CN1017349B - 抗人心房钠尿肽的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

由寄存的杂交瘤细胞系CCTCC No.C86001和No.C86002产生抗心房钠尿肽的单克隆抗体。杂交瘤是通过与产生抗心房钠尿肽抗体的哺乳动物细胞融合而产生的。因此，这种抗体可以用于某些测定方法来测定诸如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊髓液等生物样品中心房钠尿肽的水平。

Description

本发明一般涉及新的杂交瘤细胞系，特别是产生对心房钠尿肽（ANP）尤其是对人和大鼠的心房钠尿肽具有特异性的单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞系;涉及以此方法产生的mAb在体内和体外作为辅助诊断和在研究方面的应用。

将小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞进行融合（Koehler    and    Milstein，Nature    256，495-497（1975）），首次表明可以得到产生均一抗体（称为“单克隆”抗体）的传代细胞系。从那时起，已作了许多努力来制备各种杂交细胞（称为“杂交瘤”），并利用杂交细胞所形成的抗体进行各种科学研究（例如：Current    Topics    in    Microbiology    and    Immunology，Vol.81-“Lymphocyte    Hybridomas”，F.Melchers    et    al.，Springer    Verlag，1978及其中的参考文献;C.Barnstable    et    al，Cell，14，9-20（1978）;P.Parham，W.F.Bodmer，Nature，236，397-399，Handbook    of    Experimental    Imaunology，3rd，edition，Volume    2，D.M.Wier，Editor，Blackwell    1978，第25章;Chem.Eng.New.15-17（1979）9）。这些出版物叙述了利用杂交瘤产生单克隆抗体的主要技术。

已经得到了抗组织相容性抗原、抗半抗原、蛋白质和酶的单克隆抗体。但是迄今还没有可与哺乳动物如人或大鼠的心房钠尿肽高度选择性反应的单克隆抗体。

心房钠尿肽是一类具有不同链长的肽，其最小活性序列由23个氨基酸组成。另外含有其他N-末端和C-末端氨基酸的肽同样具有活性。这些肽是在心房中由一种约152个氨基酸的前体分子通过酶的作用而产生的。已克隆了编码ANP的基因，并测定了DNA序列。

ANP诱导持续期短但很强的钠尿排泄，目前尚不能查明这种物质确切的管状作用位点。此外，ANP是有效的血管扩张剂，特别是可拮抗正肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、组织胺和5-羟色胺对血管的作用。ANP的作用不被消炎痛解除，因此ANP不大可能是通过内源性前列腺素合成而起作用。对于ANP对双环（two-clip）高血压大鼠和SH大鼠的降血压作用已进行了叙述。

在分离的细胞中已检测出对醛固酮和后叶加压素分泌的抑制作用。可以利用常规抗体用放射免疫学方法测定ANP的血浆水平，这一水平取决于特定实验动物的生理状况。已用磺¹²⁵标记的ANP衍生物检测了对分离的球状带细胞的特异结合。最初的实验表明，在肾中，ANP诱导激肽释放酶的释放。在一定条件下，这种肽对肾的活性可以由于用氟哌啶醇预处理而失效（综述见Sagnella and MacGregor，Nature 399，666-668，1984）。ANP的活性谱表明，这些肽很可能与下列疾病的原因或症状有关：循环失调（高血压、低血压、动脉硬化）、心脏功能失调（急慢性心机能不全、心肌梗塞、心律不齐、冠心病）以及肾功能失调（各种基础紊乱过程中的急慢性肾功能不全、尿毒症）。因此，定量测定各种生物体液（例如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊髓液）中的ANP对于上述所有症状都是十分重要的。

采用常规抗血清测定某些ANP在血浆中的水平是很高的，这可以用这些抗体的交叉反应或缺省特异性来解释。利用高特异性的（单克隆）抗体可以减少测出心房钠尿肽不真实的高血浆水平的可能性。因此，这种类型的抗体理想地适用于诊断与ANP水平变化有关的所有疾病。

