细胞化学
对于相差显微镜,粘附的单核细胞或单层的巨噬细胞要清洗两次,在检查之前,在0.1M二甲胂酸缓冲液(PA7.4)内的1.5%戊二醛于室温下至少固定30分钟(9)。
在香登萨瑟恩(Shandon Southern)离心机中制备出细胞离心分离制备,简单来说,是把在10%牛胎血清中含50,000细胞的0.2ml等分用500rpm的速度旋转3分钟。然后把该制备用风筒快速地吹干,再用梅-格伦沃尔德的吉姆萨氏染剂(May-Gru-nwald Giemsa)来染色。
用α-乙酸萘酯为基质可测定出非专性酯酶的存在与否(10,11)。
要测定吞噬活动,可在含10%人体AB血清和1.1um胶乳珠(σ)(其浓度为每细胞有100粒珠)的RPMI-1640内把粘附的单层细胞或细胞悬液于37℃温育60分钟。清洗该单层细胞或细胞悬液可移去未吸入的珠,用150×g于20℃洗10分钟,再用RPMI-1640洗3次。吸入了2或更多粒胶乳珠的细胞可判断为吞噬的。
6.单核细胞和巨噬细胞的制备
a)人体血液单核细胞
沃登谷医院(Woden Valley Hospital)的红十字会输血服务组把人体单核白血球用菲盖-海珀克〔澳洲雪梨的法马西亚药厂(pharmacia fine Chemicals)〕的梯度上从淡黄层中分离出来。在pi/Nacl中于4℃清洗4次,把污染的血小板移去后,把该细胞片再悬浮于含60单位/毫升庆大霉素的RPHI-1640中〔纽约大岛(Grand Island)吉布克(Gibco)〕。要得到净化的单层单核细胞,可以把在RPMI-1640内的107个单核细胞涂在30毫米的小井内(林保多井板,种类第7605805号),并加入10%AB血清,该些小井是预先用2毫升的人体AB血清涂敷30分钟的。让单核细胞于37℃在含5%CO2的空气中粘附60分钟,把该单层用预热至37℃的RPMI-1640清洗6次,便可把不粘附的细胞移去。
多种方法都可显视出该粘附单层含有多过85%的单核细胞。把单层细胞用多色来染色显示94±6%的细胞是单核细胞,该单核细胞拥有大而圆或锯齿状的细胞核,并有嗜碱性的细胞质。把细胞质的酶的非专性酯酶染色,显示出该单层对这单核细胞标志有85±2%是正的。91%的粘附细胞吞噬了胶乳珠进一步证实显示出单核吞噬细胞的形态和组织化学的状态亦呈现了这种特色的功能特性。
当离体地培养时,单核细胞在尺寸上和形态上产生了很大的变化。培养的单核细胞的离心分离制备显示出在培养的过程中,单核细胞不断地增加体积,直至在7天后,很多细胞的外观尺寸比从前大了多过两倍,间中亦可见到双核的细胞。当单核细胞的体积增加时,它们的细胞质大量地形成空泡,而细胞质的颗粒亦越来越明显。进一步地培养引致更多的多核巨细胞的形成。
b)腹膜巨噬细胞
为慢性肾病而进行例行的腹膜透析的病人中抽取2公升的透析液,该透析液于20℃并以300×g的速度离心分离10分钟,所得的细胞片再浮于50ml的RPMI-1640中,然后再于20℃和200×g的速度离心分离10分钟。把那些细胞再悬浮于RPMI-1640中,使最终的浓度大约为每毫升有2×106个细胞,用3ml的菲盖-海柏克铺在6ml等分的腹膜细胞悬浮液下面,然后于20℃并用400×g的速度离心分离20分钟,再把那些细胞悬浮于含10%人体AB血清的RPMI-1640中,使浓度转为1×106/ml。
把腹膜的清洗液经过菲盖-海柏克的梯度便可得到高产量的单核细胞,以形态的准则可判断出有47%的细胞是巨噬细胞。单核细胞的离心分离制备显示出该巨噬细胞的种群是异种的,包括有大而成熟的细胞,这种细胞有大量的细胞质,间中更有两个细胞核,并包括有更多单核细胞的特色的细小细胞,这种细胞有锯齿状的细胞核,并有更高的细胞核对细胞质的比例。
如上述的单核细胞一样,把腹膜巨噬细胞粘附在塑胶的培养盘内,便可进一步把腹膜巨噬细胞净化。把不粘附的细胞层移去后,只要每2-3天把培养介质更换一次,便可把活的腹膜巨噬细胞维持于培养中达3星期之久。用非专性的酯酶染色可测定出腹膜的单层通常包含有多过87%的巨噬细胞。
c)从骨髓中取得的巨噬细胞
从矫形外科手术中得到的新鲜人体回肠峭和肋骨髓可分散于RPMI-1640的介质内,该种介质包含有10%巨细胞肿瘤(GCT)的培养上清液(美国纽约大岛(Grand Island)吉布克一拜沟特(Gibo-Biocult)和10%牛胎血清。这初步的培养维持在涂敷上凝胶的瓶内7天(1),在这段时间后,如单核细胞一样的把单核细胞或巨噬细胞粘附在培养碟上,以便把它们净化,第二次的粘附体培养可用来测定茗萘酊,所得的细胞有超过90%对非专性的酯酶有正的反应。
d)结肠粘膜的巨噬细胞
按戈尔德和多伊(Golder ard Doe)的方法,把结肠粘膜用酶酶解聚,便可从切除的结肠中获得巨噬细胞(2)。这些细胞如单核细胞一样,在RPMI-1640内作为粘附单层来生长,所得的细胞超过85%对非专性的酯酶有正的反应,并且可吞噬羊的红血球。
7.细胞的培养
a)单核细胞和巨噬细胞
把单层的单核细胞或巨噬细胞培养于RPMI-1640,并加入1%人体血清清蛋(澳洲墨尔本澳大利亚联邦血清化验所〔(Commonw-ealth Serum Labs·)〕。从上述(a)-(d)的来源所得的细胞培养,尽量维持于3×106细胞/毫升介质的比例。
以下的试剂是用于培养细胞的实验中:
a)胞壁酰基二肽〔N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺,美国加州圣卡洛斯(San Carlos)半岛化验所(pen insula Laboratories)〕,浓度为5μg/ml,b)沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595的细胞壁的酯多糖(3)。要制备后者,把不溶于水的提取物在0.1%三乙胺中用声处理,然后对着Pi/Nacl进行彻底的透析,该培养的最后浓度为0.1μg/ml。所采用的地塞米松和12-0-四癸烷酰佛波醇-13-乙酸盐(phorbol myrastate acetate)(美国MO·圣路易斯σ化学公司)的最终浓度分别为0.1μM和10ng/ml。
