DK165955B - Monoklonale antistoffer mod atriale, natriuretiske peptider hos pattedyr, hybridomcellelinier, der producerer antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af hybridomcellerne og anvendelse af antistofferne - Google Patents
Monoklonale antistoffer mod atriale, natriuretiske peptider hos pattedyr, hybridomcellelinier, der producerer antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af hybridomcellerne og anvendelse af antistofferne Download PDFInfo
- Publication number
- DK165955B DK165955B DK127686A DK127686A DK165955B DK 165955 B DK165955 B DK 165955B DK 127686 A DK127686 A DK 127686A DK 127686 A DK127686 A DK 127686A DK 165955 B DK165955 B DK 165955B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- monoclonal antibodies
- antibodies
- cells
- atrial natriuretic
- cell lines
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i
DK 165955B
Opfindelsen angår monoklonale antistoffer med atriale, natriuretiske peptider hos pattedyr, hybridomcellelinier, der producerer antistofferne, en fremgangsmåde til fremstilling af antistofferne, en fremgangsmåde til fremstilling af 5 hybridomcellerne, og anvendelsen af antistofferne.
Fusionen af muse-myelomceller med miltceller af immuniserede mus (Kohier og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) var den første henvisning til muligheden for at tilvejebringe kontinuerlige cellelinier, der producerer ensartede (såkaldte 10 "monoklonale") antistoffer. Siden da er der foretaget talrige forsøg på at fremstille forskellige hybridceller (såkaldte "hybridomer") og anvende de antistoffer, der dannes af dem, til forskellige videnskabelige undersøgelser (jf. f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 -15 "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers et al., Springer Verlag, 1978, samt de deri anførte referencer; C. Barnstable et al.,
Cell 14, 9-20 (1978); P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. oplag, bind 2, D.M. Wier, udgivet af Blackwell 1978, Kapitel 25; Chem. Eng.
20 News, 15-17 (1979) 9). Disse arbejder beskriver den principielle teknik til fremstilling af monoklonale antistoffer ved hjælp af hybridomer.
Der er produceret antistoffer mod histokompatibilitets--antigener, mod haptener, proteiner og enzymer. Der kendes 25 imidlertid ikke monoklonale antistoffer, der reagerer højselektivt med atriale natriuretiske peptider hos pattedyr, f.eks. hos mennesker eller rotter.
Ved atriale natriuretiske peptider er der tale om en gruppe med forskellig kædelængde, hvis minimalt virksomme 30 sekvens består af 23 aminosyrer. Peptider, der desuden indeholder yderligere N-terminale og C-terminale aminosyrer, er ligeledes virksomme. Peptiderne dannes ved enzymatiske påvirkninger i hjerteforkammeret på et forløbermolekyle med ca. 152 aminosyrer. Genet, der koder for ANP, er klonet, og DNA-sekvensen 35 er bestemt.
O
DK 165955 B
2 ANP'er inducerer en kortvarig stærk natriurese, idet der indtil nu ikke har kunnet påvises et eksakt tubulært angrebspunkt af stofferne. Desuden er ANP'er potente vasodilatator er, der bl.a. kan antagonisere karvirkningen af noradre-5 nalin, angiotensin II, histamin og serotonin. Virkningen af ANP ophæves ikke af indomethacin., hvilket gør en virkning via den endogene prostaglandinsyntese usandsynlig. Blodtrykssænkende virkninger af ANP er beskrevet hos two-clip-hypertone rotter og SH-rotter.
1° Hos isolerede celler kan der påvises en inhibe- rende virkning på aldosteron- og vasopressin-sekretionen.
Under anvendelse af konventionelle antistoffer kan der radio- immunologisk måles et plasmaniveau af ANP, der er afhængigt af det foreliggende forsøgsdyrs volumentilstand. Med et 125 15 I-mærket ANP-derivat kan der påvises en specifik binding til isolerede zona-glomerulosa-celler. De første eksperimenter har tydet på en frigørelse af kallikrein i nyrerne på grund af ANP. Under bestemte betingelser kan peptidernes nyrevirkning ophæves ved forbehandling med haloperidol 20 (Sagnella og MacGregor, Nature 399, 666-668 (1984)).
Virkningsspektret af ANP gør en kausal eller symptomatisk medvirken af disse peptider ved kredsløbssygdomme (hypertoni, hypotoni, arteriosclerose). ved hjertesygdomme (akut og kronisk hjerteinsufficiens, hjerteinfarkt, hjerte-25 rytmeforstyrrelser, coronar hjertesygdom) og ved nyresygdomme (akut og kronisk nyresvigt under forløbet af forskellige grund--sygdomme, uræmi) meget sandsynlig. Ved alle de nævnte sygdomsbilleder vil kvantitativ bestemmelse af ANP -i forskellige biologiske legemsvæsker (f.eks. blod, plasma, serum, urin, 30 lymfe eller cerebrospinalvæske) derfor få stor betydning.
De plasmaniveauer af ANP, der er målt med sædvanlige antisera, er til dels meget høje, hvilket kan forklares ved en krydsreaktivitet eller manglende specificitet af disse antistoffer. Risikoen for bestemmelse af ukorrekt 35 høje plasmaniveauer af atriale natriuretiske peptider kan udelukkes ved anvendelse af højspecifikke (monoklonale)
DK 165955B
3 antistoffer. Dermed vil sådanne antistoffer være ideale til diagnostik af alle sygdomme med forandret ANP-niveau.