本发明涉及能够合成和分泌具有高度特异性的抗心房钠尿肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法。本发明还涉及能够合成和分泌抗哺乳动物特别是人或大鼠的心房钠尿肽的单克隆抗体的杂交细胞系。采用前言中提到的Koehler和Milstein的方法制 备杂交瘤。用结合于一种免疫原性载体如蛋白质上的心房钠尿肽免疫小鼠后，使这些小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系的细胞融合。对由此产生的杂交瘤进行系统检验，检出那些选择性地心房钠尿肽反应的抗体。已采用这种方法分离出产生抗心房钠尿肽抗体的杂交瘤。本发明也涉及这些抗体。

产生这些抗体的杂交瘤已于1986年3月15日寄存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉珞珈山武汉大学内）。寄存号为CCTCC    No.C86001（产生mAb    11A-A11杂交瘤细胞系）和CCTCC    No.C86002（产生mAb    23M-D9杂交瘤细胞系）。

本发明的抗体可以用于例如测定生物体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊髓液中的心房钠尿肽的水平。本发明的抗体特别适于进行免疫测定。然而，它们也可以用于利用免疫吸附层析法分离心房钠尿肽。

对于深入研究ANP在各种生理和病理条件下的意义而言，动物实验研究是绝对必须的。这些研究及ANP的所有药理学研究的前提是有一些适于在体液中进行定量测定的特异而灵敏的测定方法。

本发明的抗体可以用于例如为进行诊断而测定实验动物血清中的心房钠尿肽水平。本发明的抗体也非常适用于生理或药理实验。

杂交瘤的制备一般包括如下步骤：

A）用结合于一种免疫原性载体，最好是一种免疫原性载体蛋白（例如钥孔

血蓝蛋白）上的心房钠尿肽（如人或大鼠的心房钠尿肽）（KLH-ANP）免疫哺乳动物。已证明雌性Balh/c小鼠适于这种实验，但也可采用其他品系的小鼠。KLH-ANP的浓度和免疫方式需要进行选择，以使小鼠产生足够数量的抗原刺激的淋巴细胞。以14天为间隔，分三次注射含100微克KLH-ANP的磷酸盐缓冲的生理盐水可有效地免疫小鼠。

B）得到免疫哺乳动物（例如小鼠）的脾脏，制备脾细胞在适当培养液中的悬浮液。每个脾脏加大约1毫升培养液就够了。有关实验技术是已知的。

C）采用适当的融合促进剂（例如聚乙二醇），使悬浮的脾细胞与适当细胞系的骨髓瘤细胞（例如小鼠骨髓瘤PX63Ag8）融合。较好的融合促进剂是平均分子量在1，000和4，000之间的聚乙二醇（例如市售PEC1，000等）。但是也可以采用其他已知的融合促进剂。脾细胞/骨髓瘤细胞的比例最好约为10。对于10⁸个脾细胞，融合培养基的总体积约为0.5-1.0毫升就够了。许多小鼠骨髓瘤细胞都是已知的，而且可以从科研究机构或细胞保藏机构得到。所用的细胞系最好应具有一种遗传缺陷，使得在选择培养基中非融合骨髓瘤细胞死亡而杂交细胞存活。最常用的是8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，这种细胞系缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，因此不能在HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷）中生长（Science145：709，1964）。

此外，所采用的骨髓瘤细胞系最好应是非分泌型的，这样它本身便不会形成抗体或免疫球蛋白的H或L-链。但是在某些情况下，采用分泌型骨髓瘤细胞可能是有益的。

D）将融合混合物（脾细胞和骨髓瘤细胞）进行稀释，在单个容器中用选择性培养基进行培养，使非融合的细胞不能增殖而在1-2周内死亡。通过调节稀释剂的体积分离出单个的融合细胞，从而使一定数目的细胞（大约1-4个）置于每个单独的容器中（例如微量滴定板的各小孔）。

E）检测每个容器中抗心房钠尿肽抗体的存在与否。

F）选择并克隆（例如采用有限稀释）产生所需抗体的杂交瘤。

一旦选择出所需杂交瘤并进行了克隆，则有可能通过两种不同的方法得到抗体。如果在适当培养基中培养杂交瘤一定的时间，则可以得到纯度很高的单克隆抗体，抗体是从上清液中获得的。适当的培养基和最佳培养时间很容易确定。这种体外技术提供的单克隆抗体只被少量异源血清（例如胎牛血清）来源的蛋白所污染。

为了制备纯度略低但浓度高得多的单克隆抗体，可以对小鼠腹腔注射所选择的杂交瘤，这种小鼠最好是同源或半同源的。培养一定时间后，导致小鼠形成肿瘤，该肿瘤在宿主动物的血液和腹腔渗出液（腹水）中释放高浓度的抗体（5-20毫克/毫升）。即使这些小鼠的血液和腹水中有正常的抗体，它们的浓度与mAb相比也是很低的。这样得到的单克隆抗体效价很高（稀释10^-3或更低时仍有活性），特异和非特异免疫球蛋白之比约为20：1。

实例1制备抗人和大鼠心房钠尿肽的单克隆抗体制备用于免疫的抗原

所用的抗原是人α-ANP或大鼠心房肽（atriope ptin）Ⅱ（Bachem公司提供）与钥孔

血蓝蛋白（KLH，Pacific Biomarine Supply Company）的结合物。制备时，将KLH和人α-ANP或心房肽Ⅱ以1：1的摩尔比混合，加入浓度为2毫克/毫升的戊二醛在磷酸盐缓冲的生理盐水中的溶液。反应混合液中戊二醛的终浓度为0.25%。室温下保温1小时，在4℃下将蛋白结合物对磷酸盐缓冲的生理盐水透析若干次。

Balb/c小鼠的免疫

用混以0.2毫升完全弗氏佐剂的100微克KLH-ANP结合物腹腔免疫雌性Balb/c小鼠。14天后，再次用混以不完全弗氏佐剂的100微克抗原对动物进行腹腔免疫。然后，以14天为间隔再进行两次静脉免疫注射，每只动物每次注射磷酸盐缓冲的生理盐水100微克，其中含50微克抗原。在最后一次注射抗原3天后，摘除动物的脾脏。

制备脾细胞悬浮液

迫使器官通过不锈钢筛，则从所摘除的脾脏制得单个细胞的悬浮液。将细胞移入Dulbecco最低必需培养基（DMEM），该培养基添加有4.5克/升葡萄糖、100单位/升青霉素和100微克/毫升链霉素。用DMEM洗涤细胞3次。然后按所需浓度再悬浮于同样培养基中。一般从每个脾脏得到约10⁸个细胞。

制备骨髓瘤细胞

本实验所用的骨髓瘤细胞系X63Ag8.653是不表达任何免疫球蛋白重链或轻链的小鼠骨髓瘤细胞系P3-X63-Ag8的亚克隆。（J.Immunol.123:1543-1550（1980））。

这些细胞对20微克/毫升8-氮鸟嘌呤敏感，不再能够在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基（HAT）中生长。将细胞培养在DMEM中，该培养基中添加有4.5克/升葡萄糖、20mM谷氨酰胺、1，000单位/毫升青霉素、100微克链霉素和10%胎牛血清（完全培养基）。融合时，骨髓瘤细胞处于细胞增殖的对数期。

细胞融合

以10：1的比例将脾细胞悬浮液加入含有骨髓瘤细胞的不加血清的DMEM培养基中，用圆底离心杯以200g离心10分钟。细胞沉降后，小心倾出上清液。将细胞与2毫升分子量为2，000的聚乙二醇溶液（用DMEM稀释至30%（W/W），pH7.6）于37℃下保温1分钟。然后加入20毫升DMEM，小心地悬浮细胞几分钟。再以200g离心5分钟，将细胞沉淀以10⁶个细胞/毫升的浓度再悬浮于HAT培养基中，然后按每份1毫升分置于Costar平板中。

