DK175655B1 - Polypeptidanalog til en kryptisk hGPllb-determinant, monoklonal antistofsammensætning, antistofsammensætning, hybridom, diagnostisk system i form af et sæt, fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistof, fremgangsmåde til detektering..... - Google Patents

Description

I I

I DK 175655 B1 I

I 1 i

Den foreliggende opfindelse angår en polypeptidanalog I

I til en kryptisk hGPIIb-determinant som angivet i krav 1 og I

I 2, en monoklonal antistofsammensætning som angivet i krav I

3, en antistof sammensætning som angivet i krav 4, et hybridom I

I 5 som angivet i krav 5, en monoklonal antistofsammensætning I

som angivet i krav 6 og 8, et hybridom som angivet i krav I

I 7, et diagnostisk system i form af et sæt som angivet i

I krav 9-14, en fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt . I

I antistof som angivet i krav 15-17, en fremgangsmåde til I

I 10 detektering in vivo af tilstedeværelsen af et receptor-li- I

I gand-kompleks som angivet i krav 18, en fremgangsmåde til I

I bestemmelse af tilstedeværelsen af et receptor-ligand-kom- I

pleks i en vaskulær væskeprøve som angivet i krav 19-21 I

samt en fremgangsmåde til analyse af en blodpladeholdig I

I 15 vaskulær væskeprøve for tilstedeværelsen af blodplader som I

I angivet i krav 22.

I Celleadhæsion involverer almindeligvis genkendelse I

I af specifikke adhæsionsproteiner med hjælp af celleoverflade- I

I receptorer. En familie af celleoverfladereceptorer af særlig

I 20 interesse for den foreliggende opfindelse er integrinerne. I

I Ifølge Hynes, Cell, 48:549-554 (1987), er integriner M

M en funktionelt og strukturelt beslægtet gruppe receptorer, I

I som vekselvirker med mange forskellige ligander, herunder I

ekstracellulære matrixglycoproteiner, komplement og andre I

I 25 celler. Integriner deltager i celle-matrix- og celle-celle- I

I -adhæsion i mange fysiologisk vigtige processer, herunder I

I embryologisk udvikling, hæmostase, thrombose, sårheling, , I

I immun- og ikke-immun-forsvarsmekanismer og oncogenisk trans- 1 I

I 1 H

M formation. To genetiske sygdomme hos mennesker, Glazmann's ! I

I 30 thrombasteni og leukocytadhæsionssvækkelse, påvirker elemen- I

I ter i gruppen af integriner. I

I Strukturelt er integriner heterodimere komplekser I

I omfattende ikke-covalent bundne of- og S-underenheder. Inden I for integrinfamilien genkendes grupper, som er beslægtet

I 35 ved tilstedeværelsen af omtrent samme β-undergruppe, og : M

I elementer inden for hver gruppe skelnes ved hjælp af særlige . I

2 DK 175655 B1 α-underenheder.

Eksempelvis er GPIIb-IIIa et ikke-covalent, Ca+ + --afhængigt, heterodimert kompleks omfattende a- og β-under-enheder, jfr. Jennings et al., J. Biol. Chem., 257:10458-5 10466 (1982) . a-underenheden, GPIIb, består af en tung kæde (hGPIIb) med en relativ molekylvægt på ca. 120 kg dalton (KDa) , og en let kæde (lGPIIb) på ca. 20 kg dalton, som er bundet sammen med disulfidbindinger. β-underenheden, GPIIIa, er enkeltkædet polypeptid på ca. 100 kg dalton, jfr. Phillips 10 et al., J. Biol. Chem., 252:2121-2126 (1977). Celleoverflademolekyler, der er immunologisk beslægtede med GPIIb-IIIa, har man identificeret på mange forskellige celletyper, jfr. Thiagarajan et al., J. Clin. Invest., 75:896-901 (1985);

Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6002-6006 (1986); 15 og Fitzgerald et al., J. Biol. Chem., 260:10893-10896 (1985).

GPIIb-IIIa bidrager til blodpladefunktionen gennem vekselvirkninger med RGD-holdige proteiner, såsom fibrinogen [Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2417-2421 (1983)], fibronectin [Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 20 71:619-624 (1983)], og von Willebrand faktor [Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6038-6041 (1982), og er derfor en del af den fælles blodpiadeadhæsionsproteinreceptor [Pytela et al., Science, 231-1559-1562 (1986) og Plow et al., J. Biol. Chem., 259:5388-5391 (1984)].

25 Nyere tegn antyder, at GPIIb-IIIa er en af adskillige adhæsionsreceptorer, som deler en omtrent ens β-underenhed og den funktionelle egenskab at genkende tripeptidaminosyre-gruppesekvensen Arg-Gly-Asp (idet der anvendes enkeltbog-stavssymboler, RGD), jfr. Pytela et al., Science, 231:1559-30 1562 (1986) og Ruoslahti et al., Cell, 44:517-518 (1986).

Ud over GPIIb-IIIa omfatter denne gruppe af beslægtede receptorer vitronectinreceptoren (VnR) og fibronectinreceptoren (FnR), der isoleres fra osteosarcomceller, jfr. [Pytela et al., Cell, 40:191-198 (1985), Pytela et al., Proc. Natl.

35 Acad. Sci. USA, 82:5766-5770 (1985) og Sanchez-Madrid et i al., J. Exp. Med., 158:1785-1803 (1983)]. 1

I ! DK 175655 B1 I

I I

I De omtrent samme funktionelle, strukturelle og anti- I

H gene egenskaber af disse proteiner tyder på, at GPIIb-IIIa I

H og VnR er elementer i en adhæsionsreceptorgruppe, som man I

I har foreslået at betegne "cytoadhæsin" , jfr. Plow et al. , I

I | 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6002-6006 (1986). Inden for I

I cytoadhassingruppen forener særskilte α-underenheder sig med I

H en fælles eller meget lignende β-underenhed, hvilket resul- I

terer i funktionelt skelnelige receptorer, jfr. Ginsberg et I

I al., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987). I

I 10 Man har identificeret mindst to andre grupper hetero- I

I dimere adhæsionsreceptorer, hvori en fælles β-underenhed I

I forener sig med et antal særskilte a-underenheder. Man har I

I j fundet en gruppe på leukocytter, og den omtales som leukocyt- I

I ! adhæsionsfamilien og omfatter LFA-1, Mac-1, P150,95, jfr. I

I 15 Sanchez-Madrid et al., J. Exp. Med., 158:1785-1803 (1983 og

Springer et al., Ciba Found. Symp., 118:102-126 (198.6). Den I

I anden er mere udbredt og er blevet omtalt som VLA-familien, I

I jfr. Hemler et al., J. Biol. Chem., 262:3300-3309 (1987). I

I β-underenheden af VLA-familien, [Hemler et al., J. Biol. I

I 20 Chem., 262:3300-3309 (1987)], i kyllinger er blevet klonet I

I og sekvenseret og har fået betegnelsen "Integrin", jfr. I

I [Tamkun et al., Cell, 46:271-282 (1986)]. Kyllingeintegrin- I

I sekvens ligner sekvensen for GPIIIa, jfr. Fitzgerald et I

I al., J. Biol. Chem., 262:3936-3939 (1987), og β-underenheden I

I 25 af leukocytadhæsionsfamilien, jfr. [Kishimito et al., Cell, I

I 48:681-690 (1987)]. Desuden viser partielle sekvenser af I

I adskillige a-underenheder ligeledes ligheder, jfr. Ginsberg H

I et al., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987); Suzuki et

I al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8614-8618 (1986); og I

I 30 Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8351-8356 I

I (1986) . .

De steder på GPIIb-IIIa eller de andre cytoadhæsi- H

I ner, som er af afgørende betydning for deres funktioner som H

I adhæsionsreceptorer, er for tiden ukendte. Adskillige iagt- I

I 35 tageiser tyder på, at et funktionelt signifikant sted på I

I GPIIb-IIIa ligger nær den epitop, der er bestemt af det H 1

i H

4 DK 175655 B1 monoklonale antistof PMI-1. Dette antistof binder til den tunge GPIIb-kæde, jfr. [Shadle et al., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984)] og afgrænser et område i GPIIb, som er knyttet til adskillige særskilte funktionelle aktiviteter, i 5 For det første inhiberer PMI-1 adhæsion af vaskede blodplader til collagen, jfr. Shadle et al., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984). For det andet reguleres overfladeorienteringen af dette område ved hjælp af divalente kationer, eftersom millimolær-koncentrationer af calcium eller magnesium under-10 trykker ekspression af PMI-1-epitopen, jfr. Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 78:1103-1111 (1986). For det tredje er unormal divalent kationregulering af konformationen af dette sted forbundet med en funktionel thrombastenisk tilstand, jfr. Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 78:1103-1111 15 (1986) . For det fjerde øger stimulation af blodplader med op til 100 mikromolær adenosindiphosphat (ADP) eller adrenalin, én enhed pr. ml thrombin, eller 50 mikrogram collagen af kalvehuder pr. ml, ikke bindingen af PMI-l-antistoffer til blodplader væsentligt over baggrundsværdien.

20 Det har nu vist sig, at celleoverfladereceptorer, som specifikt har bundet en ligand, kan skelnes fra ikke--okkuperede receptorer ved tilstedeværelsen af et ligandinduceret antistof-bindingssted (LIBS). Det vil sige, at der er erkendt en gruppe antigene determinanter, som udtryk-25 kes, når en celleoverfladereceptor specifikt binder en ligand, men som ikke udtrykkes hverken af den ikke-occuperede .

receptor eller den ikke-bundne ligand.

Endvidere har det vist sig, at blodplade GPIIb-IIIa--ligand-komplekser udtrykker to kryptiske antigene deter-30 minanttyper LIBS, genkendt af antistof-molekyler, produceret af hybridomerne PMI-1 og PMI-2. Desuden har man udledt et polypeptid, der kan imitere den kryptiske determinant, der genkendes af det monoklonale antistof PMI-1, ud fra den DNA-sekvens, der koder for den del af GPIIb-proteinet, som 35 danner den kryptiske determinant in vivo. 1 Således angår den foreliggende opfindelse et DNA- j

DK 175655 B1 I

segment omfattende højst ca. 12000 nukleotidbasepar omfat-

tende en sekvens, der definerer et strukturelt gen kodende I

for en del af det GPIIb-protein, der har en aminosyregrup- I

pesekvens som vist i fig. 1 fra gruppe nr. ca. 50 til gruppe I

5 nr. ca, 140, I

I en anden udførelsesform angår opfindelsen endvidere I

et rekombinant DNA-molekyle omfattende en vektor, som opera- I

tivt er bundet til et DNA-segment, som definerer et struktu-

relt gen kodende for en del af GPIIb-proteinet med en amino- I

10 syregruppesekvens som vist i fig. 1 fra gruppe nr. ca. 50 I

til gruppe nr. ca. 145. I

Endvidere angår opfindelsen en kryptisk determinant I

hGPIIb polypeptidanalog omfattende højst ca. 50 aminosyre- I

grupper og omfattende en aminosyregruppesekvens, der har I

15 formlen I

-PSPSPIHPAHHKRDRRQ-. I

Ligeledes er hybridomer med betegnelsen PMI-1 og

PMI-2, som producerer antistofmolekyler, der immunoreagerer I

med fibrinogen-bundne blodplader, omfattede. I

2 0 Endvidere omfattes en monoklonal ant i stofsammensætning I

omfattende antistofmolekyler, produceret af hybridom PMI-1, I

som immunoreagerer med fibrinogen-bundne blodplader. I

Fig. 1 viser nukleotidsekvensen og en tilsvarende I

aminosyregruppesekvens af et cDNA, der koder for en del af I

25 forløberproteinet for GPIIb, idet nukleotidsekvensen er fra I

venstre til højre og i retning fra 51-terminalen til 3’- I

-terminalen ved anvendelse af enkeltbogstavsnukleotidbase- I

koden, der er angivet som en række baser fra base nr. 1 til I

base nr. 1104 i form af en uafbrudt linie. Aminosyregrup- I

30 pesekvensen er vist fra venstre mod højre og i retning fra I

aminoterminalen til carboxyterminalen ved anvendelse af den

enkeltbogstavsaminosyregruppekode, der er vist som en række I

grupper fra gruppe nr. 1 (R) ved aminoterminalen til gruppe ' I

nr. 227 (S) ved carboxyterminalen, i form af en uafbrudt

3 5 række. I

Læserammen er angivet ved placeringen af den udledte I

6 DK 175655 B1 aminosyregruppesekvens under nukleotidsekvensen således, at det enkeltbogstav, som repræsenterer hver enkel aminosyre-gruppe, er anbragt under den første base i det tilsvarende codon.

5 Placeringerne af aminosyregruppesekvenser svarende til polypeptid med betegnelsen pl29-145 og polypeptidet med betegnelsen pll4-156 i GPIIb-forløberproteinet, er vist i henholdsvis de store og de små kasser. Placeringerne af polypeptiderne med betegnelsen pl9-34 og p53-65 er vist ved 10 understregning med henholdsvis med dobbelt- eller enkelt linie. Aminosyresekvensen for en foreslået amino-terminal for den lette GPIIb-kæde er vist ved den punkterede linie, ! og pilen markerer det eventuelle spaltningssted til dannelse ! af de tunge og lette kæder af GPIIb.

15 Fig. 2 viser en kurve, der belyser virkningen af polypeptid pl29-145 på antistof PMI-1, der binder til blodplader. Blodplader blandes med EDTA til en koncentration på 5 mM for at muliggøre fuld eksponering af PMI-l-epitopen på hGPIIb. Derefter blandes blodpladerne med forskellige kon-20 centrationer af polypeptid pl29-149, der varierer fra 0 til 100 mikromolær og med det 125I-mærkede PMI-1-antistof som beskrevet i eksempel 9. Den procentdel af •*-2^I-mærket PMI-1, bundet til blodplader, afsættes mod koncentrationen af polypeptid, sat til analysen.

25 Fig. 3 viser eksponering af PMI-1-epitopen på stimu lerede, fibrinogen-bundne blodplader, bestemt som beskrevet i eksempel 10. Mængden af 125I-mærket PMI-1, som immunorea-gerer med fibrinogen bundne blodplader under følgende betingelser 1) ingen stimulering, 2) stimulering med 50 uM ADP 30 eller 3) stimulering med 50 μΜ adrenalin, bestemmes og udtrykkes i procent i forhold til mængden af ^^I-PMI-l, immunologisk bundet til ustimulerede blodplader i nærvær af 5 mM EDTA.

På fig. 4 vises en kurve fra en skriver, som belyser 35 virkningen af polypeptiderne pl29-145 og p!44-156 på blod-pladeaggregation som beskrevet i eksempel 11. Der er vist

I DK 175655 B1 I

I I

I ! en lineær afbildning af procenten af transmitteret lys mod

I ' tiden, angivet i minutter, idet 100%'s transmittans angiver I

maksimal blodpladeaggregation. A afbilder den procent lys, I

der transmitteres af en kontrolopløsning af blodpladerig

I 5 plasma (PRP) i Tyrode's puffer (stiplet linie), og af PRP, I

I som endvidere indeholder 1 mM polypeptid pl29-145 (fuldt I

optrukken linie). B afbilder den procent lys, der transmit-

I teres af kontrolopløsningen (stiplet linie) og af PRP end- I

I videre indeholdende 1 mM polypeptid pl44-156 (fuldt optrukket I

I 10 linie). I

Fig. 5 er en grafisk afbildning, der illustrerer I

I ekspressionen af to særskilte ligand-inducerede bindings-

I steder ved hjælp af blodplade-GPIlb-Illa. Hvert LIBS in- I

I duceres ved den specifikke binding af en ligand, i form af I

15 et polypeptid med aminosyregruppesekvensen RGDS, til dannelse

I af et GPIIb-IIIa-ligand (GPIIb-polypeptid) -kompleks. Procent- I

I delen af LIBS-ekspression ved forskellige polypeptidkon- I

centrationer bestemmes som beskrevet i eksempel 13A. I

I 20 A. Definitioner. I

Aminosyre: Alle aminosyregrupper, der identificeres I

I heri, foreligger i den naturlige L-konfiguration. Idet den I

standardiserede polypeptidnomenklatur, jfr. J. Biol. Chem., I

243:3557-59, (1969) overholdes, er forkortelser for amino- I

I 25 syregrupper som vist i den følgende sammenligningstabel: I

8 DK 175655 B1 : Tabel over modsvarende forkortelser

Symbol-forkortelse Aminosyre 1-Bogstavsfork. 3-Bogstavsfork.

Y TYR L-tyrosin 5 G GLY glycin F Phe L-phenylalanin M Met L-methionin A Ala L-alanin S Ser L-serin 10 I Ile L-isoleucin L Leu L-leucin T Thr L-threonin V Val L-valin P Pro L-prolin 15 K Lys L-lysin H His L-histidin Q Gin L-glutamin E Glu L-glutaminsyre w Try L-tryptophan 20 R Arg L-arginin D Asp L-aspartinsyre N Asn L-asparagin C Cys L-cystein 25 Det bør bemærkes, at alle aminosyregruppesekvenser er repræsenteret heri med formler, hvis orientering fra venstre mod højre er i den konventionelle retning fra amino-terminalen til carboxyterminalen. Endvidere bør det bemærkes, at en bindestreg ved starten af eller slutningen af en amino-30 syregruppesekvens antyder en binding til en yderligere sekvens på en eller flere aminosyregruppe op til i alt ca. 50 grupper i polypeptidkæden.

