CN1040821A - 一种对人体过氧化锰歧化酶的单克隆抗体，其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种对人体过氧化锰歧化酶的单克隆抗体，其特征在于它是由人体Mn-SOD对小鼠产生免疫，然后使小鼠骨髓瘤细胞同该小鼠淋巴细胞进行融合得到的细胞系所产生，它对人体Mn-SOD具有很高的特异性；一种人体Mn-SOD具有很高的特异性的对人体Mn-SOD怕单克隆抗体生产方法，包括：培养由人体Mn-SOD对小鼠产生免疫而得到的细胞系，然后对小鼠骨髓瘤细胞和该小鼠淋巴细胞进行细胞融合；一种用于分析人体Mn-SOD的工具。

Description

本发明涉及一种对人体过氧化锰歧化酶（以下简称为人体Mn-SOD）有高度特异性的单克隆抗体，一种制造该单克隆抗体的方法，用该抗体的分析试剂或分析工具和分析方法，以及用该抗体的对人体卵巢癌和心肌梗死的诊断方法。

人体Mn-SOD是一种酶，其一个区域的分子量约为25000，由二聚物和四聚物构成。它位于线粒体的基质部分，能以下述方式催化过氧化物歧化阴离子团O-₂（该类阴离子团为活泼氧的主要分子形式）的反应：

妇科癌包括子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌和绒毛膜癌等等。其中，子宫颈癌的发病率逐年减少，对绒毛膜癌现在也可望有很好的疗效。然而，子宫内膜癌和卵巢癌的早期诊断方法、治疗方法和预后监视等过程中，还存在很多问题。上述这些妇科癌中，卵巢癌在从婴儿到年轻妇女到老年妇女的所有年龄群中都可发生，并且其发病率逐年增加，在五十岁以上的妇女中发病率特别高〔Mori，Miyake：Japanese        Journal        of        Cancer        Research（Gan）vol.79，No.12，1988〕。同时，在对预后极差的卵巢癌的恶性病变群患者的治疗中，极需建立一种可靠的早期诊断方法。

在迄今为止对卵巢癌的诊断方法中，常常用α-胎蛋白、胚胎癌抗原、人体绒毛膜促性腺激素或CA125（CA125是由卵巢癌衍生的培养细胞系的细胞表面糖链抗原）等等做为研究用的诊断标记物（Masato        Mochizuki：Rinsho        Byori（Clinical        Pathology）vol，34，No.11，1986;Kazuo        Omi        et        al：The        9th        Clinical        Chemical        Test        Technology        Course        Text，1989）。然而，在上述方法中，就α-胎蛋白而言，可能是由于它被用来作肝癌的诊断标记物，它对卵巢上皮癌的阳性率（Positive        ratio）为0%;胚胎癌抗原对卵巢上皮癌的阳性率为12%;人体绒毛膜促性腺激素对卵巢上皮癌的阳性率为0%。另一方面，CA125（从卵巢癌组织中衍生的培养细胞系的细胞表面糖链抗原）对卵巢上皮癌的阳性率高达94%，不过，对子宫内膜异位的阳性率为30%。因而，应用这些诊断标记物对卵巢上皮癌进行诊断时，所有这些手段都存在着标记物对病变组织的阳性率和/或特异性的问题。

另外，心肌梗死是因冠状动脉的狭窄和闭塞造成局部缺血、心肌病变和心肌坏死，并且其急性期致死率至今仍然很高，这种初期病人突然的闪电状发病同样也造成了一个社会问题。

这样，作为治疗过程中的一个预防对策，需要通过心电图、左心室造影术衬度的变化，以血清酶量的起伏来查明心肌梗死的位置、损害的过程，并对损害作出预后。

血清酶量起伏法是了解由于心肌坏死而释放的变异酶（deviated        enzyme）的量的起伏的一种生化诊断方法。在这类诊断方法中，已经发展了使用GOT（谷氨酸草酰乙酸转氨酶）、CPK（肌酸磷酸激酶）、LDH（乳酸脱氢酶）等物质的许多种方法。

然而，根据这些应用上述酶的生化诊断方法，在大多数情况下，酶的量从心肌梗死发作开始的一个短时间内就呈最大值。由于在这些诊断心肌梗死的主要方法（包括冠状血管成形术-导管法，见Yoichi        Shimizu        et        al：Nippon        Rinsho（Japanese        Clinic），vol.45，1987，extra        No.;经皮透照冠状再造术，见katsuo        Uematsuse        et        al：Nippon        Rinsho（Japanese        Clinic），vol.45，extra        No.，1987;等等）中，酶的峰值是确定心肌梗死的主要依据，因此很难准确地诊断出心肌梗死。并且由于这些酶只能在短时间内在血液中保持高浓度，因而在发作后的开始阶段往往需要频繁地抽取血样，这也成为一个问题。

另一方面，对应用多克隆抗体的研究表明，人体Mn-SoD在肝病患者血清中浓度的分析在诊断中具有重要意义（Iyaku        Journal，即Journal        of        Pharmacentical：Inagaki，Sawaki，20，1，1984;The        5th        Marker        Research        Society，Iizuka，Arai        et        al，1985）。同时，Taniguchi等人采用免疫学方法，利用对山羊进行免疫得到的多克隆抗体证明人体Mn-SOD在肺癌组织中浓度很高（Journal        of        National        Cancer        Institute，72，5，1984），还指出分析人体Mn-SOD在血清中高浓度的重要性。

然而，要用多克隆抗体来分析人体Mn-SOD在上述各种病患者血清中的浓度，就必须制造一种单克隆抗体，并建立一种制造它的方法，以进一步提高其对Mn-SOD反应的特异性，并且获得一种质量稳定的、具有高度特异反应性的抗体。但是，迄今为止还没有任何有关发现某种单克隆抗体对人体Mn-SOD具有很高的特异反应性的报道。

本发明的第一个目的在于提供一种对人体血清中的人体Mn-SOD有很高的特异反应性的单克隆抗体，和一种制造该单克隆抗体的方法。

本发明的第二个目的是利用一种对人体Mn-SOD有很高的特异免疫反应性的单克隆抗体，提供一种对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具及一种分析方法。

本发明的第三个目的是提供一种对人体卵巢上皮癌（如人体卵巢上皮致癌作用）的新型诊断方法，并通过使用包含上述单克隆抗体的对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具对人体Mn-SOD在人体体液中的浓度进行测量来做出预后监视。

本发明的第四个目的是提供一种对心肌梗死（如心肌梗死的闪电状发病）的新型诊断方法，并通过使用包含上述单克隆抗体的人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具对人体Mn-SOD在人体体液中的浓度进行分析来做出预后监视。

发明者为解决上述问题进行了充分研究，随之发现一种单克隆抗体对人体Mn-SOD表现出很强的特异反应性。这种抗体可以通过下述方式得到：用人体Mn-SOD对小鼠进行免疫，对由此得到的细胞系（cell        line）进行培养，然后进行细胞融合;用包含上述抗体的分析试剂或分析工具对人体Mn-SOD进行分析，很容易获得高精度的分析结果;通过用上述分析试剂或分析工具对人体Mn-SOD在人体体液中的浓度进行分析，在出现高的阳性率和特异性的情况下，很容易对卵巢癌（如人体卵巢上皮致癌作用）做出诊断和预后监视;用上述对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具对心肌梗死进行诊断丝毫不受治疗后进行重新灌注的影响，也不需频繁抽血样，于是，对心肌梗死的闪电状发病之类的病的诊断很容易施行，以实现本发明的目的。

更准确地说，本发明的第一个特色是，本发明提供了一种对人体Mn-SOD的单克隆抗体，该抗体的特征在于：它是由一细胞系制成的，该细胞是用人体Mn-SOD对小鼠进行免疫，然后用该小鼠的淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞进行融合而获得的。而该单克隆抗体对人体Mn-SOD有高度特异性。此外，本发明还提供了一种制造对人体Mn-SOD有高度特异性的单克隆抗体的方法，该方法包括：用人体Mn-SOD对小鼠进行免疫，然后用该小鼠的淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞进行融合，对所获得的细胞系进行培养。