杂交瘤的选择和培养

细胞融合后，于37℃下，在含有5%二氧化碳的湿气中，将细胞用HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷）进行培养。几周后，用适当的酶免疫测定法（见后）测定杂交瘤细胞培养物上清液中抗-ANP活性的存在。选择抗-ANP测定结果呈阳性的杂交瘤细胞系进行克隆。

克隆步骤包括对杂交瘤进行有限稀释操作，利用这种方法按每孔平均0.5个细胞分置在96个微量滴定孔中，每孔加入10⁵个小鼠胸腺细胞作为“喂养细胞”。将这种克隆过程后仍然产生抗-ANP抗体的细胞在含有25%胎牛血清和7.5%二甲基亚砜的完全培养基中进行增殖，并在液氮中冷冻保存。

制备大量单克隆抗体

对腹腔注射过0.5毫升鲨肝油烷而进行了预处理的小鼠腹腔注射所克隆的杂交瘤，以便在约10-15天后能够获得含有抗体的腹水液。利用放射结合抑制测定法（见实例3）测定腹水液中抗体的活性。

测定培养上清液中的抗ANP活性

将100微升培养上清液加至微量滴定板上，该滴定板已在室温下吸附牛血清清蛋白与人α-ANP或大鼠心房肽Ⅱ（5微克/毫升）的结合物3小时并用水洗涤5次。然后加入与过氧化物酶偶联的免抗小鼠免疫球蛋白，然后在室温下将滴定板保温2小时。用蒸馏水洗涤5次后，加入对酶适合的底物缓冲液，采用适用于微量滴定板的光度计测定所生成的有色产物的浓度。

实例2房钠尿肽单克隆抗体的定性

单克隆抗体的定型

分析本发明叙述的单克隆抗体的类型和亚型，从培养上清液中富集抗体，利用硫酸铵（40%饱和）沉淀进行部分纯化。采用类型特异性抗小鼠免疫球蛋白抗血清进行Ouchter  lony凝胶扩散试验，确定免疫球蛋白的类型。抗人ANP的单克隆抗体23M-D9属于IgG1型。抗心房肽Ⅱ的单克隆抗体11A-A11也属于IgG1型。

抗体与各种其他肽和激素的交叉反应

利用放射免疫结合抑制测定法测定抗人ANP的单克隆抗体与各种其它肽的交叉反应性。在一种特殊的测试缓冲液（0.02M磷酸钠;0.15氧化钠;0.01% 乙基汞硫代水杨酸钠;0.1%明胶;0.1%BSA和0.1%曲拉通-X100，pH7.4）中进行测定。在4℃下，将放射标记的碘¹²⁵-α-人ANP（氨基酸1-28）或碘¹²⁵-大鼠心房肽Ⅱ（Amersham Buchler）同适当稀释的抗体一起保温16-48小时。总体积为500微升。在进行结合抑制测定时，同样体积的测定混合液中还含有不同浓度的未标记抗原或各种抑制剂。保温结束后，加入活性炭悬浮液（0.2M磷酸钠;2%诺籁特牌活性炭;0.02%葡聚糖60;0.1%BSA和10mMNa₂EDTA pH7.4），使未与抗体结合的放射标记碘¹²⁵-抗原（具有1-28氨基酸的人α-ANP或大鼠的心房肽Ⅲ）吸附到活性炭上，然后在冰上保温20分钟。接着以3，600g离心10分钟以沉降活性炭，测定上清液的放射性。测定了各种肽从抗体中置换出50%碘¹²⁵-抗原所必需的浓度。从图1和图2明显可见，这些抗体与人和大鼠心房肽反应的特异性很高。检测不到与有关水-盐平衡调节的其他介质有交叉反应性。各种血管活性物质也同样没有交叉反应性（见表1和表2）。