b)转化的细胞系
人体的类巨噬细胞的细胞系U937(4)和HL60(5)可从乌利维奇博士(Dr.S.Ulevitch)和佩因特博士(Dr.R.G.Pain-ter)得到(美国加州拉组拉(La Jolla)斯克里普斯疹所及研究基金(Scripps Clinic,and Research Foundation)。U937细胞系亦可从美国种类培养收集所(American Type Cul-ture Collection)〔美国马里兰(Maryland)罗克维尔(Ro-ckville)〕中得到。RC2A(6)可从克拉夫特博士(Dr.N.Kr-aft)〔澳州墨尔本亨利王子医院(Prince Henr′S Hospita-m)〕MLA144是长臂猿的T-淋巴细胞系(7)。人体的红细胞系K562(8)是由沃登医疗(Woden Valley Hospital)癌症研究部(Cancer Research Unit)的沃伦博士(Dr.H.S.warren)所发现的,而COLO 394是人体结肠的癌细胞系,由墨尔本皇家医院(Royal Melbourne HOspital)路德维格癌症研究所(Ludwig Institute of Cancer Research)的怀特黑特博士(Dr.R.Whitehead)所提供。在抽取上清液来分析之前,上述所有的细胞都是生长在不含血清的RPMI-1640介质中。溶胞产物是在有0.5%三硝基甲苯×-100的情况下制备的,并可用作酶的研究。
结果
1.在细胞种群中生产茗萘酊
a)人体血液的单核细胞
在科尔曼和格林(Coleman and Green)(12)(图1)的比色测定中看到尿激酶的活性被抑制了,这可显出茗萘酊由粘附的人体单核细胞中产生,并存在于无血清的介质中。无论细胞的起始粘附是否由人体血清所促进,亦可观察到这种抑制。在制备粘附的单层时所得的不粘附单核细胞部分不会在培养中产生大量的茗萘酊。
采用首24小时的单核细胞的培养上清液可得到最高的茗萘酊活性,接着在连续的每24小时内所产生抑制剂的速度一直在下降,直至在4天后,生产抑制剂的速度是极不显著,这效果可在培养上清液和溶胞产物中观察到。不过,用胞壁酰基二肽或细菌的脂多糖在体外把单核细胞活化,引致持续地生产和分泌茗萘酊(图1A和1B)。在首24小时内在培养上清液中的抑制剂量与细胞的数目有关(图2)。在密度大于106细胞/毫升的培养中生产出最多的茗萘酊,在更高的细胞密度时,则生产出较少量的茗萘酊。在前已结说过用地塞米松(10-6-10-8M)来处理细胞培养,可导致胞浆素原活化剂的一种抑制剂在人体的成纤维细胞培养中合成,但对茗萘酊的生产则没有影响。
b)人体腹膜的巨噬细胞
虽然新鲜分离出来的血液单核细胞的溶胞产物不含茗萘酊(参阅图1B),但所有新鲜分离出来的粘附腹膜巨噬细胞的溶胞产物则含有很高的茗萘酊(大约30%的抑制)尚茗萘酊的含量亦在培养时继续增加(图3)。茗萘酊的持续生产亦可在相对的培养上清液所量度到的大量的分泌产物所反影出来。与对照的单核细胞培养所不同的是在3天的培养期间内,腹膜巨噬细胞的溶胞产物的茗萘酊量都维持在很高的水平。这细胞种群在形态上好像大多数是由新近补充的单核细胞组成的,这显示出重复的透视所导致的轻微发炎的活体刺激,足以活化单核细胞,以便在腹腹腔内生产茗萘酊。由于加入胞壁酰基二肽不会进一步在溶胞产物或上清液中增加茗萘酊的生产(图3),因此腹膜的巨噬细胞好像是对进一步的活化作用没有反应。
c)从骨髓中取得的巨噬细胞
用GCT(巨细胞肿瘤培养上清液)刺激第一次的骨髓培养7天后,便可得到粘附的骨髓巨噬细胞。由于这些细胞只能在组织的7天的第一次培养后才能作为第二次培养来研究,因此,这些细胞在起始时的茗萘酊的生产和分泌不能直接与新近分离的血液单核细胞或腹巨噬细胞比较。
尽管如此,在7天的第一次培养后的第二次培养中所得的粘附骨髓巨噬细胞的溶胞产物显现了高度的茗萘酊活性,但无论在有无胞壁酰基二肽的情况下茗萘酊的活性都会下降(图4)这些骨髓细胞亦会分泌大量的茗萘酊至上清液中,在上清液和溶胞产物中的茗萘酊的分量都不会受到胞壁酰基二肽所影响。
d)结肠粘膜的巨噬细胞
从人体结肠切除后所酶解聚的粘膜中分离出来的巨噬细胞在培养中只有很有限的生产茗萘酊的能力,而茗萘酊量与上述的三个来源(在四个独立的实验中,24小时的上清液有平均4%的抑制)比较是毫不显著的。这些低的茗萘酊量不能因为加入沙门氏菌的脂多糖(0.1μg/ml)至培养中而增加。
要决定肠的巨噬细胞缺乏反应是否由长期暴露于分离时所用的降解酶(胶原酶和脱氧核糖核酸酶)所造成,可以把正常的人体血液单核细胞放在肠的巨噬细胞制备的上清液介质中培育数小时。用酶处理过的血液单核细胞在接着的培养中维持了它们生产和分泌茗萘酊的能力(参照图表1)。
图表1
对照的单核细胞 用酶处理
溶胞产物 90% 100%
上清液 67% 72%
用含脱氧核糖核酸酶和胶原酶的结肠解聚上清液培育前后的人体血液单核细胞的茗萘酊的生产。结果可用单核细胞对尿激酶测定的抑制的百分比。
因此,血液的单核细胞好像是处于理想的发育阶段,有分泌茗萘酊的潜能。当离体地用胞壁酰基二肽来活化或积极地在体内增加发炎点便可实现此潜能。另一方面,从肠粘膜分离出来的成熟的组织巨噬细胞失去了它们产生和分泌茗萘酊的能力,就算有刺激时亦不能产生和分泌茗萘酊。
e)人体的巨噬细胞系U937