Polvpeptid oo peptid: Polypeptid og peptid er udtryk, der anvendes i flæng heri til at betegne en lineær række 35 på højst ca. 50 aminosyregrupper, der er forbundet med hinanden ved peptidbindinger mellem a-amino- og carboxygruppeme ^fl

I DK 175655 B1 I

9 I

på nabostillede grupper. I

B Protein: Protein er et udtryk, der anvendes heri til I

betegnelse af en lineær række på mere end 50 aminosyregrup- I

per, der er forbundet med hinanden som i polypeptid. I

B 5 Nukleosid og nukleotid: En monomerenhed af DNA eller fl RNA bestående af en sukkerdel (pentose), et phosphat og en fl

B nitrogenholdig heterocyclisk base. Basen er bundet til suk- I

B kergruppen via glycosidcarbonatomet (det første carbonatom I

B i pentosen) og denne kombination af base og sukker er et I

B 10 nukleosid. Når nukleosidet indeholder en phosphatgruppe, I

B bundet til 3'- eller 5'-stillingen i pentosen, omtales det fl

B som et nukleotid. I

B Basepar (bp): Et hydrogen-bundet partnerskab mellem fl

B ! adenin (A) og thymin (T) eller mellem cytosin (C) og guanin I

B 15 (G) i et dobbeltstrenget DNA-molekyle. I

B Receptor; Receptor og receptorprotein er udtryk, der fl

B anvendes heri til at betegne et biologisk aktivt proteinhol- I

B digt molekyle, som specifikt binder til (eller med) andre fl

B molekyler. I

fl 20 Ligand og sammenhørende ligand: Ligand refererer til I

fl et molekyle, som indeholder en strukturel del, som er bundet fl

fl ved specifik vekselvirkning med et bestemt receptorprotein. I

fl Ligandinduceret bindingssted (LIBS): LIBS er en neo- I

I -antigendeterminant, som udtrykkes ved hjælp af et celleover- I

I 25 fladereceptor-ligandkompleks, men ikke udtrykkes hverken fl

I ved den ikke-okkuperede receptor eller den ubundne ligand. ; I

I Et LIBS kan være enten "konformationsmæssigt" eller "se- I

I kvensmæssigt". Et LIBS kan være resultatet af specifikke fl I ændringer af receptoren, induceret ved ligandbinding, dvs. fl I 30 en "kryptisk antigendeterminant", eller det kan være dannet fl

I med en kombination af receptor og ligandaminosyregrupper I

fl ved et receptor-ligandkontaktsted. fl I Kryptisk antigendeterminant: Refererer til en neo- fl fl -antigendeterminant, der er dannet ved ændringer i konforma- fl I 35 tion eller membranoverfladeorientering af et receptorprotein fl I ved binding til dets sammenhørende (specifikke) ligand. De fl I 'i i 10 DK 175655 B1 receptorproteiner, der er beskrevet heri, udtrykker normalt ikke en kryptisk antigendeterminant, medmindre receptoren specifikt har bundet en ligand.

5 B. DNA-segmenter I levende organismer er aminosyregruppesekvensen i et protein eller polypeptid direkte relateret via den genetiske kode til deoxyribonucleinsyre (DNA)-sekvensen for det strukturelle gen, som koder for proteinet. Således kan et 10 strukturelt gen defineres, udtrykt ved den aminosyregrup-pesekvens, dvs. protein eller polypeptid, for hvilket det koder.

Et vigtigt og velkendt særtræk for den genetiske kode er redundansen deraf. Dvs. for de fleste af de amino-15 syrer, der anvendes til at fremstille proteiner, kan mere end en kodende nukleotidtriplet (codon) kode for eller angive en bestemt aminosyregruppe. Derfor kan et antal forskellige nukleotidsekvenser kode for en bestemt aminosyregruppesekvens. Sådanne nukleotidsekvenser anses for at være funktio-20 nelt ækvivalente, eftersom de kan resultere i produktion af den samme aminosyregruppesekvens i alle organismer. Lejlighedsvis kan en methyleret variant af en purin eller pyri-midin inkorporeres i en given nukleotidsekvens. Imidlertid påvirker sådanne methyleringer ikke kodeforholdet på nogen 25 måde.

Et DNA-segment ifølge opfindelsen omfatter et strukturelt gen, som koder for et protein indeholdende en GPIIb--beslægtet aminosyregruppesekvens, dvs. et GPIIb-beslægtet protein. En GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens er en 30 sekvens på mindst ca. 10 grupper, hvis sekvens er homolog, fortrinsvis identisk, til en del af den aminosyregruppesekvens, der er vist i fig. 1 fra gruppe ca. nr. 50 til ca. nr. 227.

Et DNA-segment ifølge opfindelsen omfatter en DNA-35 -sekvens, som koder for en aminosyregruppesekvens som vist i fig. 1 fra gruppe ca. nr. 50 til gruppe ca. nr. 145. I en

I DK 175655 B1 I

I 11 I

H anden udførelsesform omfattes et DNA-segment, som omfatter I

en DNA-sekvens, der koder for en aminosyregruppesekvens som I

vist i fig. 1 fra gruppe nr. ca. 50 til gruppe nr. ca. 227. I

i Ligeledes omfattes et DNA-segment, som omfatter en DNA-se- I

1 5 kvens kodende for en aminosyregruppesekvens som vist i fig. I

1 fra gruppe nr. ca. 146 til gruppe nr. ca. 227. Fortrinsvis I

koder et DNA-segment ifølge opfindelsen for en aminosyregrup- I

pesekvens, vist i fig. 1 fra gruppe nr. ca. 1 til gruppe I

nr. ca. 227. Fortrinsvis er DNA-sekvensen til stede som en I

10 uafbrudt lineær række codons, hvor hvert codon koder for en I

aminosyregruppe, der findes i de ovenfor beskrevene amino- I

syregruppesekvenser, dvs. en DNA-sekvens, der ikke indeholder I

nogen introns. I

Således udgør et DNA-segment bestående af i det væ- I

15 sentlige den nukleotidsekvens, der er vist i fig. 1 fra I

base nr., ca. 148 til base nr. ca. 435, en udførelsesform I

ifølge den foreliggende opfindelse. Et DNA-segment i det I

væsentlige bestående af den nukleotidsekvens, der er vist i I

fig. 1. fra base nr. ca. 148 til base nr. ca. 681, udgør en I

I 20 anden udførelsesform for opfindelsen. Fortrinsvis består et I

I DNA-segment ifølge opfindelsen i det væsentlige af den nu- I

I kleotidsekvens, der er vist i fig. 1, fra base nr. ca. 1 I

I til base nr. ca. 1104. I

I Et DNA-segment ifølge opfindelsen, der koder for en I

25 GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens, kan let syntetiseres I

I ved kemiske fremgangsmåder, eksempelvis phosphotriester- I

I metoden ifølge Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 I

(1981). Naturligvis kan man ved kemisk syntetisering af den I

I kodende sekvens foretage hvilke som helst ønskede modifika- I

I 30 tioner ved simpelt hen at erstatte de baser, der koder for · j I

I den. native aminosyregruppesekvens med de hensigtsmæssige I

I baser. Imidlertid foretrækkes DNA-molekyler omfattende se- I

I kvenser, som er nøjagtigt homologe til de sekvenser, der er I

I vist i fig. 1. I

I 35 Endvidere kan man få DNA-segmenter bestående i det I

I væsentlige af strukturelle gener kodende for GPIIb-beslægtede I

12 DK 175655 B1 proteiner fra rekombinante DNA-molekyler indeholdende disse gener. Eksempelvis indeholder det rekombinante DNA-molekyle' HEL-41 af plasmidtypen DNA-sekvensen/ vist i fig. 1, og koder således for aminosyregruppesekvensen, vist i fig. 1 5 fra gruppe nr. 1 til gruppe nr. 227. En kultur af Escherichia coli (E. coli) transformeret med HEL-41 er deponeret ifølge Budapesttraktaten hos American Type Culture Collection, (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, den 7. juli 1987, og har accesssionsnummeret 67456.

10 Et DNA-segment, som omfatter en DNA-sekvens kodende for en GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens kan fremstilles ved operativ binding (ligering) af passende restriktionsfragmenter fra det ovennævnte deponerede plasmid ved anvendelse af velkendte fremgangsmåder. DNA-molekylerne ifølge den 15 foreliggende opfindelse, produceret på denne måde, har typisk klæbrige termini, dvs, "udragende" enkeltstrengede dele, som strækker sig ud over den dobbeltstrengede del af molekylet. Tilstedeværelsen af klæbrige termini på DNA-molekylerne ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes.

20 Ligeledes omfatter den foreliggende opfindelse ribo- nukleinsyre (RNA)-ækvivalenter af de ovenfor beskrevne DNA--segmenter.

C. Rekombinante DNA-molekyler.

25 Et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfindelse kan produceres ved operativ binding af en vektor til et DNA-segment ifølge opfindelsen.

Udtrykket "vektor", som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, henviser til et DNA-molekyle, der er i 30 stand til autonom replikation i en celle, og til hvilken man operativt kan binde et andet DNA-segment for at bevirke replikation af det tilknyttede segment. Vektorer, der kan styre ekspressionen af gener kodende for proteiner med GPIIb--beslægtede aminosyregruppesekvenser, omtales heri som "eks-35 pressionsvektorer". Således er et rekombinant DNA-molekyle (rDNA) et hybrid DNA-molekyle omfattende mindst to nukleotid-

I DK 175655 B1 I

I 13 I

sekvenser, der ikke almindeligvis findes sammen i naturen. I

Valget af vektor, hvortil et DNA-segment ifølge op- I

findelsen bindes operativt, afhænger direkte, som det er I

velkendt, af de ønskede funktionelle egenskaber, eksempelvis I

5 proteinekspression, og den værtscelle, der skal transforme- I

res, idet disse begrænsninger er iboende i teknikken til I

konstruktion af rekombinante DNA-molekyler. Imidlertid er I

en vektor, der omfattes af den foreliggende opfindelse, i I

det mindste i stand til styre replikationen og fortrinsvis I

10 også ekspressionen af genet kodende for et protein med en I

GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens, inkluderet i DNA- I

' -segmenter, hvortil den bindes operativt. I

Ved foretrukne udførelsesformer omfatter en vektor, I

I der omfattes af den foreliggende opfindelse, et procaryotisk I

15 replicon, dvs. en DNA-sekvens med evnen til at styre auto- I

nomreplikation og bevarelse af det rekombinante DNA--molekyle I

ekstrachromosomalt i en procaryotisk værtscelle, såsom en I

bakterieværtscelle, transformeret dermed. Sådanne repliconer I

I er velkendte. Desuden omfatter disse udførelsesformer, som I

I 20 inkluderer et procaryotisk replicon, ligeledes et gen, hvis I

I ekspression giver resistens mod lægemidler til en bakterie- I

vært, transformeret dermed. Typiske bakterielle lægemiddel- I

I resistente gener er gener, som giver resistens mod ampicillin I

I eller tetracyclin. I

I 25 De vektorer, som omfatter en procaryotisk replicon, I

I kan ligeledes omfatte en procaryotisk promotor, der kan I

I styre ekspressionen (transcription og translation) af det I

I gen, der koder for en GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens I

I i en bakterieværtscelle, såsom E. coli, transformeret dermed. I

I 30 En promotor er et ekspressionskontrolelement, dannet af en I

I DNA-sekvens, som tillader, at der sker binding af RNA-poly- I

I merase og transcription. Promotorsekvenser, der er kompatible I

I med bakterieværter, stilles typisk til rådighed i plasmid- I

vektorer indeholdende hensigtsmæssige restriktionssteder I

I 35 til indskydelse af et DNa-segment ifølge den foreliggende I

opfindelse. Sådanne typiske vektorplasmider er pUC8, pUC9, I

14 DK 175655 B1 pBR322 og pBR329, der kan fås fra Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA), og pPL og pKK223, der kan fås fra Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.

Ekspressionsvektorer, der er kompatible med eucaryo-5 tiske celler, fortrinsvis de vektorer, der er kompatible med celler fra hvirveldyr, kan ligeledes anvendes til dan-i nelse af rekombinante DNA-molekyler ifølge opfindelsen.

Eucaryotiske celleekspressionsvektorer er velkendte og kan fås fra adskillige kommercielle kilder. Typisk stilles' så-10 danne vektorer, der indeholder hensigtsmæssige restriktionssteder til indskydelse af det ønskede DNA-segment, til rådighed. Sådanne typiske vektorer er pSVL og pKSV-10 (Pharmacia) , pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies,

Inc.), og pTDTl (ATCC, #31255).

15 I foretrukne udførelsesformer omfatter de eucaryotiske celleekspressionsvektorer, der anvendes til at konstruere de rekombinante DNA-molekyler ifølge opfindelsen, en selektionsmarkør, der er virkningsfuld i eucaryotiske celler, fortrinsvis en selektionsmarkør for lægemiddelresistens. En 20 foretrukken markør for lægemiddelresistens er det gen, hvis ekspression resulterer i neomycinresistens, dvs. neomycin--phosphotransferase-(neo)-genet, jfr. Southern et al., J.

Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982).

Opfindelsen omfatter ligeledes anvendelsen af retro-25 virusekspressionsvektorer til dannelse af rDNA'erne ifølge den foreliggende opfindelse. Udtrykket "retrovirusekspres-sionsvektor", som det anvendes heri, henviser til et DNA--molekyle, som omfatter en promotorsekvens, afledt fra den i lange terminale repeterende ("repeat", LTR)-område i et 30 retrovirusgenom. j I en foretrukken udførelsesform er ekspressionsvektoren typisk en retrovirusekspressionsvektor, som fortrinsvis er replikations-inkompetent i eucaryotiske celler. Konstruktionen og anvendelsen af retrovirusvektorer er beskrevet af 35 Sorge et al-, Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984).

Man har udviklet mange forskellige metoder til opera-

I DK 175655 B1 I

I I

i tiv binding af DNA til vektorer via komplementære klæbrige I

termini. Eksempelvis kan man addere komplementære homopoly- I

mere systemer til DNA-segmentet, der skal indskydes, og til I

vektor-DNA'et. Vektoren og DNA-segmentet forbindes derefter I

5 ved hydrogenbinding mellem de komplementære homopolymere I

haler til dannelse af rekombinante DNA-molekyler. I

I Syntetiske linkere indeholdende et eller flere re- I

striktionssteder tilvejebringer en alternativ fremgangsmåde I

H i til forbinding af DNA-segmentet til vektorer. DNA-segmentet, I

10 dannet ved endonuclease-restriktionsnedbrydning som ovenfor I

I beskrevet, behandles med bakteriophag T4 DNA polymerase I

eller E. coli DNA polymerase I, enzymer, som fjerner udragen- I

I de, 3’-, enkeltstrengede termini med deres 3'-5'-exonucleo- I

H lytiske aktiviteter og udfylder tilbagetrukne 3'-ender med I

15 deres polymeriserende virkninger. Kombinationen af disse I

aktiviteter danner derfor "blunt-end"ede DNA-segmenter. De I

H "blunt-end"ede segmenter inkuberes derpå med et stort molært I

overskud af linkermolekyler i nærvær af et enzym, som kan I

I katalysere ligeringen af "blunt-end"ede DNA-molekyler, såsom I

I 20 bakteriophag T4 DNA-ligase. Således er produkterne ved reak- I

I tionen DNA-segmenter med polymere linkersekvenser i enderne I

deraf. Disse DNA-segmenter spaltes derpå med et passende I

I restriktionsenzym og ligeres til en ekspressionsvektor, som I

er spaltet med et enzym, som producerer termini, der er

25 kompatible med DNA-segmentet. I

I Syntetiske linkere indeholdende flere forskellige I

restriktionsendonucleasesteder er kommercielt tilgængelige I

I fra adskillige kilder, herunde International Biotechnologies, I

Inc., New Haven, CN, USA. I

I 30 Ligeledes omfattes RNA-ækvivalenter af de ovenfor I

I beskrevne rekombinante DNA-molekyler af den foreliggende I

I opfindelse. 1

1 I

16 DK 175655 B1 D. Transformerende celler og kulturer.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes en værtscelle, transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen. Værtscellen kan være enten procaryotisk eller 5 eucaryotisk. Bakterieceller er foretrukne procaryotiske værtsceller, og typisk er en stamme af E. coli, såsom E. coli-stammen DH5, der kan fås fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, USA. Foretrukne eucaryotiske ! værtsceller omfatter gær og pattedyrceller, fortrinsvis 10 hvirveldyrceller, såsom celler fra en muse-, rotte-, abeeller human fibrobla.st-cellelinie. Foretrukne eucaryotiske celler omfatter ovarieceller fra kinesiske hamstre (CHO-cel-ler) , der kan fås fra ATCC som CCL61 og NIH schweiziske museembryoceller NIH/3T3, der kan fås fra ATCC som CRL 1658.

15 En foretrukken transformeret cellelinie er E. coli indeholdende det rekombinante DNA-molekyle HEL41, hvoraf en kultur er deponeret hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, den 7. juli 1987, med accessionsnummeret 67456.

20 Transformation af passende værtsceller med et rekom binant DNA-molekyle ifølge opfindelsen sker ved velkendte fremgangsmåder, som typisk afhænger af den anvendte type 1 vektor. Med hensyn til transformation af procaryotiske værtsceller, jfr. eksempelvis Cohen et al., Prpc. Natl. Acad. | 25 Sci. USA, 69:2110 (1972) og Maniatis et al., Molecular

Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, NY (1982) . Med hensyn til transformation af hvirveldyrceller med retrovirusvektorer indeholdende rDNA'er, -jfr. eksempelvis Sorge et al., Mol. Cell. Biol.

30 4.:1730-37 (1984); Graham et al., Virol., 52:456 (1973); og I

Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1373-76 (1979).

Med succes transformerede celler, dvs. celler, som indeholder et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen, kan identificeres ved velkendte fremgangsmåder. Eksempelvis 35 kan man klone celler, der resulterer fra indføringen af et rDNA ifølge opfindelsen, til produktion af monoklonale kolo-

I DK 175655 B1 I

I I

I nier. Man kan høste celler fra disse kolonier, de kan lyses, I

og deres DNA-indhold undersøges for tilstedeværelsen af I

rDNA ved anvendelse af en fremgangsmåde, såsom den, der er I

I ! beskrevet af Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) eller I

I 5 Berent et al., Biotech., 3:208 (1985). I

I Foruden direkte analyse for tilstedeværelsen af rDNA I

kan man bekræfte med held gennemført transformation ved I

velkendte immunologiske metoder, når rDNA er i stand til at I

styre restriktionen af et GPIIb-beslægtet protein. Eksempel- I

.! 10 vis producerer celler, med held transformerede med en eks- I

H pressionsvektor, proteiner, der har GPIIb-antigenitet. Prøver I

af celler, der mistænkes for at være transformerede, høstes I

og analyseres for GPIIb-beslægtet protein ved anvendelse af I

antistoffer, der er specifikke for disse antigener, såsom I

15 de antistoffer, der produceres af. et hybridom ifølge opfin- I

I delsen. I

I Således omfatter den foreliggende opfindelse foruden

selve de transformerede værtsceller en kultur af disse cel- I

I ler, fortrinsvis en monoklonal (klonalt homogen) kultur I

I 20 eller en kultur, der stammer fra en monoklonal kultur, i et I

I næringsmedium. Fortrinsvis indeholder kulturen ligeledes et I

I protein, der har GPIIb-antigenitet. j I

I Næringsmedier, der er anvendelige til dyrkning af I

transformerede værtsceller, er velkendte og kan fås fra I

25 adskillige kommercielle kilder. I udførelsesformer, hvori I

I værtscellen er en pattedyrcelle, anvendes fortrinsvis et I

"serum-frit" medium. I

I I

I E. Fremgangsmåder til produktion af GPIIb-beslæqtede I

I 30 proteiner. I

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse angår I

I en fremgangsmåde til produktion af proteiner med GPIIb-anti-

I genitet. Proteiner, som har GPIIb-antigenitet, er proteiner, I

I som immunoreagerer med antistoffer, induceret af nativt I

I 35 GPIIb. Proteiner, som har GPIIb-antigenitet, er anvendelige I

I som antigener og til produktion af antistoffer, som begge I

18 DK 175655 B1 kan anvendes i de her omhandlede diagnostiske systemer og fremgangsmåder.

i Den foreliggende fremgangsmåde medfører opstart af en kultur omfattende et næringsmedium indeholdende værtscel-5 ler, fortrinsvis humane celler, transformerede med et her omhandlet rekombinant DNA-molekyle, som kan udtrykke et gen kodende for en GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens. Kulturen opretholdes, i en tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, at de transformerede celler kan udtrykke et pro-10 tein indeholdende en GPIIb-beslægtet aminosyregruppesekvens.