本发明的第二个特色是提供了一种分析人体Mn-SOD的分析试剂或工具，包括：

（a）一种对人体Mn-SOD有极高度特异的免疫反应性的单克隆抗体。

（b）一种用酶标记的、对人体Mn-SOD有极高度特异免疫反应性的单克隆抗体试剂;一种分析人体Mn-SOD的方法，该方法包括：把上述单克隆抗体固定在载体上，然后使固定的单克隆抗体、待测样品中的人体Mn-SOD和上述酶标记单克隆抗体发生反应，这样就得到一种包含固定在载体上的单克隆抗体、人体Mn-SOD和酶标记单克隆抗体的复合物。

本发明的第三个特色是提供了一种新型的诊断人体卵巢上皮癌的方法，该方法即：通过使用一种对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具（其中包含一种对人体Mn-SOD有很高特异性的单克隆抗体），来分析人体Mn-SOD在人体体液中的浓度。

本发明的第四个特色是提供了一种对心肌梗死的新型诊断方法，该方法用一种对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具（其中含有一种对人体Mn-SOD有很高的特异性的单克隆抗体），对人体Mn-SOD在人体体液中的浓度进行分析。

图1表示在上层清液中人体Mn-SOD相对活性。该上层清液是通过下述方式获得的：用一含有NI8（□）、PE9（■）或PG11（●）的培养物上层清液（使用时稀释至1倍、10倍或100倍）与人体Mn-SOD混合，将混合物在37℃下孵育30分钟，然后加入蛋白质A琼脂糖，再将此混合物在37℃下孵育10分钟，随之进行离心处理。为了对照，使用了NS-1细胞系（○）培养物上层清液。

图2给出了依据本发明的人体Mn-SOD分析法中的分段反应法而制备的人体Mn-SOD的标准曲线。

图3是标准血清的稀释试验的结果。该结果是依据本发明的人体Mn-SOD分析法中的分段反应法而获得的。

图4给出了依据本发明的人体Mn-SOD分析法中的混合溶液反应法而制备的人体Mn-SOD的标准曲线。

图5示出了依据分段反应法研究人体血清蛋白中的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、血红蛋白、铜、锌过氧化物歧化酶的交叉反应性的结果。

图6示出了依据混合溶液反应法研究人体血清蛋白中的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、血红蛋白、铜、锌过氧化物歧化酶的交叉反应性的结果。

图7给出了卵巢上皮癌患者手术后退化期、稳定期和进展期中人体Mn-SOD在相应的23例血清中的浓度的起伏。

图8至图14表示依照本发明诊断心肌梗死的新型方法得到的人体Mn-SOD在相应的7例心肌梗死患者的血清中浓度的起伏，其中发作时刻定为零时，抽血时间以此为准。

图15表示在15例心肌梗死患者中的每个人血清中“诊断期”的Mn-SOD浓度的最大值与CPK浓度最大值之间的关系。

图16表示在14例心肌梗死患者中的每个人的血清中“诊断期”的Mn-SOD浓度的最大值与心脏功能改善率之间的关系。

本发明的单克隆抗体是通过用人体Mn-SOD对小鼠免疫后进行细胞融合所获得的细胞系而制备的，该抗体对人体Mn-SOD有很高的特异反应性。

由于本发明使用免疫原对小鼠进行免疫，任何能够提供对人体Mn-SOD有很高的特异反应性的单克隆抗体的物质都可使用，没有任何特别的限制。例如，可以使用构成人体Mn-SOD的单聚物、人体Mn-SOD、和含有一部分人体Mn-SOD的合成肽。最好使用人体Mn-SOD。

对人体Mn-SOD有很高特异性的单克隆抗体对人体铜、锌过氧化物歧化酶（以下简称人体Cu、zn-SOD）、人体白蛋白、人体球蛋白没有任何反应性。获得具有这种特异性的单克隆抗体的方式例如：用人体Mn-SOD对小鼠进行免疫，得到的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，这样能得到杂种瘤细胞系，如NI8细胞系（FERM-P        No.1606）、PE9细胞系（FERM-P        No.1607）、PG11细胞系（FERM        No.1608）。对上述细胞系加以培养，就能得到这种单克隆抗体。

上述杂种瘤可以依照本领域技术人员熟知的方法制备而成。例如，Milstein和khoeler的方法〔Nature，256，495（1976）〕。上述杂种瘤细胞系最佳制备方法如下依次概述。

制造单克隆抗体的杂种瘤细胞系的制备

（ⅰ）被免疫动物的淋巴细胞的制备

用溶解在PBS（磷酸盐缓冲剂）中的人体Mn-SOD（10至400μg），一次性或以几周的间隔对小鼠施药几次，以对小鼠进行免疫。

第一次施药时也可以不施用辅药（即促进免疫的物质，包括明矾、结核杆菌死细胞、核酸等等），不过最好施用采用辅药制备的乳剂。

淋巴细胞可以在最后一次免疫后的几天以后、当确认做为免疫动物的小鼠的抗体值足够高时从血液、淋巴结、脾等中取得，不过，最好从脾中取得。

（ⅱ）骨髓瘤细胞的制备

为进行细胞融合，可以用MPC-11、P3-X63-Ag8.653（653）、P3-X63-Ag8-U1（P3U1）、P3-NS-1（NS-1）、SP2/0-Ag14（SP2/0）等从小鼠身上取得的骨髓瘤细胞，以及210.RC        Y3.Ag1.2.3.（Y3）这样从老鼠中取得的细胞，等等。不过最好采用那些不产生向细胞外分泌抗体的骨髓瘤，如653、P3U1、NS-1、SP        2/0等等。

（ⅲ）细胞融合

细胞融合可通过将上述免疫动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞按（3至20）∶1的细胞数之比充分混合，并在离心处理后将HVJ（仙台病毒）或PEG（聚乙烯二醇）溶液加进小球（细胞集团）来完成。上述的细胞混合过程一般应用了不会对细胞融合造成任何不利影响的细胞悬浮液。比如，一种用于培养淋巴细胞的含培养基成份的溶液（培养基成份如HEM、DMEM、McCoy1、RPMI        1640等等），以及同位素缓冲剂等。离心处理后加入PEG溶液比较可取，PEG溶液的最佳重量是1000至8000的平均分子量的30%至60%。此时，为促进细胞融合，也可加入秋水仙碱、二甲亚矾、多L精氨酸（Poly-L-arginine）等。

由于将骨髓瘤细胞用于细胞融合，那些取自其它动物的、与免疫小鼠的骨髓瘤细胞异系的骨髓瘤细胞也可使用。不过从用于制备骨髓瘤细胞系的单克隆抗体的抗体产率和稳定性的角度考虑，用与免疫动物的骨髓瘤细胞同系的骨髓瘤细胞比较好，最好是用相同的细胞系。

（ⅳ）杂种瘤的选取

在HAT培养基中完成细胞融合后，就可用培养细胞的方式完成杂种瘤的选取（培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核甙、胎牛血清。关于培养基的成份，通常用于培养淋巴细胞的培养基的成份都可使用）。

杂种瘤的培养方法是：在培养片上设置适当数量的细胞，用于把抗体制备井（antibody        Producing        Well）筛成逐个分离的井（培养井）。此时，如果需要的话，也可施用促进杂种瘤生长的物质，或者用产生促进杂种瘤生长物质（例如从胸腺、脾、淋巴结衍生的淋巴细胞）的细胞做为喂养细胞。

用在HAT培养基中生长的方法选取的杂种瘤在HT培养基中培养几天（培养基中含次黄嘌呤、胸腺嘧啶核甙、胎牛血清。关于培养基的成份，通常用于培养淋巴细胞的培养基的成份都可使用），直到细胞数达到能够筛选抗体制备井的数量。然后在常用的含胎牛血清的用于培养淋巴细胞的培养基中继续培养。