用科尔曼和格林(Coleman and Green)的方法(12)来测定从人体的巨噬细胞系U937所得的上清液不能测定出有茗萘酊的活性。不过,当这细胞系在有地塞米松(1μM)的情况下培育,在培养上清液中可量度到高的茗萘酊量。这结果可以用U937细胞伴随的胞浆素原活化剂的生产来解释,该胞浆素原活化剂有效地与所产生的茗萘酊结合,因而使比色测定法不能测定出茗萘酊的存在。其实,当把U937细胞从含地塞米松的介质移走72小时后,可导致高量的胞内胞浆素原活化剂,这可靠测定在0.5%三硝基甲苯×-100的细胞提取物中的胞浆素原活化剂来量度得到。在无地塞米松的情况下培养超过7天的U937细胞完全失去它们对产生茗萘酊的能力,但就算加入最终浓度为10μM的地塞米松亦不能恢复茗萘酊的生产。
由U937细胞所分泌的茗萘酊量大约比在培养中用胞壁酰基二肽诱发过的单核细胞所产生的茗萘酊量低出4倍。不过,在培养的U937细胞中加入佛波醇酯(如12-0-四癸烷酰佛波醇-13-乙酸盐)可令到U937细胞所分泌茗萘酊量增加16倍。从人体类巨噬细胞系RC2A或人体〔朱尔吉特(Jurkat)〕和长臂猿(MLA144)的T-淋巴细胞系中所得的上清液不能测量出茗萘酊的活性。
2.茗萘酊的专性
a)纤维蛋白溶解作用的抑制
要研究茗萘酊对抑制蛋白酶的专性,把不同的酶加在纤维素/琼脂糖凝胶上开的小井中,并让含茗萘酊的单核细胞培养上清液与这些酶一起培育。该凝胶混合物中包含了20μg/ml的胞浆素原,以帮助茗萘酊活化剂的表达,亦选择了适当的酶,以便于37℃温育20小时后可产生类似的溶胞面积(参照图5的描述)。
就算茗萘酊与这些酶预先于23℃温育2小时才加在小井中,茗萘酊很明显地不是胞浆素或胰蛋白酶的抑制剂(图5)。在人体的胞浆素原活化剂之中,尿激酶的两种制备(CUK和SUK)都在用茗萘酊处理过后失去所有纤维蛋白溶解活性。不过,差不多完全鉴于组织型的胞浆素原活化剂(HPA66)(参照下文),就算在预先培育后,人体的黑瘤素培养上清液的纤维蛋白溶解活性不会受茗萘酊所抑制。用凝血酶把纤维蛋白原凝固亦不会受到茗萘酊的影响。
b)用比色测定来抑制
可进一步应用科尔曼和格林(Coleman and Green)的测定法来研究茗萘酊的抑制的专性。当在没有胞浆素原的情况下,用胞浆素测试剂来培育(12)可作为胰蛋白酶和胞浆素的高度灵敏的测定,当在有胞浆素原的时候,可测定多种的胞浆素原活化剂。一个明显的例外是在人体黑瘤素调节过的介质中的HPA66,HPA66可能由于缺乏纤维素,所以在这测定中是无活性的(16)。
茗萘酊不会抑制胰蛋白酶或胞浆素的赖氨酸硫酯酶的活性(图表2),不过依赖胞浆素原的尿激酶为在胞浆素原活化剂大大地受茗萘酊所抑制,这类的胞浆素原活化剂包括CUK和SUK和长臂猿的下淋巴细胞系(MLA 144)的APA52。另外,当与胞浆素原培育时亦有茗萘酊,便可观察到尿激酶的抑制,但当在测定胞浆酶的时期加入茗萘酊便不会观察到尿激酶的抑制。
在老鼠13762肿瘤的稀释匀浆中的老鼠胞浆素原活化剂(RPA48,可能与HPA52同种)的活性不会受茗萘酊所影响。
茗萘酊对蛋白酶的比色测定的抑制
未稀释的茗萘酊培养上清液(20μl)与显示出的酶于23℃预先温育2小时,其最终的体积为40μl,然后把20μl的100μg/ml的胞浆素原加于该此活化剂中,而1ml的胞浆素测定剂则加于其他的蛋白酶中,每个测定继续至有颜色的形成。
c)SDS-PAGE和纤维素的涂敷
格雷拉尼-皮柏卢和赖克(Granelli-pirerno & Reich)的纤维素涂敷法(14)是用来鉴定茗萘酊抑制的专性和测定各种不同的胞浆素原活化剂是否不逆地受茗萘酊所钝化。把酶用茗萘酊预先培育,然后经过SDS-PAGE,而剩余的酶的活性可看作为补充有胞浆素原的纤维素/琼脂糖凝胶上的分解面积。
当丙烯酰胺和纤维素凝胶在一起培育5小时后,该对照的(未经处理的)尿激酶(CUK)产生了两条显著的谱带,一条是代表HPA52,而另一条则代表其蛋白水解产物(17)的HPA36(图9,第1行)。不过,如果在SDS-PAGE之前把CUK用茗萘酊预先培育,5小时后便会在涂敷的凝胶上出现一条微弱的分解谱带,而这谱带是置于比HPA52更高分子量的地方(图9A,第10行)。
当凝胶在一起培育20小时后,该谱带增加了亮度,在比HPA36更高的毛分子量的地方可看见另一条谱带(参照图6,第2行)。这些结果显视出茗萘酊可钝化HPA52和HPA30,使最后剩余的活性比未经处理的酶有更高的分子量。因此,茗萘酊与尿激酶的相互作用的方式包括复合体的形成或在尿激酶的结构上有一个基的转变,因而影响到它在电泳的迁移性(参照下面的第3部分)。HPA36好像比HPA52更容易钝化。
长臂猿细胞系MLA144在无血清的培养介质中分泌胞浆素原活化剂,在SDS-PAGE和纤维素的显影后,这活性在与人体的尿激酶的HPA52的同一个分子量位置中分解为两条密集的谱带(图6,第3行)。把MLA144培养上清液用茗萘酊预先培养都不会影响任可一条谱带(图6,第4行)。用茗萘酊来处理都不会影响从人体的黑瘤素培养上清液所得的Mr66,000的胞浆素原活化剂(图6,第5和6行)和从老鼠肿瘤所得的Mr48,000的胞浆素原活化剂(图6,第7和8行)。这些结果显示出茗萘酊专性地抑制人体尿激酶类的胞浆素原活化剂(HPA52和HPA36),但不会抑制人体组织类的胞浆素原活化剂(HPA66)或其他哺乳类动物(最少有些)的胞浆素原活化剂。
3.茗萘酊与尿激酶类的胞浆素原活化剂的相互作用
要分析茗萘酊与尿激酶的相互作用,在没有胞浆素原的情况下把茗萘酊和CUK预先培育,然后用上述的比色测定法测定剩余的胞浆素原活化剂的活性。钝化作用在两个小时内于23℃进行,而最后的剩余胞浆素原活化剂的活性比较在零时把尿激酶、茗萘酊和胞浆素原所观察到的少出一半(图7)。在两小时的预先培育过程中,该钝化作用在起始时是很快的然后转平,因此再进一步培育都不能使剩余的尿激酶钝化。这结果暗示出该反应是化学计量的,而不是例如尿激酶是由蛋白酶所分解。把尿激酶用茗萘酊的稀释培养上清液来滴定。产生了一条简单的相互作用曲线,在图8中显示出来。4mPU尿激酶(CUK)的活性可被相当于这实验所用的1.5μl培养上清液钝化一半。