Den foreliggende opfindelse angår:
Monoklonale antistoffer mod atriale natriuretiske 5 peptider hos pattedyr, hvilke antistoffer er ejendommelige ved, at de ikke udviser nogen krydsreaktivitet med andre endogene mediatorer med karvirkning eller med virkning på salt-vand-balancen.
Hybridomcellelinier, som er ejendommelige ved, at de 10 producerer monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen.
En fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes hybridomcellelinier ifølge opfindelsen, hvorved hybridomcellelinierne især dyrkes i et 15 egnet kulturmedium, og antistofferne udvindes fra den ovenstående væske, eller injiceres i syngene eller semisyngene mus, og antistofferne udvindes fra blodet eller det peritone-ale ekssudat.
- En fremgangsmåde til fremstilling af hybridomceller 20 ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at myelomceller, fortrinsvis musemyelomceller, især af non-secreting type, fusioneres med celler, fortrinsvis miltceller, fra pattedyr, fortrinsvis mus, der producerer antistoffer mod atriale natriuretiske peptider, hvorved immuni-25 seringen fortrinsvis er sket med atriale natriuretiske peptider, der er bundet til en immunogen bærer, især et protein.
Anvendelsen af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen til bestemmelse af atriale natriuretiske peptider i biologiske væsker, til bestemmelse af atriale natriuretiske 30 peptider i blod, plasma, serum, urin, lymfe eller cerebrospi-nalvæsken, til immunanalyser eller til isolering af atriale natriuretiske peptider ved immunadsorptionschromatrografi. Hybridomcellelinierne fremstilles ved den i indledningen nævnte metode ifølge Kohier og Milstein ved f.eks. immunise-35 ring af mus med atriale natriuretiske peptider, som er bundet til en immunogen bærer, f.eks. protein, og fusionering af
DK 165955 B
4
O
miltceller fra disse mus med celler fra en muse-myelom-celle-linie. De derved fremkomne hybridomer undersøges systematisk for antistoffer, der regerer selektivt med de atriale natriu-retiske peptider. På denne måde isoleres hybridomer, der 5 producerer antistoffer mod atriale natriuretiske peptider.
Hybridomer, der producerer disse antistoffer, er deponeret den 14. marts 1985 under deponeringsnumrene 85031401 (hybridomcellelinie, der producerer mAK 11A-A11) og 85031402 (hybridomcellelinie, der producerer mAK 23 M-10 D9) hos National Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, Storbritannien.
De her omhandlede antistoffer kan f.eks. anvendes til bestemmelse af niveauet af atriale natriuretiske peptider 15 i biologiske væsker, f.eks. blod, plasma, serum, urin, lymfe eller cerebrospinalvæske. De her omhandlede antistoffer er særlig velegnede til fremstilling af immunoassays. De kan imidlertid også anvendes til isolering af atriale natriuretiske peptider ved hjælp af immunadsorptionschromatogråfi.
20 Til udforskning af betydningen af ANP under forskel lige fysiologiske og patofysiologiske betingelser er eksperimentelle undersøgelser med dyr ubetinget nødvendige. En forudsætning for disse arbejder og for alle arbejder vedrørende farmakologien af ANP er specifikke og følsomme tests til 25 kvantitativ bestemmelse i legemsvæsker.
De her omhandlede antistoffer kan f.eks. anvendes til bestemmelse af niveauet af atriale natriuretiske peptider i serum fra forsøgsdyr til diagnostiske formål. De her omhandlede antistoffer er også særdeles velegnede til fysiolo-30 giske eller farmakologiske eksperimenter.
Fremstillingen af hybridomerne omfatter i almindelighed følgende trin: 35
O
DK 165955B
5 A) Immunisering af pattedyr med atrialt natriuretisk peptid, f.eks. fra menneske eller rotte, der er bundet til en immunogen bærer, især immunogent bærerprotein (f.eks. nøglehuls--albueskæl-hæmocyanin (keyhole limpet hemocyanin) (KLH-ANP)).
5 Hunlige Balb/c-mus viser sig at være brugbare hertil, men andre musestammer kan også anvendes. Immuniseringsskemaet og koncentrationerne af KLH-ANP skal vælges således, at der dannes et tilstrækkeligt antal antigenstimulerede lymfocyter.
Tre immuniseringer med 14 dages mellemrum med 100 ^ig KLH-ANP/-10 mus ved injektion i phosphatpufret fysiologisk natriumchlorid-opløsning har vist sig at være effektivt.
B) Udtagning af miltene fra de immuniserede pattedyr (f.eks. mus) og fremstilling af en miltcellesuspension i et egnet medium. Ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrækkelig. De eksperi- 15 menteile metoder til dette formål er kendte.