（ⅴ）产生杂种瘤的抗体的选取

分析上述（ⅳ）部分获得的杂种瘤是否已产生了所需的抗体，可以用ELISA法（enzyme-linked        immunosobent        assay）、血小板形成法、凝集反应法、RIA法（放射免疫分析法）、间接萤光抗体技术（IFA）等等。不过，如果分析量很大，最好用ELISA法。

ELISA法施行步骤如下所述。

将杂种瘤培养物上层清液（hybridoma        culture        supernatant）加入ELISA板上的每个井（分析井）中（其中人体Mn-SOD固定于ELISA板上），并使该清液在板上稳定地放置一段时间。然后，将能够与限制在每个清洗过的、被束缚在那里的分析井中的，从动物体中衍生的抗体反应的酶标记抗体（enzyme-labeled        antibody）加入到这些分析井中，随之使其稳定地放置一段时间（用来标记的酶包括过氧化物酶、碱性磷酸脂酶、β-半乳糖苷酶等等。对被标记的抗体没有限制，只要它只与限制在分析井内从动物体内衍生的抗体反应就行。例如，从小鼠、老鼠、兔子、山羊等动物中获得的血清，或者用小鼠细胞制备的杂种瘤细胞系产生的单克隆抗体等等）。然后，清洗这些分析井，将相应于所用的酶的酶作用物溶液（Substrate        Solution）加入，以分析酶的活性。如果酶的活性得到确认，就可以认为产生所需量的抗体的杂种瘤就存在于培养井之中，培养物上层清液就是从该培养井取样的。

于是，在其中生长细胞并产生抗体的杂种瘤就得到了。

（ⅵ）杂种瘤的克隆化

可以通过下列方式实现培养井（已确认抗体在其中产生）中杂种瘤的克隆：有限稀释法（Limiled        Dilution）、单细胞操作法〔其中在倒象（inverted）显微镜下把杂种瘤放置在一个井中〕、用软琼脂拾取菌落的方法、应用FACS（萤光激发细胞分类器）的方法等等。此时，（ⅴ）部分所述的产生杂种瘤的抗体可以用上述任何一种克隆方法进行培养，并且借助培养井（已确认抗体在其中生长）中的上层清液，可以用ELISA法按照同（ⅴ）部分相同的选取产生杂种瘤的抗体的方式将产生抗体的井彼此筛选。

于是，就选出了能够产生对人体Mn-SOD有高度特异性和高抗体值（high        antibody        titer）的杂种瘤细胞系。

制备单克隆抗体的方法

可以用培养依上面（ⅵ）部分内容在瓶子中或在动物腹膜内得到的杂种瘤细胞系的方式产生单克隆抗体，该单克隆抗体对人体Mn-SOD具有高度特异性并具有高抗体值。

通过在瓶子中培养（ⅵ）部分得到的杂种瘤细胞系而获得的所述的单克隆抗体，可以，比如放在通常用于培养淋巴细胞的培养基中继续培养繁殖（培养基中含有0%到20%的胎牛血清，例如含有MEM、DMEM、McCoy、RPMI1640等培养基成份的一种培养基）直到细胞浓度达到其上限。此时，所述的单克隆抗体就包含在离心处理后的培养物上层清液之中。

另一方面，也可用与那个动物（用于细胞融合的细胞就取自那个动物）异系的动物来产生上面（ⅵ）部分得到的杂种瘤细胞系。不过，用同系的动物比较可取，最好用同一细胞系的那个动物。

产生所述的对人体Mn-SOD有高度特异性并具有高抗体值的单克隆抗体也可如此进行：向适当的动物（如小鼠、老鼠、仓鼠等）腹膜内施用一种能降低其免疫能力的物质，比如，姥鲛烷这样的矿物油，施用几周后用上述（ⅵ）部分方法得到的杂种瘤细胞系的细胞数达到10⁶至10⁷，使该细胞系在腹膜中继续生长几周，使细胞密度达到一个高的水平。此时，所述的单克隆抗体就包含在离心处理后的腹水上层清液中。这样，抗体浓度已是瓶子中培养时培养物上层清液中抗体浓度的10至1000倍。

在瓶中或动物腹膜中培养杂种瘤细胞系，获得的所述的单克隆抗体可以用盐析、透析、离子交换色谱法、亲和色谱法（affinity        chromatography），即通常用以提纯蛋白质的方法来提纯，从而得到高纯的单克隆抗体。

所述的用上述方法得到的单克隆抗体对人体Mn-SOD有很高的特异反应性。

下面将叙述本发明关于人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具和分析方法这一部分内容。

本发明关于对人体Mn-SOD分析方法中所用的对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具至少包括：一种对人体Mn-SOD有很高的特异免疫反应性的单克隆抗体（以下简称“抗体”），和一种包括一种对人体Mn-SOD有很高的特异的免疫反应性的用酶标记的单克隆抗体（以下简称“酶标记抗体”）的试剂。为分析人体Mn-SOD，除了上述这些试剂外，还需要：载体、冲洗溶液（a        Washing        solution）、阻塞溶液（a        blocking        solution）、用来做人体Mn-SOD校准曲线的已知浓度的人体Mn-SOD溶液（以下简称“标准人体Mn-SOD溶液”）、一种与酶标记抗体的酶相应的酶作用物溶液（以下简称“酶作用物溶液”）。这些可以事先装在分析工具中或者在分析前准备好。如果载体事先装在人体Mn-SOD的分析工具中，“抗体”也可事先固定在载体上。

对本发明中有关对人体Mn-SOD的分析工具中的“抗体”，如果它是对人体Mn-SOD有很高的特异性的单克隆抗体，则对它没有特别的限定。它可以是那些由上述杂种瘤细胞系PG11细胞系（FERM-P        No.1608）制成的抗体，等等。上述抗体最好用经盐析（用硫酸氨）和离子交换色谱法而提纯至高纯度的抗体。如果需要，也可向“抗体”中加入一定需要量的蛋白质保存剂，如叠氮化钠、邻巯基苯甲乙汞化钠（sodium        ethylmer-curithiosalcylate）等等。

在制备本发明的对人体Mn-SOD分析工具中的“酶标记抗体”时，由于用酶标记“抗体”，所用的酶至少包括下列酶的一种：过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、乙醇氧化酶、单胺氧化酶、β-半乳糖苷酶等氧化还原酶，以及碱性磷酸酯酶等磷酸水解酶。

只要用上述酶标记的“抗体”是对人体Mn-SOD有很高特异性的单克隆抗体，对它就没有特别的限定，它可以包括那些由杂种瘤细胞系PG11细胞系（FERM-P        No.1608）产生的抗体。比较可取的“抗体”是经盐析（用硫酸胺）和离子交换色谱法提纯的高纯度的抗体。

制备“酶标记抗体”的方法如下：使至少一个上述的“抗体”与至少一个上述的酶结合在一起，结合方式包括应用戊二醛的一步法（one        step        method）〔Immunochemistry，6，43（1969）〕或两步法〔Immunochemistry，8，1175（1971）〕、高碘酸氧化法〔Method        in        Enzymology，37，133（1975）〕或马来酰亚铵法〔Journal        of        the        Biochemistry，78，235〕，不过，最好用后两种方法。

这样得到的产物也可用作“酶标记抗体”，不过，为进一步提高对人体Mn-SOD的分析精度，最好用经凝胶过滤（用交联葡聚糖、Sephacryl等）提纯后的产物做“酶标记抗体”。

这样经凝胶过滤得到的成份也可以做为“酶标记抗体”使用（如果蛋白质浓度过低，可以浓缩至指定浓度;如果过高，可以稀释至指定浓度），不过，最好用pH值接近中性的缓冲剂（如磷酸盐缓冲溶液或3-氢氯化物缓冲溶液）等物对它进行透析，经低压冻干法或经灭菌过滤器后再构成透析液，如果需要，将其贮入到“酶标记抗体”溶液中，使其使用前蛋白质浓度为0.01至100μg/ml，最好是0.1至10μg/ml。