在这些实验中采用的培养上清液中没有任何显著的一般蛋白水解活性,这可从上述的纤维蛋白溶解实验中的对照小井中看到(图5),在高度灵敏的比色测定法中,测定不到显著的赖氨酸硫酯酶活性亦可表明这点。不过,要决定茗萘酊对尿激酶的钝化在这个分子中是否包括蛋白水解的活性,CUK要在有或无茗萘酊的情况下,并加入很多不同的蛋白酶抑制剂来预先培育,所用的抑制剂及其最终浓度为:抑肽酶,0.2mg/ml;α-抗胰蛋白酶,16μg/ml;黄豆蛋白酶抑制剂,0.16mg/ml;碘乙酰胺,3mM;乙二胺四乙酸,6mM;十二烷基硫酸钠;4-氨甲基环己烷羧酸,3mM和苄脒;3mM。把这些预先培育过的再经SDS-PAGE,然后用上述的纤维素分解作用来显影尿激酶的活性。在没有茗萘酊的情况下,用每种蛋白酶抑制剂预先培育的对照显示出,只有黄豆的胰蛋酶抑制剂失去了在电泳后才显影的HPA52和HPA36的谱带(图9A)。当每种预先培育过的液体都包含有茗萘酊,其他的蛋白酶抑制剂都不会防止受茗萘酊催化的尿激酶的钝化(图9B),不过,如果在加入茗萘酊之前或加入茗萘酊之后立即加入SDS至尿激酶中,便可防止尿激酶的钝化(图9,第8行)。因此,茗萘酊是胞浆素原活化剂,而不是抑制剂。
把这些结果归纳于一起建义出茗萘酊与尿激酶之间的作用包括在开始时快速形成一种可逆的复合体,跟着的便是一个较慢的和对SDS敏感的阶段(对蛋白酶抑制剂不敏感)。在这阶段中生产出一种较游离的酶有更高分子量的不逆产物,这产物又比酶和茗萘酊的1∶1复合体有更低的分子量。因此,在零时加入至预先培育液的SDS可以完全倒转茗萘酊的抑制作用,但预先用茗萘酊培育,再用SDS来处理则完全抑制HPA52和HPA36。在长期的显影后,在高分子量的地方出现了微量的活性,但如果在纤维素涂敷上加上茗萘酊,这活性便会被抑制,这代表了小量的局部活化的酶或在起始时形成的可逆复合体的离解产物。
很多从人体巨噬细胞系的转化细胞得来的胞浆素原活化剂亦可用比色测定法来测试茗萘酊的钝化作用。很清楚知道茗萘酊很强烈地抑制从人体前体的巨噬细胞系(HL60)和人体的类巨噬细胞的白血病细胞系(RC2A)得来的胞浆素原活化剂(图3)。人体的红血球细胞系(K562)和灵长类动物的T-淋巴细胞系(MLA 144)所分泌的胞浆素原活化剂亦会受到抑制,但鼠尿的尿激酶则不会受到抑制。
胞浆素原活化剂的来源 对2mPU尿激酶当量的
抑制百分比
尿激酶 95
单核细胞 18
RC2A 80
HL60 78
K562 75
MLA144 60
鼠尿 4
单核细胞的茗萘酊对不同来源的胞浆素原活化剂的抑制,包括人体的转化细胞系
4.从其他细胞种群得来的茗萘酊的专性
用纤维素径向扩散测定法可确定从其他巨噬细胞种群所生产的茗萘酊与单核细胞所生产的茗萘酊是相同的,这是由于单核细胞的茗萘酊对人体尿激酶类的胞浆素原活化剂是有高度专性的。
挑选不同的蛋白酶和胞浆素原活化剂,包括胞浆素、胰蛋白酶、HPA66(从人体黑瘤素培养上清液中得来的组织类活化剂)和人体的尿激酶(HPA52和HPA36),可测试出在每个细胞种群中产生的茗萘酊的抑制作用。
采用腹膜巨噬细胞和血液单核细胞的培养上清液可观察到尿激酶类胞浆素原活化剂的专性抑制作用(图11),这些细胞所生产的茗萘酊对于胞浆素原、胰蛋白酶或HPA66的治性都没有影响。腹膜巨巨噬细胞、血液单核细胞和骨髓巨噬细胞的所有溶胞产物都用三硝基甲苯来溶解,所有这些溶胞产物都对尿激酶类胞浆素原活化剂产生抑制作用,但对胞浆素原或胰蛋白酶则没有显著的抑制。不过,血液单核细胞和腹膜巨噬细胞则对HPA66有微弱的抑制(参照图11)。
U 937细胞所生产的茗萘酊与单核细胞所生产的茗萘酊在一般特性上相同,用纤维素径向扩散法来比较U 937细胞和感应单核细胞所产生的净化茗萘酊的专性,显现出从这两个来源所得的茗萘酊可专性地抑制尿激酶类的胞浆素原活化剂(CUK和SUK),但却不会抑制组织类的胞浆素原活化剂(HPA66)(图12)。对胞浆素和小鼠尿激酶的对照每有抑制。
从单核细胞和U 937细胞所得的茗萘酊制备,如果在不变性和不连续的聚丙烯酰胺凝胶系统上比较是有相近的电泳迁移率(参照图13)。要显影茗萘酊的抑制作用谱带,可以用尿激酶来培育该凝胶,然后再用纤维素/琼脂糖凝胶来涂敷。从U 937细胞系得到的茗萘酊制备好像比较从单核细胞得来的茗萘酊有稍大的电泳迁移率(图13)。这轻微的分别反映出在凝胶上分解量的差异,亦可能是由于从两种不同来源所得的茗萘酊的不同的糖基化作用。
用纤维素径向扩散法可说明从U 937细胞或感应单核细胞分离出来的茗萘酊,对于从人体胎盘分离出来的胞浆素原活化剂的抑制剂有不同的专性(23)(图12)。人体胎盘的抑制剂(加州生化)可钝化尿激酶类和组织类的胞浆素原活化剂,但茗萘酊的抑制作用只对前者有专性的作用。
例二
净化茗萘酊的方法
1.净化从人体单核细胞培养中得来的茗萘酊
要从人血中分离出单核细胞,首先是用离心分离法在红血球上形成一层白色的白血球“淡黄层”,然后用菲盖-海珀克(Ficoll-Hypaque)把白血球分为粒细胞和淋巴组胞加单核细胞,再用离心淘洗法把单核细胞从淋巴细胞中分离出来。