C) Fusion af de suspenderede miltceller med myelomceller af en egnet cellelinie (f.eks. musemyelom PX63Ag8), idet der anvendes en egnet fusionspromotor (f.eks. polyethylen-glycol). Foretrukne fusionspromotorer er polyethylenglycoler 20 med en gennemsnitlig molekylvægt mellem 1000 og 4000 (f.eks.
kommercielt tilgængeligt PEG 1000 etc.). Der kan dog også anvendes andre kendte fusionspromotorer. Der foretrækkes et forhold på ca. 10 miltceller pr. myelomcelle. Et samlet volumen på
O
ca. 0,5-1,0 ml fusionsmedium er tilstrækkeligt til 10 milt-25 celler. Mange myelomceller fra mus er kendte og tilgængelige, f.eks. fra videnskabelige institutter eller celledeponeringsinstitutioner. Den anvendte cellelinie bør fortrinsvis udvise en genetisk defekt, således at ikke-fusionerede myelomceller dør i et selektivt medium, medens hybriderne overlever. Der be-30 nyttes hyppigst 8-azaguanin-resistente cellelinier, der mangler enzymet hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase, og derfor ikke kan vokse i et HAT-medium (hypoxanthin, amino-pterin, thymidin), jf. Science 145, 709 (1964).
Fortrinsvis bør den anvendte myelomcellelinie også være af 35 "non-secreting" type, således at den ikke selv danner antistoffer eller H- eller L-kæder af immunoglobuliner. I visse til- 6
DK 165955B
fælde kan myelomceller med sekretion dog være fordelagtige.
D) Fusionsblandingen (milt- og myelomceller) fortyndes og dyrkes i enkeltbeholdere i et selektivt medium, således at de ikke-fusionerede celler ikke formerer sig og dør i løbet 5 af 1-2 uger. De enkelte fusionerede celler isoleres ved, at volumenenet af fortyndingsmidlet indstilles således, at der fås et bestemt antal celler (ca. 1-4) i hver enkelt beholder (f.eks. hver fordybning i en mikrotiterplade).
E) Undersøgelser for tilstedeværelse af antistoffer mod atri-10 ale natriuretiske peptider i hver beholder.
F) Selektion (f.eks. ved grænsefortynding) og kloning af hybri-domerne, der producerer de ønskede antistoffer.
Når det ønskede hybridom er selektioneret og klonet, kan antistofferne produceres på to forskellige måder.
15 Monoklonale antistoffer med meget høj renhed fås, når hybrido-merne dyrkes i et egnet medium i et vist tidsrum, og antistofferne udvindes fra den ovenstående væske. Et egnet medium og en optimal dyrkningstid kan bestemmes på enkel måde. Denne in-vitro-teknik giver monoklonale antistoffer, der kun er for-20 urenet med ringe mængder af proteiner fra det heterologe serum (f.eks. kalvefosterserum).
Til opnåelse af en væsentlig højere koncentration af monoklonale antistoffer med kun lidt ringere renhed kan det udvalgte hybridom injiceres intraperitonealt i en mus, for-25 trinsvis en syngen eller semisyngen mus. Dette fører efter en inkubationstid hos musen til dannelse af en tumor, der frigør høje antistofkoncentrationer (5-20 mg/ml) i blodet og i det peritoneale ekssudat (ascitesvæske) hos værtsdyret.
Selv om disse mus har normale antistoffer i blod og ascites-30 væske, er disses koncentration· meget ringe i sammenligning med koncentrationen af mAK. Det således fremstillede monoklonale antistof har en høj titer (det er aktivt i fortyn- _3 dinger på 10 eller derunder), og forholdet mellem specifikt og ikke-specifikt immunoglobulin er ca. 20:1.
35 Opfindelsen illustreres i de følgende eksempler med henvisning til tegningen, hvis fig. 1 og 2 er forklaret nærmere i eksempel 3.
O
DK 165955B
7
Eksempel 1
Fremstilling af monoklonale antistoffer mod atriale natriuretiske peptider fra menneske og rotte.
5 Fremstilling af det til immunisering anvendte antigen.
Som antigen anvendes et konjugat af humant a-ANP eller atriopeptin II fra rotte (Firma Bachem) og nøglehuls--albueskæl-hæmocyanin (KLH, Pacific Biomarine Supply Company). Til fremstilling af dette blandes KLH og humant a-ANP 10 eller atriopeptin II i et molært forhold på 1:1, og ved en koncentration på 2 mg/ml i phosphatpufret fysiologisk natriumchloridopløsning tilsættes der glutaraldehyd. Slutkoncen-trationen af glutaraldehyd i reaktionsblandingen er 0,25%.
Efter 1 times inkubering ved stuetemperatur dialyseres pro-15 teinkonjugaterne flere gange ved 4°C mod phosphatpufret fysiologisk natriumchloridopløsning.
Immunisering af Balb/c-mus.
Hunlige Balb/c-mus immuniseres intraperitonealt med 20 100 ^ig KLH-ANP-konjugat i 0,2 ml Freund's komplette adju- vans. 14 dage senere modtager dyrene på ny 100 ^ig af antigenet intraperitonealt i Freund's ukomplette adjuvans. To yderligere immuniseringer foretages intravenøst med 14 dages intervaller, idet der hver gang anvendes 50 ^ig antigen i 25 100 jxq phosphatpufret natriumchloridopløsning pr. dyr. Tre dage efter den sidste antigenindgivelse udtages dyrenes milte.
Fremstilling af en miltsuspension.