同样，如果需要的，也可把一定量的对酶活性分析不造成不利影响的蛋白质保存剂（如叠氮化钠、邻巯基苯甲乙汞化钠等）加入到“酶标记抗体”之中。

本发明用作人体Mn-SOD校准曲线的已知量的人体Mn-SOD（即“标准人体Mn-SOD溶液”）可以按照〔Journal        of        National        Cancer        Institute，72，5，（1984）〕所述的处理法：硫酸铵化学分离法、离子交换色谱法、凝胶过滤法、等电子点色谱法等方法，经提纯后得到。

本发明分析人体Mn-SOD所用的载体的作用是作为固定人体Mn-SOD分析工具中“抗体”的载体。

本发明用于固定人体Mn-SOD的载体，为便于免疫分析，可以取片状、管状、小球、隔膜等各种形状，组成成份可以是聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、硝化纤维、玻璃等等。

本发明用于分析人体Mn-SOD的冲洗溶液的作用是：当载体上已固定了一预定量的“抗体”以后，将没有固定在载体上的物质冲走，或者当分析样品中的人体Mn-SOD同固定在载体上的“抗体”反应后，冲走未反应的物质。

用于上述目的冲洗溶液可以是，例如水、反应中pH值经过调整的缓冲溶液（如磷酸盐缓冲溶液，3-氢氯化物缓冲剂等。上述缓冲溶液含有0%至3%体积比的表面活性剂，如吐温20，吐温60等等）。不过，最好用反应中pH值经过调整，含0.02%至0.8%体积比上述表面活性剂的缓冲剂。

本发明用于分析人体Mn-SOD的阻塞溶液的作用是：阻止“酶标记抗体”或待分析样品中人体Mn-SOD非特异地（non-specially）吸附在载体的表面，也可用作制备待分析样品的稀释溶液时的溶剂。

可以用溶解高分子蛋白质（存在于如上所述的反应过程中pH得到调整的冲洗溶液中）的方式制备用于上述目的阻塞溶液，这些蛋白质包括牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（OVA）、眼孔

血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyamin）（kLH）、γ-球蛋白、许多种动物的血清，等等。这些高分子量蛋白质的浓度可以是0.1至10wt/vol%。如果它是用各种动物的血清制备的，血清的浓度可以是1至50vol/vol%，最好在10至20vol/vol%之间，这可以如上所述用清洗溶液来调节。

此外，如果需要的话，可以把一定量的蛋白质保存剂（如叠氮化钠、邻巯基苯甲乙汞化钠等）加入到阻塞溶液中。

人体体液（如人尿、血液、血清等）或这些经适当稀释使得能用上述冲洗溶液对其中的人体Mn-SOD进行分析的分析样品，可以用作本发明中对人体Mn-SOD进行分析的样品。

关于本发明中的，与用来分析人体Mn-SOD的酶相对应的，酶作用物溶液，当酶作用物（在“酶标记抗体”中用来标记抗体的酶与这种酶作用物发生反应）为H₂O₂时，缓冲剂可以是邻苯二胺（O-Phenylenediamine）、2，2′-aminobis 3-乙苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）等。该缓冲剂含有一种由酶反应产生的物质，该物质有特定的颜色。如果酶作用物是磷酸对硝基酚，可以用含有这种酶作用物的物质，如二乙醇胺等作缓冲剂。

如上所述，制备了载体、冲洗溶液、阻塞溶液、“人体Mn-SOD标准溶液”、“酶作用物溶液”并使用了“抗体”、“酶标记抗体”（这些构成了人体Mn-SOD的分析工具）之后，对待分析样品中的人体Mn-SOD，就可以通过下述的分段反应法或混合溶液反应的每一种分析法的各自操作步骤进行分析。

（1）将预定量的“抗体”固定在载体上的步骤

将预定体积的“抗体”溶液同载体接触一段时间。对接触时的温度没有特别的限定，只要“抗体溶液”没有冻结或沸腾就行，不过，最好在2℃至40℃之间。

（2）冲洗没有固定在载体上的“抗体”的步骤

当“抗体”溶液和载体接触一段时间以后，移走“抗体”溶液，再用冲洗溶液冲洗几遍，将未固定在载体上的“抗体”冲走。

（3）阻止分析样品和“酶标记抗体”在没有“抗体”固定于其上的载体表面非特异地（non-specific）结合的步骤

将一定体积的阻塞溶液同载有上面（2）部分所述“抗体”的载体接触一段时间。对接触时的温度没有特别的限定，只要阻塞溶液没有冻结或沸腾就行。不过，最好在2℃至40℃之间。

（4）使固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”反应，以获得包含固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”的复合物（以下简称“复合物”）的步骤

作为使固定在上述（3）部分的载体上的“抗体”、分析样品中的人体Mn-SOD和“酶标记抗体”这三种物质发生反应以得到“复合物”的方法，包括分段反应法和混合溶液反应法。在分段反应法中，先用“抗体”同分析样品反应，再用“酶标记抗体”同前一反应的产物反应。在混合溶液反应法中，将准备好的包括分析样品和“酶标记样品”的混合溶液同“抗体”反应。

在分段反应法中，使固定在上面（3）部分所述载体上面的“抗体”同一预定量的分析样品接触一段时间以进行反应。然后，除去未反应的混合物，用冲洗溶液冲洗几次，以除去那些没有通过“抗体”而固定在载体上的分析样品，随后使一预定体积的“酶标记抗体”同通过“抗体”固定在载体上的人体Mn-SOD接触一段时间以进行反应，这样就得到了“复合物”。

在混合溶液反应法中，准备好包含分析样品和“酶标记抗体”的混合溶液，使一预定量的混合溶液同固定在上面（3）部分所述的载体上的“抗体”反应，就得到了“复合物”。当混合溶液准备好后，最好使分析样品和“酶标记抗体”之间的反应在抑制状态进行，这可采用如冰致冷等方法。

（5）当固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”反应后，除去未反应混合物的步骤

用冲洗溶液冲洗几次，将上面（4）部分所述未反应的混合物冲走。

（6）固定在载体上的“酶标记抗体”做为“复合物”同“酶作用物溶液”的反应

可以用含有一种与“酶标记抗体”中用来标记抗体的酶相对应的酶作用物以及一种通过发生酶反应而指示颜色的物质的溶液，做为用在此处的“酶作用物溶液”。

使一预定体积的“酶作用物溶液”与固定在载体上做为“复合物”的“酶标记抗体”反应一段时间。使酶的反应终止的方式最好是：使用酸（如硫酸等）、或碱（如氢氧化钠等），或使用酶抑制剂。反应温度可以控制在所用酶当时最佳温度范围，以不产生特别的问题为限，不过，最好在20℃至35℃之间。

（7）测量酶反应后反应混合物的吸收系数的步骤

在上述酶反应进行以后，当反应混合物的颜色指示呈现最大吸收率的波长时，在该波长处测量反应混合物的吸收系数。

如上所述，用“标准人体Mn-SOD溶液代替分析样品，所得的结果可以做出校准曲线，根据校准曲线，可以对分析样品中人体Mn-SOD的量进行快速、高精度地分析。

下面介绍本发明的新型诊断方法。

本发明的对人体卵巢上皮癌的新型诊断方法对人体卵巢上皮癌的阳性率约为50%，对肝癌约为30%，对子宫颈癌约为15%，对子宫内膜癌约为7%，对非上皮卵巢癌和黑色素瘤为0%。

在本发明的对人体卵巢上皮癌的新型诊断方法中，使用了一种对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具以及一种分析方法。该分析试剂或分析工具含有一种对人体Mn-SOD有高度特异的免疫反应性的单克隆抗体，这点如上所述。

更具体地说，根据本发明的对人体卵巢上皮癌的新型诊断方法，当用人体体液作为分析样品按如上所述的方式对人体Mn-SOD进行分析时，发现人体Mn-SOD浓度呈现一个高达130ng/ml（健康妇女的平均值+2倍的标准偏差值）或更高的值，就可以诊断该妇女很可能患卵巢上皮癌，并且在手术后再分析其浓度，就可以监视预后过程，得知癌瘤处于退化、稳定或进展期中的哪个阶段。