该净化的单核细胞(在3-4公升的血液中通常有5-8×108个细胞)粘附在15厘米的胶碟上,该胶碟是预先用白明胶处理,再用人体血清来处理,然后清洗,而粘附的密度为0.20-0.34×106个细胞/厘米2,并培养于含0.05μg/ml胞壁酰基二肽((辅助肽)的不含血清的RPMI-1640(0.50-0.75毫升/106个细胞)中。继续培养3天,其后收获该培养上清液,并用离心分离法来净化。然后把固体的氯化钠加于上清液中,使其浓度变为2M,再把该溶液于4℃加入苯基-琼脂糖亲合色谱柱(法马西亚)中。该柱是用含2M NaCl的两个床体积的50mM甘氨酸(pH7.8)来清洗,以便移去非结合的甘氨酸,然后在同一种缓冲液中,把结合的蛋白质用下降的NaCl梯度来洗提。从这梯度所得的部分可用科尔曼和格林(Coleman and Green)的方法(12)来测定茗萘酊的活性,而蛋白质的浓度则用劳里(Lowry)的方法(24)来测定。图14显视出这柱的典型分布图。把最活性的部分集中,用50mM甘氨酸(pH7.8)来透析,再把这些集中的部分加在(可能没有进一步处理,亦可用森特康30(阿米康)来浓缩)用西巴扩安蓝-琼脂糖(法马西亚)造的亲合柱上,西巴扩安蓝-琼脂糖是用同一种缓冲液均衡过的。茗萘酊不会被吸收,但其他的蛋白质污染物亦会被这柱所留住。基于蛋白质的浓度(劳里的方法)和用尿激酶的抑制作用的比色测定来滴定茗萘酊的活性,可以知道在这步骤中所达到的总净化约为1000倍。如先前在茗萘酊的培养上清液中观察到,该茗萘酊产物和尿激酶的相互作用是化学计量的(参照图8)。虽然典型的茗萘酊产物在每毫升内包含了200-500单位的茗萘酊,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳后,该茗萘酊组分不会明确的相同。
用这方法把茗萘酊净化后,再使在培养中活体地标记的(35S-甲硫氨酸)单核细胞制备在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在3天的时间内分泌了很多蛋白质于不含血清的培养介质中,经过苯基-琼脂糖色谱法后,活性率得到了显著的增加(图15)。经过蓝琼脂糖的色谱法后(图16),进一步把更多的蛋白质污染物移走。当尿激酶(HPA36)用这些茗萘酊制备培育后,可观察到分子量的转变,生产出一种相对于Mr 70-75,000的尿激酶和茗萘酶的复合体(图16)。在电泳迁移率上的转移可辨识出茗萘酊这蛋白质的分子量,这转移与毛Mr为39-48,000的茗萘酊制备所没有的主要蛋白质谱带有关,在Mr 60,000和32,000的位置亦见到有微弱的谱带。在还原的情况下,只显现出一条蛋白质的谱带,相对于30-35,000的分子量。
2.净化从人体巨噬细胞系U 937中得来的茗萘酊细胞培养
不粘附的人体巨噬细胞系U 937在含10%牛胎血清和1μM地塞米松的RPMI 1640中培养,可以放在T 175的培养瓶或10公升的布老恩发酵桶(Braun fermenter)中。该些细胞可维持于1-3×106个细胞/毫升的浓度。虽然茗萘酊是由这生长期的细胞分泌,但要把该些细胞较至不含血清的介质中,以便得到上清液,作为茗萘酊净化之用。把该些细胞压成片,清洗一次,再悬浮于含1μM地塞米松的RPMI 1640中,然后再培养3天在以下有些净化例子中,在不含血清的介质中加入0.7%白明胶,以增加细胞的生存性,在有白明胶的情形下,茗萘酊的活性通常可增加4至8倍(图17)。
收获了该些细胞,其上清液是用于以下的净化例子中。以下的例子可以以任何的组合或次序来采用,以便提供一种大致上净化了的茗萘酊产物。
净化例1:采用阶式pH洗脱法的苯基-琼脂糖色谱法
把茗萘酊从培养于有0.7%白明胶的情形的U937细胞上清液中净化出来。把50ml的苯基-琼脂糖柱用含2M Nacl的50mM柠檬酸(pH5.5)来均衡,加入1M柠檬酸至1.6公升的U 937培养上清液中,使它的pH调整至5.5,在加上该柱之前,加入固体的NaCl至2M的浓度。用均衡缓冲液把该柱彻底地清洗,然后再用含0.5M NaCl的50mM柠檬酸(pH5.0)来清洗。用50mM的甘氨酸(pH7.8)把茗萘酊洗提,然后用科尔曼和格林(Coleman and Green)的比色方法(12)来测定其活性,蛋白质的含量则用布雷德福(Bradford)的方法(25)来测定,图18显视了该柱的典型分布图。
该产量是3,360单位的茗萘酊或66%,而活性率则为140单位/毫克,这表示活性率增加了214倍。
净化例2:用蓝来洗脱的分批苯基-琼脂糖色谱法除非是另外说明,否则U 937细胞都是在无白明胶的情形下培养,而茗萘酊就从其上清液中净化出来。
(a)浓缩不含血清的茗萘酊上清液
用阿米坎DC2空心纤维的透析/浓缩组合(Amicon DC2Hollow Fiber Dialysis/Concentration Unit)把4-5公升的培养上清液浓缩10倍,该组合置备了一个30,000MW的断流筒,最少用相等体积的50mM甘氨酸(pH7.8)来把浓缩物透析,以便移去所有的染料。
(b)把茗萘酊浓缩物离心分离
把透析了的浓缩物在一个JA10回旋器内用8,000rpm的速度于4℃离心分离30分钟,以便把在透析期间沉淀了的剩余的细胞残渣和蛋白质做成片状。把澄清了的上清液分成等分,然后于-20℃下冷冻,直至下次的净化过程。
在这阶段已恢复了100%起始时茗萘酊的活性,生产10-20,000单位的茗萘酊,其活性率为20单位/毫克。
(c)分批的苯基-琼脂糖色谱法
为进一步从浓缩了的培养上清液中(从培养于0.7白明胶的细胞中得到,其活性率为1单位/毫升)净化茗萘酊,可在苯基-琼脂糖上采用分批的盐分洗提法。用固体NaCl把750毫升的上清液的离子强度调整至2M。把预先用50mM甘氨酸(pH7.8)和2M NaCl均衡过的苯基琼脂糖加入上清液中,W/V的比率为1∶7.5。该悬浮液于室温下培育2小时或于4℃下培育一夜,并加上搅拌。在真空下用玻璃过滤器(glass-scintered filter)把苯基-琼脂糖过滤出来,然后用同一种仪器用均衡缓冲液把苯基-琼脂糖彻底清洗,跟着再用含50mM甘氨酸(pH7.8)和1.4M NaCl的缓冲液冲洗,以便移去污染的蛋白质。用50mM甘氨酸(pH7.8)把茗萘酊从柱中洗提出来。