Det udtrykte protein udvindes derefter fra kulturen.

Fremgangsmåder til udvinding af et udtrykt protein fra en kultur er velkendte og omfatter fraktionering af den proteinholdige portion af kulturen ved anvendelse af vel-15 kendte biokemiske fremgangsmåder. Eksempelvis kan man anvende gelfiltrering, gelchromatografi, ultrafiltrering, elektro-forese, ionbytning og affinitetschromatografi, såsom det er kendt til proteinfraktioneringer, til isolering af de udtrykte proteiner, der findes i kulturen. Desuden kan man 20 gennemføres immunokemiske metoder, såsom immunaffinitet og immunadsorption, ved anvendelse af velkendte fremgangsmåder. j

Aminosyregrupper, til stede i et her omhandlet poly-peptid ud over en sekvens, som specificeres nedenfor, op I

til i alt højst ca. 50 aminosyregrupper, kan være hvilke 25 som helst grupper, som ikke afgørende påvirker de basale og hidtil ukendte egenskaber for et polypeptid som nedenfor omtalt. Sådanne yderligere grupper sættes almindeligvis til den ene eller begge termini hos et specificeret polypeptid og kan omfatte repeterende enheder og partiale repeterende 30 enheder for en specificeret polypeptidsekvens.

F. Polvoeotider.

Et her omhandlet polypeptid indeholder højst ca. 50, sædvanligvis færre end ca. 35 og fortrinsvis færre end ca.

3 5 2 5 aminosyregrupper og indeholder mindst ca. 10 grupper.

Desuden er et polypeptid ifølge opfindelsen karakteriseret

I DK 175655 B1 I

I 19 I

ved dets aminosyregruppesekvens og hidtil ukendte funktionel- I

le egenskaber. I

1. hGPIIb kryptiske determinant polvpeptidanaloge. I

51 det store og hele omfatter en udførelsesform ifølge I

opfindelsen et polypeptid, som omfatter en aminosyregrup- I

I pesekvens, der kan imitere en kryptisk antigendeterminant, I

udtrykt af den tunge kæde af at-underenheden af et RDG-bind- I

ende cytoadhæsivt protein. Aminosyregruppesekvensen af den I

I 10 kryptiske determinant polypeptidanalog svarer til sekvensen I

I af de ca. 15 carboxyterminale aminosyregruppe i den tunge I

kæde i α-underenheden i cytoadhæsinet. I

I En foretrukken kryptisk determinant polypeptidanalog I

tung kæde af a-underenheden af cytoadhæsinet kan imitere I

I 15 en hGPIIb kryptisk determinant, der dannes, når hGPIIb binder I

I fibrinogen. I foretrukne udførelsesformer omfatter en hGPIIb I

I kryptisk determinant polypeptidanalog mindst den følgende I

I aminosyregruppesekvens: I

I -PAHHKRDRRQ-, I

I 20 som repræsenterer aminosyregrupperne nr. 137-145 som vist i I

I £ig· i. I

I Nærmere bestemt omfatter en hGPIIb kryptisk deter- . I

minant polypeptidanalog mindst den følgende aminosyregrup- I

I pesekvens: | I

I 25 -PSPSPIHPAHHKRDRRQ-, · I

I der repræsenterer aminosyregruppesekvenserne nr. 129-145 I

I som vist i fig. 1. I

I Foretrukne hGPIIb kryptiske determinantanaloge omfat- i I

3 0 ter de analoge, hvis aminosyregruppesekvenser er vist i I

I tabel I. . I

20 DK 175655 B1

Tabel I

Betegnelse3 Aminosyregruppesekvens

P136-145 PAHHKRDRRQ

5 pl33-145 PIHPAHHKRDRRQ

P131-145 PSPIHPAHHKRDRRQ

pl29-145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ

a Betegnelsen på hvert enkelt polypeptid repræsenterer den 10 omfattede aminosyregruppesekvens, vist i fig. 1.

Polypeptiderne, vist i tabel I, er endvidere karakteriserede ved deres evne til at neutralisere (kompetitivt inhibere) bindingen af PMI-1 antistofmolekyler, beskrevet 15 nedenfor, med hGPIIb, når hGPIIb er til stede som et GPIIb--IIIa/fibrinogen-kompleks.

Som udtrykket "kompleks" anvendes heri, refererer det til produktet af en specifik bindingsreaktion, såsom en antistof-antigen- eller receptor-ligand-reaktion. Som ek-20 sempler på typiske komplekser tjener immunoreaktionsprodukter GPIIb-IIIa-f ibrinogen-bindingsreaktionsprodukter og cytoadhæsin-ligand-bindingsreaktionsprodukter.

Ved foretrukne udførelsesformer er en hGPIIb kryptisk determinantanalog endvidere karakteriseret ved dens evne 25 til kompetitivt at inhibere aggregationen af fibrinogen- -bundne blodplader. Som eksempel på en typisk hGPIIb kryptisk determinantanalog, der kan inhibere fibrinogen-bundet blod-pladeaggregation, tjener polypeptid pl29-145.

Det bør forstås, at en her omhandlet hGPIIb kryptisk 30 determinant polypeptidanalog ikke nødvendigvis skal være identisk med hGPIIb's aminosyresekvens, så længe den kan inhibere fibrinogen-bundet aggregation kompetitivt og/eller kompetitivt kan inhibere bindingen af PMI-1 antistofmolekyler, beskrevet nedenfor, til hGPIIb, når hGPIIb er til stede 35 som et GPIIb-IIIa/fibrinogen-kompleks. Derfor kan en hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog underkastes forskellige ændringer, såsom indskydelser, deletioner og substitutioner,

I DK 175655 B1 I

m I

enten bevarende eller ikke bevarende, hvor sådanne ændringer I

tilvejebringer visse fordele ved anvendelsen deraf. I

Bevarende substitutioner er substitutioner, hvor man . I

I erstatter en aminosyregruppe med en anden, biologisk lignende I

5 gruppe. Eksempler på bevarende substitutioner omfatter sub- I

I stitutionen af en hydrofobisk gruppe, såsom en isoleucin, I

valin, leucin eller methionin med en anden, eller substitu- I

tionen af en polær gruppe med en anden, såsom mellem arginin I

og lysin, mellem glutaminsyre og aspartinsyre eller mellem I

10 glutamin og asparagin og lignende. Udtrykket "bevarende I

substitution" omfatter ligeledes anvendelsen af en substitu- I

H eret aminosyre i stedet for en usubstitueret stamaminosyre, I

med det forbehold at et sådant polypeptid ligeledes har den I

I krævede bindingsaktivitet. I

I 15 Når et polypeptid ifølge opfindelsen har en sekvens, I

I som ikke er identisk med hGPIIb's, fordi man har foretaget I

I en eller flete bevarende eller ikke-bevarende substitutioner, I

I substitueres sædvanligvis højst ca. 20% og mere usædvanligt I

I højst ca. 10% af aminosyregrupperne, undtagen når yderligere I

I 20 grupper er blevet adderet ved den ene eller begge terminaler I

I til tilvejebringelse af en "linker", ved hjælp af hvilken de I

I her omhandlede polypeptider bekvemt kan blive fastgjort til I

en markør eller fast matrix eller antigen bærer. Markører, I

faste matricer og bæreren, der kan anvendes sammen med de I

25 her omhandlede polypeptider, er beskrevet nedenfor. I

I Aminosyregruppelinkere er sædvanligvis mindst en I

I gruppe og kan være færre eller flere grupper, oftere fra 1 I

I til 10 grupper. Typiske aminosyregrupper, anvendt til bin- I

I ding, er tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre og aspartin- I

I 30 syre. Desuden kan en her omhandlet polypeptidsekvens adskille I

I sig fra den naturlige sekvens ved, at sekvensen er modifice- I

I ret ved terminal-NH2-acylering, eksempelvis acetylering, I

I eller thioglycolsyreamidering, terminal-carboxylamidering, ‘ I

I såsom ammoniak og methylamin. I

I 35 En hGPIIb kryptisk determinant polypept idanalog ifølge I

I opfindelsen kan, når den er koblet til en bærer via en linker I

22 DK 175655 B1 til dannelse af, hvad der er kendt som et bærer-haptenkon-jugat, inducere antistoffer, som immunoreagerer med hGPIIb, når hGPIIb er til stede som et blodplade-bundet GPIIb-IIIa/-fibrinogen-kompleks. I betragtning af det veletablerede 5 princip med immunologisk krydsreaktivitet omfatter den foreliggende opfindelse derfor antigent beslægtede varianter af polypeptidet pl29-149. En "antigentbeslægtet variant" er et polypeptid, som omfatter mindst en seks aminosyregruppe stor sekvensdel af polypeptidet pl29-145, og som kan inducere 10 antistof molekyler, som immunoreagerer med polypeptid pl29-145 og hGPIIb, når hGPIIb er til stede som et blodpladebundet GPIIb-Illa/fibrinogen-kompleks.

2. lGPIIb polvoeptider.

15 I en anden udførelsesform omfatter den foreliggende opfindelse et lGPIIb polypeptid, som omfatter mindst den følgende aminosyregruppesekvens: -RQUFKOEOEQOSR-, som repræsenterer aminosyregrupperne 144-156 som vist i 20 fig. 1.

Et lGPIIb polypeptid er endvidere karakteriseret ved dets evne til at inducere antistofmolekyler, som immunoreagerer med 1GPIIB, men som ikke immunoreagerer med hGPIIb.

Et foretrukket lGPIIb polypeptid med tegneisen pl44-156 har 25 en aminosyregruppesekvens med formlen: RQIFLPEPQPSR.

Både et hGPIIb- og et lGPIIb polypeptid ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved hvilke som helst af de frem- . gangsmåder, som er kendt for fagfolk inden for polypeptidom-30 rådet. Man kan finde en fortrinlig opsummering af de mange tilgængelige fremgangsmåder i J. M. Steward og J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins og Peptides", bd. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983 35 vedrørende fastfasepeptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", bd. 1, Academic Press (New York), 1965 ved-

I DK 175655 B1 I

I I

H

rørende den klassiske opløsningssyntese. I

G. Inocula I

I en anden udførelsesform anvendes et polypeptid I

5 ifølge opfindelsen eller en antigen beslægtet variant deraf I

I i en farmaceutisk acceptabel vandig fortyndingsmiddelblanding I

til dannelse af et inoculum, der, når det indgives i en I

virkningsfuld mængde, kan inducere antistoffer, som immuno- I

I reagerer med hGPIIb. I

10 Udtrykket "inoculum" i dets forskellige grammatiske I

former anvendes heri til beskrivelse af en blanding indehold- I

ende et polypeptid ifølge opfindelsen som en aktiv ingredi- I

ens, anvendt til fremstilling af antistoffer mod den tunge I

I eller lette GPIIb-kæde. I

15 Når man anvender et polypeptid til inducering af I

I antistoffer, skal det forstås, at polypeptidet kan anvendes I

alene eller bundet til en bærer som et konjugat eller som I

en polypeptidpolymer, men af bekvemmelighedshensyn omtales .1

de forskellige udførelsesformer for de her omhandlede poly- I

20 peptider samlet ved udtrykket "polypeptid" og dets forskel- I

lige gramatiske former. I

I For et polypeptid, som indeholder færre end ca. 35 I

I aminosyregruppe, foretrækker man at anvende peptidet, bundet I

I til en bærer, til inducering af produktionen af antistoffer I

I 25 som allerede bemærket. j I

I Som allerede bemærket kan man addere en eller flere I

I yderligere aminosyregrupper til amino- eller carboxyter- I

I minalerne i polypeptidet for at hjælpe til binding af poly- I

peptidet til en bærer. Cysteingrupper, adderet til amino- I

30 eller carboxy-terminalerne i polypeptidet har vist sig at I

I være særligt anvendeligt til dannelse af konjugater via I

I disulfidbindinger. Imidlertid kan man ligeledes anvende I

I andre kendte fremgangsmåder til fremstilling af konjugater. I

I Anvendelsen af Michael-additionsreaktionsprodukter, di-al- I

I 35 dehyder, såsom glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. I

I Dis., 147, 318-326 (1983), eller anvendelsen af carbodiimid- I

24 DK 175655 B1 teknologi som ved anvendelsen af vandopløselig carbodiimid til dannelse af amidbindinger til en bærer tjener som typiske eksempler på yderligere bindingsprocedurer, jfr. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., bd. 8, Supp-1, 7, 7-23 (1978), 5 for en redegørelse for proteinkonjugater eller kobling ved hjælp af aktiverede grupper.

Anvendelige bærere er velkendte og er almindeligvis selv proteiner. Som eksempler på sådanne bærere tjener I keyhole limpet hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, 10 albuminer, såsom bovinserumalbumin (BSA) eller human serumalbumin (HSA), røde blodlegemer, såsom fåre-erythrocytter (SRBC), tetanustoxoid, choleratoxoid samt polyaminosyrer, såsom poly(D-lysin: D-glutaminsyre).

Valget af bærer afhænger mere af slutanvendelsen af 15 inoculet og er baseret på kriterier, som ikke er specielt involveret i den foreliggende opfindelse. Eksempelvis bør man vælge en bærer, som ikke genererer en uheldig reaktion i det bestemte dyr, der skal inoculeres.

Det her foreliggende inoculum indeholder en effektiv 20 immunogen mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen, typisk som et konjugat, bundet til en bærer. Den effektive mængde polypeptid eller protein pr. enhedsdosis afhænger blandt andet af arten af det inoculerede dyr, dyrets legemsvægt og den valgte inoculumkur, som det er velkendt inden for teknik-25 ken. Inocula indeholder typisk polypeptid- eller proteinkoncentrationer fra ca. 10 mikrogram til ca. 500 mikrogram pr. inoculering (dosis), fortrinsvis fra ca. 50 mikrogram til ca. 50 mg pr. dosis.

Udtrykket "enhedsdosis", som det vedrører inocula | 30 ifølge opfindelsen, refererer til fysisk særskilte enheder, : som er egnede som enhedsdoseringer til dyr, idet hver enhed indeholder en på forhånd bestemt mængde af aktivt materiale, beregnet til at fremkalde den ønskede immunogene virkning i forbindelse med det krævede fortyndingsmiddel, dvs. bærer 35 eller vehicle. Specifikationerne for den her omhandlede enhedsdosis af et inoculum ifølge opfindelsen dikteres af j

I DK 175655 B1 I

25 I

og afhænger direkte af a) det aktive materiales særlige I

egenskaber og den bestemte immunologiske virkning, der skal I

opnås, og b) de begrænsninger, som er iboende ved sammensæt- I

ning af sådant aktivt materiale til immunologisk anvendelse I

I 5 i dyr, som beskrevet i enkeltheder heri, idet opfindelsen I

I angår disse særlige træk. I

I Inocula fremstilles typisk ud fra det tørrede faste I

| polypeptidkonjugat ved dispergering af polypeptidkonjugatet I

li i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel eller vehicle, I

I 10 såsom vand, fysiologisk saltvand eller phosphatpufret salt- I

I vand, til dannelse af en vandig blanding. Sådanne fortyn- I

I dingsmidler er velkendte og er eksempelvis omtalt i I

I Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. udg., Mack I

I Publishing Company, Easton, PA (1980) på side 1465-1467. I

I 15 Inocula kan ligeledes omfatte et adjuvans som del af I

I fortyndignsmidlet. Adjuvanser, såsom komplet Freund's ad- 1 I

juvans (CFA), ukomplet Freund's adjuvans (IFA) og alun, er I

materialer, som er velkendte og er tilgængelige kommercielt I

fra adskillige kilder. I

fl 20 I

B H. Antistoffer og antistofpræparater. I

I 1. Antistofpræparater. I

B Udtrykket "antistof" i dets forskellige grammatiske I

B former anvendes heri for at referere til immunoglobulin- I

I 25 molekyler og immunologisk aktive dele af immunoglobulin- I

B molekyler, dvs. molekyler, som indeholder et antistof "com- I

B bining site" eller paratop. Som eksempler på antistofmoleky- I

B ler tjener intakte immunoglobulinmolekyler, i det væsentlige I

B intakte immunoglobulinmolekyler og de dele af et immunoglo- I

B 30 bulinmolekyle, som indeholder paratopen, herunder de dele, I

B der er kendte som Fab, Fab', F(ab')2 og F(V). I

B Et antistof "combining site" er den strukturelle del I

B af et antistofmolekyle, der er omfattet af en tung og let I

B kæde i variable og hypervariable områder, som specifikt I

B 35 binder (immunoreagerer med) antigen. Udtrykket "immunoreage- . I

B rer" i dets forskellige former betyder binding mellem et I

26 DK 175655 B1 antigendeterminantholdigt molekyle og et molekyle indeholdende et antistof combining site, såsom et helt antistofmolekyle eller en del deraf.

"Antigendeterminant" henviser til den faktiske struk-5 turelle del af antigenet, som immunologisk er bundet ved hjælp af et antistof combining site. Udtrykkene anvendes ligeledes i flæng sammen med "epitop".