在对心肌梗死的新型诊断方法中，使用了一种对人体Mn-SOD的分析试剂或分析工具。该分析试剂或分析工具含有一种如上所述对人体Mn-SOD有很高的特异的免疫反应性的单克隆抗体，还使用了如上所述的分析方法。

本发明的对心肌梗死的新型诊断方法不受对心肌梗死治疗后重新灌注的影响，也不需频繁地采集体液样品。这是因为在心肌梗死发作后的110±10小时期间，人体体液中Mn-SOD的浓度（生物指数）始终高达150ng/ml或更高（以下简称这个人体Mn-SOD高浓度值阶段为“诊断期”），而且在“诊断期”，即使发作两天或更久以后也能对体液进行取样。

现在，借助“参考实施例”及“实施例”，对本发明进行更为详细的说明。列举这些实施例的目的只是为了便于说明，完全不应对本发明进行限制。

实施例1

〔产生对人体Mn-SOD的单克隆抗体的杂种瘤细胞系的制备〕

（a）小鼠的免疫和脾脏淋巴细胞的制备

将1ml的溶解有80μg的人体Mn-SOD的PBS（磷酸盐缓冲剂，pH7.4），与1ml的弗罗因德（Freund）完全辅助剂进行充分混合，所得到的乳剂（0.5ml），施于BALB/C小鼠腹膜内（雌性，八周令）。

开始免疫后的两周，以上述同样的方法，只是用弗罗因德不完全辅助剂代替弗罗因德完全辅助剂而制备的乳剂（0.5ml），施于该小鼠的腹膜内。

接着，两周后，作为最后免疫，将0.2ml的溶解有20μg的上述人体Mn-SOD的PBS，经鼠尾静脉施于该小鼠的静脉内。

在最后免疫的第四天，从免疫后的小鼠摘取脾脏，放在装有10ml的RPMI1640溶液（用于培养淋巴细胞的溶于蒸馏水中的培养基粉剂）的陪替氏培养皿中，在冰冷条件下进行冲洗，转移到新配制的RPMI1640溶液中，用剪刀分成相等的四份，再用钳子使其松散。

所得到的漂浮的淋巴细胞悬浮在RPMI1640溶液中，进行离心处理（旋转数：1000rpm，时间：5分钟），在RPMI1640溶液中重新悬浮，从而得到作为细胞融合使用的小鼠脾脏淋巴细胞。

（b）细胞融合

将1.82×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞（它在对数生长相中对8-氮杂鸟嘌呤（NS-1）具有抵抗力〕，与1.39×10⁸个经如上处理的小鼠脾脏淋巴细胞一起放入由塑料制成的、体积为50ml的圆锥形离心管中进行混合，然后将上层清液进行离心处理（旋转数：1500rpm，时间：5分钟），随后轻轻拍打该离心管，使小球松散。

与猛烈摇动小球的同时，将1ml、50%的PEG4000溶液（37℃），在超过1分钟的时间内放入离心管中，然后再猛烈摇动1分钟。

与轻轻摇动该离心管的同时，将10ml的RPMI1640溶液（37℃），在超过3分钟的时间内逐渐加入到该离心管中，随后再次加入40ml的RPMI1640溶液（37℃），将混合液在室温下静置20分钟，然后，在室温下进行离心处理（旋转数：1000rpm，时间：5分钟），以吸引法移出上层清液。

轻轻拍打该离心管，使小球松散，小球被悬浮在75ml的HAT培养基中（含有1×10^-4M次黄嘌呤，4×10^-7M铵基蝶呤，1.6×10^-5M胸腺嘧啶核甙和20%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃下保存），然后将悬浮液加入到7只96-井培养平皿的每一个培养井中，每井加入100μl，培养作业在CO₂恒温箱（5%CO₂，95%空气，37℃，湿度100%）中进行。

在细胞融合后的第四天及第六天，每次添加50μl的上述HAT培养基，然后，每两天一次将混合液与相等数量的50μl的HT培养基（含有1×10^-4M次黄嘌呤，1.6×10^-5M的胸腺嘧啶核甙和20%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃下保存）进行互换。

（C）杂种瘤的选择

如上（b）所项述的培养，从开始一周以后至三周内，根据下面讲到的ELISA方法进行研究，以识别在细胞生长的培养平皿的每一井中，其培养物上层清液内是否含有对人体Mn-SOD的抗体。

首先，在平底的96-井ELISA平皿的每一分析井内，加入50μl的对人体Mn-SOD的多克隆抗体溶液（由山羊产生的，100μg/ml，溶于0.05M的碳酸盐、pH9.8的缓冲剂中）将混合液在室温下静置2小时。

接着，将ELISA平皿的每一分析井，用冲洗液（含有0.05%吐温20的PBS）冲洗两次，然后在每一分析井中加入100μl，0.1%的OVA（卵白蛋白）溶液（溶于PBS中），将混合液在室温下静置30分钟。然后将混合液用冲洗液冲洗两次，在每一井中加入50μl的人体Mn-SOD溶液（1μg/ml），接着在4℃下过夜。每一分析井用同样的冲洗液冲洗两次，然后将上述培养平皿的每一个培养井中的培养物上层清液50μl，加入到这些分析井中的每一井，随后在37℃下静置1小时（对于阴性对照，使用类似于小鼠骨髓瘤细胞培养所得到的上层清液，对于阳性对照，本发明细胞融合所用的小鼠血清，用冲洗液稀释十倍后使用）。

其次，ELISA平皿的每一分析井用冲洗液冲洗三次，将50μl的与抗小鼠IgG及IGM抗体溶液偶合的（Conjugated）的辣根过氧化物酶，加入到每一分析井中，在室温下静置1小时。将ELISA平皿的每一分析井用冲洗液冲洗四次之后，在每一分析井中加入100μl的酶作用物溶液（用20mg的邻苯二胺，10μl、35%的H₂O₂溶于50μl、0.1M、pH5.0的柠檬酸盐缓冲剂中制备），在室温及遮光条件下反应30分钟后，将50μl、2N的硫酸加到每一分析井中，以停止酶的反应，随后使用微平皿吸收测量装置，测量每一井在490nm上的吸收系数。

通过研究，在培养平皿中，678个培养井中的8个井内，识别出对人体Mn-SOD抗体产物。

（d）杂种瘤的克隆

利用含有20%胎牛血清的RPMI1640培养基，对上述步骤（C）中所识别到的具有抗体产物的8个培养井中的一个培养井，根据有限稀释法，对杂种瘤进行克隆。

对于进行培养，使用96-井培养平皿，利用BALB/c小鼠胸腺细胞悬浮液（10⁷个细胞/ml）作为喂养细胞，培养被固定在多于（immobilized out at）（0.1-5杂种瘤）/（100μl胸腺细胞悬浮液）/每井。

在上述的一个培养井的克隆中，在大约从第10天起就能观察到单个菌落，将培养井的上层清液收集起来，借助于ELISA方法，利用人体Mn-SOD（与上述步骤（C）的方法相同），对产生抗体的井进行筛选。对于已被识别出的具有对人体Mn-SOD的抗体产物的上层清液，根据ELISA方法（与上述步骤（C）同样的方法），进一步检查其与人体球蛋白、人体白蛋白及人体铜、锌-SOD的反应性。因此，在每一个克隆中，可以得到至少一种杂种瘤细胞系，它已经产生抗体，该抗体显示了对人体Mn-SOD的反应性，并且，将它们重复进行克隆。

因此，所得到的细胞系标记为NI8细胞系（FERM-P        No.1606），并且，由此细胞系生产的单克隆抗体也标记为NI8。

NI8细胞系培养物上层清液中所含的单克隆抗体的类和亚类，按下述的分析试验Ⅰ来予以确定，人体Mn-SOD与该单克隆抗体的反应性由分析试验Ⅱ予以鉴定，与各种蛋白质的反应性由分析试验Ⅲ予以检查。

分析试验Ⅰ

〔对人体Mn-SOD的单克隆抗体的类及亚类的确定〕

由NI8细胞系产生的免疫球蛋白的类及亚类的确定，根据Ouchterlony试验，利用对小鼠抗体（对Ig、G₁、IgG₂a、IgG₂b、IgG₃、IgM、IgA的抗体）的各个类及亚类的特定抗体溶液进行。