用这方法所产生的茗萘酊活性为4,800单位,这相等于起始材料的35%产量,茗萘酊产物的活性率则增加了大约100倍至96单位/毫克。
净化例3:用阶式pH洗脱法的二乙氨乙基-琼脂糖色谱法
用净化例2中所述的步骤(a)和(b)把不含细胞的上清液用pH洗脱法处理,把浓缩了的茗萘酊上清液(40毫升,6.5单位/毫克)加在二乙氨乙基-琼脂糖柱中,该柱用50mM甘氨酸(pH7.8)预先均衡。用均衡缓冲液彻底清洗以便移去非结合的蛋白质,然后再用含2M NaCl的25mM柠檬酸磷酸盐(pH5.0)来清洗,以便移去剩余的蛋白质,图19显示出该柱的典型分布图。
用这方法生产的茗萘酊的活性率为63单位/毫克,而回收的产量为35%,这表示该活性率增加了10倍。
净化例4:初步的不变性的凝胶电泳
用净化例2所述的(a)、(b)和(c)的步骤来把不含细胞的上清液处理。在电泳之前,将茗萘酊(3.5单位,活性率为25单位/毫升)和适当的标准蛋白质跟同等体积的样本缓冲液混合,该样本缓冲液包含有0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯-苯胺、50mM的三HCl(pH7.5)、18%蔗糖和1%三硝基甲苯×100,该凝胶包括了一个5-15%的直线双丙烯酰胺梯度,所用的凝胶系统基本上是如琳利(Laemmli)(26)所述的一样,但并没有加入十二烷基硫酸钠,0.15%三硝基甲苯×100只在流动的缓冲液蓄水器中取代了SDS。把该样本加于凝胶中,并于固定的100mA电流中电泳。用一个有水套的冷却系统把温度维持于25℃以下。当低迁移率的示踪染料二甲苯-苯胺行毕凝胶全长时,便把凝胶移走,然后把凝胶切片(每径迹大约为0.5×1厘米),再加入150μl的50mM甘氨酸(pH7.8),然后用一个布兰森的声震细胞破裂器(Branson Sonifier cell disrupter)于20声功率和4℃下把该样本声震10至20秒。整夜把蛋白质从凝胶片中洗提出来,并加上不断的搅拌,把该样本以14,930xg的速度离心分离10分钟,使该凝胶形成片状,然后移走上清液以便测定茗萘酊的活性。可以同时采用重复的样本,使蛋白质的含量可以用适当的凝胶径迹上的银的染色剂来显影(27),其结果是显示于图20中。
从凝胶中所回收的茗萘酊很高,在第一次的洗提后,可回收64%的起始茗萘酊活性,用同一种方法第二次洗提后,可回收额外的13%。用银来染色的蛋白质分布图中显示出,茗萘酊的活性与该制备中的一种重要的蛋白质污染物分隔开,所得的茗萘酊的活性率为2323单位/毫克,这表示在这步骤中把茗萘酊净化了93倍。
净化例5:蓝琼脂糖的色谱法
用净化例2所述的(a)和(b)的步骤把不含细胞的上清液处理,把10ml浓缩的上清液(600单位;20.0毫克;活性率为30.0)加在3.2cm×2.8cm的蓝琼脂糖柱中,该蓝琼脂糖于100mM的磷酸钾(pH7.0)中均衡。用同一种缓冲液把该柱清洗,然后收集8.1ml的部分。把7个部分汇集成一组,然后用50mM甘氨酸(pH7.8)于4℃透析一夜,再测定蛋白质的含量和茗萘酊的活性。茗萘酊从这柱快速地洗提,并定量地回收,生产出120单位/毫克的茗萘酊,其活性率增加了4倍。
净化例6:用盐的梯度洗提法的二乙基氨乙基-塞弗西尔色谱法
用净化例2所述的(a)和(b)的步骤把不含细胞的上清液处理,把10ml浓缩上清液(640单位;20.0毫克;活性率为32.0)加在2.6cm×6cm的二乙基氨乙基-塞弗西尔柱中,该二乙基氨乙基-塞弗西尔于50mM甘氨酸(pH7.8)中均衡。用50ml的50mM甘氨酸(pH7.8)把该柱清洗,然后加入在同一种缓冲液中直线梯度为0至0.5M的NaCl。当完成该梯度时,该柱是用含1M NaCl的另外90ml的50mM甘氨酸(pH7.8)来清洗,然后收集6ml的部分。把每10个部分汇集于一起,再用50mM甘氨酸(pH7.8)于4℃透析一夜,然后测定茗萘酊的活性和蛋白质的含量,其结果是显示于图21中。用0.24M NaCl把茗萘酊洗提,最高可回收79%,其活性率为216单位/毫克,这代表把茗萘酊净化6.75倍。
净化例7:用pH梯度洗提法的二乙基氨乙基-塞弗西尔色谱法
用净化例2中所述的(a)和(b)的步骤把不含细胞的上清液处理,把10ml浓缩的介质(400单位;20毫克;其活性率为20.0单位/毫克)加在2.6cm×6cm的二乙基氨乙基-塞弗西尔柱中,该二乙基氨乙基-塞弗西尔于20mM的NH4Ac(pH6.9)中均衡。用30ml的20mM NH4Ac(pH6.9)把该柱清洗,然后加入由20m M NH4Ac至20mM乙酸的500ml梯度至该柱中,以便洗提茗萘酊。当完成该梯度后,用20mM乙酸把该柱清洗,直至于275nm的吸收率回复至基线。收集35.5ml的部分,并把10个部分汇集成一组,再用NaOH把调整至7和8之间。用50mM的甘氨酸(pH7.8)于4℃把每个汇集部分的5.0ml等分透析一夜,然后测定茗萘酊和蛋白质的含量,其结果是显示于图22中。有最高茗萘酊活性的汇集部分于pH5.3下洗提,代表加于该柱中的原料的74%,这材料的活性率为1966单位/毫克,这表示出有98倍的净化。从每个汇集部分中移去相当于70μg蛋白质的等分,并用SDS-PAGE来分析,其结果是显示于图23中。
净化例8:羟磷灰石色谱法