30 Af de udtagne milte fremstilles en enkeltcellesuspen sion ved,at organerne presses gennem en si af rustfrit stål. Cellerne overføres til Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), der er suppleret med 4,5 g/liter glucose, 100 enheder/ml penicillin og 100 ^ig/ml streptomycin. Cellerne vaskes 35 3 gange med DMEM og resuspenderes derefter i det samme medi-
O
8
DK 165955B
um i den ønskede koncentration. I almindelighed fås de-r
O
ca. 10 celler pr. milt.
Præparering af myelomcellerne.
5 Den her anvendte myelomcellelinie X63Ag8-653 er en subklon af musemyelomcellelinien P3-X63-Ag8, der ikke eks-primerer nogen tunge eller lette kæder af immunoglobuliner (J. Immunol. 123, 1543-1550 (1980). Cellerne er følsomme for 20 ^ig/ml 8-azaguanin og kan ikke vokse i medium, der inde-10 holder hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT). De dyrkes i DMEM, der er suppleret med 4,5 g/liter glucose, 20 mM glutamin, 1000 enheder/ml penicillin, 100 ^ig streptomycin og 10% kalvefosterserum (komplet medium), Myelomcel-lefne befinder sig på tidspunktet for fusioneringen i den loga-15 ritmiske vækstfase.
Cellefusion.
Miltcellesuspensionerne sættes til myelomcellerne i DMEM uden serum i et forhold på 10:1 og centrifugeres i 20 10 minutter ved 200 gi bægere med rund bund. Efter sedimenta tion af cellerne dekanteres den ovenstående væske forsigtigt. Cellerne inkuberes med 2 ml af en opløsning af polyethylen-glycol med en molekylvægt på 2000 (fortyndet til 30 vægt-% med DMEM, pH-værdi 7,6) il minut ved 37°C. Derpå tilsættes 25 der 20 ml DMEM, hvorefter cellerne resuspenderes forsigtigt i løbet af nogle minutter. De centrifugeres yderligere i 5 minutter ved 200 g, og cellepelleten resuspenderes i HAT-
C
-medium til en koncentration på 10 celler/ml, hvorefter de fordeles i portioner på 1 ml på Costår-plader.
30
Selektionering og dyrkning af hybridomer.
Efter cellefusionen dyrkes cellerne i HAT-medium (hypoxanthin, aminopterin, thymidin) ved 37°C med 5% C02 i fugtig atmosfære. Efter nogle uger undersøges de oven-35 stående væsker fra hybridomcellekulturerne for tilstedeværelse af anti-AHP-aktivitet ved hjælp af en tilsvarende
O
DK 165955B
9 enzym-immunobestemmelse (se nedenfor).
Hybridomcellelinierne, der giver positive resultater ved anti-ANP-testen, udvalges til kloning.
Derved underkastes hybridomerne en grænsefortyn-5 dings-teknik/ hvorved der i 96 mikrotiterfordybninger gennemsnitligt udsås 0,5 celler pr. fordybning, idet der til-
C
sættes 10 musethymocyter pr. fordybning som "feeder"-cel-ler. De celler, der efter denne kloningsmetode stadig producerer anti-ANP-antistoffer, formeres, nedfryses og 10 opbevares i komplet medium, der indeholder 25% kalvefoster-serum samt 7,5% dimethylsulfoxid i flydende nitrogen.
Fremstilling af store mængder monoklonalt antistof.
Klonede hybridomer injiceres intraperitonealt i mus, 15 der er forbehandlet med 0,5 ml Pristan ved intraperitoneal injektion, således at der efter ca. 10 til 15 dage kan udvindes en antistofholdig ascitesvæske. Antistofaktiviteten i ascitesvæsken bestemmes véd en radioaktiv bindingsinhibe-ringstest (se eksempel 3).
20
Bestemmelse af anti-ANP-aktivitet i ovenstående væske fra kulturer._ 100 ^ag ovenstående væske fra en kultur anbringes på mikrotiterplader, på hvilke et konjugat af kvægserumålbu-25 min og humant a-ANP eller rotte-atriopeptin II (5^ag/ml) er absorberet i 3 timer ved stuetemperatur, og som derefter er vasket 5 gange med vand. Kanin-anti-muse-immunoglobulin, der er koblet med peroxidase, tilsættes, og derefter inkuberes pladerne i 2 timer ved stuetemperatur. Efter 5 ganges 30 vaskning med destilleret vand tilsættes en for enzymet egnet substratpuffer, og koncentrationen af det opstående farvede produkt bestemmes med et egnet fotometer til mikrotiterplader .
35
O
DK 165955B
10
Eksempel 2
Karakterisering af det monoklonale antistof mod atriale natriuretiske peptider.
5 Bestemmelse af typen af det monoklonale antistof.
Det her beskrevne monoklonale antistofs klasser og underklasser analyseres. Antistoffet koncentreres fra den ovenstående væske fra kulturen ved fældning med ammoniumsulfat (40%'s mætning) og renses partielt. Under anvendelse 10 af klassespecifikke anti-muse-immunoglobulin-antisera bestemmes immunoglobulinklassen ved Ouchterlony's geldiffusionstest.
Det monoklonale antistof 23M-D9 mod humant ANP hører til IgG^-klassen. Det monoklonale antistof 11A-A11 mod atrio-peptin II hører ligeledes til IgG^-klassen.