Et antistofpræparat ifølge opfindelsenm er karakteriseret som indeholdende antistofmolekyler, som immunorea-10 gerer med a) hGPIIb eller lGPIIb, og b) mindst et specifikt polypeptid ifølge opfindelsen. I en foretrukken udførelsesform indeholder et antistofpræparat ifølge opfindelsen mere end 1 slags paratop, der kan immunoreagere med GPIIb.

Eksempelvis kan et antistofpræparat ifølge opfindelsen 15 indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med blod-plade-bundne GPIIb-IIIa/fibrinogen-komplekser og en hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog, men som ikke væsentligt immunoreagerer med polypeptid p53-64, hvis aminosyre-. gruppesekvens er vist i tabel II, skelne fibrinogen-bundne 20 blodplader fra blodplader, som ikke har bundet fibrinogen.

Således foretrækkes antistofpræparater indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med: a) hGPIIb, når det er til stede som et blodplade-bundet GPIIb-IIIa/fibrinogen--kompleks, og b) polypeptid pl29-145, og er i det væsentlige 25 fri for immunoreaktion med polypeptid p53-64.

Et antistofpræparat ifølge opfindelsen produceres typisk ved immunisering af et pattedyr med et inoculum af den foreliggende opfindelse og derved inducering i pattedyret af antistofmolekyler med en hensigtsmæssig polypeptimmuno-30 specificitet. Antistofmolekylerne opsamles derefter fra pattedyret og isoleres i det ønskede omfang ved velkendte fremgangsmåder, såsom ved immunaffinitetschromatografi. Det således producerede antistofpræparat kan blandt andet anvendes ved de diagnostiske metoder og systemer ifølge opfindel-35 sen til detektering af fibrinogen-bundne blodplader i en , legemsanalyseprøve.

I DK 175655 B1 I

27 I

2. Monoklonale antistofsammensætninger I

Et anti-LIBS monoklonalt antistofsammensætning omfat- I

tes ligeledes af den foreliggende opfindelse. Udtrykket I

"monoklonalt antistofsammensætning" i dets forskellige gram- I

I 5 matiske former henvises til en population af antistofmoleky- I

I ler, som kun indeholder en slags antistof combining site, I

H der kan immunoreagere med et bestemt antigen. Et monoklonalt I

antistof sammensætning har således typisk en enkeltbindingsaf- ' I

finitet for hvilket som helst antigen, med hvilket det im- I

I 10 munoreagerer. Et monoklonalt antistof sammensætning kan derfor I

I indeholde et antistofmolekyle med en flerhed af antistof I

combining sites, som hver er immunospecifik for et andet I

H antigen, dvs. et bispecifikt monoklonalt antistof. I

H Et monoklonalt antistof sammensætning er typisk sammen- I

15 sat af antistoffer, produceret af kloner af en enkelt celle, I

betegnet som hybridom, som kun udsondrer (producerer) en I

slags antistofmolekyle. Hybridomcellen dannes ved at fusio- I

I nere en antistofproducerende celle og et myelom eller anden I

I "udødelig" cellelinie. Sådanne antistoffer blev først be- I

I 20 skrevet af Kohier og Milstein, Nature 256:495-497 (1975), I

hvortil der henvises. I

I I en udførelsesform er et monoklonalt antistofpræparat I

ifølge opfindelsen karakteriseret ved at indeholde antistof- I

I molekyler, som immunoreagerer med en LIBS, udtrykt af et I

I 25 celleoverfladereceptor-ligandkompleks, fortrinsvis en kryp- I

I tisk antigendeterminant af receptoren i komplekset. I

I en anden udførelsesform indeholder et monoklonalt I

antistofpræparat antistofmolekyler, som immunoreagerer med I

I hGPIIb og en hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog, I

I 30 fortrinsvis pl29-145. Antistofmolekylerne, indeholdt i disse I

I præparater, immunoreagerer med hGPIIb ved eller tæt ved et I

I GPIIb funktionelt sted, men inhiberer ikke bindingen af I

I . fibrinogen ved hjælp af blodplade-bundet GPIIb-IIla, og kan I

I immunologisk reagere med blodplade-bundet GPIIb-IIIa, når I

I 35 det· har bundet fibrinogen. Et foretrukket monoklonalt anti- I

I stof af denne type indeholder antistofmolekyler, der kan I

28 DK 175655 B1 produceres af hybridom PMI-1 (ATCC HB 9476), dvs. PMI-1 antistofmolekyler.

3. Fremgangsmåder til produktion af monoklonale anti-5 stofsammensætninger

Den foreliggende opfindelse omfatter en fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistof, som a) immunoreage-rer med et ligand induceret bindingssted (LIBS), udtrykt ved et celleoverfladereceptor-ligandkompleks, og b) ikke 10 immunoreagerer hverken med den ikke-okkuperede receptor eller den ikke bundne ligand i receptor-1igandkomplekset. Fremgangsmåden omfatter trinene: a) Immunisering af et dyr med et celleoverflade-recep-torkompleks eller en hG.PIIb kryptisk determinant polypep- 15 tidanalog. Dette sker typisk ved indgift af en immunologisk virkningsfuld mængde, dvs. en mængde, der er tilstrækkelig til at fremkalde en immunrespons, af immunogen til et immunologisk kompetent pattedyr. Fortrinsvis er pattedyret en gnaver, såsom en kanin, rotte eller mus. Pattedyret holdes 20 derefter i en tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, at pattedyret kan producere celler, som udsondrer antistof-molekyler, som immunoreagerer med receptor-ligandkomplekset.

b) En suspension af antistof-producerende celler, fjernet fra det immuniserende pattedyr, fremstilles derefter.

25 Dette sker typisk ved at fjerne pattedyrets milt og mekanisk separere de særskilte miltceller i et fysiologisk acceptabelt medium ved anvendelse af velkendte fremgangsmåder.

c) De suspenderede antistofproducerende celler behandles med et transformeringsmiddel, der kan producere en 30 transformeret ("udødeliggjort") cellelinie. Transformerings-midler og anvendelsen deraf til produktion af udødeliggjorte cellelinier er velkendte og omfatter DNA-vira, såsom Epstein Bar Virus (EBV), Simian Virus 40 (SV40), Polyoma Virus, RNA vira, såsom Moloney Museleukæmivirus (MoMuLV) og Rous Sarcoma 35 Virus, myelomceller, såsom P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4.

I DK 175655 B1 I

I 29 I

Ved de foretrukne udførelsesformer resulterer behand- I

H ling med transformeringsmidlet i produktionen af et hybriddm I

H ved at fusionere de suspenderede miltceller med musemyelom- I

celler fra en passende cellelinie ved anvendelsen af en I

5 passende fusionspromotor. Det foretrukne forhold ligger på I

ca. 5 miltceller pr. myelomcelle, rumfang i alt ca. 10® I

splenocytter. I

Den anvendte cellelinie bør fortrinsvis være af den I

såkaldte "lægemiddelresistente" type således, at ufusionerede I

10 myelomceller ikke overlever i et selektivt medium, medens I

hybrider overlever. Den almindeligste gruppe er 8-azaguanin- I

resistente cellelinier, som mangler enzymet hypoxanthin- I

I guaninphosphoribosyltransferase og derfor ikke kan støttes I

I af HAT (hypoxanthin, aminopterin og thymidin)-medium. Det I

15 foretrækkes ligeledes almindeligvis, at den anvendte myelom- I

celle skal være af den såkaldte "ikke-udsondrende" type I

ved, at den ikke selv producerer noget antistof, skønt man I

kan anvende udsondrende typer. I visse tilfælde kan udson- I

I drende myelomcellelinier imidlertid foretrækkes. Medens I

20 den foretrukne fusionspromotor er polyethylenglycol med en I

I gennemsnitsmolekylvægt fra ca. 1000 til ca. 4000 (kommercielt I

tilgængelig som PEG 1000, osv.), kan man ligeledes anvende . I

andre kendte fusionspromotorer. ' I

d) De transformerede celler klones derpå, fortrinsvis I

25 til monoklonalitet. Kloningen udføres fortrinsvis i et vævs- I

I kulturmedium, som ikke støtter ikke-transformerede celler. I

Når de transformerede celler er hybridomer, sker det typisk I

I ved at fortynde og dyrke blandingen af ufusionerede miltcel- I

I ler, ufusionerede myelomceller og fusionerede celler (hybri- I

I 30 domer) i et selektivt medium, som ikke støtter de ufusione- I

I rede myelomceller i særskilte beholdere i et tidsrum, der I

I er tilstrækkeligt langt til, at de ufusionerede celler dør : I

I væk (ca. l uge). Fortyndingen kan være af typen grænsefor- I

tynding, hvori rumfanget af fortyndingsmidlet beregnes sta- I

35 tistisk til isolering af et vist antal celler (eksempelvis I

I 1-4) i hver særskilt beholder (såsom hver enkelt brønd i en I

30 DK 175655 B1 mikrotiterplade). Mediet er et medium (såsom HAT-medium), som ikke støtter den lægemiddelresistente (såsom 8-azaguanin-resistente) ufusionerede myelomcellelinie.

e) Vævskulturmediet fra de klonede transformanter 5 vurderes med hensyn til tilstedeværelsen af udsondrede anti- -LIBS-antistofmolekyler ved anvendelse af velkendte immunologiske fremgangsmåder.

f) Når først en ønsket transformant er blevet identificeret i trin e), udvælges og dyrkes den i et egnet vævs- 10 kulturmedium i en passende tidsperiode, fulgt af udvinding af det ønskede antistof fra kultursupernatanten. Et egnet medium og en passende længde af dyrkningstiden er kendt eller let at bestemme.

Til produktion af en meget højere koncentration af 15 lidt mindre rent antistof kan man injicere det ønskede hybridom i mus, fortrinsvis syngene eller semisyngene mus. Hybri-domet vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende inkubationstid, hvilket resulterer i en høj koncentration af det ønskede antistof (fra ca. 5 til i 20 ca. 20 mg/ml) i blodstrømmen og det peritoneale ekssudat (as cites) i værtsmusen.

Medier, der er anvendelige til fremstilling af disse præparater, er velkendte og kommercielt tilgængelige og omfatter syntetiske dyrkningmedier, indavlede mus og lig-25 nende. Som eksempel på et syntetisk medium tjener Dulbecco's minimal essential medium [DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)], kompletteret med 4,5 g glucose pr. liter, 20 mm glutamin og 20% kalveføtusserum. Som typisk eksempel på en indavlet musestamme tjener Balb/c.

30 De monoklonale antistofpræparater, fremstillet ved den ovennævnte fremgangsmåde, kan eksempelvis anvendes i diagnostiske og terapeutiske modaliteter, hvori der ønskes dannelse af et LIBS-holdigt immunoreaktionsprodukt. Eksempler på reaktionsprodukter omfatter et GPIIb- eller et GPIIIa-35 -holdigt immunoreaktionsprodukt.

i

I DK 175655 B1 I

I 31 I

I. Hybridomer og fremgangsmåder til fremstilling I

deraf. I

De her omhandlede hybridomer er hybridomer, som er I

karakteriserede ved at have evnene til at producere en anti- I

5 -LIBS monoklonalt antistofsammensætning. I

Et foretrukket hybridom ifølge opfindelsen er karak- I

teriseret som et hybridom, der producerer antistofmolekyler, I

som immunoreagerer med en celleoverfladereceptor-kryptisk I

I antigendeterminant. I

10 Fremgangsmåder til fremstilling af hybridomer, som I

producerer (Udsondrer) antistofmolekyler med en ønsket im- I

munspecificitet, dvs. med evnen til at immunoreagere med et I

bestemt protein, et identificerbart epitop på et bestemt I

I protein og/eller et polypeptid, er velkendte. Især kan den I

H 15 hybridomteknik, der er beskrevet af Niman et al., Proc. I

' Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983) og ved Galfre et I

I al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), anvendes. I

Hybridomkulturen PMI-1 er deponeret ifølge Budapest- I

I traktaten hos ATCC den 7. juli 1987 og har accessionsnurmieret I

I 20 HB 9476. Hybridomkulturen PMI-2 er på lignende måde deponeret I

I hos ATCC den 22. december 1987 og har accessionsnummeret HB I

I 9615. I

I J. Terapeutiske fremgangsmåder og præparater I

25 En hGPIIb kryptiske determinant polypeptidanalog I

ifølge opfindelsen kan anvendes til at modulere aggregationen I

I af fibrinogenbundne blodplader in vivo. I

Eksempelvis kan man anvende en hGPIIb kryptisk deter- I

I minant polypeptidanalog i et farmaceutisk acceptabelt præpa- I

I 30 rat, der, når det indgives til en forsøgsperson i en virk- I

I ningsfuld mængde, kan inhibere aggregationen af fibrinogen- I

I bunde blodplader kompetetitivt. Denne inhibering menes at I

I resultere i en nedsat thrombedannelseshastighed. Således I

I kan man anvende in vivo indgift af en hGPIIb kryptisk deter- I

I 35 minant polypeptidanalog til at modulere hvilken som helst I

I fysiologisk respons, der startes af blodpladeaggregation, I

a 32 DK 175655 B1 såsom koagulation og nogle inflammatoriske responser.

I en anden udførelsesform kan aggregationen af fibri-nogen-bundne blodplader inhiberes ved intravenøs indgift af en effektiv mængde af et farmaceutisk acceptabelt præparat 5 i det væsentlige bestående af antistofmolekyler, som im-munoreagerer med en hGPIIb kryptisk determinant polypep-tidanalog, fortrinsvis pl29-145. Fortrinsvis er antistofmolekylerne til stede som et monoklonalt antistofpræparat, I og de antistofmolekyler, der produceres af hybridomet PMI-1 10 er mere foretrukne.

De indgivne polypeptid- eller antistofmolekyleholdige præparater tager form af opløsninger eller, suspensioner, imidlertid kan polypeptider ligeledes tage form af tabletter, piller, kapsler, formuleringer med forsinket frigivelse 15 eller pulvere. I alle tilfælde indeholder præparaterne typisk fra ca. 0,1 μΜ til ca. 1,0 M aktiv ingrediens, fortrinsvis fra ca. 1,0 μΜ til ca. 10 millimolær (mM).

Fremstillingen af et terapeutisk præparat, som indeholder polypeptider eller antistofmolekyler som aktive in-20 gredienser er godt belyste og forståede. Typisk fremstilles sådanne præparater som injicerbare præparater, enten som flydende opløsninger eller suspensioner, imidlertid kan man ligeledes fremstille faste former, der er egnet til opløsning i eller suspension i væske forud for injektion. Præparationen 25 kan ligeledes emulgeres. Den aktive terapeutiske ingrediens blandes ofte med strækkemidler, som er farmaceutisk acceptable og kompatible med den aktive ingrediens, hvilket er velkendt. Egnede strækkemidler er eksempelvis vand, fysiologisk saltvand, dextrose, glycerol eller ethanol, og kom-30 binationer deraf. Desuden kan præparatet om ønsket indeholde mindre mængder af hjælpestoffer, såsom fugte- eller emulgerende midler, pH-pufringsmidler, som forøger effektiviteten af den aktive bestanddel.

Man kan formulere et polypeptid- eller antistofmole-35 kylepræparat til det terapeutiske præparat som neutraliserede farmaceutisk acceptable saltformer. Farmaceutisk acceptable

I DK 175655 B1 I

33 I

saltformer omfatter syreadditonssaltene, (dannet med de frie I

aminogrupper i polypeptid- eller antistofmolekylet), som er I

dannede med uorganiske syrer, såsom saltsyre eller phosphor- I

I syre, eller sådanne organiske syrer som eddikesyre, vinsyre I

I 5 og mandelsyre. Salte, dannede med de frie carboxylgrupper, I

I kan ligeledes afledes af uorganiske baser, såsom natrium-, I

kalium-, ammonium-, calcium- eller ferrihydroxid, og sådanne I

H organiske baser som isopropylamin, trimehylamin, 2-ethyl- I

H aminoethanol, histidin og procain. I

I 10 De terapeutiske polypeptid- eller antistofmolekyle- I

I holdige præparater injiceres gængs intravenøst, ved injektion I

I af eksempelvis en enhedsdosis. Udtrykket "enhedsdosis" refe- I

I rerer, når det anvendes med reference til et terapeutisk I

I præparat ifølge opfindelsen, til fysisk diskrete enheder, I

15 der er egnede som enhedsdoseringer til mennesker, idet hver I

I dosis indeholder en på forhånd bestemt mængde aktivt mate- I

I riale, beregnet til at fremkalde den ønskede terapeutiske I

I virkning i forening med det krævede fortyndingsmiddel, dvs. I I

I bærer eller vehicle. I

I 20 Præparaterne indgives på en måde, som er kompatibel j I

med dosisformuleringen, og i en terapeutisk virkningsfuld I

I mængde. Den mængde, der skal indgives, afhænger af den for- I

søgsperson, der skal behandles, forsøgspersonens evne til I

I 1 at anvende den aktive ingrediens, og den ønskede grad af , I

I 25 inhibering af receptor-ligandbindingen. Præcise mængder af . I

I aktiv ingrediens, der skal indgives, afhænger af lægens be- I

I dømmelse og er særlig for hvert enkelt individ. Imidlertid I

I ligger passende dosisområder i en størrelsesorden fra 1 til I

I adskillige mg aktiv ingrediens pr. individ pr. dag og af- I

I 30 hænger af indgiftsvejen. Egnede kurver til initial indgift I

I og boosterindgift er ligeledes variable, men som typisk I

I eksempel kan angives en initial indgift fulgt af gentagne I

I doser med en eller flere timers interval ved en derpå følg- I

I ende injektion eller anden indgift. Alternativt omfatter I

I 35 opfindelsen kontinuert intravenøs infusion, der er tilstræk- I

I kelig til at opretholde terapeutisk virkningsfulde koncentra- I

34 DK 175655 B1 tioner i blodet. For et hGPIIb kryptisk determinant polypep-tid ligger terapeutisk virkningsfulde blodkoncentrationer i et interval fra ca. 0,1 mM til ca. 10 mM, fortrinsvis ca. 1,0 mM. Terapeutisk virkningsfulde koncentrationer af'antistof -5 molekyler i blodet ifølge den foreliggende opfindelse ligger i et interval fra ca. 0,1 μΜ til ca. 10 μΜ, fortrinsvis 1,0 μΜ.

K. Diagnostiske systemer 10 Et diagnostisk system i form af et sæt af den forelig gende opfindelse omfatter et udtrykt protein, polypeptid, antistofsammensætning eller monoklonalt antistofsammensætning ifølge opfindelsen som reagenser, pakkede hver for sig, i en mængde, der er tilstrækkelig til mindst en bestem-15 melse. Der er typisk inkluderet en brugsvejledning for det pakkede reagens.