结果，由NI8细胞系（NI8）所产生的单克隆抗体，被发现是属于IgM的一种抗体。

分析试验Ⅱ

〔人体Mn-SOD与单克隆抗体反应性的鉴定〕

数量为30μl的人体Mn-SOD（10μg/ml）与含有50ml        NI8的培养物上层清液50ml进行充分混合，（NI8稀释至一倍、十倍或一百倍使用）在37℃下反应30分钟，然后加入10μl蛋白质A琼脂糖溶液（结合的蛋白质A数量：1至2mg/ml琼脂糖凝胶），在37℃下进一步反应10分钟，随后进行离心处理（旋转数：10000rpm，时间：5分钟），并分析上层清液的人体Mn-SOD活性（对于阴性对照，应使用骨髓瘤的上层清液。

结果，发现人体Mn-SOD活性下降（图1所示）。

分析试验Ⅲ

〔对人体Mn-SOD的单克隆抗体与各种蛋白质反应性的检查〕

对于NI8反应特异性，与各种蛋白质，例如人体白蛋白，人体球蛋白，人体铜、锌-SOD，人体Mn-SOD的反应性，根据Western吸墨法进行检查。结果判明NI8具有很高的对人体Mn-SOD的特异反应性，判明与其它蛋白质没有反应性。

实施例2

〔产生对人体Mn-SOD的单克隆抗体的杂种瘤细胞系的制备〕

（a）小鼠的免疫及脾脏淋巴细胞的制备

类似于实施例1，进行免疫及淋巴细胞的制备。

（b）细胞融合

如实施例1所述的操作，重复进行同样的操作，只是使用了1.7×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞（P3U1）（它在对数生长相中对8-氮杂鸟嘌呤具有抵抗力），与8.5×10⁷个小鼠脾脏细胞来进行制备。

（c）杂种瘤的选取

重复进行如实施例1中所述的操作。

研究的结果，在培养平皿中，678个培养井中的20个井内，识别出对人体Mn-SOD的抗体产物。

（d）杂种瘤的克隆

使用含有20%胎牛血清的RPMI1640培养基，对上述步骤（c）中所识别的具有抗体产物的20个培养井中的一个培养井，进行如实施例1同样的操作，以有效地对杂种瘤进行克隆。

所得到的细胞系标记为PE9细胞系（FERM-P        No.1607），并且，由此细胞系产生的单克隆抗体也标记为PE9。

保存在PE9细胞系培养物上层清液中的单克隆抗体的各种性质，按实施例1中的同样方法进行研究。结果，发现PE9的类及亚类属于Ig        M。借助于PE9与蛋白质A琼脂糖溶液反应所得到的上层清液的人体Mn-SOD活性降低（如图1所示）。判明PE9具有很高的对人体Mn-SOD的特异反应性，并与其它蛋白质没有反应性。

实施例3

〔产生对人体Mn-SOD的单克隆抗体的杂种瘤细胞系的制备〕

（a）小鼠的免疫及脾脏淋巴细胞的制备

类似于实施例1，进行免疫及脾脏淋巴细胞的制备。

（b）细胞融合

如实施例1所述的操作，重复进行同样的操作，只是使用1.4×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞（P3U1）（它在对数生长相中对8-氮杂鸟嘌呤具有抵抗力）与如上述制备的5.3×10⁷个小鼠脾细胞来进行制备。

（c）杂种瘤的选择

重复进行如实施例1中所述的同样的操作。

研究的结果，在培养平皿中，678个培养井中的15个井内，识别出对人体Mn-SOD的抗体产物。

（d）杂种瘤的克隆

使用含有20%胎牛血清的RPMI1640培养基，对上述步骤（c）中所识别的具有抗体产物的15个培养井中的一个培养井，进行如实施例1同样的操作，以有效地对杂种瘤进行克隆。

所得到的细胞系标记为PG11细胞系（FERM-P        No.1608），并且由此细胞系产生的单克隆抗体也标记为PG11。

保存在PG11细胞系培养物上层清液中的单克隆抗体的各种性质，按实施例1中的同样方法进行研究。结果，发现PG11的类及亚类属于IgG2a。利用PG11与蛋白质A琼脂糖溶液反应所得到的上层清液的人体Mn-SOD活性降低得更显著（如图1所示），因为它与蛋白质A比NI8和PE9更易于反应。判明PG11具有很高的与人体Mn-SOD的特异反应性，并与其它蛋白质没有反应性。

实施例4

〔利用烧瓶培养法产生对人体Mn-SOD的单克隆抗体〕

在含有15%的胎牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，所得到的NI8细胞系的细胞培养物被转移到10ml的RPMI1640溶液中（不含胎牛血清），在死亡前立即被培养成一种状态。

发现对人体Mn-SOD的单克隆抗体被包含在由培养物肉汤离心处理（旋转数：3000rpm，时间：5分钟）后所得到的上层清液中，浓度为35μg/ml（利用单辐射免疫扩散法测量）。

实施例5

〔在小鼠腹膜内产生对人体Mn-SOD的单克隆抗体〕

为了得到大数量的对人体Mn-SOD的单克隆抗体，可在小鼠腹膜内培养PG11细胞系的细胞。

将RPMI1640中的PG11细胞系的数量为5×10⁶个细胞的悬浮液，施于BALB/C小鼠的腹膜内（雌性，六周令，在前两周将0.5ml的姥鲛烷施于腹膜内）。

大约一周后，小鼠体重明显增加，两周时收集腹水（10ml/每鼠）。将腹水进行离心处理（旋转数：3000rpm，时间：5分钟）而得到腹水上层清液。

发现对人体Mn-SOD（PG11）的单克隆抗体被包含在腹水上层清液中，浓度为8.0mg/ml（利用单辐射免疫扩散法测量）。

参考实施例1

〔抗体的产生与纯化〕

培养PG11细胞系，它产生具有很高特异性的对人体Mn-SOD的单克隆抗体（FERM-P No.1608），将漂浮在磷酸盐缓冲剂中的10⁷个已培养的细胞施于BALB/C小鼠的腹膜内（雌性，八周令，在前两周，将0.5ml的姥鲛烷施于腹膜内）。在大约一周后，该小鼠体重明显增加。在第一周至第三周时，适当抽取腹水。因此所得到的单克隆抗体的抗体值为10⁶至10⁸。

下面说明从腹水所得单克隆抗体的纯化作业。

上述腹水用3-盐酸盐缓冲剂（pH7.4）进行透析，并通过经相同缓冲剂平衡的DEAE纤维柱。对通过的部分用50%饱和硫酸铵进行盐析，所得到的沉淀物溶于磷酸盐缓冲剂中（pH7.4），随后以同样的缓冲剂进行透析。根据平板凝胶电泳，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶发现，这样得到的对人体Mn-SOD的单克隆抗体的纯度在所有的抗体中是很高的。

根据利用如上所述得到的提纯的对人体Mn-SOD的单克隆抗体（“抗体”）的人体Mn-SOD分析法（ELISA），使更快速、灵敏度更高地分析人体Mn-SOD成为可能。

实施例6

〔酶标记抗体的制备〕

将参考实施例1中所得到的纯化单克隆抗体（“抗体”）作为“酶标记抗体”中的抗体使用。

利用单克隆抗体，按下述的方法用酶来标记抗体，以获得本发明分析工具中的“酶标记抗体”。

首先，8.5mg的辣根过氧化物酶溶于1ml的蒸馏水中，加入200μl、0.1M的偏高碘酸钠，将混合液在室温下静置30分钟。利用1mM乙酸盐缓冲剂（pH4.5），使酶溶液在4℃下透析、过夜。然后加入100μl、0.2M碳酸钠缓冲剂（pH9.5），以调节pH值为9.5。