用净化例2所述的a和b的步骤把不含细胞的上清液来处理,把10ml浓缩了的上清液(520单位;16.6毫克;其活性率为31.0单位/毫克)加在2.6cm×4.5cm的羟磷灰石柱中,该羟磷灰石柱在50mM的甘氨酸(pH7.8)中均衡,然后用50mM的甘氨酸(pH7.8)把该柱清洗,再加入由50mM甘氨酸(pH7.8)至0.5M磷酸钠(pH7.0)的500ml梯度。把5.75ml的部分汇集成10个部分一组,然后把等分于4℃透析一夜,再测定这些等分中茗萘酊的活性和蛋白质的含量。图24显示该茗萘酊于梯度的最后端洗提,而该些管所含的最高茗萘酊量为加于该柱的茗萘酊的50%,这材料的活性的活性率为651单位/毫克,代表着净化21倍。把含70μg茗萘酊等分的部分用SDS-PAGE来分析,并在图25中显示出来。
例3
茗萘酊对肿瘤组织的影响
这例子提供了所采用方法的详情,并描述了茗萘酊对结肠肿瘤细胞的影响。
方法
1.组织样本和均化作用
在外科切除手术之后立刻获取人体结肠的样本,从粘膜肌层切割开结肠的粘膜,并用汉克的溶液(Hank′s Solution)来清洗。从每种结肠中取得在低倍放大下是正常的粘膜和真正的癌样本,并在冷冻的情况下储脏。再积部分的溶解材料的重量,然后慢慢地用手把该材料与含0.5%三硝基甲苯×100的50mM甘氨酸缓冲液(pH7.8)慢慢地均化,在每毫克湿重量的组织中采用10μl的缓冲液。
2.胞浆素原活化剂的比色测定
用例1中所述的科尔曼和格林(Coleman and Green)的测定方法(12)来确定组织均浆和细胞培养上清液中的胞浆素原活化剂含量。在测定之前,先把用上述方法制备的均浆用均匀缓冲液来稀释至1∶10。
3.SDS-PAGE和纤维素涂敷酶谱
如例1所述的一样,在这分离技术中采用格雷拉尼-皮柏卢和赖克(Granelli-Piperno and Reich)的方法(13)。把组织匀浆在以下的情况下加在不还原的11%丙烯酰胺凝胶中:(a)没有进一步处理,(b)与亲合法净化过的人体胞浆素原于37℃温育30分钟,(c)与单核细胞茗萘酊于23℃温育90分钟,或是(d)先用胞浆素原培育,然后再用茗萘酊来培育。把上述培育液中未经处理的样本(60μl)加在凝胶上,并加入SDS样本缓冲液(40μl)。
4.径向扩散测定
如例1一样的方法进行扩散测定,采用于培养液的蛋白酶包括1.5μg激肽释放酶、150ng胞浆素、2.5mPU小鼠尿激酶、HPA66(黑瘤素培养上清液)、12.5mPU人体尿激酶和包含1.3mPU HPA52的COLI 394上清液。这些酶用过量的茗萘酊于23℃温育90分钟,然后再加在扩散凝胶的小井内。
5.结肠癌细胞的培养
人体结肠细胞系COLO 394(28)是培养于补充有10%牛胎血清的RPMI-1640中,每星期流过两次。
为研究茗萘酊和癌细胞培养酶的影响,在6个多井的碟上(琳宝(Linbro)第76-058-05号)的每一个井内敷上大约3×3×106细胞。当粘附一夜后,把该些细胞清洗,然后用不含血清的RPMI 1640培养48小时。加在3个试验性培养中的包括(1)人体胞浆素原(15μgml);(2)胞浆素原和茗萘酊(相当于1PU的尿激酶);或(3)胞浆素原、茗萘酊和抑肽酶(18μg/ml)。
6.茗萘酊的制备
如例6所述,用于这作实验中的茗萘酊是用人体血液单核细胞培养上清液来制备的,在胶碟上的粘附单核细胞培养在含0.05μg/ml胞壁酰基二肽的RPMI 1640中培养3天。
结果
茗萘酊对肿瘤组织均浆的影响
1.正常与肿瘤结肠组织中胞浆素原活化剂的含量的比较
(a)比色测定
把稀释的结肠粘膜用科尔曼和格林(Coleman and Green)的方法(12)来测定胞浆素原活化剂,这测定法量度出胞浆素原活化剂的酶(即酶原和活化酶)的总含量,这是由于所采用的胞浆素原基质包含了微量的胞浆素,足以活化该酶原。在稀释的均浆中用与胞浆素原无关的中性蛋白酶把赖氨酸硫酯胞浆素基质直接水解不会显著地提供颜色的显影。如图26所示,在带癌的结肠组织上正常的地方和真正结肠的癌组织中,都测定胞浆素原活化剂的活性。
正常组织均浆的活性都集中于一个中心点,其平均数为0.51±0.16。虽然只有少数的样本在SDS-PAGE纤维涂敷法中显示了活性尿激酶的谱带(参照下文),但在更灵敏的比色测定法中,所有的正常组织的均浆都包含了可在这测定法中测定得到的胞浆素原活化剂。如果没有加入纤维素,所测定的很可能是低数量的尿激酶类胞浆素原活化剂(HPA52),而不是普遍存在的组织类胞浆素原活化剂。(HPA66)(29)。
不过,肿瘤的均浆显示出很大范围的胞浆素原活化剂的活性,其范围包括了由1至10倍的吸收率,平均的吸收率是1.15±0.56,比较正常的组织均浆的平均值大出超过两倍,不过这比率包括了所有抽样的材料。如果把每条结肠中肿瘤的样本与相对的正常组织比较(图27),其平均比率增加至超过3倍,有的比率更超过5倍。
6.SDS-PAGE和纤维素涂敷
从带癌的结肠组织上正常的地方中得到的结肠粘膜均浆,通常在SDS-PAGE之后,在纤维素-琼脂糖酶谱中只产生一条主要的裂解谱带,这是相对于人体黑瘤素培养上清液的组织类胞浆素原活化剂(HPA66)(图28A),次要的谱带则是置于约96,000和110,000分子量的地方,不过,有些正常组织的均浆亦在相对于高分子量型的尿激酶(即HPA52)的地方产生裂解谱带。如果把典型的正常结肠未稀释的均浆与人体胞浆素原于测定缓冲液中培育,胞浆素原产生了活化,使一条胞浆素谱带形成于酶谱中Mr 85,000的地方(图28A),第2行)。用胞浆素原培育2小时后把样本移走,HPA66的活性续渐地消失,而于96,000和110,000的次要谱带亦很快地消失。
癌组织的均浆通常都会产生一条HPA52的主要谱带,第2条谱带则为HPA66,其相对强度是不定的,有时这谱带甚至完全不存在(图28B),上面提到的其他次要谱带通常是很弱或不存在。预先用胞浆素原于37℃温育2小时后,会续渐失去HPA66(图28B,第2-4行)。所产生的胞浆素原(裂解于Mr 85,000)可影响到HPA52转化至其活性分裂产物,该产物的Mr大约33-36,000。