"Brugsvejledning" omfatter typisk en konkret ytring, der beskriver reagenskoncentrationerne eller i det mindste en analysemetodeparameter, såsom de relative mængder af 20 reagens og analyseprøve, der skal blandes, holdetidsperioder for reagens-/analyseprøveblandinger, temperatur og pufferbetingelser .

I en udførelsesform omfatter et diagnostisk system til bestemmelse af fibrinogen-bundne blodplader i en blod-25 pladeholdig vaskuløs væskeprøve, såsom blod eller plasma, en pakning indeholdende molekyler, som immunoreagerer med en hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog, fortrinsvis pl29-145. Især er antistofmolekylerne de molekyler, der produceres af hybridomet PMI-1, som immunoreagerer med 30 hGPIIb. Fortrinsvis er antistofmolekylerne til stede som et monoklonalt antistofsammensætning. Endvidere foretrækkes sæt, hvori antistofmolekylerne er bundet til et radionuclid-mærkestof, fortrinsvis pmi_i antistofmolekyler.

I en anden udførelsesform er et diagnostisk system 35 ifølge opfindelsen anvendeligt til bestemmelse af tilstedeværelsen af en thrombe in vivo. Systemet omfatter en pakning i

DK 175655 B1 I

I 35 I

indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med en I

hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog, fortrinsvis I

H pl29-145. Især er antistofmolekylerne til stede som en mono- I

klonal antistofsammensætning i det væsentlige bestående af I

5 PMI--1 antistofmolekyler, som immunoreagerer med hGPIIb. I

Antistofmolekylerne er bundet til en in vivo indikator. I

Således omfatter et diagnostisk system ifølge opfin- I

delsen i foretrukne udførelsesformer endvidere et mærkestof I

eller indikatormiddel, der kan signalere dannelsen af et I

10 kompleks indeholdende et antistofmolekyle eller polypeptid I

I ifølge opfindelsen. I

I Som udtrykkene "mærkestof" og "indikatormiddel" i I

deres forskellige grammatiske former anvendes heri, refererer I

Hl de til enkelte atomer og molekyler, som er enten direkte I

15 eller indirekte involveret i frembringelsen af et detekter- I

bart signal til indikering af tilstedeværelsen af et kom- I

pleks. "In vivo" mærkestoffer eller indikatormidler er de, I

H der er anvendelige i en forsøgspersons legeme, og omfatter I

I i:L1In, 9^Tc, 67Ga, 136Re og 132I. Hvilket som helst mærkestof I

20 eller indikatormiddel kan bindes til eller inkorporeres i I

I et udtrykt protein, polypeptid eller antistofmolekyle, som I

I er del af et antistof- eller monoklonalt antistofsammensæt- I

I ning ifølge opfindelsen, eller anvendes særskilt, og de I

I atomer eller molekyler kan anvendes alene eller sammen med I

I 25 yderligere reagenser. Sådanne mærkestoffer er selv velkendte I

I inden for klinisk diagnostisk kemi og udgør kun en del af I

I opfindelsen, for så vidt de anvendes sammen med på anden I

måde særlige proteinmetoder og/eller systemer. I

I Binding af mærkestoffer, dvs. binding af polypeptider I

I 30 og proteiner, er velkendt. Eksempelvis kan man mærke anti- - ! I

stofmolekyler, produceret af et hybridom, ved metabolisk I

inkorporering af radioisotop-holdige aminosyrer, der er I

tilvejebragt som en komponent i dyrkningsmediet, jfr. eksem- I

pelvis Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Teknik- I

I 35 ken til proteinkonjugation eller -kobling ved hjælp af ak- I

tiverede funktionelle grupper er især anvendelig, jfr. eksem- I

I I

36 DK 175655 B1 pelvis Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., bd. 8 Suppl.

. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) og U.S.-patentskrift nr. 4.493.795.

De diagnostiske systemer kan ligeledes, fortrinvis 5 som en separat pakning, omfatte et specifikt bindingsmiddel.

Et "specifikt bindingsmiddel" er en molekylær entitet, der kan binde et reagens ifølge opfindelsen selektivt, men som ikke selv er et proteinekspressionsprodukt, polypeptid eller antistofmolekyle ifølge opfindelsen. Som eksempler på speci-10 fikke bindingsmidler tjener antistofmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter deraf og protein A. Fortrinsvis kan det specifikke bindingsmiddel binde antistofmolekylet eller polypeptidet ifølge opfindelsen, når det er til stede som del af et kompleks.

15 I de foretrukne udførelsesformer er det specifikke bindingsmiddel mærket. Når det diagnostiske system omfatter et specifikt bindingsmiddel, som ikke er mærket, anvendes midlet imidlertid typisk som et forstærkningsmiddel eller -reagens. I disse udførelsesformer kan det mærkede specifikke 20 bindingsmiddel specifikt binde forstærkningsmidlet, når forstærkningsmidlet er bundet til et reagensholdigt kompleks.

De diagnostiske sæt ifølge opfindelsen kan anvendes ved en "ELISA" procedure til detektering af tilstedeværelsen eller mængden af fibrinogen-bundne blodplader i en legems-25 væskeprøve, såsom serum, plasma eller urin. "ELISA" refererer til en enzymimmunanalyse, hvori der anvendes et antistof eller antigen, bundet til en fast fase, og et enzym-antigen-eller enzym-antistofkonjugat til detektering og kvantificering af mængden af et antigen eller antistof, til stede i 30 en prøve. En beskrivelse af ELISA-teknikken findes i kapitel 24 i Basic and Clinical Immunology af D. P. Sites et al., udgivet af Lange Medical Publications of Los Altos, CA, i 1982, 4. udg. og i USA-patentskrif terne nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043, hvortil der henvises. j 35 I foretrukne udførelsesformer kan det udtrykte prote- i in, polypeptid eller antistofmolekyle ifølge opfindelsen

Η I

I DK 175655 B1 I

I

således fikseres på en fast matrix til dannelse af et fast I

H støttemateriale, som indpakkes separat, i de omhandlede I

diagnostiske systemer. I

| Reagenset fikseres typisk til den faste matrix ved I

H 5 adsorption fra et vandigt medium, skønt man kan anvende I

andre fikseringsmetoder, velkendte for fagfolk. I

Anvendelige faste matricer er velkendte. Sådanne I

materialer omfatter den tværbundne dextran,· der kan fås I

under varebetegnelsen "SEPHADEX" fra Pharmacia Fine Chemicals I

10 (Piscataway, NJ, USA), agarose, perler af polystyren fra I

ca. 1 μ til ca. 5 mm i diameter, der kan fås fra Abbott I

I Laboratories of North Chicago, IL, USA, polyvinylchlorid, I

polystyren, tværbundet polyacrylamid, nitrocellulose- eller I

I nylon-baserede væv, såsom ark, strimler eller rørepinde, I

15 eller rør, plader eller brøndene i en mikrotiterplade, såsom I

I dem, der er fremstilles af polystyren eller polyvinylchlorid. I

Reagenserne, det mærkede specifikke bindingsmiddel I

eller forstærkningsreagenset i hvilket som helst diagnostisk I

I system, beskrevet heri, kan fås i opløsning, som en væske- I

20 dispersion eller som i det væsentlige tørt pulver, eksempel- I

vis i lyofiliseret form. Når indikatormidlet er et enzym, I

H kan man ligeledes få enzymets substrat i en separat pakning I

i systemet. Et fast støttemateriale, såsom den ovenfor be- I

I skrevne mikrotiterplade, og en eller flere puffere, kan , I

25 ligeledes være inkluderet som separat indpakkede elementer ' I

I i dette diagnostiske analysesystem. De pakninger, der er I

I omtalt heri i forhold til diagnostiske systemer, er de, som I

I sædvanligvis anvendes i diagnostiske systemer. Sådanne pak- I

I ninger omfatter glas- og plast (eksempelvis' polyethylen, I

30 polypropylen og polycarbonat) , flasker, hætteglas, plast og - I

I plastfolielaminerede hylstre og lignende. I

L. Analvsemetoder I

I Den foreliggende opfindelse omfatter hvilken som I

35 helst fremgangsmåde, som resulterer i detektering af GPIIb, I

og især et kompleks indeholdende fibrinogen-bundet GPIIb, I

38 DK 175655 B1 som det findes i en thrombe eller fibrinogen-bundne blodplader, ved at tilvejebringe et kompleks indeholdende et udtrykt i protein, polypeptid eller antistofmolekyle, indeholdt i et antistof- eller monoklonalt antistofpræparat ifølge opfin-5 delsen. Fagfolk forstår, at der er adskillige velkendte kliniske diagnostisk-kemiske fremgangsmåder, der kan anvendes til dannelse af disse komplekser. Skønt man heri beskriver typiske eksempler på analysemetoder, er opfindelsen således ikke begrænset på denne måde.

10 1. Thrombedetektion

En fremgangsmåde til detektering af tilstedeværelsen af en thrombe i en forsøgsperson er omfattet af opfindelsen.

En effektiv mængde af et antistofpræparat eller et mono-15 klonalt antistofpræparat ifølge opfindelsen indeholdende anti-hGPIIb antistofmolekyler, bundet til et in vivo indikatormiddel, indgives intravenøst til forsøgspersonen. I. foretrukne udførelsesformer er de mærkede antistofmolekyler de molekyler, som immunoreagerer med hGPIIb og polypeptid 20 pl29-145, men ikke p53-64, især de molekyler, der produceres af hybridom PMI-1.

Forsøgspersonen holdes derefter i en på forhånd bestemt tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, at de mærkede antistofmolekyler· kan reagere med hGPIIb, til stede 25 som del af en thrombe, og danne et kompleks, og fortrinsvis i en yderligere tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, at en væsentlig mængde af hvilke som helst ikke-reagerede antistofmolekyler kan forsvinde fra legemet. Forsøgspersonen analyseres derefter for tilstedeværelsen og fortrinsvis | 30 stedfæstelsen af hvilket som helst mærket kompleks, der dannes. ! 2. Detektion af fibrinoaen-bundne blodplader i en legemsprøve 35 Man kan anvende forskellige forskrifter til heterogen og homogen analyse, enten kompetitive eller ikke-kompetitive.

I DK 175655 B1 I

Μ I

til detektering af tilstedeværelsen og fortrinsvis mængden I

I af fibrinogenbundne blodplader i en blodpladeholdig legems- I

prøve, fortrinsvis en legemsvæskeprøve, såsom blod eller en

blodpladeholdig portion blod. Eksempelvis blandes en heparin- I

I 5 -konserveret (ikke-levret) blodprøve og *25i-mærkede PMI-1 I

antistofmolekyler. Immunoreaktionsblandingen, der således I

dannes, holdes under biologiske analysebetingelser i en I

tidsperiode, der er tilstrækkelig til, at hvilke som helst I

fibrinogen-bundne blodplader kan immunoreagere med de mærkede I

I 10 antistoffer og danne et mærket immunoreaktionsprodukt. De I

I I mærkede immunoreaktionsprodukter adskilles derefter fra de I

ikke-reagerede mærkede antistoffer, typisk ved centrifuge- I

I I ring, der er tilstrækkelig til at pelletisere alle blodpla- I

I der, til stede i prøven. Mængden af dannet mærket immunoreak- I

I 15 tionsprodukt analyseres derpå. I

I Biologiske analysebetingelser er de betingelser, som I

I opretholder den biologiske aktivitet af antistofmolekylerne I

og polypeptidmolekylerne ifølge opfindelsen og de fibrinogen- I

I -bundne blodplader, som forsøges bestemt. Disse betingelser I

20 omfatter et temperaturinterval fra ca. 4°C til ca. 45°C, I

I fortrinsvis ca. 37°C, et pH-interval fra ca. 5 til ca. 9, I

fortrinsvis ca. 7, og en ionstyrke, der varierer fra destil- I

I leret vand til ionstyrken for ca. 1 M natriumchlorid, for- I

I trinsvis ca. ionstyrken for fysiologisk saltvand. Fremgangs- I

I 25 måder til optimering af sådanne betingelser er velkendte. I

I 1 I

I Eksempler I

I De følgende eksempler er tiltænkt at belyse men ikke I

I begrænse den foreliggende opfindelse. I

I 30 1. Isolation af GPIIb-IIIa I

I A. Blodpladeisolation I

I 60 ml helt humant fuldblod opsamles i 5 ml ACD (0,065 I

I M citronsyre, 0,085 M natriumcitrat, 2% dextrose), indehold- I

I . ende hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ved en I

I 35 slutkoncentration på 0,06 enheder pr. ml (E/ml) og centrifu- ; I

I geres i 15 minutter ved 120g. Den fremkomne supernatant, I

40 DK 175655 B1 betegnet som blodpladerig plasma (PRP) udvindes,, isoleres og centrifugeres yderligere i 15 minutter ved 1200g til dannelse af en pellet af isolerede blodplader.

5 B. GPIIb-IIIa isolering fra blodplader

En blodpladepellet, fremstillet som i eksempel 1A, suspenderes atter i 5 ml TBS (0,15 M natriumchlorid, 0,2 M tris, pH-værdi = 7,4, 5X10'4 M calciumchlorid, ΙΟ"5 M leupep-! tin) og lydbehandles på is i 10 minutter med en maksimal 10 indstilling ved anvendelse af en model W-375 lydbehandlings-anordning (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY, USA).

Den lydbehandlede suspension fryses og optøs to gange ved anvendelse af et tøris/metanolisbad og opbevares ved -20°C.

Det frosne/optøede lydbehandlede blodplademateriale lægges 15 i et lag oven på 5 ml af en saccharoseopløsning (40 volumenprocent i TBS) og centrifugeres ved 4°C i 1 time ved 38000 ! opm i en SW41 centrifugerotor (Beckman Instruments, Fuller ton, CA, USA) til dannelse af en mælkefarvet infranatant. Den mælkeagtige infranatant udvindes derefter og centrifugeres 20 ved 43000 opm i en SW50.1 centrifugerotor (Beckman) ved 4°C i 1 time. Den fremkomne pellet suspenderes atter i typisk 1-2 ml TBS til dannelse en blodplademembranopløsning, hvis proteinkoncentration bestemmes til at ligge i et interval fra 10 til 25 mg pr. ml, typisk ved anvendelse af Bio-Rad 25 Protein Assay Kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) ifølge fabrikantens anvisninger.

Blodplademembranopløsningen centrifugeres atter i en SW50.1 centrifugerotor som ovenfor, og den fremkomne pellet suspenderes atter i 2 ml ekstraktionspuffer (0,03 M Tris, 30 pH 7,4, 1X10'5 M leupeptin, 200 mM n-octyl-β-D-glucopyrano-sid; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA). Det således dannede blodplademembranekstrakt blandes grundigt ved omhvirvling og henstår derefter ved stuetemperatur i 30 minutter. Ekstrakten centrifugeres derefter ved 45000 opm i en SW50.1 35 centrifugerotor i 1 time ved 4°C, og den således dannede blodplademembranekstrakt supernatant udvindes.

I DK 175655 B1 I

I 41 I

i

H Den udvundne supernatant påføres på en LKB Ultrogel I

Aca 34 gelfiltreringssøjle (3 x 97 cm, LKB Instruments, I

Gaithersburg, MD, USA) , som er blevet ækvilibreret med 1 I

liter søjlepuffer {0,03 M Tris, pH-værdi lig med 7,4, 0,1 I

5 mM calciumchlorid, 0,1% n-octyl-S-D-glucopyranosid), og der I

opsamles 5 ml's fraktioner fra den resulterende søjleaf- I

gangsvæske. Den optiske densitet ved 280 nanometer for hver I

fraktion bestemmes, og fraktionerne omkring de forskellige I

toppe forenes til dannelse af en blanding for hver enkelt I

10 top. Prøver fra hver enkelt blanding analyseres ved elektro- I

forese i 6% polyacrylamidgelplader ved anvendelse af de I

reducerende puffere og fremgangmsåder, der er beskrevet af I

I i Laemmli, Nature (London), 227:680-685 (1970), og proteinstan- I

darder med lav molekylvægt, som varierer i størrelse fra I

I 15 14,4 kdalton til 92,5 kdalton (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). I

Den blanding, som indeholder overvejende to proteiner med I

H molekylvægte, svarende til GPIIb og GPIIIa, dvs. henholdsvis I

120 kdalton og 100 kdalton, udvindes. Proteinkoncentrationen I

af den isolerede således fremstillede GPIIb--Illa tilbered- I

20 ning bestemmes typisk ved anvendelse af Bio-Rad Protein I

Assay Kits til at ligge i et interval fra 0,3 til 0,8 mg I

I pr. ml. I

I 2. Fremstilling af polvklonalt anti-GPIIb-IIIa an- I

I 25 tiserum I

I Kanin-anti-GPIIb-IIIa antistoffer fremstilles ved I

I immunisering med et præparat indeholdende den komplette I

I Freund's adjuvans og 100 mikrogram isoleret GPIIb-IIIa pro- I

tein, fremstillet som beskrevet i eksempel l. Boosterinjek- I

30 tioner af GPIIb-IIIa indgives i en flerhed af intradermale I

I steder (typisk 100 /ig, fordelt over fire steder) i ukomplet I

I Freund's adjuvans en gang om ugen i tre uger, fulgt af to I

I gange om ugen i yderligere 3 måneder. I

I 35 I

DK 175655 B1 '· i 42 3. cDNA bibliotekskonstruktion, antistofscreening og identifikation af cDNA-kloner

Totalt cellulært RNA fremstilles ud fra HEL-celler ved hjælp af guanidium-isothiocyanat/cesiumchloridmetoden.

| 5 Poly (A+)RNA renses ud fra hele RNA fraktionen ved to chro- matograf icycler på oligo (dT) cellulose . Dobbeltstrertget cDNA syntetiseres ud fra 10 μg HEL poly (A+)RNA ved anvendelse af AMW reverstranscriptase (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, FL, USA) og vilkårlige oligodeoxynucleotid-primeren 10 ifølge standardprocedurer. cDNA, udvalgt med hensyn til størrelsen, ligeres til EcoRI-stedet i phagen gtll, pakkes i phagen i overensstemmelse med fabrikantens forskrift ved anvendelse af "Gigapack" pakningsekstrakten, der kan fås fra Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA, og ud-15 pletteres og amplificeres på E. coli Y1088. Udplettering af phagen på E. coli Y1090, induktion af fusionsproteinsynstese, overføring til nitrocellulosefiltre og screening af filtrene med den polyklonale GPIIb-IIIa-antiserum fra kaniner, der er fremstillet i eksempel 2, udføres som be-20 skrevet af Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1194-1198 (1983) ved anvendelse af den immunoperoxidase baserede "Vectastain ABC" metode (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ifølge fabrikantens instruktioner. Positive rekom-binante kloner plaque-renses, amplificeres og opsamles som 25 et pladelysat.

Ved indledende screening af 200.000 rekombinanter med det polyklonale GPIIb-IIIa antiserum fra kaniner identificeres seks immunoreaktive kloner. For at undersøge im-munoreaktiviteten af β-galactosidase-cDNA-fusionsproteinet 30 af positive kloner med det monoklonale antistof PMI-1 tilvejebringes phaglysogener i E. coli stamme Y1089 som beskrevet af Young et al., Science, 222:778-782 (1983). Der fremstilles lysater ud fra IPTG-inducerede kulturer ved at gensuspendere bakteriecellepellets i reducerende gelprøve-35 puffer, hvorefter prøverne køres på 6% SDS-polyacrylamidgeler, overfors til nitrocellulose som beskrevet af Towbin et

I DK 175655 B1 I

I i

I al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 26:4350-4354 (1974) og I

undersøges med PMI-1 under anvendelse af Vecastain ABC-me- I

toden. I

Det viser sig, at en af disse kloner, HEL41, som I

5 indeholder et indskud på 1,1 kbase, styrer syntesen af et I

bakterielt fusionsprotein på 140 kdalton med egenskaber, . I

som er konsistent med, at den har GPIIb-epitoper. Disse I

egenskaber omfatter: (1) blokerbar reaktivitet af den poly- I

klonale anti-GPIIb-IIIa-antistofsammensætning med det fu- I

10 sionsprotein, som HEL41-klonen koder for, blokeres.af tid- I

ligere absorption med isoleret GPIIb-IIIa, (2) specifik I

reaktion af antistoffer, affinitetsrenset på fusionsprotei- I

net, med GPIIb i immunoblot af blodpladelysater og renset I

H GPIIb-IIIa, og (3) immunfældning af GPIIb-IIIa fra over- I

I 15 flademærkede blodplader med det affinitetsrensede antiserum. I

I Det affinitetsrensede antistof reagerer ikke med α-underen- I

H heden af vitronectinreceptoren (VnR) ved Western-blotting, I

H og immunfælder ikke det beslægtede endothel-cellecytoadhæsin. I

Desuden er det fusionsprotein, som HEL41 koder for, immuno- I

I 20 reaktivt med det monoklonale antistof PMI-1, hvilket giver I

I yderligere bevis på, at denne klon koder for epitoper, som I

I er tilgængelige på GPIIb. I

I 4. DNA-sekvensering og sekvensanalvse I

I 25 Man renser rekombinant phag DNA fra HEL41 ved væske- I

I kulturteknikken, nedbryder det med EcoRI og subkloner til I

I M13mpl8. DNA-sekvensen for hver streng bestemmes ved dideoxy- I

kædetermineringsfremgangsmåden ifølge Sanger et al., Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977) under anvendelse I

I 30 af 3^S-dATP og puffergradientgeler, beskrevet af Biggin et I

I al-, Proc,. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3963-3965 (1983). c DNA- I

I -sekvensen forlænges ved anvendelse af den specifikke primer- I

I -styrede DNA-sekvenseringsfremgangsmåde, som beskrevet af I

I Strauss et al., Anal. Biochem., 154:353-360 (1986). Oligonu- I

I 35 kleotid 20 mer sekvenseringsprimere syntetiseres på en I

I Applied Biosystems Model 380A DNA-Synthesizer. Begge strenge I

44 DK 175655 B1 sekvenseres for at løse flertydigheder.

Nukleotidsekvensen for klon HEL41 er vist i fig. 1 og har de følgende særlige træk. Indskuddet består af en åben læseramme på 681 baser med et TAG-stopcodon, der be-5 gynder i position 682, fulgt af 420 baser med 3'-utranslate-ret sekvens. De første 120 nukleotider ved 5'-enden af klonen har de samme egenskaber som consensus Alu repeterende sekvens, hvilket tyder på, at denne klon kan stamme fra et ufuldstændigt behandlet mRNA.

10 cDNA-sekvensen for klon HEL41 koder for en åben læseramme på 227 aminosyrer (fig. 1) . Den analyserede N--terminalsekvens for den lette kæde af GPIIb, som refereret ; af Charo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8351-8356 (1976), kan identificeres i klonen som aminosyregrupperne 15 fra 157 til 171. Concensus Alu repeterende sekvens trans-laterer i rammen og tegner sig for de første 40 aminosyre-grupper, som HEL41 koder for.

Ved sammenligning mellem de udledte aminosyresekvenser for GPIIb- og VnR α-underenhederne [Suzuki et al., Proc.

20 Natl. Acad. Sci. USA, 83:8614-8618 (1986)] ved hjælp af matrixanalyse [George et al., PIR rapport nr. REL-0286, National Biomedical Research Foundation (1986)], opdagede man to ens områder, som tillader bevarende substitutioner.

Et område, som omfatter ca. 50 aminosyregruppe, er placeret 25 nær ved den tunge kædes carboxylterminal. Det andet området på ca. 15 grupper er anbragt nær ved aminoterminalen i de lette kæder og omfatter cysteingrupper, som kan være involverede i dannelse af disulfidbindinger mellem de tunge og lette kæder fra begge proteiner. Vurdering af den statis-30 tiske signifikant af slægtsskabet mellem sekvensen af GPIIb og VnR α-underenheder ved hjælp af Relate-programmet, hvori man anvender en mutationsdatamatrix, tyder på en lav sandsynlighed for at finde denne grad af lighed, som er til stede i de to sekvenser, tilfældigt (p<0,0001). Analyse af 35 slægtsskabet mellem sekvensen af GPIIb- og FnR a-underen-hederne [Argraves et al., J. Biol. Chem., 261:12922-12924

I DK 175655 B1 I

I i

(1986)] viser en lignende lav sandsynlighed for tilfældigt I

at finde den grad af lighed, som er til stede i de to se- I

I kvenser <P<0,0005). I

I En datamatbaseret søgning afslører ikke yderligere I

5 tydelige ligheder mellem denne del af GPIIb og andre se- I

I kvenser, der er til stede i NBRF proteindatabasen. Endvidere I

opdages der ikke signifikante ligheder ved en direkte sammen- I

ligning med den offentliggjorte partielle sekvens for nerve- I

I celleadhæsionsmolekylet, N-CAM. I

H 10 I

5. Polvpeptidsvntese I

Baseret på den aminosyresekvens, som er deduceret ud I

I fra nukleotidsekvensen, syntetiseres polypeptider svarende I

til de forskellige GPIIb-områder, der anvendes heri, kemisk I

H 15 på en Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer ved I

I anvendelse af den symmetriske anhydridmodel ifølge Hagen- I

I maier, et al., Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem., 353:1973 I

I (1982). I

I Aminosyresekvenserne for de syntetiserede polypeptider I

I 20 og deres placering i den udledte aminosyresekvens for GPIIb I

I 'som vist i fig. 1 er angivet i form af en liste i tabel II. I

I Tabel II I

I Betegnelse Aminosyresekvens I

I 25 pl9-34 WEAKAGRSPEVRSSRS I

I p53- 65 REQNSLDSWGPKV I

I pi29-145 PS PSPIHPAHHKRDRRQ I

I pl36-145 PAHHKRDRRQ I

I pi44-156 RQIFLPEPEQPSR I

I 30 _ I

I 6. Fremstilling af monoklonale ant i stofsammensætninger I

I Monoklonale antistofsammensætninger omfattende isole- I

I 35 ret immunoglubo.lin IgG (IgG) isoleres ud fra ascitesvæsken I

I fra en mus indeholdende musehybridomcellelinien PMI-1 (ATCC I

46 DK 175655 B1 nr. HB 9476) ved anvendelse af protein A-Sepharose, der typisk fås fra Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ, USA) og anvendt i overensstemmelse med fabrikantens vejledning. Proteinkoncentrationen af det isolerede IgG bestemmes ved anven-5 delse af Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) ifølge fabrikantens vejledning.

For at fremstille en PMI-1 monoklonal antistofsammensætning indeholdende 12^i-mærkede antistofmolekyler blandes 350 mikroliter PBS (0,15 M natriumchlorid, 0,01 M natrium-10 phosphat, pH-værdi lig med 7,09) indeholdende 1 mg af det ovennævnte isolerede PMI-1 IgG pr. ml med 4 0 mikrogram chlor-amin-T og 1 milliCurie bærerfri natrium 125I (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Den fremkomne blanding holdes i 5 minutter ved ca. 20°C og blandes derpå med 20 μΐ af en 15 natriummetahydrogensulfit-opløsning i en koncentration på 2 mg pr. ml og 20 mikroliter af en kaliumiodidopløsning. Derefter blandes S00 μΐ PBS indeholdende 1% BSA i, fulgt af yderligere iblanding af diisopropylfluorphosphat til en slutkoncentration på 10 mM. Den fremkomne blanding henstår 20 i 60 minutter ved 22°C og dialyseres derpå mod PBS. Den specifikke aktivitet af den fremkomne 125I-mærkede PMI-1 er ca. 4,5 microCurie pr. μg.

Sammensætninger indeholdende Fab-fragmenter fra det ovennævnte isolerende IgG fremstilles ved nedbrydning med 25 papain (forholdet mellem IgG og papain er 20:1 (vægt/vægt) i 6 timer ved 37°C, idet man følger fremgangsmåden ifølge Mage et al., Methods in Enzymology, 70:142-150 (1980). Ikke--nedbrudte IgG og Fc-fragmenter fjernes ved chromatografi på protein A-Sepharose. De fremkomne sammensætninger iridehold-30 ende Fab-fragmenter er derpå parat til brug, eller mærkes med 125i, ait efter behov, idet man anvender den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor for monoklonale antistofsammensætninger.

Monoklonale antistof sammensætninger ifølge opfindelsen 35 med en anden immunospecificitet end PMI-1's fremstilles ligeledes som beskrevet ovenfor for PMI-1. Eksempelvis frem-

DK 175655 B1 I

I 47 I

stilles sådanne sammensætninger ved anvendelse af musehybri- I

I domcellelinien PMI-2 (ATCC nr. 9615). I

7. ELISA-bestemmelser I

5 A. Polypeptid-ELISA I

Antistof molekyler indeholdt i PMI-1 og Tab monoklonale I

antistofsammensætninger undersøges for deres evne til at I

immunoreagere med polypeptiderne pl29-145 og pl44-156. (Tab I

er et ubeslægtet monoklonalt antistof, der anvendes som I

10 kontrol). Der blandes 50 μΐ overtræksopløsning (0,1 M na- I

triumhydrogencarbonat, pH-værdi = 8,5, 0,1% Na^) indehold- I

ende 20 μΐ polypeptid, i brøndene i 96 brønds mikrotiterpla- I

der med flad bund (Immulon 2, Dynatech Laboratories, I

Chantilly, VA, USA). Pladerne holdes derpå i 60 minutter I

15 ved 37 °C for at lade polypept idet absorbere på brøndenes I

vægge. Overtræksopløsningen fjernes ved rystning, brøndene I

skylles to gange med vaskepuffer (0,01 M Tris, pH-værdi = I

7,4, 0,05% Tween 20, 0,15 M natriumchlorid, 20 mg merthiolat I

pr. ml), og 50 μΐ blokeringsopløsning [5% bovinserumalbumin I

20 (BSA, vægt/volumen)] i overtræksopløsning] blandes til hver I

brønd (fast støttemateriale) for at blokere overskydende I

I proteinsæder. I

Brøndene holdes i 60 minutter ved ca. 37°C, og der- I

I efter fjernes blokeringsopløsningen. Til hver brønd blandes ! I

I 25 der 50 μΐ af en opløsning indeholdende a) kanin-antipolypep- I

I tid-antistof, fremstillet i eksempel 8, og fortyndet i for- I

I holdet 1:200 i fortyndingspuffer (vaskepuffer indeholdende I

I 5 mM EDTA og 1 mg BSA pr. ml), b) 1,5 nanomolar PMI-1 mono- I

klonalt antistof IgG, fremstillet som beskrevet i eksempel I

I 30 6, eller c) TAB hybridomascitesvæske (leveret af Dr. R. · | I

I McEver, University of Texas, San Antonio, TX, USA) fortyndet ! I

I i forholdet 1:320.000 i fortyndingspuffer. De fremkomne I

I faststof/væskefaseimmunreaktionsblandinger holdes ved stue- I

I temperatur i 60 minutter for at muliggøre dannelse af et I

I 35 første fastfase-bundet immunoreaktionsprodukt mellem det I

fastfasebundne polypeptid og iblandede antistoffer. De faste I

48 DK 175655 B1 og flydende faser skilles derefter, brøndene skylles to gange med vaskepuffer, og overskydende væske fjernes ved rystning.

50 μΐ af en opløsning indeholdende peberrod-peroxi-5 dase--mærket gede-anti-muse-IgG (Tago, Inc., Burlingame, CA, USA), fortyndet i forholdet 1:2000 i fortyndingspuffer, eller gede-anti-kanin-IgG (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA, USA), fortyndet i forholdet 1:2000 i fortyndingspuffer, blandes til hver brønd til dannelse af en anden 10 faststof/væskefaseimmunreaktionsblanding (mærkestof-immunreakt ionsblanding). Brøndene henstår i 50 minutter ved stuetemperatur for at muliggøre dannelse af et andet immunreaktionsprodukt mellem det mærkede antistof og hvilket som helst fastfasebundet antistof fra det første immunreaktions-15 produkt og skylles derefter to gange med vaskepuffer til isolering af de fastfase-bundne mærkestofholdige immunreaktionsprodukter. Overskydende væske fjernes derefter fra brøndene.

Derefter iblandes 50 μΐ chromogen substratopløsning 20 indeholdende 0,4 mg o-phenylendiamin pr. ml og 0,012 volumenprocent hydrogenperoxid i CP-puffer (243 ml 0,1 M citronsyre og 250 ml 0,2 M dibasisk natriumphosphat pr. liter vand) i hver brønd til dannelse af en farvefremkaldende reaktionsblanding. Efter henstand af den farvefremkaldende reaktions-25 blanding er holdt i 10 minutter ved ca. 20°C tilsættes til hver brønd 50 μΐ 2 N svovlsyre for at standse fremkaldelsesreaktionen, og de resulterende opløsninger analyseres for adsorbans ved lys med en bølgelængde på 490 nanometer under anvendelse af en model 310 ELISA-pladeaflæser (Bio-Tek In-30 struments, Winooski, VT, USA).

Resultaterne af denne undersøgelse, vist i tabel 3, viser, at monoklonalt antistof PMI-1 immunoreagerer med polypeptid pl29-145, men immunoreagerer ikke med polypeptid pl44-156. Eftersom PMI-1, som nedenfor omtalt, immunoreagerer 35 med en kryptisk determinant, dannet af (eksponeret på) hGPIIb, når GPIIb-IIIa binder fibrinogen, viser resultaterne

I DK 175655 B1 I

I 49 I

af denne undersøgelse, at pl29-145 har evnen til at imitere I

denne hGPIIb kryptiske determinant. I

I Tabel III I

I I

Polypeptid Monoklonalt antistof I

I Antigen PMI-1 Tab I

pl29-14 5 1,310±0,132 0,068 + 0,009 I

I pl44-156 0,069+0,005 0,061+0,005 I

10 BSA1 0,068±0,005 0,060+0,004 I

1 BSA = brønde, overtrukne med bovinserumalbumin, anvendt I

som negative kontroller. I

I 2 Gennemsnitlige optiske densitetsværdier + standardafvigel- I

I 15 se, der fås fra bestemmelser in triplo. I

I B. "Competition ELISA" I

Polypeptider og isoleret GPIIb-IIIa undersøges for I

I deres evne til at konkurrere som antigen med fastfase GPIIb- I

I 20 -Illa til immunreaktion med antistofmolekyler, indeholdt i I

H PMI-1 og Tab monoklonale antistofsammensætninger. I

I "Competition ELISA" udføres som beskrevet i eksempel I

I 7A med den undtagelse, at 1) i stedet for polypeptid anvendes I

I GPIIb-IIIa, isoleret som beskrevet i eksempel 1, ved en I

25 koncentration på 20 μg pr.ml i en overtræksopløsning til I

belægning af mikrotiterpladebrøndene, og 2) GPIIb-IIIa eller I

I polypeptidet blandes ved en koncentration på henholdsvis I

I 0,73 μΜ eller 25 μΜ, brøndene umiddelbart før, at antistof I

I tilblandes til dannelse af immunreaktionsblandingen. I

I 3 0 Resultaterne af denne undersøgelse, der er vist i I

tabel IV, viser, at mens pl29-145 og GPIIb-IIIa kompetitivt I

I inhiberer den immunologiske binding af PMI-1 antistofmole- I

kyler til fastfase GPIIb-IIIa, gør pl44-156 det ikke. Desuden I

I viser det sig, at ingen af polypeptiderne har en signifikant I

I 35 virkning på Tab antistofmolekylernes evne til at immunreagere I

I med GPIIb-IIIa. Disse resultater viser, at polypeptidet I

50 DK 175655 B1 pl29-145 har evnen til at imitere den sekundære struktur og antigene determinanter i hGPIIb-området indeholdende pl29-145 aminosyregruppesekvensen.

5 Tabel IV

Monoklonalt antistof

Kompetitor PMI-1 Tab pl29-145 0,06710,0021 1,002±0,026 10 pl44-156 0,814±0,012 1,117±0,024

Ingen 0,804+0,002 1,040+0,05 GPIIb-IIIa 0,433±0,013 0,134±0,010 1 Gennemsnitlige optiske densitetsværdier ± standardafvigel-15 se, der fås fra forsøg in triplo.

8. Fremstilling af anti-peptidantisera Anti-peptidantistoffer produceres ved immunisering af kaniner med peptiderne, fremstillet i eksempel 5. Kobling 20 af peptiderne med glutaraldehyd til dannelse af thyroglobulin som antigen bærer (Bovine Type I, Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO, USA) udføres som beskrevet af J. G. Dockray,

Regulatory Peptides, 1:169-186 (1980), hvortil der henvises.

Herefter udføres immunisering som beskrevet i eksempel 2 ; 25 med den undtagelse, at der anvendes 400 μς thyroglobulin--koblet peptid i den primære immunisering.

9. Inhibering af antistofbindina til blodpladefor-bundet GPIIb ved hjælp af polvpeptider 30 A. Blodpladetilberedning

Isolerede blodplader, fremstillet som i eksempel 1 A, suspenderes atter i 2 ml calciumfri Tyrodes puffer (0,13 M natriumchlorid, 0,0026 M kaliumchlorid, 0,002 M MgCl2-6H20, 5 mM Hepes, 0,012 M NaHC03, pH = 7,2) indeholdende 1 35 mg BSA pr. ml og 1 mg dextrose pr. ml. Blodpladesuspensionen påføres derefter på en Sepharose CL2B-søjle (i alt 40 ml

I DK 175655 B1 I

51 I

I lag-volumen, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) ækvilibre- I

ret med den samme Tyrode's-puffer. Blodpladerne udvindes I

Η I atter fra CL2B-søjlens tomme rumfang til et slutrumfang fra I

ca. 4 til ca. 5 ml, betegnes som vaskede blodplader og sus- I

5 pensioner af de resulterende vaskede blodplader, og tælles I

I med en Coulter Model Il-tæller (Coulter Electronics, Inc., I

I Hialeah, FL, USA). Hele blodpladetilberedningsfremgangsmåden I

gennemføres i plastbeholdere og udføres ved stuetemperatur. I

I 10 B. Blodplade- "competition11 -bestemmelse I

2 x 108 vaskede blodplader pr. ml, fremstillet i I

Tyrode's puffer som beskrevet i eksempel 9A, blandes med I

I j EDTA, således at der fås en slutkoncentration på 5 mM, og I

I henstår i 30 minutter ved 37°C for at muliggøre eksponering I

I 15 af PMI-l-bindingsepitopen. Blodpladerne blandes derefter I

H med polypeptidet pl29-145 ved de koncentrationer, der er

I angivet i fig. 2, og blandes derefter yderligere med 125I- I

I -mærket PMI-1, fremstillet i eksempel 6, for at tilvejebringe I

I 1 μΜ mærket antistof i den fremkomne immunreaktionsblanding. I

I 20 Denne blanding henstår i 30 minutter ved 22°C for at tillade, I

I at der dannes immunreaktionsprodukter. Derefter isoleres I

125I-PMI-l/blodpladeimmunreaktionsprodukteme fra det ubundne I

I 125I-PMI-1 ved centrifugering af hele den blanding, der I

I henstår, gennem 0,3 ml 20% saccharose i en Beckman Microfuge I

I 25 B (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA), hvorved man I

I får en blodpladepellet. Mængden af radioaktiv 125I-PMI-1, I

I forbundet med blodpladepellet1 en, bestemmes ved scintil- I

I lationsspektrometri. I

I Resultaterne af denne undersøgelse, vist i fig. 2, I

I 30 viser, at polypeptidet pl29-145 kompetitivt kan inhibere I

bindingen af PMI-l-antistofmolekyler til blodplademembran- I

I -forbundne GPIIb i fravær af divalente kationer. Fig. 2 I

I viser ligeledes, at den omtrentlige Kd af pl29-145/PMI-l- I

I -vekselvirkningen er 1,2 μΜ, fordi 50%'s inhiberingen opnås I

I 35 ved en polypeptidkoncentration på 1,6 μΜ, når antistofmole- I

I kylerne er til stede ved en koncentration på 1 μΜ.

* 52 DK 175655 B1 10. Ekspression af hGPIIb kryptisk determinant med fibrinogen-bundne blodplader

Blodpladerig plasma (PRP) fremstilles som i eksempel . la og deles i tre portioner. I en portion stimuleres blod- j 5 pladerne til at udtrykke funktionelt GPIIb-IIIa (fibrinogen- receptorer) ved tilblanding af adenosindiphosphat (ADP) til en slutkoncentration på 50 μΜ til fremstilling af ADP-stimu-lerede blodplader. I den anden portion stimuleres GPIIb--Illa ekspression ved tilblanding af adrenalin til en slut-10 koncentration på 50 μΜ. I begge tilfælde udtrykkes GPIIb--Illa fibrinogenreceptorerne på det stimulerede blodplade-bundne fibrinogen, til stede i plasmaet, til fremstilling af fibrinogen-bundne blodplader. Som en negativ kontrol får den tredje portion PRP ingen stimulus til fremstilling af I 15 ikke-stimulerede blodplader.

125I-mærkede PMI-1 Fab-fragmenter, fremstillet ved sædvanlige fremgangsmåder ud fra de 125I-mærkede antistoffer,, beskrevet i eksempel 6, tilblandes derefter til en slutkoncentration på 0,8 μΜ til hver af PRP-portionerne. De således I 20 dannede immunreaktionsblandinger henstår ved 37°C i 30 minut ter for at tillade dannelse af mærkede immunreaktionsprodukter, dvs. fibrinogen-bundne blodplade/125I-PMI-l-komplekser.

De mærkestof-holdige immunreaktionsprodukter skilles derefter fra ubundet ^2~>I-PMI-1 ved centrifugering af blodpladerne 25 gennem en saccharosepude som beskrevet i eksempel 9B.

På fig. 3 ses resultaterne af denne undersøgelse, og den viser, at PMI-l-antistof-molekylerne immunoreagerer med stimulerede, fibrinogenbundne blodplader, men i det væsentlige ikke immunoreagerer med ikke-stimulerede blodplader.

30 Det menes, at det 125I-PMI-1, der iagttages som "bundet" i den ikke-stimulerede PRP-portion, skyldes uspecifik binding ("klæbning") og/eller tilstedeværelsen af et naturligt forekommende baggrundsniveau af stimulerede, fibrinogenbundne blodplader eller blodplader, stimulerede og bundne som et 35 resultat af håndtering. Disse resultater viser derfor, at binding af fibrinogen, en arg-gly-asp (RGD) -aminosyregrup-

I DK 175655 B1 I

I I

pesekvensholdig ligand, med GPIIb-IIIa cytoadhæsinet resul- I

terer i ekspression af en ellers kryptisk antigendeterminant. I

Således kan man anvende PMI-1 antistofmolekyler og antistof- I

molekyler med lignende immunspecificitet til at bestemme I

I 5 tilstedeværelsen og mængden af stimulerede, fibrinogen-bundne I

blodplader i en vaskuløs væskeprøve. I

11. Inhiberinq af blodpiadeaqqreqerinq ved hjælp af I

H 1 oolvpeptider

I 10 200 μΐ af det blodpladerige plasma (PRP), fremstillet I

som beskrevet i eksempel 1A, blandes med 190 μΐ Tyrode1 s I

puffer indeholdende BSA og dextrose {hver med en koncentra- I

H tion på 1 mg/ml), og de forskellige mængder polypeptider I

I pl29-145 er pl44-156, som er vist i fig. 4. Der tilsættes

15 derefter 10 μΐ ADP (80 μΜ i Tyrode's puffer) til stimulering I

I af blodpladeaggregeringen. Denne blanding henstår ved 37°C, I

H medens blandingens ændringer i lystransmission overvåges I

I hen over tiden ved anvendelse af et Dual Sample Aggregation I

Meter (Model DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO). I

I 20 Aggregationsmeteret kalibreres ved anvendelse af en H

I ^ opløsning indeholdende 200 μΐ PRP og 200 μΐ Tyrode's puffer I

I til indstilling af en nedre basislinie for lystransmission H

ved 5% for kontrolaggregationer og ved 10% for aggregationer I

I i nærvær af polypeptider. Den øvre grænse for 100%'s lys- I

25 transmission indstilles ensartet ved anvendelse af en bian- H

I ding af 100 μΐ PRP og 300 μΐ Tyrode's puffer. I

12. Immunreaktion af GPIIb (lette kæder) ved anven- I

I delse af anti-peptidantisera I

30 Ca. 10^ blodplader, fremstillet som i eksempel ΙΑ, I

I suspenderes atter i 1 ml kold (dvs. 4°C) PBS og blandes med I

200 μg lactoperoxidase (Sigma) og 2 mCi bærerfri Na12^i (ig I

mCi/μgf Amersham, Arlington Heights, IL, USA), hvorved der I

dannes en blodplademærkningssuspension. Peroxidase blandes I

35 derefter med denne suspension ved to 5 μΐ store tilsætninger

fra en 0,06% stamopløsning med et interval på 5 minutter og I

54 DK 175655 B1 henstår i 4°C for at tillade, at der sker en mærkningsreaktion. Derefter standses reaktionen ved at tilblande 200 μg I tyrosin og vaskes fem gange ved gentagen centrifugering ved 1200 g i 15 minutter, fulgt af resuspension i kold PBS til 5 dannelse af en mærket blodpladesuspension. Efter det femte i. centrifugeringstrin lyseres de mærkede blodplader ved resus pension i 400 ml lysepuffer (0,5% Triton X-100 (volumen/vo-lumen) , 10 mM EDTA, 10 μg benzamidin pr. ml og 100 enheder Trasylol pr. ml, alt fra Sigma) til dannelse af et mærket 10 blodpladelysat.

En ml mærket blodpladelysat blandes med 15 μΐ varme--inaktiveret normalt kaninserum (NRS) og henstår i 30 minutter ved 22°C, fulgt af yderligere tilblanding af 100 μΐ af en 10 volumen/volumenprocents opløsning af Pansorbin (Behring i 15 Diagnostics, La Jolla, CA, USA), fremstillet i immunreaktionspuffer (IPB: 0,02 M Tris-Cl, pH = 7,4, 0,156 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM benzamidin-HCl, 10 μg sojatrypsininhibitor pr. ml, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 volumen/volu-, menprocent Triton X-100, 0,05 volumen/volumenprocent Tween ! 20 20, 0,02 vægt/volumenprocent NaN3, 5 enheder Trasylol pr.

ml, alt fra Sigma), centrifugering i 1 minut i en Beckman Microfuge B og isolering af den fremkomne supernatant til dannelse af et "cleared" lysat. Denne "clearing" procedure med tilblanding af NRS, henstand, tilblanding af Pansorbin 25 og centrifugering gentages to gange og følges derefter af den samme fremgangsmåde, idet man atter anvender. Pansorbin, men udelader NRS og henstandstrinene til dannelse af et tre-folds "cleared" lysat.

Det tre-folds "cleared" lysat blandes derefter med 30 250 μΐ IPB, 4 μΐ anti-polypeptid pl44-156 antiserum, frem stillet i eksempel 8, anti-GPIIb-IIIa, fremstillet i eksempel 2, eller NRS og bovinse rumalbumin (BSA) til en slutkoncentra-tion på 1% BSA i den fremkomne blanding. Denne fremkomne blanding henstår derefter i 12-18 timer ved 4°C, blandes 35 yderligere med 100 μΐ 10% Pansorbin og henstår derefter i 1 time ved 22°C. Derefter centrifugeres blandingen i en

DK 175655 B1 I

I 55 I

Microfuge Bil minut, og den fremkomne pellet isoleres. Den I

isolerede pellet vaskes derefter to gange i IPB, en gang i I

0,5 M LiCl og en gang atter i IPB, hvori vaskeprocedurerne I

omfatter resuspension i ca. 1 ml af den nævnte puffer, fulgt I

5 af centrifugering i 1 minut i Microfuge B og isolering af I

den fremkomne pellet. I

De vaskede pellets solubiliseres derefter til frigive- I

Η I Ise af hvilke som helst immunkomplekser, der er til stede, I

I ved opvarmning i 3 minutter ved 100°C i ca. 100 ml af den I

I

10 prøvepuffer, der er beskrevet af Laemmli, jfr. eksempelvis I

I Laemmli, U.K., Nature (London), 227:680-685 (1970). Solubi- I

liserede immunkomplekser centrifugeres derefter i 1 minut i I

en Microfuge B, og den fremkomne supernatant indeholdende I

immunfældede proteiner analyseres ved elektroforese i en I

15 15%'s polyacrylamidgelplade ved anvendelse af Laemmli-puf fere I

I indeholdende 5% 2-mercaptoethanol. Derefter tørres gelerne, I

H og de proteiner, der er indeholdt deri, visualiseres ved I

I autoradiografisk eksponering for Kodak X-Omat AR-film I

, (Eastman Kodak, Rochester, N.Y., USA). Molekylvægte for de I

I 20 fremkomne visualiserede proteiner bedømmes på basis af elek- I

I troforesemobiliteten i forhold til -^C-mærkede proteinstan- I

I darder varierende mellem 12.300 og 97.400 dalton i molekyl- I

I vægt (New England Nuclear, Boston, MA, USA). I

Mærkede lysater, analyserede på denne måde, giver et I

I 25 protein, visualiseret på de fremkomne geler, med en molekyl- I

I vægt på ca. 20 kdalton, som svarer til det lette GPIIb-- I

kædeprotein (lGPIIb), når man anvender anti-polypeptid pl44- : I

I 156 antiserum, som ikke blev detekteret substantielt, når I

I der anvendes anti-GPIIb-IIIa antiserum eller NRS. Derfor I

I 30 kan man anvende anti-polypeptid pl44-156 antiserum, og anti- I

I I

stofsammensætninger med lignende immunspecificitet, til '

I detektering af lGPIIb. I

I 35 I

56 DK 175655 B1 13. Ekspression af GPIIb-IIIa kryptiske antigene determinanter ved liaandbindina A. Bestemmelse af antistofbinding til blodplader, som udtrykker kryptiske antigene determinanter 5 ved blanding

Vaskede blodplader tilberedes til en koncentration på 1 x 108 pr. ml som beskrevet i eksempel 9A med den undtagelse, at den anvendte Tyrode's puffer først behandles . med "Chelex" 100 (200-400 mesh natrium-form, Bio-Rad Labora-10 tories, Richmond, CA, USA), henstand til kompleksdannelse med hvilke som helst di valente kationer, til stede i Tyrode's, puffer og filtrering til fjernelse af de komplekst bundne divalente kationer fra pufferen.

Den ovenfor fremstillede vaskede blodpladeholdige 1 15 opløsning deles i portioner, og blodpladerne i hver portion stimuleres derefter enten ved blanding med ADP til en slut-koncentration på 50 μΜ til dannelse af ADP-stimulerede blodplader, eller stimuleres ikke.

Monoklonale antistof sammensætninger indeholdende 20 enten 125I-mærkede hele antistofmolekyler eller 125I-mærkede Fab-fragmenter, fremstillet som beskrevet i eksempel 6, blandes først med forskellige polypeptider og enten divalente kationer eller EDTA. De 128I-mærkede antistof/peptidblandinger blandes derpå med enten stimulerede eller ustimulerede 25 blodpladeportioner således, at antistoffet eller Fab-fragmenterne er til stede ved en koncentration på ca. 0,8 μΜ.

De fremkomne immunreaktionsblandinger henstår derefter i 30 minutter ved 37°C for at tillade ekspression af den kryptiske antigene determinant og for at tillade dannelsen af 125i-30 -mærkede immunreaktionsprodukter, dvs. ligand-bundne blod-plade/125! -antistof eller 12^I-Fab-fragmentkompleker. De mærkestofholdige immunreaktionsprodukter skilles derefter fra ikke-bundet 125I-mærket antistof eller Fab-fragment ved centrifugering af blodpladeport ionen gennem en saccharosepude 35 som beskrevet i eksempel 9B.

I DK 175655 B1 I

I I

I tabel V vises resultaterne af bestemmelse af mærket I

H antistofbinding til blodplader i nærvær af ligander ved · I

anvendelse af monoklonalt antistof PMI-1. I

5 Tabel V ' I

Ligand-afhængig forøgelse i PMI-l IgG- eller Fab-binding til I

blodplader I

Antistof Øgning af bundet PMI-ll I

10 Art Ligand^· Ustimuleret Stimuleret I

I PMI-1 IgG KYGRGDS 6378±753 6000+714 I

I GRGDSP 5313±522 5561±158 I

I GRGESP 898+357 837+374 I

I H-12 IB3 3663+878 I

15 EDTA 6064+593 5674±512 I

I PMI-1 Fab KYGRGDS 7722±1189 5661+373 I

I GRGDSP 4437+852 5250+300 I

I GRGESP -279±281 147+165 I

I 20 H-12 IB 3014+430 I

I EDTA 5299±225 6505±560 I

58 DK 175655 B1 der er beskrevet i eksempel 13A, eller er kontrolpolypep-tide.t H12 med aminosyresekvensen HHLGGAKQAGDV, og er afledt af fibrinogengammakæden ved grupperne 399-410, ligeledes i en koncentration 1 mM, eller er 4,5 mM EDTA, 5 tilsat, i fravær af ligandpolypeptid som en kontrol. I alle tilfælde, hvor EDTA ikke er omfattet, er 2mM cal-ciumchlorid og 1 mM magnesiumchlorid inkluderet.

2 Ikke bestemt.

10 I tabel VI er vist resultaterne af undersøgelse af antistofbinding til blodplader i nærvær af ligander ved anvendelse af en monoklonal antistofsammensætning indeholdende hele antistofmolekyler eller Fab-fragmenter, produceret af hybridom PMI-2 (dvs. et PMI-2 monoklonalt antistof).

15

Tabel VI

Bundet PMI-2^

Ligand2 Divalent ion3 Ustimuleret Stimuleret 20 Ingen CaCl2 1220 2.480 RGDS CaCl2 2210 10.780 SDGR CaCl2 1960 2.360 GRGESP CaCl2 1560 4.680 i 400-411 CaCl2 1840 9.650 25 Fg CaCl2 2300 13.800

Ingen EDTA 8660 10.670 RGDS EDTA 8540 10.080 Mængden af bundet PMI-2 IgG bestemmes som beskrevet i 30 eksempel 13A og er udtrykt som molekyler bundet PMI-2 pr. blodplade under de angivne immunreaktionsbetingelser.

2 Den anvendte ligand ér en af de angivne polypeptider, ; fremstillet som beskrevet i eksempel 5 og tilsat til en slutkoncentration på 0,5 mM, eller er et polypeptid med 35 en sekvens svarende til sekvensen af fibrinogengammakæden fra gruppe nr. 400 til gruppe nr. 411 (400-411) ligeledes

DK 175655 B1 I

I 59 I

H tilsat i en koncentration på 0,5 mM, fibrinogenprotein I

{Fg), isoleret som beskrevet af Marguerie et 1., J. Biol. I

Chem., 254:5357-5363 (1979) og anvendt ved en slutkon- I

centration på 15 μΜ, eller der anvendes som kontrol ikke I

5 nogen tilsat ligand. I

3 Tilsat divalent kation er enten l mM calciumchlorid eller I

H 5 mM EDTA. I

Resultaterne, vist i tabellerne V og VI, påviser I

10 fibrinogen (Fg's), Fg-deriverede peptid, 400-411 og RGD-hol- I

dige peptiders evne til at binde GPIIb-IIIa og bevirke, at I

kryptisk antigene determinanter, genkendt af enten PMI-1 I

eller PMI-2, eksponeres under betingelser, hvor disse anti- I

gene determinanter normalt undertrykkes, nemlig i nærvær af I

15 fysiologiske koncentrationer af calciumchlorid. I

I Resultaterne viser ligeledes, at den kryptiske anti- I

H gene determinant, genkendt af PMI-2, kun kan induceres ved I

ligandbinding med stimulerede, men ikke ustimulerede blod- I

plader. I modsætning hertil kan den kryptiske antigene deter- I

20 minant, genkendt af PMI-1, induceres ved polypeptidligandbin- I

ding til både stimulerede og ustimulerede blodplader. I

Endvidere viser resultaterne også den strukturelle . I

I specificitet af liganden for GPIIb-IIIa. Et reverst peptid, i I

I SDGR, inducerer ikke den PMI-2-genkendte antigene deter- | I

25 minant, og en bevarende substitution, hvorved en glutaminsyre I

I (E) ombyttes med en normalt funden aspartinsyregruppe (D) I

I resulterer i et peptid, som er betydeligt mindre effektivt I

I som en kryptisk antigendeterminant-inducerende ligand. I

I Når koncentrationen af polypeptidliganden, RGDS, I

30 varieres i den ovennævnte betemmelse af antistofbinding til I

I blodplader, genereres en dosisresponskurve for ligandinduk- I

I tion af kryptisk antigene determinanter, til stede på enten I

I stimulerede eller ustimulerede blodplader. Resultater af en I

I dosisresponskurve er vist i fig. 5, idet man anvender enten I

35 PMI-1 eller PMI-2 IgG til detektering af den kryptiske anti- I

I gene determinant, og udtrykkes som en procent af LIBS-induk- I

60 DK 175655 B1 i ! tion. Mængden af IgG, bundet i nærvær af polypeptid, udtrykkes som en procent af den maksimale mængde IgG, bundet efter i fuldført ligandinduceret bindingssted (LIBS)-induktion, | [ hvor IgG-binding, målt som molekyler IgG pr. blodplade i i 5 nærvær af 4,5 mM EDTA, og i fravær af peptider, anses for at være 100% induktion, og IgG-binding, i nærvær af 2 mM calciumchlorid og 1 mM magnesiumchlorid og i fravær af peptider, anses for at være 0% induktion.

De resultater, der er vist i fig. 5, viser, at poly-10 peptidliganden inducerer to særskilte kryptiske antigene determinanter ved omtrent ens halv-maksimale ligandkoncentra- j tioner på ca. 2 mM. Desuden viser resultaterne, at medens den determinant, der genkendes af PMI-2, er inducerbar på stimulerede, men ikke på ustimulerede blodplader, er den 15 kryptiske antigene determinant, der genkendes af PMI-1, inducerbar på både stimulerede og ustimulerede blodplader ved anvendelse af RGDS-polypeptidet.

Det bør bemærkes, at skønt både PMI-1 og PMI-2 mono-klonale antistoffer er anti-LIBS-monoklonale antistoffer, kan 20 man skelne specificiteterne af disse to antistoffer. Således kan besættelse af en receptor med en ligand inducere mere et LIBS. Som et resultat deraf kan fremgangsmåderne ifølge opfindelsen anvendes til at fremstille mere end en særskilt monoklonal antistofart, som immunoreagerer med et celleover-25 fladereceptor-ligandkompleks.

B. Bestemmelse af antistofbinding til opløselig renset GPIIb-IIIa, som udtrykker kryptiske antigene determinanter 30 Evnen af forskellige polypeptidligander til at in ducere ekspression af en kryptisk antigendeterminant undersøges ved anvendelse af opløst isoleret GPIIb-IIIa.

Til dette udføres "competition" ELISA som beskrevet i eksempel 7B med de følgende undtagelser. Mikrotiterplademe 35 belægges ved anvendelse af en overtræksopløsning indeholdende GPIIb-IIIa, isoleret som beskrevet i eksempel 1, ved en i i Η

I DK 175655 B1 I

I

H koncentration på 10 μς pr. ml. Efter blokering behandles I

H alle de anvendte opløsninger med "Chelex" 100 før anvendelse I

som beskrevet for Tyrode 1 s puffer i eksempel 13A. Immunreak- I

tionsblandinger fremstilles indeholdende 1) 1,5 nanomolær I

5 PMI-1 IgG, fremstillet som beskrevet i eksempel 5, eller I

Tab hybridom, som beskrevet i eksempel 7A, 2) 2 mM calcium- I

chlorid, 3) GPIIb-IIIa, isoleret som beskrevet i eksempel I

1, og tilsat til en slutkoncentration på 40 ^g/ml til PMI- I

-1-bestemmelsen og 4 /xg/ml for Tab-bestemmelsen, og 4) poly- I

10 peptid ved en koncentration på 1 mM. Immunreaktionsbian- I

I dingerne henstår ved 22°C i 16-20 timer for at tillade dan- I

nelse af et første fastfase-bundet immunreaktionsprodukt I

I mellem det fastfase-bundne GPIIb-IIIa og tilblandede anti- I

I stoffer. I

I ' 15 Resultaterne af de ovennævnte undersøgelser er vist I

i, tabel Vil nedenfor. I

Tabel VII I

Ekspression af PMI-1 definerede kryptisk antigene determinan- I

I 20 ter. induceret ved ligand-binding til GPIIb-IIIa i opløsning I

% udtrykt1 I

62 DK 175655 B1 angivet i parenteserne, og resultaterne er gennemsnittet ± standardafvigelsen af disse målinger.

2 Den tilsatte ligand er et polypeptid, syntetiseret som beskrevet i eksempel 5, hvis sekvens er angivet ved den 5 viste enkeltbogstavskode. "Kontrol" betyder, at der ikke er tilsat noget polypeptid.

Resultaterne i tabel VII viser, at de RGD-holdige polypeptidligander inducerer ekspressionen af en kryptisk 10 antigendeterminant med GPIIb-IIIa på en måde, som er analog til den, der iagttages ved anvendelse af intakte blodplader (jfr. eksempelvis tabel VI) . Specificiteten af ligandinduceret ekspression verificeres ved anvendelse af polypep-tider med reverserede sekvenser (SDGR) eller bevarende sub-! 15 stitutioner (GRGESP), og verificeres yderligere ved ikke at iagttage nogen signifikant ligandpåvirkning ved Tab mono-klonal antistofbinding. Disse resultater viser, at ligandinduceret ekspression af den genkendte kryptiske antigene determinant med monoklonalt antistof PMI-1 er en iboende 20 egenskab for GPIIb-IIIa og ikke afhængig af GPIIb-IIIa--binding med blodpladerne.

i

Claims (22)

1. Polypeptidanalog til en kryptisk hGPIIb-deter- I minant, der ikke omfatter mere end 50 aminosyrerester og I indeholder en aminosyrerestsekvens, der svarer til sekvensen I H 5 med formlen: I I -PSPSPIHPAHHKRDRRQ-, I idet polypeptidanalogen er i stand til kompetitivt at in- I hibere (a) fibrinogenbundet blodpladeaggregering eller (b) I binding af PMI-l-antistofmolekyler (ATCC HB 9476) til hGPIIb, I 10 når hGPIIb er til stede som et GPIIb-IIIa/fibrinogen-kom- I pleks. I

2. Polypeptidanalog til en kryptisk hGPIIb-determinant I med en aminosyrerestsekvens med formlen: I I PSPSPIHPAHHKRDRRQ. I

3. Monoklonal antistofsammenætning indeholdende anti- I stofmolekyler, der immunoreagerer med hGPIIb og med et poly- I ' peptid med formlen: I PSPSPIHPAHHKRDRRQ. I

4. Antistofsammensætning i det væsentlige bestående I 20 af antistofmolekyler, som: I a) immunoreagerer med et polypeptid med formlen: I I PSPSPIHPAHHKRDRRQ, og I I b) i det væsentlige ikke immunoreagerer med et poly- I I peptid med formlen I

25 REQNSLDSWGPKV. I

5. Hybridom med betegnelsen ATCC HB 9476 (PMI-1), som I I producerer antistofmolekyler, som immunoreagerer med stimu- I I lerede, fibrinogenbundne blodplader. I

6. Monoklonal antistofsammensætning omfattende anti- I I 30 stof molekyler, produceret af hybridom ATCC HB 9476 (PMI- I I 1), som immunoreagerer med stimulerede, fibrinogen-bundne I blodplader. I

7. Hybridom med betegnelsen ATCC HB 9615 (PMI-2), I I som producerer antistofmolekyler, der immunoreagerer med I I 35 stimulerede, fibrinogenbundne blodplader. I

8. Monoklonal antistofsammensætning omfattende anti- I 9 DK 175655 B1 64 stofmolekyler, produceret af hybridom ATCC HB 9615 (PMI-2), som immunoreagerer med stimulerede, fibrinogen-bundne blodplader.

9. Diagnostisk system i form af et sæt til analyse for 5 tilstedeværelsen af et receptor-ligand-kompleks i en vas- kulær væskeprøve, idet komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, som er specifikt bundet, hvilket system omfatter en pakning indeholdende en monoklonal antistofsammensætning indeholdende antistofmolekyler, som 10 immunoreagerer med receptor-ligand-komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når nogen af dem er i en ubunden form, i en mængde, der er tilstrækkelig til at udføre mindst én bestemmelse.

10. Diagnostisk system ifølge krav 9, i hvilket anti-15 stofmolekylerne er mærket med et radionukleid.

11. Diagnostisk system i form af et sæt til analyse for tilstedeværelsen af et cellereceptor-ligand-kompleks in vivo, idet komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, som er specifikt bundet, hvilket system omfat- 20 ter en pakning indeholdende en monoklonalt antistofsammensætning indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med receptor-ligand-komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når en af dem foreligger i en ubunden form, idet antistofmolekylerne er 25 bundet til en in vivo-indikator, i en mængde, der er tilstrækkelig til at gennemføre mindst en bestemmelse.

12. Diagnostisk system i form af et sæt til analyse af en vaskulær væskeprøve med hensyn til tilstedeværelsen af blodplader, der udtrykker et GPIIb-IIIa-ligand-kompleks, 30 hvilket system omfatter en pakning indeholdende anti-GPIIb-Illa i en mængde, der er tilstrækkelig til at udføre mindst én bestemmelse, idet anti-GPIIb-IIIa-antistofmolekylerne er produceret af hybridom HB 9476 (PMI-1) eller HB 9615 (PMI-2) .

13. Diagnostisk system ifølge krav 12, i hvilket 35 antistofmolekylerne er mærket med et radionukleid og er til stede som en monoklonal antistofsammensætning. I DK 175655 B1 I i I

14. Diagnosatisk system i form af et sæt til analyse I for tilstedeværelsen af en thrombe in vivo, omfattende en I pakning indeholdende, i en mængde tilstrækkelig til udførelse I af mindst én analyse, en monoklonal antistofsammensætning I 5 indeholdende anti-GPIIb-IIIa-antistofmolekyler produceret I I af hybridom HB 9476 (PMI-1) eller HB 9615 (PMI-2) , hvor I antistofmolekylerne er forbundet til en in vivo-indikator. I

15. Fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt I antistof, som immunoreagerer med et ligandinduceret bin- I I 10 dingssted, udtrykt ved et receptor-ligand-kompleks, hvori I komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, som er specifikt bundet, hvilken fremgangsmåde omfatter: I I a) immunisering af et pattedyr.med komplekset, I b) fjernelse af antistofproducerende celler fra dette I I 15 immuniserede pattedyr og fremstilling af en suspension af I I cellerne, I c) behandling af cellerne med et transformerende I I middel til fremstilling af transformerede antistof-produce- I rende celler, I I 2 0 d) kloning ved grænsefortynding i et vævskulturmedium, I som ikke støtter ikke-transformerede celler, af de celler, I som er behandlet i trin c) , til fremstilling af klonede I I transformanter, I e) bedømmelse af vævskulturmediet for de klonede I I 25 transformanter med hensyn til tilstedeværelsen af udsondrede I I antistofmolekyler, som immunoreagerer med receptor-ligand- I komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverflade- I I receptoren eller liganden, når hver af dem foreligger i I I ubunden form, j I I 30 f) selektering og dyrkning i et vævskulturmedium af - i I I en klonet transformant, som producerer disse udsondrede ! I I antistofmolekyler, og I g) høst af de udsondrede antistofmolekyler fra dyrk- I ningsmediet for den selekterede og klonede transformant. I

16. Fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt I antistof, som immunoreagerer med et ligandinduceret bin- I 66 DK 175655 B1 dingssted udtrykt ved et receptor-ligand-kompleks, hvor komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, der er specifikt bundet, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) immunisering af en mus med komplekset, 5 b) fjernelse af milten fra musen og fremstilling af en suspension af miltcellerne, c) fusionering af miltcellerne med musemyelomceller i nærværelse af en fusionspromotor til fremstilling af antistof sekreterende hybridomer, 10 d) fortynding og dyrkning af de fusionerede celler i særskilte brønde i et medium, som ikke understøtter ikke-fusionerede myelomaceller, e) bedømmelse af supernatanten i hver brønd indeholdende et hybridom for tilstedeværelsen af sekreterende anti- 15 stofmolekyler, som immunoreagerer med receptor-ligand-komplekset, men ikke immunoreagerer med celleroverfladereceptorer eller liganden, når denne er i ubundet form, f) udvælgelse og kloning af et hybridom, der sekreterer antistofmolekylerne, og 20 g) indhøstning af antistofmolekylerne fra supernatan ten over klonerne.

17. Fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistof, som immunoreagerer med et ligandinduceret bindingssted udtrykt ved et receptor-ligand-kompleks, hvor 25 komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, der er specifikt bundet, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) immunisering af en mus med komplekset, . (b) fjernelse af milten fra musen og fremstilling af en suspension af miltcellerne, 30 (c) fusionering af miltcellerne med musemyelomceller i nærværelse af en fusionspromotor til fremstilling af antistof sekreterende hybridomer, (d) fortynding og dyrkning af de fusionerede celler i særskilte brønde i et medium, som ikke understøtter ikke- 35 fusionerede myelomaceller, (e) bedømmelse af supernatanten i hver brønd indehol- I DK 175655 B1 I I I dende et hybridom for tilstedeværelsen af sekreterende anti- I stofmolekyler, som immunoreagerer med receptor-ligand-kom- I plekset, men ikke immunoreagerer med celleroverfladerecep- I torer eller liganden, når denne er i ubundet form, I 5 (f) udvælgelse og kloning af et hybridom, der sekrete- I rer antistofmolekylerne, I (g) intraperitoneal overførsel af klonerne til en I mus og I (h) indhøstning af ascites eller serum fra musen, I 10 når ascites eller serum indeholder det ønskede antistof. I

18. Fremgangsmåde til in vivo detektering af tiiste- I deværelsen af et receptor-ligand-kompleks, idet komplekset I indeholder en celleoverfladereceptor og en ligand, som er I specifikt bundet, hvilken fremgangsmåde omfatter trinene: I 15 a) intravenøs indgift til et menneske af en virksom mængde I H af en monoklonal antistofsammensætning omfattende et fysio- I logisk acceptabelt fortyndingsmiddel og antistofmolekyler, I H som immunoreagerer med receptor-ligand-komplekset, men som I I ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller lig- I 20 anden, når begge dele foreligger i ubunden form, idet anti- I I stofmolekylerne bindes til et in vivo indikatormiddel, I I b) opretholdelse af den, der har fået indgiften, i en på I I forhånd bestemt tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, I I at antistofmolekylerne kan immunoreagere med receptor-ligand- I 25 komplekset in vivo og danne et immunoreaktionsprodukt, og I I c) analyse med hensyn til tilstedeværelsen af hvilket som I I helst immunoreaktionsprodukt dannet i trin b) og derved I tilstedeværelsen af komplekset i forsøgspersonen. I

19. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen I I 30 af et receptor-ligandkompleks i en vaskulær væskeprøve, I I hvori komplekset indeholder en celleoverfladereceptor og en I I ligand, som er specifikt bundet, kendetegnet I I ved, at den omfatter trinene: I a) dannelse af en immunreaktionsblanding ved at blande I I 35 en vaskulær væskeprøve med en monoklonal antistofsammensæt- ' I I ning indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med I 68 DK 175655 B1 receptor-1igandkomplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når hver af dem foreligger i ubunden form, b) henstand af blandingen i en tidsperiode, der er 5 tilstrækkelig lang til, at antistofferne immunoreagerer med hvilket som helst receptor-ligandkompleks, der er til stede i prøven, og danner et immunreaktionsprodukt, og c) detektering af tilstedeværelsen af hvilket som helst immunreaktionsprodukt dannet i trin b) og derved til- 10 stedeværelsen af komplekset i prøven.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at celleoverfladereceptoren i komplekset er et ' -cytoadhæsin.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kende teg-15 net ved, at cytoadhæsinet er blodplade-glycoproteinet GPIIb-IIIa.

22. Fremgangsmåde til analyse af en blodpladeholdig vaskulær væskeanalyseprøve for tilstedeværelsen af blodplader udtrykkende et GPIIb-IIIa-ligand-kompleks, hvilken fremgangs- 20 måde omfatter trinene: a) dannelse af en immunoreaktionsbiånding ved at blande den vaskulære væskeanalyseprøve med en effektiv mængde af en monoklonal antistofsammensætning indeholdende anti-GPIIb--Illa-antistof-molekyler, produceret af hybridom HB 9476 25 (PMI-1) eller HB 9615 (PMI-2), b) henstand af blandingen i en tidsperiode, der er tilstrækkelig lang til, at antistofferne kan immunoreagere med hvilke som helst fibrinogenbundne blodplader, der er til stede i analyseprøven, og danne et immunoreaktionsprodukt, og 30 c) detektering af tilstedeværelsen af hvilket som helst immunoreaktionsprodukt dannet i trin b).