15
Krydsreaktion af antistoffet med forskellige andre peptider.
Krydsreaktiviteten af det monoklonale antistof mod humant ANP med forskellige andre peptider bestemmes ved hjælp af en radioimmunologisk bindingsinhiberingstest. Testen gennem-20 føres i en speciel puffer (0,02 M natriumphosphat, 0,15 M
NaCl, 0,01% thiomersal, 0,1% gelatine, 0,01% BSA og 0,1% 125 "Triton-X 100", pH-værdi 7,4). Radioaktivt mærket iod-a- 125 -humant ANP (aminosyre 1-28). fra menneske eller iod-atrio-peptin II fra rotte (Amersham Buchler) inkuberes sammen med 25 antistoffer i en passende fortynding i 16-48 timer ved 4°C.
Det samlede volumen udgør 500 ^il. Ved bindingsinhiberings-testen indeholder testblandingen ved samme volumen desuden umærket antigen hhv. de forskellige inhibitorer i forskellige koncentrationer. Efter inkuberingen bliver det ikke til anti-30 stof bundne, radioaktivt mærkede iod-antigen (humant a-ANP
med aminosyrerne 1-28 eller rotte-atriopeptin II) efter tilsætning af en suspension af aktivt kul (0,02 M natriumphosphat, 2% aktivt kul ("Norit-A"), 0,02% dekstran 60, 0,1% BSA og 10 mM Na2~EDTA, pH-værdi 7,4) og efterfølgende inkubering i 20 minutter på is adsorberet til kullet. Derefter sedimenteres det aktive kul ved centrifugering i 10 minutter
DK 165955B
11 o ved 3600 g, og radioaktiviteten i den ovenstående væske bestemmes. Der bestemmes den koncentration af forskellige 125 peptider, der er nødvendig for at fortrænge 50% af -iod--antigenet fra antistoffet. Som det fremgår af fig. 1 og 2, 5 reagerer antistofferne højspecifikt med atriale peptider fra menneske og rotte. Krydsreaktiviteter med andre mediatorer, der deltager i reguleringen af salt-vand-balancen, kan ikke påvises. Lige så uvirksomme er forskellige vasoaktive stoffer (se tabel I og II).
10
Eksempel 3
Anvendelse af det monoklonale antistof mod atriale natriuretiske peptider.
15 Påvisning af ANP-immunreaktivitet i biologiske væsker og væv ved hjælp af det monoklonale antistof._
Antigener i høj fortynding kan bestemmes kvantitativt ved hjælp af en radioimmunobestemmelse. Nødvendige for denne test er højspecifikke antistoffer og et radioaktivt 20 mærket antigen. Bindingen af det radioaktivt mærkede antigen til antistoffet kan inhiberes dosisafhængigt af ikke-radio-aktivt antigen. Hvis forskellige definerede koncentrationer af ikke-radioaktivt antigen inkuberes med konstante koncentrationer af antistoffer og radioaktivt mærket antigen, 25 kan der på denne måde tilvejebringes en karakteristisk målekurve. Fig. 1 viser en sådan målekurve, nemlig fortrængningen 125 af det radioaktivt mærkede antigen ( iod-humant-α-ΑΝΡ, aminosyre 1-28) fra mAK 23M-D9 med forskellige atriopeptiner eller derivater deraf. Derved anføres bindingen af det radioaktive 30 antigen til antistoffet i % mod koncentrationen af ikke- -mærket antigen eller fragmenter deraf i firtol/ml. Herved betyder -φ- Humant cc-ANP (1-28) ------O------Humant ANP-fragment (7-28) 35 -0-ANP-fragment (18-28) 12
O
DK 165955 B
Testen gennemføres med ascitesvæske i en slutfortyn-ding på 1:1.500.000 som beskrevet i teksten. Testen med ovenstående væske fra kultur giver samme resultater, idet den anvendelige fortynding blot er en faktor 500 til 1000 5 ringere. Dette forsøg viser tydeligt, at ANP-fragmentet (aminosyre 18-28) ikke er i stand til at fortrænge det radioaktivt mærkede antigen fra antistoffet. Antistoffet har altså ingen krydsreaktivitet med dette fragment. Ukendte mængder af antigen i opløsningen kan bestemmes ved hjælp af denne 10 målekurve. En radioimmunobestemmelse baseret på det her be- 125 skrevne monoklonale antistof og iod-humant-α-ΑΝΡ (aminosyre 1-28) som tracer muliggør påvisning i biologiske væsker og vævsekstrakter indtil en koncentration på 20 pg/ml, hvilket svarer til en mængde på ca. 6 fmol/ml 15 (se fig. 1).
Pig. 2 viser et på samme måde gennemført forsøg med mAK 11A-A11, der reagerer specifikt med rotte-atriopeptin. Herved betyder
20 -CZI- Atriopeptin I
----------Atriopeptin II
--Atriopeptin III
----------ANP-Fragment (13-28) 25 Kurverne er optegnet på samme måde som i fig. 1.
Testen gennemføres med ascitesvæske i en slutfortyn-ding på 1:1.250.000 som beskrevet i teksten. Testen med ovenstående væske fra kultur giver de samme resultater, idet den anvendelige fortynding blot er en faktor 500 til 1000 ringere.