另一方面，将8.5mg的单克隆抗体（PG11）溶于0.1M磷酸盐缓冲剂（pH7.4）中（以下简称PBS），利用0.01M碳酸钠缓冲剂（pH9.5）在4℃下透析、过夜。将得到的过氧化物酶与单克隆抗体进行混合，在室温下静置二个半小时，将四氢硼酸钠加到反应混合物中，随后在4℃下静置二小时。将所得到的过氧化物酶偶合单克隆抗体，利用PBS，在4℃下透析、过夜，在每一小瓶中放入10μl，以构成“酶标记抗体”（30μg/每瓶），即是人体Mn-SOD的分析工具。在分析人体Mn-SOD时，在使用前用PBS进行适当的稀释。

实施例7

〔根据利用人体Mn-SOD的分析工具的人体Mn-SOD分段反应法制备校准曲线〕

将参考实施例1的“抗体”溶液（10μg/ml溶于PBS），在96一井平底平皿中每井加入100μl作免疫分析，它即是载体（Nunc公司的聚苯乙烯平皿），然后在4℃下静置过夜，使“抗体”固定在每一井上。其次，为了除掉未固定在载体上的“抗体”，用含有0.05%的吐温20的PBS组成的冲洗溶液冲洗每一井。然后，为了防止在平皿上产生人体Mn-SOD或“酶标记抗体”的非特异吸收，在每井中加入含有0.1%BSA的PBS 200μl，随后在室温下静置30分钟。其次，在用同样的冲洗液冲洗以后，制备出“标准人体Mn-SOD溶液”（2、5、13、32、80、200、500ng/ml，用PBS溶解），并在每一井中加入100μl，随后在室温下静置1小时。以后，在用同样的冲洗液冲洗以后，将由实施例6中所得到的“酶标记抗体”溶液在每井中加入100μl，随后在室温下静置1小时。然后，在用同样的冲洗液冲洗之后，将“酶作用物溶液”（100mg的邻苯二胺和5μl、35%H₂O₂溶于25ml、0.1M的柠檬酸盐缓冲剂）在每井中加入100μl，随后在室温及遮光条件下静置15分钟。最后，加入50μl、2N硫酸，使酶反应停止。反应停止后，利用微平皿分光光度计测量溶液在492nm上的吸收系数。结果，根据利用“酶标记抗体”的分段反应法，来分析人体Mn-SOD，就可以用用于免疫分析的96-井平底平皿（Nunc公司的聚苯乙烯微平皿），（其上固定有“抗体”），在大约两个半小时内，以很高的灵敏度对人体Mn-SOD进行分析。其结果如图2所示。

实施例8-10

〔根据分段反应法，血清的稀释试验〕

如实施例7同样的方法来分析人体Mn-SOD，只是在实施例7中，使用“标准人体Mn-SOD溶液”，而在8-10实施例中，使用人体标准血清（由Kaketsuken制造的Nescol        X），将其稀释至浓度为220，660或1800ng/ml而制备的人体Mn-SOD溶液，再稀释到4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍而得到的溶液。结果，在8至128倍的稀释范围内判明为线性稀释。其结果如图3所示。

实施例11-12

〔根据分段反应法，人体Mn-SOD的添加和恢复试验〕

如实施例7同样的方法来分析人体Mn-SOD，只是使用含有人体Mn-SOD的稀释剂（0，50，100ng/ml，溶于由Kaketsuken制造的Nescol        X溶液中）稀释至11倍的一种溶液，而不是使用实施例7中的“标准人体Mn-SOD溶液”。结果，添加的人体Mn-SOD量大致与实际检定的人体Mn-SOD量一致。结果如表1所示。

表1

实施例	添加量（ng/ml)	测量值（ng/ml)	恢复量（ng/ml)	恢复率（％）
						0	67.1	-	-
11	50	119.9	52.8	105.6
					12	100	161.7	94.6	94.6

实施例13

〔根据利用人体Mn-SOD的分析工具的人体Mn-SOD混合溶液反应法制备校准曲线〕

将参考实施例1中的参考实施例1“抗体”溶液（10μg/ml，溶于PBS中），加到免疫分析用的96-井平底平皿中（Nunc公司的聚苯乙烯微平皿），每井100μl，随后在4℃下静置过夜，以使“抗体”固定在每个井上。其次，为了除去没有固定在载体上的“抗体”，用含有0.05%的吐温20的PBS组成的冲洗液将每一井都进行冲洗。此外，为了防止人体Mn-SOD或“酶标记抗体”在平皿上的非特异吸收，在每井中加入200μl的含有0.1%BSA的PBS，随后在室温下静置30分钟。以后，用同样的冲洗液冲洗，以后，将由已知数量的人体Mn-SOD溶液和实施例1的“酶标记抗体”所组成的混合液制备成“标准人体Mn-SOD溶液”（2、5、13、32、80、200、500ng/ml，用PBS溶解），在每一井中加入100μl，随后在室温下静置1小时。以后，在用同样的冲洗液清洗之后，将100μl的“酶作用物溶液”（10μg的邻苯二胺及5μl、35%的H₂O₂溶于25ml、0.1M的柠檬盐缓冲剂中）加到每一井中，随后在室温及遮光条件下静置15分钟。最后，加入50μl、2N硫酸，以使酶反应停止，在反应停止后，利用微平皿分光光度计测量溶液在492nm上的吸收系数。结果，根据利用“酶标记抗体”的混合溶液反应法来分析人体Mn-SOD，就可以用96-井平底平皿（Nunc公司的聚苯乙烯微平皿）（其上固定有“抗体”），在大约一个半小时内，以很高的灵敏度对人体Mn-SOD进行检测。其结果如图4所示。

实施例14-15

〔根据混合溶液反应法，人体Mn-SOD的添加及恢复试验〕

如实施例13同样的方式分析人体Mn-SOD，只是使用含有人体Mn-SOD的稀释液（0，100，250ng/ml，溶于由Kaketsuken制造的Nescol溶液中），稀释至11倍而制备的溶液来代替实施13中使用的“标准人体Mn-SOD溶液”。结果，添加人体Mn-SOD的数量大致与实际测定的人体Mn-SOD的数量一致。结果如表2所示。

表2

实施例号	添加数量（ng/ml)	测量值（ng/ml)	恢复数量（ng/ml)	恢复率（％）
						0	92.4	-	-
14	100	189.2	96.8	96.8
					15	250	319.0	226.6	90.6

对比实施例1-5

〔根据分段反应法，与人体血清蛋白的交叉反应性〕

如实施例7同样的方法，只是使用人体血清蛋白质的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、血红蛋白、铜锌-过氧物歧化酶的溶液来取代实施例7中的“标准人体Mn-SOD溶液”，研究同这些人体血清蛋白质的交叉反应性。结果，在所有人体血清蛋白质中，在492nm上基本上看不到吸收作用（即所有的人体血清蛋白质都不对本发明的分析产生干扰，因为α-球蛋白与β-球蛋白两者都完全不进行反应，其图形略去）。结果如图5所示。

对比实施例6-10

〔根据混合溶液反应法，与人体血清蛋白质的交叉反应性〕

如实施例13中的同样的方法，只是使用人体血清蛋白质的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、血红蛋白、铜锌-过氧化物歧化酶的溶液来取代实施例13中的“标准人体Mn-SOD溶液”，研究与这些人体血清蛋白质的交叉反应性。结果，在所有人体血清蛋白质中，在492nm上基本上观察不到吸收作用（即所有的上述人体血清蛋白质对本分析不产生干扰，因为α-球蛋白、β-球蛋白两者都完全不起反应，其图形被略去）。结果如图6所示。

实施例16-25

〔在各种女性患者血清中人体Mn-SOD浓度的分析〕

应用实施例7中的人体Mn-SOD分析方法，但不使用“标准人体Mn-SOD溶液”，而是使用不同疾病患者的用稀释液稀释十倍的血清，如表3所示〔卵巢上皮癌（例16：病例23个），非上皮卵巢癌（例17：病例12个），子宫内膜癌（例18：病例15个），子宫颈癌（例19：病例7个），肺癌（例20：病例4个），肝癌（例21：病例7个），黑色素瘤（例22：病例3个），在妇产科领域中的其它癌症（包绒毛膜癌、外阴癌、乳房癌;例23：病例8个），肝硬变（例24：病例8个），在产科和妇科领域中的其它疾病（子宫内膜异位、卵巢囊肿、绒毛状病、部分胎块;例25：病例7个）〕，分析其人体Mn-SOD浓度。作为对照，将健康妇女的血清（对照：病例：207个）用稀释液稀释十倍使用，而代替女性患者血清。结果如表3所示。