2.在结肠粘膜均浆中茗萘酊与尿激酶类胞浆素原活化剂的相互作用
在电泳之前,用茗萘酊处理正常的结肠组织均浆,对于组织类胞浆素原活化剂HPA66所产生的分裂谱带没有任何影响,但只引致差不多所有HPA52的次要活性谱带消失(图29A)。
用胞浆素原把该均浆预先培育会生胞浆素,这引致HPA52的谱带减弱,并产生出Mr为33-36,000的微弱谱带,这代表HPA52的活性降解产物。预先用胞浆素原活化剂培育后,再用茗萘酊来处理,引致HPA52的谱带和于33-36,000的微弱谱带消失。
肿瘤组织的均浆产生显著的HPA52分解谱带,用茗萘酊来培育会减弱此谱带(图29B)。在电泳之前,预先用胞浆素原处理可产生胞浆素,如前述的正常组织均浆中观察到,该胞浆素可以把HPA52转化为HPA33-36。因此,虽然茗萘酊对HPA66没有影响,但对于肿瘤结肠组织和正常的结肠组织(产生Mr52,000的谱带)的均浆中的酶,如果人体单核细胞的茗萘酊来培育,则会受到类似的影响。如果开始时用胞浆素原来处理该均浆,然后再用茗萘酊来处理,通常在电泳后出现的HPA 52谱带会消失,而代表HPA33-36的谱带亦会消失(图29B)。因此,很明显地,用茗萘酊处理后才用茗萘酊把HPA52钝化是比未经处理的均浆更为有效。这显示出存在于组织中的HPA52的最主要形式是酶原,而HPA52与茗萘酊的作用是与酶原转化为活性酶有关,这转化多半是靠胞浆素的。
3.相对于尿激酶类胞浆素原活化剂的酶原的茗萘酊特性比色测定
茗萘酊与尿激酶的化学计量关系是成立于很大范围的尿激酶浓度,由10mPU至1000mPU(图30),不过,在稀释的结肠粘膜均浆中把茗萘酊对胞浆素原活化剂的抑制来滴定则不显出这种特性(图31)。其实,在正常组织中抑制HPA52的低活性,比较抑制肿瘤组织均浆中增强了的活性,需要更多茗萘酊,这符合了在组织均浆中有HPA52酶原的情况。
转化结肠肿瘤细胞系COLO 394的不含血清的培养上清液显示出这种HPA52酶原的存在。由这细胞系所分泌的胞浆素原活化剂主要包括HPA52和其他较高Mr的谱带,这些谱带的形式与上述的肿瘤组织均浆很相似(图32)。当在培养介质中加入胞浆素原,可产生一些胞浆素(从比色测定中显示出来,图33),胞浆素可加速HPA52至HPA36的转化。如果把茗萘酊和胞浆素原加于该介质中,在培养时所产生的所有胞浆素原活化剂都会被钝化,这可从SDS-PAGE和纤维素涂敷的显影(图32)和比色测定法(图33)中显示出来。不过,如果除了胞浆素原和茗萘酊之外,还加入一种胞浆素的快速和有效的抑制剂抑肽酶,则不会产生钝化作用(图32)。由于抑肽酶不会直接影响茗萘酊与尿激酶之间的作用,这些结果显示出COLO 394所产生的HPA52是酶原,须要胞浆素来表达它的活性及进行它与茗萘酊之间的作用。在SDS-PAGE纤维素涂敷系统中,存在于胞浆素原基质中的微量胞浆素会引致活化作用的产生,当抑肽酶把胞浆素抑制时,该活化作用就不会产生。
这些结果显示出多种主要的人体癌细胞比较邻近的不涉及到的组织显著地产生了更大量的尿激酶类胞浆素原活化剂。当直接把茗萘酊加于组织均浆中,茗萘酊至少可以局部地抑制人体尿激酶类胞浆素原活化剂HPA52,这钝化作用对于尿激酶类胞浆素原活化剂HPA66是专性的。进一步确定出茗萘酊不会影响HPA52的酶原,但须要蛋白酶的活性(在这情况下是由胞浆素来提供)把HPA52在它与茗萘酊起作用之前转化为活性的形式。
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勘误表
勘误表
Claims (16)
2、按权利要求1的方法,将该上清液加入到疏水相互作用的色谱柱中或离子交换色谱柱中,然后再采用亲合色谱法,由此从培养上清液中回收茗萘酊。
3、按权利要求1或2的方法,其特征是上述茗萘酊是用凝胶过滤法或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进一步净化。
4、按权利要求2的方法,其特征是能生产茗萘酊的细胞是从人类血液单核细胞、能生产茗萘酊的巨噬细胞和单核细胞源的转化细胞的单层培养物中挑选出来的。
5、按权利要求1或2所述制备茗萘酊的方法,其特征是在体外用如胞壁酰基二肽,脂多糖,地塞米松或佛波醇酯如12-0-四癸烷佛波醇-13-乙酸盐的化学剂刺激可生产茗萘酊的细胞以生产茗萘酊。
6、按权利要求1或2的方法,其特征是上述的细胞培养上清液包含了从体外培养的可生产茗萘酊的细胞中得出来的茗萘酊。
7、一种制备含有茗萘酊的细胞培养上清液的方法,其特征是在体外培养能生产茗萘酊的细胞。
8、一种制备适用于在组织样本中或体内辨认和定出肿瘤范围的试剂的方法,其特征是用一种适当的标记来标记茗萘酊。
9、一种适用于在人体体液和组织中监测慢性发炎的方法,其特征是用适当标记来标记茗萘酊。
10、按权利要求8或9所述的方法,其中茗萘酊是用放射性同位素来标记的。
11、按权利要求10的方法,其中同位素是锝。
12、按权利要求8或9所述的方法,其中茗萘酊是用酶标记的。
13、按权利要求8或9所述的方法,其中茗萘酊是用一种如萤光素的化合物来标记的。
14、一种制备适用于抑制肿瘤入侵,治疗肿瘤或治疗慢性发炎的试剂的方法,其特征是将茗萘酊与药用上合用的稀释剂载体或佐剂混合。
15、一种制备适用于抑制肿瘤入侵,治疗肿瘤或治疗慢性发炎的试剂的方法,其特征是将茗萘酊附于如外源凝集素或毒素的药上。
16、一种制备茗萘酊抗体的方法,其特征是将适当的佐剂中的茗萘酊注射入一种适当的动物体内,随后从该动物的血清中获得抗体。
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