30 Dette forsøg viser tydeligt, at ANP-fragmentet (aminosyre 13-28) ikke er i stand til at fortrænge det radioaktivt mærkede antigen fra antistoffet. Antistoffet har altså ingen krydsreaktivitet med dette fragment. Ukendte mængder af antigen i opløsning kan bestemmes ved hjælp af denne måle- 35 kurve. En radioimmunobestemmelse baseret på det her beskrev- 125 ne monoklonale antistof og iod-atriopeptin III som tracer
O
DK 165955B
13 muliggør påvisning i biologiske væsker og vævsekstrakter indtil en koncentration på 20 pg/ml, hvilket svarer til en mængde på ca. 6 fmol/ml (se fig. 2).
Med de beskrevne monoklonale antistoffer kan der 5 foruden de her beskrevne radioimmunologiske metoder også gennemføres andre former for immunobestemmelser (f.eks.
ELISA, kemoluminiscens).
Eksempel 4 10 Antagonisering af in-vivo-effekterne af rotte-atriopeptin.
Der anvendes hanlige Wistar-rotter (med en vægt på 240-270 g), der faster fra aftenen før forsøgsdagen, men har fri adgang til drikkevand. Præparation og forsøg sker under Inactin-narkose (100 mg/kg i.p.). Efter tracheo-15 tomi og injektion af 1 mg/kg atropin i.p. indsættes der til blodtryksmåling et plastkateter i arteria femoralis og til injektion eller infusion af opløsninger et plastkateter i vena jugularis, og der indlægges et blærekateter. Efter endt præparation modtager rotterne en injektion af 5 ml/kg 20 0,9%'s natriumchloridopløsning og derefter under hele for søget en infusion af den samme opløsning (1,2 ml/time). Forsøgsdyrenes rektale temperatur holdes på 37 " 1°C ved hjælp af strålevarme. Efter en ækvilibreringstid på 1 time samles urinen i februd vejede beholdere, der skiftes efter 10 4* 4- 25 hhv. 20 minutter. Koncentrationerne af Na og K i urinen bestemmes flammefotometrisk (Instrumentation Laboratory, Lexington, Mass., USA). Antistofvæsken indeholder i 1 ml 0,9%'s natriumchloridopløsning 100 ^il sterilfiltreret asci-tesvæske og 0,1% kvægserumalbumin. Syntetisk atriopeptin II 30 (firma Bachem) injiceres ligeledes i en vandig opløsning med 0,9% NaCl og 0,1% kvæg serumalbumin. Injektionsvolumenet er i alle tilfælde 1 ml/kg legemsvægt. Forforsøg har vist, at bolusinjektion af 1 ml/kg legemsvægt 0,9%'s natriumchloridopløsning med 0,1% kvægserumalbumin kun påvirker urinvolume-35 net og natriumudskillelsen i ringe grad. Efter afslutning af forsøgene udtages der fra hver rotte en arteriel blodprøve 14
O
DK 165955 B
til kontrol af syre-base-status.
10 yug/kg atriopeptin II fører i de første 10 minutter efter intravenøs bolusinjektion til en stærk forøgelse af urinvolumenet og natriumudskillelsen (se fig. 3 og 4). Denne 5 forøgelse klinger hurtigt af i de efterfølgende opsamlingsperioder og kan efter 1 time reproduceres godt ved fornyet injektion af 10 ^ig/kg legemsvægt ANP i.v. Ved bolusinjektion af 100 ^il/kg legemsvægt af antistofholdig ascitesvæske (antistof 11A-A11) 5 minutter før den anden ANP-injektion kan for-10 øgeisen af urinvolumenet og natriumudskillelsen undertrykkes næsten fuldstændigt.
Fig. 3 og 4 viser resultaterne i enkeltheder. Opsamlingstiden (opsamlingsperioderne) er afsat i minutter ad ordinaten mod urinudskillelsen i ^il/min. (fig. 3a og 3b) 15 eller natriumudskillelsen i ^imol/min. (fig. 4a og 4b).
Fig. 3a viser urinvolumenet efter 2 ganges bolusinjektion af 10 ^ig/kg atriopeptin II (ANP), n = 4.
Fig. 3b viser mAK-ANP's antagonisering af effekten af 10 ^jig/kg atriopeptin. 5 Minutter før den anden injek-20 tion af ANP indgives en bolusinjektion af 100 ^il/kg antistofholdig ascitesvæske (AK), n = 4.
Fig. 4a viser natriumudskillelsen efter to ganges bolusinjektion af 10 ^ig/kg atriopeptin II (ANP), n = 4.
Fig. 4b viser mAK-ANP's antagonisering af effekten 25 af 20 ^ig/kg atriopeptin II. 5 Minutter før den anden injektion af ANP indgives en bolusinjektion af 100 ^il/kg antistofholdig ascitesvæske (AK), n = 4.
Antistofferne antagoniserer altså den natriuretiske virkning af atriopeptin II in vivo.
30 35
O
DK 165955B
15
Tabel I
Undersøgelse af krydsreaktiviteten af mAK 23 M-D9 med andre endogene mediatorer med karvirkning eller med virkning på salt-vand-balancen.