实施例26

〔利用人体Mn-SOD浓度分析，对卵巢上皮癌患者予后的监测〕

利用对一段时间间隔后血清中的人体Mn-SOD浓度的分析，来对23例卵巢上皮癌患者手术后治疗期的监测，这样进行予后的监测。具体地说，以实施例7中人体Mn-SOD的分析方法，利用经一段时间间隔后，从卵巢上皮癌患者抽取的血清，用稀释液稀释十倍，来取代“标准人体Mn-SOD溶液”，分析每位病人血清中的人体Mn-SOD浓度。

在上述23例患者中，7例表现出退化期，4例为稳定期，而12例为进展期。治疗期间与人体Mn-SOD浓度之间的关系如表4及图7所示。

表4

Mn-SOD浓度	退化期	稳定期	进展期
				降低	6例	1例	－
不变	1例	3例	4例
				增加	－	－	8例

实施例27

〔心肌梗死患者血清中Mn-SOD浓度的分析〕

如实施例7中人体Mn-SOD的分析方法，利用经一段时间间隔后，抽取7例心肌梗死患者血液的血清，稀释十一倍取代“标准人体Mn-SOD溶液”，分析它的人体Mn-SOD浓度。一段时间间隔后，各个患者血清中Mn-SOD浓度的分析结果如图8-14

在所有7个病例中（图8-14），CPK、GOT的生物指数在疾病发作后的12到14小时之后就能辨明出第一个峰，而LDH的生物指数在发作后30到60小时之后也可辨认出第一个峰，而Mn-SOD的生物指数在发作后10到24小时即可辨认出第一个峰。

在6个病例中（图8-13），可以认为有一“诊断期”（此术语表明，在这一期间内，Mn-SOD浓度持久不变地保持一个高值状态150ng/ml，大约持续110±10小时更长）。

有一个病例（图14），Mn-SOD浓度甚至在疾病发作后约110小时之后，仍然持续增加，直至具有很高数值400ng/ml或更高的状态，可以认定没有治疗效果，病人死亡。

CPK浓度的分析是根据UV-射线部分法（Genji        Kitamura，Shiro        Miwa        et        al，eds.;Clinical        Test        Manual，P.197，Bunkodo，1988）。

通过根据对比诊断法测定慢性期排出物成份及急性期排出物成份，来测定相应于左心室造影术衬度的心脏功能的改善率（%），（Genji        Kitamura，Shiro        Miwa        et        al，eds.;Clinical        Test        Manual，P.1110，Bunkodo，1988），并按下列公式进行计算：

改善率＝ (慢性期排出物成份-急性期排出物成份)/(急性期排出物成份) ×100

实施例28

〔“诊断期”中Mn-SOD浓度最大值与CPK浓度最大值之间的关系〕

如实施例7中人体Mn-SOD的分析方法，利用15个心肌梗死病例中的病人，经一段时间间隔后抽取的血液的部分血清，稀释到十一倍来取代“标准人体Mn-SOD溶液”，分析其人体Mn-SOD浓度。也利用同一血清，分析CPK的浓度以确定Mn-SOD浓度最大值与CPK浓度最大值在“诊断期”内之间的关系。结果如图15所示。

实施例29

〔“诊断期”中Mn-SOD浓度最大值与心脏功能的改善率之间的关系〕

如实施例7中人体Mn-SOD的分析方法，利用14个心肌梗死病例中的病人，经一段时间间隔后抽取的血液的血清，稀释到十一倍来取代“标准人体Mn-SOD溶液”，分析其人体Mn-SOD浓度。从“诊断期”中这样测得的Mn-SOD浓度最大值，以及由左心室对照法测量的心脏功能改善率，来确定两者之间的关系。结果如图16所示。

利用培养本发明的细胞系而得到的具有很高的对人体Mn-SOD的特异反应性的单克隆抗体，在涉及Mn-SOD的基础研究中作试剂用是极有希望的，在临床试验中作分析试剂是非常有用的。利用大致包括：“抗体”、“酶标记抗体”的人体Mn-SOD分析试剂或分析工具，可以容易地、快速地以及灵敏度很高地进行分析人体Mn-SOD。

此外，根据本发明提出的新颖的诊断卵巢癌的方法，借分析人体Mn-SOD浓度，就可能容易地、以很高的准确性来判断病人是否会受到卵巢上皮癌的折磨，在监测疾病的进展方面也是很有效的。此外，根据本发明的新颖的诊断心肌梗死的方法，借分析人体Mn-SOD浓度，可以很容易地诊断，而不必受到在心肌梗死治疗后重新灌注的影响，也不必多次抽取血液样品。

Claims (10)

1、一种对人体过氧化锰歧化酶(以下简称Mn-SOD)的单克隆抗体，其特征在于它是利用由人体Mn-SOD对小鼠产生免疫，然后使小鼠骨髓瘤细胞同上述小鼠淋巴细胞进行融合而得到的细胞系所产生，并且该单克隆抗体对人体Mn-SOD具有很高的特异性。

2、根据权利要求1所述的抗体，其中所说的细胞系从由NI8细胞系（FERM-P        No.1606）、PE9细胞系（FERM-P        No.1607）及PG11细胞系（FEPM-P        No.1608）所组成的小组中选择;这些细胞系是杂种瘤细胞系，是由人体Mn-SOD免疫的上述小鼠淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞融合而得到的。

3、一种对人体Mn-SOD具有很高特异性的对人体Mn-SOD的单克隆抗体的生产方法，包括：培养人体Mn-SOD对小鼠产生免疫，然后使该小鼠淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的细胞系。

4、一种用于分析人体Mn-SOD的工具，主要包括：

（a）一种对人体Mn-SOD具有很高的免疫反应性的单克隆抗体;以及

（b）一种用一种酶标记的单克隆抗体试剂，对人体Mn-SOD具有很高的特异免疫反应性（酶标记抗体）。

5、如权利要求4的工具，其中所说的抗体是PG11（FERM-P        No.1608）。

6、一种对人体Mn-SOD的分析方法，包括：将对人体Mn-SOD具有很高的特异性的单克隆抗体固定在载体上，然后使被固定的单克隆抗体、分析样品中的人体Mn-SOD和酶标记抗体进行反应，借此制备一种包括固定在载体上的单克隆抗体、人体Mn-SOD及酶标记抗体的复合物。

7、如权利要求6所述的人体Mn-SOD分析方法，其中所述的抗体是由PG11细胞系（FERM-P        No.1608）生产的抗体。

8、如权利要求6所述的人体Mn-SOD分析方法，其中所说的分析包括下述步骤：

（1）将予定数量的“抗体”固定在载体上的步骤;

（2）将未在载体上固定的“抗体”除去的步骤;

（3）防止分析样品和“酶标记抗体”在没有固定“抗体”的载体表面进行非特异结合的步骤;

（4）使固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”进行反应以得到包括固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”的复合物的步骤;

（5）在固定在载体上的“抗体”、人体Mn-SOD和“酶标记抗体”反应后，除去未反应的混合物的步骤;

（6）使“固定在载体上作为复合物的“酶标记抗体”与“酶作用物溶液”进行反应，以及

（7）测量酶反应后反应混合物的吸收系数的步骤。

9、一种新颖的诊断人体卵巢上皮癌的方法，包括：利用人体Mn-SOD分析工具分析体液中人体Mn-SOD的浓度，该分析工具包括对人体Mn-SOD具有很高特异性的单克隆抗体。

10、一种新颖的诊断心肌梗死的方法，包括：利用人体Mn-SOD分析工具分析体液中人体Mn-SOD浓度，该分析工具包括对人体Mn-SOD具有很高的特异性的单克隆抗体。

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