实例3抗心房钠尿肽单克隆抗体的应用

采用单克隆抗体检测生物体液和组织的ANP免疫活性

采用放射免疫测定法能定量测定高度稀释的抗原。这种测定需要高度特异性的抗体和放射标记的抗原。放射标记抗原与抗体的结合可以被非放射性抗原以剂量依赖方式抑制。如果将各种限定浓度的非放射性抗原与恒定浓度的抗体以及放射标记的抗原一起保温，则能采用这种方法画出一条特征校准曲线。图1显示了这种类型的校准曲线，具体显示的是各种心房肽或其衍生物对mAb 23M-D9中的放射标记抗原（碘¹²⁵-人-α-ANP，氨基酸1-28）的置换。这需要将放射活性抗原与抗体结合的百分比对非标记抗原或其片段的浓度（fmol/ml）作图。在本图中，

- -表示人-αANP（1-28）

…    …表示从-ANP片段（7-28）

-    -表示ANP片段（18-28）

如本文所述，用最终稀释度为1：1，500，000的腹水液进行测定。用培养上清液进行测定得到类似结果，只是所用的稀释度可以小500-1，000倍。该实验清楚地表明，ANP片段（18-28氨基酸）不能从抗体中置换出放射标记的抗原。因此，抗体与该片段没有交叉反应性。利用上述校准曲线可以测出溶液中未知量的抗原。基于本文所述的单克隆抗体并用碘¹²⁵-人-α-ANP（氨基酸1-28）作示踪物的放射免疫测定法，有可能对浓度低至20pg/ml（大约相当于6fmol/ml的量）的生物体液和组织提取液进行检测。（见图1）。

图2显示用同样方法对特异地与大鼠心房肽反应的mAb11a-a11进行的实验。在本图中，

-□-表示心房肽Ⅰ

-■-表示心房肽Ⅱ

-△-表示心房肽Ⅲ

-▲-表示ANP片段（13-28）

绘图方式同图1。

如本文所述，用最终稀释度为1：1，250，000的腹水液进行测定。用培养上清液进行测定得到类似结果，只是所用的稀释度可以小500-1，000倍。该实验清楚表明，ANP片（氨基酸13-28）不能从抗体中置换出放射标记的抗原。因此，抗体与该片段没有交叉反应性。利用上述校准曲线可以测出溶液中未知量的抗原。基于本文所述的单克隆抗体并用碘¹²⁵心房肽Ⅲ作示踪物的放射免疫测定法，有可能对浓度低至20pg/ml（大约相当于6fmol/ml的量）的生物体液和组织提取液进行检测（见图2）。除了这里所列出的放射免疫法外，也可以利用所述单克隆抗体进行其他类型的免疫测定（例如ELISA法、化学发光法、荧光法）。

实例4对大鼠心房肽体内作用的拮抗

用雄性Wistar大鼠（体重240-270克）进行实验，实验前一天晚上开始禁食，但供给饮用水。准备和实验在仲丁硫巴比妥钠（100毫克/千克腹腔注射）麻醉下进行。切开气管后，腹腔注射1毫克/千克阿托品，将一根塑料导管插入股动脉以测量血压，一根塑料管导插入颈静脉以注射或灌注溶液，并插入一根膀胱导尿管。准备工作完成后，给大鼠注射5毫升/千克0.9%氯化钠溶液，然后在实验期间灌注同样的溶液（1.2毫升/小时）。用红外加热灯维持实验动物的直肠温度在37±1℃。平衡1小时后，用预先称重的容器收集尿液，每10或20分钟换一个容器。用火焰光度计（Instrumentation    Laboratory，Lexington，Mass/USA）测定尿中的钾离子和钠离子浓度。抗体液为1毫升含100微升无菌过滤的腹水液和0.1%牛血清清蛋白的0.9%氯化钠溶液。同样注射0.9氢化钠和0.1%牛血清清蛋白的合成心房肽Ⅱ（Bachem提供）水溶液。在所有情况下，注射体积都为1毫升/千克体重。 初步实验表明，以1毫升/千克体重快速浓注含有0.1%牛血清清蛋白的0.9氯化钠溶液，对尿体积和钠排泄只有轻微影响。实验完成后，取每只大鼠的动脉血样品检查其酸碱性。

心房肽Ⅱ在以10微克/千克静脉快速浓注后的前10分钟内，导致尿体积和钠排泄大大增加（见图3和4）。在随后的收集期中，这种增加趋迅速减弱，1小时后，再以10微克/千克体重静脉快速浓注ANP很好地再现这种增加。在第二次注射ANP前5分钟，以100微升/千克体重快速浓注含抗体的腹水液（抗体11A-A11）则几乎可以完全抑制尿体积和钠排泄的增加。

图3和图4显示了详细结果。以收集时间（收集期）为纵坐标，对尿排泄量（微升/分）（图3a和3b）和钠排泄量（微摩尔/分）（图4a和4b）作图。

图3a：两次快速浓注10微克/千克心房肽Ⅱ（ANP）后尿的体积，n＝4

图3b：抗ANP的mAb对10微克/千克心房肽Ⅱ的拮抗作用：在第二次注射ANP5分钟前，快速浓注100微升/千克含抗体的腹水液（Ab），n＝4

图4a：两次快速浓注10微克/千克心房肽Ⅱ（ANP）后钠的排泄，n＝4

图4b：抗ANP的mAb对20微克/千克心房肽Ⅱ的拮抗作用：在第二次注射ANP5分钟前，快速浓注100微升/千克含抗体的腹水液（Ab），n＝4

因此抗体在体内拮抗心房肽Ⅱ的促钠尿排泄作用。

表1

mAb23M-D9与具有血管活性或对水-盐平衡有影响的其他内源性介体的交叉反应性的研究

物质    最大测试浓度    交叉反应性

（微微摩尔/毫升）

血管紧张素Ⅱ（人）    14    -

Leu-脑啡肽    26    -

P物质    10    -

醛固酮    44    -

促肾上腺皮质激素（猪）    4    -

舒缓激肽    13    -

γ-促黑激素    10    -

胰岛素（大鼠）    3    -

加压素    15    -

血管紧张肽原酶（猪）    0.5    -

表2

mAb11A-A11与具有血管活性或对水-盐平衡有影响的其他内源性介体的交叉反应性的研究

物质    最大测试浓度    交叉反应

（微微摩尔/毫升）

血管紧张素Ⅱ（人）    14    -

Leu-脑啡肽    26    -

P物质    10    -

醛固酮    44    -

促肾上腺皮质激素（猪）    4    -

舒缓激肽    13    -

γ-促黑激素    10    -

胰岛素（大鼠）    3    -

加压素    15    -

血管紧张肽原酶（猪）    0.5    -

Claims (3)

1、制备抗哺乳动物心房钠尿肽的单克隆抗体的方法，该抗体与具有血管活性或能影响盐-水平衡的其他内源性介体没有交叉反应，其特征在于将分泌这类抗体的杂交瘤细胞11A-A11和23M-D9(CCTCC No.C86001和CCTCC No.C86002)培养在适当的培养基中，并从其上清液中得到该抗体。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于将所述杂交瘤细胞注射到同源或半同源的小鼠中，并从其血液或腹腔渗出液中得到该抗体。

3、根据权利要求1和2之一的方法，其中所述内源性介体是血管紧张素Ⅱ（人），Leu-脑啡肽，P物质，醛固酮，促肾上腺皮质激素（猪），舒缓激肽，u-促黑激素，胰岛素（大鼠），加压素和血管紧张肽原酶（猪）。

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