5
Stof Maksimal testet Krydsreaktivitet koncentration _(pmol/ml)_______
Angiotensin II 14 (humant) 10
Leu-Encephalin 26
Substans P 10
Aldosteron 44 ACTH (svin) 4
Bradykinin 13 15 V-MSH 10
Insulin (rotte) 3
Vasopressin 15
Fenin (svin) 0,5
20 Tabel II
Undersøgelse af krydsreaktiviteten af mAK 11A-A11 med andre endogene mediatorer med karvirkning eller med virkning på salt-vand-balancen.
25 Stof Maksimal testet Krydsreaktivitet koncentration __(pmol/ml)__
Angiotensin II 14 (humant) 30 Leu-Encephalin 26
Substans P 10
Aldosteron 44 ACTH (svin) 4
Bradykinin 13 35 V-MSH 10
Insulin (rotte) 3
Vasopressin 15
Fenin (svin) 0,5
Claims (11)
1. Monoklonale antistoffer mod atriale natriuretiske peptider hos pattedyr, kendetegnet ved, at de ikke udviser nogen krydsreaktivitet med andre endogene media- 5 torer med karvirkning eller med virkning på salt-vand-balan-cen.
2. Monoklonale antistoffer ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de endogene mediatorer er angiotensin II (humant), Leu-encephalin, substans P, aldosteron,
3. Monoklonale antistoffer ifølge krav 1 og 2, produceret af hybridomacellen 85031401.
4. Monoklonale antistoffer ifølge krav 1 og 2, produ-15 ceret af hybridomacellen 85031402.
5. Hybridomcellelinier, kendetegnet ved, at de producerer monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4.
6. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at der 20 anvendes hybridomcellelinier ifølge krav 5, hvorved hybridom-cellelinierne dyrkes i et egnet kulturmedium, og antistofferne udvindes fra den ovenstående væske.
7. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at 25 der anvendes hybridomceller ifølge krav 5, og at disse cellelinier injiceres i syngene eller semisyngene mus, og antistofferne udvindes fra blodet eller det peritoneale ekssudat.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af hybridomceller ifølge krav 5, kendetegnet ved, at myelomceller, for-30 trinsvis musemyelomceller, især af non-secreting type, fusioneres med celler, fortrinsvis miltceller, fra pattedyr, fortrinsvis mus, der producerer antistoffer mod atriale natriuretiske peptider, hvorved immuniseringen fortrinsvis er sket med atriale natriuretiske peptider, der er bundet til en immunogen 35 bærer, især et protein. DK 165955B
9. Anvendelse af monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4 til bestemmelse af atriale natriuretiske peptider i biologiske væsker# til bestemmelse af atriale natriuretiske peptider i blod, plasma, serum, urin, lymfe eller cerebro-5 spinalvæsken.
10. Anvendelse af monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4 til immunanalyser.
10 ACTH (svin), bradykinin, nr-MSH, insulin (rotte), vasopressin og renin (svin).
11. Anvendelse af monoklonale antistoffer ifølge krav 1-4 til isolering af atriale natriuretiske peptider 10 ved immunadsorptionschromatografi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853509958 DE3509958A1 (de) | 1985-03-20 | 1985-03-20 | Monoklonale antikoerper gegen atriale, natriuretische peptide vom menschen |
| DE3509958 | 1985-03-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK127686D0 DK127686D0 (da) | 1986-03-19 |
| DK127686A DK127686A (da) | 1986-09-21 |
| DK165955B true DK165955B (da) | 1993-02-15 |
| DK165955C DK165955C (da) | 1993-07-05 |
Family
ID=6265723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK127686A DK165955C (da) | 1985-03-20 | 1986-03-19 | Monoklonale antistoffer mod atriale, natriuretiske peptider hos pattedyr, hybridomcellelinier, der producerer antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af hybridomcellerne og anvendelse af antistofferne |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5156977A (da) |
| EP (1) | EP0195331B1 (da) |
| JP (2) | JPH0648994B2 (da) |
| KR (1) | KR940010021B1 (da) |
| CN (1) | CN1017349B (da) |
| AT (1) | ATE75754T1 (da) |
| AU (1) | AU570838B2 (da) |
| CA (1) | CA1340391C (da) |
| DE (2) | DE3509958A1 (da) |
| DK (1) | DK165955C (da) |
| ES (1) | ES8801945A1 (da) |
| FI (1) | FI90988C (da) |
| GR (1) | GR860732B (da) |
| IL (1) | IL78172A (da) |
| NO (1) | NO170692C (da) |
| PT (1) | PT82215B (da) |
| ZA (1) | ZA862029B (da) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1335082C (en) * | 1987-09-01 | 1995-04-04 | Hiroo Imura | Monoclonal antibody recognizing -hanp and a reagent for immunoassay of -hanp |
| JP2724315B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1998-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | α−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体およびα−ＡＮＰの免疫学的測定法 |
| CA1339210C (en) * | 1988-05-31 | 1997-08-05 | John Lewicki | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
| JP2561513B2 (ja) * | 1988-07-04 | 1996-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
| JP2665850B2 (ja) * | 1991-11-14 | 1997-10-22 | 塩野義製薬株式会社 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
| AU2493499A (en) * | 1998-02-03 | 1999-08-16 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Determination of the amount of hlhbeta core fragment in a sample from a subject and uses thereof |
| CN101046478B (zh) * | 1999-01-29 | 2013-04-03 | 罗赫诊断器材股份有限公司 | 鉴定样品中的n-末端前bnp的方法 |
| US6949282B2 (en) | 2000-07-07 | 2005-09-27 | Delphi Technologies, Inc. | Contoured crushable composite structural members and methods for making the same |
| US20170363620A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Abbott Laboratories | BIOMARKERS TO PREDICT NEW ONSET HEART FAILURE WITH PRESERVED EJECTION FRACTION (HFpEF) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4451570A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
| US4659678A (en) * | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| JPS60184098A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Suntory Ltd | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| JPH0794473B2 (ja) * | 1984-03-02 | 1995-10-11 | サントリー株式会社 | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| US4596769A (en) * | 1984-03-05 | 1986-06-24 | Temple University | Monoclonal antibodies to peptidoglycan and methods of preparing same |
| WO1985004870A1 (en) * | 1984-04-19 | 1985-11-07 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides |
| US4666829A (en) * | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
-
1985
- 1985-03-20 DE DE19853509958 patent/DE3509958A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-03-04 NO NO860804A patent/NO170692C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-03-08 EP EP86103100A patent/EP0195331B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-08 AT AT86103100T patent/ATE75754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-03-08 DE DE8686103100T patent/DE3685145D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-15 CN CN86101671A patent/CN1017349B/zh not_active Expired
- 1986-03-17 IL IL78172A patent/IL78172A/xx unknown
- 1986-03-18 CA CA000504379A patent/CA1340391C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-18 FI FI861128A patent/FI90988C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-03-18 AU AU54914/86A patent/AU570838B2/en not_active Expired
- 1986-03-18 PT PT82215A patent/PT82215B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-03-19 DK DK127686A patent/DK165955C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-03-19 ES ES553154A patent/ES8801945A1/es not_active Expired
- 1986-03-19 GR GR860732A patent/GR860732B/el unknown
- 1986-03-19 ZA ZA862029A patent/ZA862029B/xx unknown
- 1986-03-19 KR KR1019860002012A patent/KR940010021B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-03-20 JP JP61061055A patent/JPH0648994B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-14 US US07/323,527 patent/US5156977A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-14 JP JP6014950A patent/JPH0746999B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK175655B1 (da) | Polypeptidanalog til en kryptisk hGPllb-determinant, monoklonal antistofsammensætning, antistofsammensætning, hybridom, diagnostisk system i form af et sæt, fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistof, fremgangsmåde til detektering..... | |
| US5733549A (en) | Peptides including amino acid sequences selected from lipoprotein (a) and apolipoprotein (a), antibodies recognizing these amino acid sequences, and methods of determination using these antibodies | |
| EP0359063B1 (en) | Antibody having high affinity to methamphetamine and immunogen for obtaining the same | |
| US4797473A (en) | Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically-glycated proteins | |
| JPH037597A (ja) | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 | |
| EP0098179B1 (en) | Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline | |
| JP2011136978A (ja) | ハイブリドーマ及びハイブリドーマから得られた複数のビタミンｄ代謝物を認識できる抗体の作製方法 | |
| US5233025A (en) | Amphetamine protein complex as immunogen for obtaining antibodies specific to methamphetamine | |
| EP0580859A1 (en) | Anti-eda monoclonal antibody | |
| DK165955B (da) | Monoklonale antistoffer mod atriale, natriuretiske peptider hos pattedyr, hybridomcellelinier, der producerer antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af antistofferne, fremgangsmaade til fremstilling af hybridomcellerne og anvendelse af antistofferne | |
| AU2006213411A1 (en) | Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay | |
| DK174151B1 (da) | Monoklonalt antistof, hybridoma og reagens til immunoanalyse af alfa-hANP | |
| CA1334076C (en) | Monoclonal antibody recognizing atrial natriuretic polypeptide | |
| DK175750B1 (da) | Monoklonale antistoffer, der genkender gamma-atrialt natriuretisk polypeptid, hybridomceller, der producerer sådanne antistoffer, og fremstilling og anvendelse deraf | |
| EP0450095B1 (en) | Method of assaying d-vanillylmandelic acid, and reagent and kit therefor | |
| EP0575906A2 (en) | Sandwich immunoassay of beta-N-acetylglucosaminidase and monoclonal antibody used therein | |
| Dzau et al. | Monoclonal antibodies binding renal renin. | |
| JPS62500421A (ja) | モノクロ−ナル抗−イデイオタイプ抗体の産生方法 | |
| US7148063B2 (en) | Mitochondrial creatine kinase antibody | |
| JPS60253871A (ja) | 抗アポａ−１抗体 | |
| JPH08157500A (ja) | Ｆａｓ抗原の定量法 | |
| CA1288074C (en) | Monoclonal antibody, process for preparation thereof and diagnostic drugcontaining the same | |
| US4521510A (en) | Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline | |
| JP2837030B2 (ja) | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 | |
| EP0264489A2 (en) | Monoclonal antibody against human pancreatic amylase, process for preparing the same and process for determining human pancreatic amylase by using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |