JP2001190287A - 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体を
提供する。 【解決手段】 血小板関連ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａがフィ
ブリノーゲンに結合する際の抗原決定基を形成するＧＰ
ＩＩｂ重鎖（Ｈ鎖）（ｈＧＰＩＩｂ）の一部の構造遺伝
子をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ及び組換えＤＮ
Ａ分子、並びに、ｈＧＰＩＩｂの潜在的抗原決定基であ
るポリペプチドアナログ及びこのポリペプチドと免疫反
応する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血小板関連ＧＰＩ
Ｉｂ−ＩＩＩａがフィブリノーゲンに結合する際の抗原
決定基を形成するＧＰＩＩｂ重鎖（Ｈ鎖）（ｈＧＰＩＩ
ｂ）の一部の構造遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む
ＤＮＡ及び組換えＤＮＡ分子に関するものである。ま
た、本発明は、ｈＧＰＩＩｂの潜在的抗原決定基である
ポリペプチドアナログ及びこのポリペプチドと免疫反応
する抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】一般的
に、細胞粘着（adhesion）は、細胞表面レセプターによ
る特異的粘着タンパク質の認識と関係している。本発明
に特に興味のもたれる一群の細胞表面レセプターは、イ
ンテグリン（integrin）である。ハインズ（Hynes)（セ
ル（Cell）、４８、５４９−５５４（１９８７））によ
れば、インテグリンは、細胞外マトリクス糖タンパク
質、補体及び他の細胞と相互作用を起こす機能的及び構
造的に関連した一群のレセプターである。インテグリン
は、発生学的発生、止血、血栓症、傷害治癒、免疫及び
非免疫防御メカニズム、及び腫瘍遺伝子トランスホーメ
ーションを含む、多くの生理学的に重要なプロセスにお
ける、細胞−マトリクス及び細胞−細胞粘着に関与して
いる。２つのヒトの遺伝病、グラスマン・トロンバスセ
ニア及び白血球粘着欠損症は、インテグリン類のいくつ
かを冒している。

【０００３】構造的に、インテグリンは、アルファ及び
ベータサブユニットが非共有的に会合したヘテロ二量体
的複合体である。インテグリン類の中には、同様のベー
タサブユニットが存在することによって、関連づけられ
るグループがあり、また、各グループの中のメンバー
は、独特のアルファサブユニットによって区別される。
例えば、ＧＰIIｂ− IIIａは、アルファ及びベータサブ
ユニットからなる非共有性、Ｃａ⁺⁺依存性のヘテロ二量
体複合体である。ジェニングス（Jennings）等、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.）２５７、１０４５８−１０４６６（１９８
２）。アルファ・サブユニット、ＧＰIIｂは約１２０キ
ロダルトン（KDa)の相対分子量を有する重鎖（ｈＧＰII
ｂ）及びジスルフィド結合でこれと結合している約２０
KDa の軽鎖（ｌＧＰIIｂ）からなる。ベータサブユニッ
ト、ＧＰ IIIａは約１００KDa の一本鎖ポリペプチドで
ある。フィリップス（Phillips）等、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２
５２、２１２１−２１２６（１９７７）。免疫学的に、
ＧＰIIｂ− IIIａと関連する細胞表面分子は、多くの細
胞型で同定されてきている。チアガラジャン（Thagaraj
an）等（ジャーナル・オブ・クリニカル、インベスチゲ
ーション（J. Chem. Invest.）７５、８９６−９０１
（１９８５）、プロー（Plow）等、プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc. Natl. Acsd. Sei.）ＵＳＡ、８３、６００２−６０
０６（１９８６）及びフィッツジエラルド（Fitzgeral
d）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）２６０、１０８９３−１０８９
６（１９８５）参照。

【０００４】ＧＰIIｂ− IIIａは、フィブリノーゲン
〔ベネット（Bennett)等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat
l. Acad. Sei.）ＵＳＡ、８０、２４１７−２４２１
（１９８３）〕、フィブロネクチン〔ギンスベルグ（Gi
nsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニカル、インベス
チゲーション（J. Chem. Invest.）７１、６１９−６２
４（１９８３）〕及びフォン・ウィルブランド因子〔ル
ゲリ（Ruggeri)等、プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Aca
d. Sei.）ＵＳＡ、７９、６０３８−６０４１（１９８
２）〕などのＲＧＤ含有タンパク質との相互作用を通し
て血小板機能に寄与しており、従って、一般的血小板粘
着タンパク質レセプターの一成分である（ピテラ（Pyte
ra）等、サイエンス（Science)２３１、１５５９−１５
６２（１９８６）及びプロー（Plow）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.）２５９、５３８８−５３９１（１９８４）。

【０００５】最近、ＧＰIIｂ− IIIａは、同様のベータ
サブユニット及びトリペプチドアミノ酸残基配列Ａrg−
Ｇly−Ａsp（一文字記号を用いるとＲＧＤ）を認識する
機能的性質をもつ、いくつかの粘着レセプターのうちの
１つであるという証拠が示された。ピテラ（Pytera）
等、サイエンス（Science)２３１、１５５９−１５６２
（１９８６）及びルオスラティ（Ruoslahti)等、セル
（Cell）、４４、５１７−５１８（１９８６）。ＧＰII
ｂ− IIIａに加えて、関連するレセプターのグループに
は、オステオザルコーマから単離したヒドロネクチンレ
セプター（ＶｎＲ）及びフィブロネクチンレセプター
（ＦｎＲ）が含まれる（ピテラ（Pytera）等、セル（Ce
ll）、４０、１９１−１９８（１９８５）、ピテラ（Py
tera）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）
ＵＳＡ、８２、５７６６−５７７０（１９８５）及びサ
ンチェス・マドリッド（Sanches-Madrid）等、ジャーナ
ル・オブ・エススペリメンタル・メディシン（J. Exp.
Med.）１５８、１７８５−１８０３（１９８３））。

【０００６】これらタンパク質の同様の機能的、構造的
及び抗原的性質は、ＧＰIIｂ− IIIａ及びＶｎＲが、
“サイトアドヘシン”という名前が提唱された粘着レセ
プターグループのメンバーであることを示している。プ
ロー（Plow）等、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.S
ei.）ＵＳＡ、８２、６００２−６００６（１９８
６）。サイトアドヘシングループでは、独特のアルファ
サブユニットが共通もしくは非常に類似しているベータ
サブユニットと結合しており、機能的に区別しうるレセ
プターとなる。ギンスバーグ（Ginsbsrg）等、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol. Ch
em.）２６２、５４３７−５４４０（１９８７）。ヘテ
ロ二量体粘着レセプターの少なくとも２つの他のグルー
プが同定されており、それらの場合、１つの共通ベータ
サブユニットは、独特のアルファ・サブユニットのいく
つかと結合している。１つのグループは、白血球で見ら
れるもので、白血球粘着群と呼ばれ、ＬＦＡ−１、Ｍac
−１、Ｐ１５０、９５が含まれる。サンチェス・マドリ
ッド（Sanchez-Madrid）等、ジャーナル・オブ・エスス
ペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）１５８、１
７８５−１８０３（１９８３）及びスプリンガー（Spri
nger）等、（シバ・ファウンド・シンポジウム）（Cib
a, Found, Symp.）１１８、１０２−１２６（１９８
６）。その他のものはより広く分布しており、ＶＬＡ族
と呼ばれている（ヘムラー（Hemler）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.）２６２、３３００−３３０９（１９８７））。チキ
ンのＶＬＡ族のベータサブユニット〔ヘムラー（Hemle
r）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）２６２、３３００−３３０９
（１９８７）がクローン化され、配列決定され、“イン
テグリン”と命名された（タムクン（Tamkun）等、セル
（Cell）、４６、２７１−２８２（１９８６）〕。チキ
ン・インテグリンの配列はＧＰ IIIａのもの〔フィッツ
ジエラルド（Fitzgerald）等、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、
３９３６−３９３９（１９８７）〕及び白血球粘着族の
ベータサブユニットのベータサブユニットのもの〔キシ
モト（Kishimoto)等、セル（Cell）４８、６８１−６９
０（１９８７）〕と同様である。さらに、いくつかのア
ルファサブユニットの部分配列も類似性を示している。
ギンスベーグ（ginsberg）等、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６２、
５４３７−５４４０（１９８７）；スズキ（Suzuki）
等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sei.）ＵＳ
Ａ、８２、８６１４−８６９８（１９８６）及びシャロ
（Charo)等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Se
i.）ＵＳＡ、８３、８３５１−８３５６（１９８６）。

【０００７】粘着レセプターとしてのそれらの機能に基
本的なＧＰIIｂ− IIIａ又はその他のサイトアドヘシン
上の部位は、現在でも不明である。いくつかの観察は、
ＧＰIIｂ− IIIａ上の機能的に重要な部位は、モノクロ
ーナル抗体ＰＭＩ−１で決定されるエピトープ付近にあ
ることを示している。この抗体は、ＧＰIIｂの重鎖に結
合し〔シャドル（Shadle）等、ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオロジー（J. Cell. Biol.）９９、２０５６
−２０６０（１９８４）、いくつかの独特な機能活性に
関連するＧＰIIｂの領域を限定する。第１に、ＰＭＩ−
１は、洗浄した血小板のコラーゲンへの粘着を阻害す
る。シャドル（Shadle）等、ジャーナル・オブ・セルラ
ー・バイオロジー（J. Cell. Biol.）９９、２０５６−
２０６０（１９８４）。第２に、本領域の表面での配向
は、カルシウム又はマグネシウムのミルモル濃度（mM）
がＰＭＩ−１エピトープの発現を抑制することから、二
価カチオンにより制御される。ギンスバーグ（Ginsber
g）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲ
ーション（J. Clin. Invest.）７８、１１０３−１１１
１（１９８６）。第３に、この部位の構造の異常な二価
カチオン制御は、機能的にトロンバスセニック状態と関
連している。ギンスバーグ（Ginsberg）等、ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（J. Clin.
Invest.）７８、１１０３−１１１１（１９８６）。第
４に、１００ミリモル濃度までのアデノシン二リン酸
（ＡＤＰ）又はエピネフリン、ミリリットル当り１ユニ
ットのトロンビン、又は、ミリリットル当り５０マイク
ログラムのウシ皮膚コラーゲンによる血小板の刺激は、
実質的に、血小板に対するＰＭＩ−１抗体の結合を、バ
ックグランド以上に増加させることはなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】現在、特異的にリガンド
と結合した細胞表面レセプターは、リガンド誘導抗体結
合部位（ＬＩＢＳ）の存在により、非占有レセプターと
区別できることが分っている。すなわち、細胞表面レセ
プターが特異的にリガンドと結合したときに発現する
が、非占有レセプター又は非結合領域リガンドのいずれ
かによっても発現されない一群の抗原決定基が発見され
ている。従って、ある態様において、本発明は、特異的
に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レ
セプター−リガンド複合体によって発現された、リガン
ド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を作
る方法を考案しており、この方法には、 (a) ホ乳類をこの複合体で免疫化すること； (b) 免疫化したホ乳類から抗体産生細胞を取り出し、
この細胞のサスペンジョンを作ること； (c) この細胞をトランスホーミング剤で処理して、ト
ランスホームした抗体産生細胞を生成すること； (d) 非トランスホーメーション細胞は生存できない組
織培養培地で制限希釈することにより、ステップ（ｃ）
で処理した細胞をクローニングし、クローン化トランス
ホーマントを作ること； (e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、
いずれも非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドと
は免疫反応しない分泌抗体分子の存否について、該クロ
ーン化トランスホーマントの組織培養培地の評価を行う
こと； (f) 分泌抗体分子を生産するクローン化トランスホー
マントを選択し、組織培養培地中で生育させること；及
び (g) 選択され、かつクローン化されたトランスホーマ
ントの培養培地から、分泌抗体分子を収穫すること、が
含まれる。

【０００９】別の態様において、本発明は、特異的に結
合した細胞表面レセプター及びリガンドを含むレセプタ
ー−リガンド複合体によって発現される、リガンド誘導
結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する
方法を考案しており、その方法には、 (a) マウスを該複合体で免疫化すること； (b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサス
ペンジョンを作ること； (c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウス
のミエローマ細胞と融合し、抗体分泌ハイブリドーマを
生成すること； (d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞を生育
させない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること； (e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、
非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免
疫反応しない、分泌抗体分子の存在について、ハイブリ
ドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること； (f) 抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、こ
れをクローニングすること；及び (g) 上記クローンの上清から、抗体分子を収穫するこ
とが含まれる。

【００１０】さらに、特異的に結合した表面レセプター
及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体によ
り発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモ
ノクローナル抗体を生成する方法を考案しており、その
方法には、 (a) マウスを該複合体で免疫化すること； (b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサス
ペンジョンを作ること； (c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウス
のミエローマ細胞と融合し、抗体分布ハイブリドーマを
生産すること； (d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞は生育
できない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること； (e) 細胞表面レセプター−リガンド複合体とは免疫反
応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガンド
とは免疫反応しない分泌抗体分子の存在について、ハイ
ブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること； (f) この抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択
し、クローニングすること； (g) このクローンを、マウス腹腔内に移すこと、そし
て、 (h) 望ましい抗体を含む、マウスの腹水又は血清を収
穫すること；が含まれる。

【００１１】また、特異的に結合した細胞表面レセプタ
ー及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体の
存在を、インビボで検出する方法を考案しており、その
方法には、 (a) 生理学的に許容される希釈剤及びレセプター−リ
ガンド複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表面レ
セプター又はリガンドとは免疫反応しない、インビボの
指示手段を結合した抗体分子を含む、効果量のモノクロ
ーナル抗体組成物を被検者に静脈注射する、 (b) インビボで抗体分子がレセプター−リガンド複合
体と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な、
予め決めた時間、その被投与者を維持する、 (c) ステップ（ｂ）で形成して免疫反応産物の存在及
びそれによる被検者中の複合体の存在を検定する、以上
のステップが含まれている。

【００１２】また、さらに、血液サンプル中の、特異的
に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レ
セプター−リガンド複合体の存在を検定する方法を考案
しており、その方法には (a) 血液サンプルを、該レセプター−リガンド複合体
とは免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセ
プター又はリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含む
モノクローナル抗体組成物と混合することにより免疫反
応混合物を作る； ｂ） 抗体分子が、サンプル中に存在するレセプター−
リガンド複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を形成
するのに十分な時間、この混合物を維持する； ｃ） ステップ（ｂ）で形成した免疫反応産物の存在を
検出し、かつそれによりサンプル中の複合体の存在を検
出する、以上のステップが含まれる。

【００１３】なお、ここでは、ＧＰIIｂ− IIIａ−リガ
ンド複合体を発現する血小板の存在について、血小板を
含む血液サンプルを検定する方法も開示され、その方法
には、 (a) 血液サンプルを、ハイブリドーマＰＭＩ−１又は
ＰＭＩ−２によって生産されたＧＰIIｂ− IIIａ抗体分
子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物と混合す
ることにより、免疫反応混合物を作る； (b) 該抗体がサンプル中に存在するフィブリノーゲン
結合血小板と免疫反応し、免疫反応産物を生成するのに
十分な時間、この混合物を維持する； (c) ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を
検出する、以上のステップが含まれる。

【００１４】また、インビボで血栓の存在を検定する、 (a) 生理学的に許容される希釈剤及びハイブリドーマ
ＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産される、インビボ指
示手段と結合した抗ＧＰIIｂ− IIIａ抗体分子を含む、
効果量のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈注射
する； (b) 抗体分子がインビボでフィブリノーゲン結合血小
板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物が生成されるのに
十分な、予め決められた時間、被投与者を維持する； (c) ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を
検出する、以上（ａ）〜（ｃ）のステップを含む方法が
開示されている。特異的に結合した細胞表面レセプター
及びリガンドを含む血液中のレセプター−リガンド複合
体の存在を検定する、キット型の診断システムも開示さ
れており、そのシステムには、(a) 少なくとも１回の
検定を行なうのに十分な量の、該レセプター−リガンド
複合体と免疫反応するが、非結合形の細胞表面レセプタ
ーもしくはリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含む
モノクローナル抗体組成物を含有するパッケージ、が含
まれている。

【００１５】特異的に結合した細胞表面レセプター及び
リガンドを含む細胞レセプター−リガンド複合体の存在
を、インビボで検出するための、キット型の診断システ
ムが開示されており、そのシステムには、(a) 少なく
とも１回の検定を行なうのに十分な量の、該レセプター
−リガンド複合体とは免疫反応するが、非結合型の細胞
表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない、
インビボ指示手段と結合した抗体を含むモノクローナル
抗体組成物を含むパッケージ、が含まれている。ＧＰII
ｂ− IIIａ−リガンド複合体を発現する血小板の存在に
ついて、血液サンプルを検定するための、キット型の診
断システムが開示されており、そのシステムには、(a)
少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、ハイ
ブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産された抗
ＧＰIIｂ− IIIａの抗体分子を含むパッケージ、が含ま
れている。

【００１６】インビボで血栓の存在を検定するための、
キット型の診断システムも開示されており、それには、
(a) 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、
ハイブリドーマＰＭＩ−１又はＰＭＩ−２から生産され
る、インビボの指示手段と結合した、抗ＧＰIIｂ− III
ａ抗体分子を含むパッケージが含まれている。さらに、
現在、血小板ＧＰIIｂ− IIIａ−リガンド複合体は、ハ
イブリドーマＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２によって生産さ
れる抗体分子によって認識される、２個の潜在的抗原決
定基型ＬＩＢＳを発現することが分っている。さらに、
モノクローナル抗体ＰＭＩ−１により認識される潜在的
決定基を真似ることができるポリペプチドがインビボ
で、潜在的決定基を形成しているＧＰIIｂタンパク質の
一部をコードするＤＮＡ配列から誘導されている。

【００１７】従って、本発明は、図１に示される、残基
約５０番から約１４０番のアミノ酸残基配列を有するＧ
ＰIIｂタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義
している配列を含むせいぜい約１２０００個のヌクレオ
チド塩基対を含むＤＮＡ断片を考案している。別の態様
においては、図１における残基約５０番から約１４５番
までの、アミノ酸残基配列を有する、ＧＰIIｂタンパク
質の一部をコードする構造遺伝子を定義しているＤＮＡ
断片と機能的に結合したベクターを含む組換えＤＮＡ分
子も開示されている。さらに、せいぜい約５０アミノ酸
残基を含み、かつ、式 −ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ− で表わされるアミノ酸残基配列を含む、ｈＧＰIIｂ潜在
的決定基ポリペプチドアナログも開示されている。ま
た、フィブリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗体分
子を生産する、ＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２と命名された
ハイブリドーマも考案している。ファブリノーゲン結合
血小板と免疫反応する、ハイブリドーマＰＭＩ−１によ
り生産される抗体分子を含む、モノクローナル抗体組成
物を考案している。

【００１８】

【発明の実施の形態】Ａ．定義 アミノ酸：ここで同定されているアミノ酸残基は、天然
のＬ型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従が
い（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）２４３、３５５７−５９（１９６
９）、アミノ酸残基の略号は、下記の対応表に示した。 対応表 記号 アミノ酸 一文字 三文字 Ｙ Ｔyr チロシン Ｇ Ｇly グリシン Ｆ Ｐhe フェニルアラニン Ｍ Ｍet メチオニン Ａ Ａla アラニン Ｓ Ｓer セリン Ｉ Ｉle イソロイシン Ｌ Ｌeu ロイシン Ｔ Ｔhr スレオニン Ｖ Ｖal バリン Ｐ Ｐro プロリン Ｋ Ｌys リジン Ｈ Ｈis ヒスチジン Ｑ Ｇln グルタミン Ｅ Ｇlu グルタミン酸 Ｗ Ｔrp トリプトファン Ｒ Ａrg アルギニン Ｄ Ａsp アスパラギン酸 Ｎ Ａsn アスパラギン Ｃ Ｃys システィン ここでは、全てのアミノ酸残基配列が左から右にアミノ
末端からカルボキシ末端の、伝統的に用いられている方
向の式で表わされていることに注意しなければならな
い。さらに、アミノ酸残基配列の始めと終りのダッシュ
は、ポリペプチド鎖中の１つ以上で全部で約５０残基ま
での配列につながる結合を示していることにも注意しな
ければならない。

【００１９】ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド
及びペプチドはここでは同時に用いられている語で、隣
り合うα−アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結
合により互いに連結しているせいぜい約５０個の連続す
るアミノ酸残基を示している。 タンパク質；ここで用いられているタンパク質という語
は、ポリペプチドのように互いに連結している連続した
５０個以上のアミノ酸残基を示している。ヌクレオシド
及びヌクレオチド；糖部分（ペントース）、リン酸、及
び窒素ヘテロ環塩基からなる、ＤＮＡ及びＲＮＡの単量
体ユニット。この塩基は、グリコシド炭素（ペントース
の１′炭素）を介して糖部分に結合しており、この塩基
と糖との組合せてヌクレオシドという。このヌクレオシ
ドが、そのペントースの３′位又は５′位に結合したリ
ン酸基を含むとき、これをヌクレオチドと呼ぶ。

【００２０】塩基対（bp）；二本鎖ＤＮＡ分子中のアデ
ニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグ
アニン（Ｇ）の水素結合の組合せ。 レセプター；ここで用いているレセプター及びレセプタ
ータンパク質とは他の分子に特異的に結合する生物学的
に活性なタンパク質性分子を示している。リガンド及び
同種リガンド；リガンドとは、特別なレセプタータンパ
ク質と特異的相互作用によって結合する構造部分を含む
分子を意味する。 リガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）；ＬＩＢＳとは、細
胞表面レセプター−リガンド複合体によって発現される
が、非占有レセプター又は未結合リガンドによっては発
現されないネオ抗原決定基のことである。ＬＩＢＳは、
“構造的”なものと“配列的”なものがある。ＬＩＢＳ
は、リガンド結合により誘導されるレセプターの特異的
修正の結果、すなわち、“潜在的抗原決定基”であり、
またこれは、レセプター−リガンド接触部位でのレセプ
ターとリガンドアミノ酸残基の組合せによって形成され
る。

【００２１】潜在的抗原決定基；同種（特異的）リガン
ドとの結合により、レセプタータンパク質の構造又は膜
表面配位方向の変化によって生じたネオ抗原決定基を意
味する。ここで述べているレセプタータンパク質は、通
常、このレセプターが特異的にリガンドと結合しないか
ぎり、潜在的抗原決定基を発現しない。 Ｂ．ＤＮＡ断片 生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸
残基配列は、タンパク質をコードする構造遺伝子のデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）と遺伝子コードを介して直接対
応している。従って、構造遺伝子は、それがコードする
アミノ酸残基配列、すなわち、タンパク質又はポリペプ
チドで定義することができる。遺伝子コードでよく知ら
れており、重要な性質は、その縮退である。すなわち、
タンパク質を構成する全んどのアミノ酸について、１つ
以上のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）が、
１つのアミノ酸残基をコード、もしくは指定している。
それゆえ、特別のアミノ酸残基配列を、多種のヌクレオ
チド配列がコードしうる。このようなヌクレオチド配列
は、全ての生物において、同じアミノ酸残基配列の生産
を起こすことから、機能的には等価と考えることができ
る。場合によっては、プリン又はピリミジンのメチル化
体も、ヌクレオチド配列中に組込まれていることもあ
る。しかし、これらメチル化は、コード関係になんら影
響を与えることはない。

【００２２】本発明のＤＮＡ断片には、ＧＰIIｂ関連ア
ミノ酸残基配列、すなわち、ＧＰ IIIｂ関連タンパク質
を含むタンパク質をコードする構造遺伝子が含まれる。
ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列は、図１の約５０番から
約２２７番で示される、アミノ酸残基配列の１部と相同
的、好ましくは同一の、少なくとも約１０残基の配列で
ある。本発明のＤＮＡ断片には、図１の残基約５０番か
ら約１４５番で示されるアミノ酸残基配列をコードする
ＤＮＡ配列が含まれる。別の態様においては、図１の残
基約５０番から約２２７番で示されているアミノ酸残基
配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を考案し
ている。また、図１の残基約１４６番から約２２７番で
示されているアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ断片も考案している。本発明のＤＮＡ断片
は、図１の残基約１番から約２２７番で示されるアミノ
酸残基配列をコードしていることが望ましい。ＤＮＡ配
列は、上述のアミノ酸残基配列中のアミノ酸残基をコー
ドするコドンが連続して存在する、すなわち、ＤＮＡ配
列がイントロンを含まないことが望ましい。

【００２３】基本的に図１の塩基約１４８番から約４３
５番で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片
も、本発明の１態様を構成している。基本的に、図１の
塩基約１４８番から約４３５番で示されるヌクレオチド
配列からなるＤＮＡ断片は、本発明の別の態様を構成し
ている。基本的に本発明のＤＮＡ断片が図１の塩基約１
番から約１１０４番で示されるヌクレオチド配列からな
ることが好ましい。ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコ
ードする本発明のＤＮＡ断片は、化学的技術、例えばマ
チュウシ（Matteucci)等（ジャーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイアティ（J. Am. Chem. Soc.)１０
３、３１８５（１９８１））のホスホトリエステル法に
よって容易に合成することができる。もちろん、コード
配列を化学的に合成することによって、天然のアミノ酸
残基配列をコードするものを適当な塩基に置換すること
によって、望ましい修正を容易に行うことができる。し
かし、図１に示したものと全く相同的な配列を含むＤＮ
Ａ分子であることが望ましい。

【００２４】さらに、基本的に、ＧＰIIｂ関連タンパク
質をコードする構造遺伝子からなるＤＮＡ断片は、これ
らの遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得ることができ
る。例えば、プラスミド型組換えＤＮＡ分子ＨＥＬ−４
１は、図１に示したＤＮＡ配列を含み、従って、図１の
残基１番から２２７番で示されるアミノ酸残基をコード
している。ＨＥＬ−４１でトランスホームした大腸菌
（E. coli)培養物を、ブダペスト条約要請事項に従が
い、１９８７年７月７日、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２、ＭＤ
州、ロックビル、パークローン・ドライブ、１２３０
１）に登録し、受理番号６７４５６号を割当てられた。
ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ断片を、従来法に従がい、上記登録のプラ
スミド由来の適当な制限断片を機能的に結合（ライゲー
ション）することにより作ることができる。

【００２５】典型的に、このようにして作った本発明の
ＤＮＡ分子は、粘着末端、すなわち、この分子の二本鎖
部分を越えて伸びる“突出した”一本鎖部分を有してい
る。本発明のＤＮＡ分子上の粘着末端が存在することは
好ましいことである。また、上記ＤＮＡ断片と等価なリ
ボ核酸（ＲＮＡ）も本発明で考案されている。 Ｃ．組換えＤＮＡ分子 本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ断片にベ
クターを機能的に結合することにより作ることができ
る。ここで用いられるように、“ベクター”という語句
は、細胞中で自己増殖可能なＤＮＡ分子を意味し、別の
ＤＮＡ断片を機能的に結合することにより、その付随す
る断片の複製をもたらすことができるものである。ＧＰ
IIｂ関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコード
する遺伝子の発現を司るベクターを、ここでは“発現ベ
クター”と呼ぶ。従って、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮ
Ａ）は、天然では、通常一緒に発見されることはない、
少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリット
ＤＮＡ分子である。

【００２６】本発明のＤＮＡ断片が機能的に結合するベ
クターの選択は、この分野でよく知られているように、
望ましい機能的性質、例えばタンパク質の発現及びトラ
ンスホームされる宿主細胞に直接依存し、これらは、組
換えＤＮＡ分子を構築する分野において本質的な制限と
なっている。しかし、本発明で考案されているベクター
は、機能的に結合されたＤＮＡ断片中に含まれるＧＰII
ｂ関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードす
る遺伝子の少なくとも複製、そして好ましくは発現も司
ることができる。好ましい態様において、本発明で考案
されたベクターは、原核性レプリコン、すなわち、バク
テリア宿主細胞のような原核性宿主細胞において、染色
体外で組換えＤＮＡ分子を自己複製及び維持を司ること
ができる能力を有するＤＮＡ配列を含んでいる。このよ
うなレプリコンは当分野ではよく知られているものであ
る。さらに、原核性レプリコンを含む、これらの態様
は、それでトランスホームしたバクテリア宿主に薬剤耐
性を付与する遺伝子も含んでいる。典型的なバクテリア
の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリ
ン耐性を付与するものである。

【００２７】原核性レプリコンを含む、これらベクター
は、大腸菌のようなバクテリア宿主細胞をトランスホー
ムすることで、ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配列をコード
する遺伝子の発現（転写及び翻訳）を司る原核性プロモ
ーターも含む。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼ
の結合及び転写を可能とするＤＮＡ配列によって形成さ
れる発現コントロール要素である。バクテリア宿主に適
合するプロモーター配列は一般的に、本発明のＤＮＡ断
片の挿入のための、簡便な制限部位を含むプラスミドベ
クター中に提供されている。このようなベクタープラス
ミドの典型例には、バイオ・ラド・ラボラトリー（ＣＡ
州、リッチモンド）から市販されているｐＵＣ８、ｐＵ
Ｃ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びファルマシ
ア（ＮＪ州、ピスカタウェイ）から市販されているｐＰ
Ｌ及びｐＫＫ２２３がある。

【００２８】真核性細胞好ましくは脊椎動物細胞に適合
する発現ベクターは、本発明の組換えＤＮＡ分子を生成
するのに用いることができる。真核性細胞発現ベクター
は、当分野でよく知られており、また、いくつかの販売
元から市販されている。典型的に、このようなベクター
は、望ましいＤＮＡ断片の挿入するために便利な制限部
位を含むものが提供されている。このようなベクターの
典型例には、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（ファルマシ
ア）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナル
バイオテクノロジーズ）及びｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃
３１２５５）がある。好ましい態様において、本発明の
組換えＤＮＡ分子を構築するのに使用される真核細胞発
現ベクターは、真核細胞中で効果的な選択マーカー、好
ましくは、薬剤耐性選択マーカーを含んでいる。好まし
い薬剤耐性マーカーは発現によりネオマイシン耐性とな
る遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ（neo)遺伝子である。サウザーン（Southern）
等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプラ
イド・ジェネティクス（J, Mol. Appl. Genet.）１、３
２７−３４１（１９８２）。

【００２９】本発明のｒＤＮＡを生成するのにレトロウ
ィルス発現ベクターを用いることも考案している。ここ
で用いているように“レトロウィルス発現ベクター”と
いう語句は、レトロウィルス・ゲノムのロング・ターミ
ナル・リピート（ＬＴＲ）由来のプロモーター配列を含
むＤＮＡ分子を意味する。好ましい態様における、典型
的な発現ベクターは、好ましくは、真核細胞中で複製不
能なレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィル
スベクターの構築を使用例がソージ（Sorge)等（モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell.
Biol.）４、１７３０−３７（１９８４）によって報告
されている。相補的粘着末端を介して、ベクターにＤＮ
Ａを機能的に結合する多くの方法が開発されてきてい
る。例えば、相補的ホモポリマー鎖を、挿入するＤＮＡ
断片及びベクターＤＮＡに付加することができる。それ
から、この相補的ホモポリマー末端間の水素結合によ
り、このベクター及びＤＮＡ断片を結合し組換えＤＮＡ
分子を生成する。

【００３０】１つ以上の制限部位を含む合成リンカー
は、ＤＮＡ断片とベクターを結合する別法を提供する。
先に説明したように、エンドヌクレアーゼによる制限消
化により生じたＤＮＡ断片を３′−５′エクソヌクレア
ーゼ活性により、突出する３′一本鎖末端を除去し、ま
た重合活性により、窪んだ３′末端を充填する酵素であ
る、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。それゆえ、こ
れら活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡ断片を生ずる。そ
れから、この平滑末端断片をバクテリオファージＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ等の平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーション
を触媒しうる酵素の存在下、大過剰のリンカー分子とイ
ンキュベーションする。このようにしてできた反応産物
は、その末端に重合リンカー配列をもつＤＮＡ断片であ
る。これらＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、この
ＤＮＡ断片の末端に適合する末端を生ずる酵素で切断し
た発現ベクターにライゲーションする。

【００３１】多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む
合成リンカーは、ＣＮ州、ニュヘブンのインターナショ
ナル・バイオテクノロジーズ社を含む多くの業者から市
販されている。本発明は、上述の組換えＤＮＡ分子と等
価なＲＮＡも考案している。 Ｄ．トランスホームした細胞及び培養 また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子でトランス
ホームした宿主にも関連している。宿主細胞は原核性の
ことも、真核性のこともある。バクテリア細胞が原核性
宿主細胞であることが好ましく、また典型的には、ＭＤ
州、ベセスダ、ベセスダ州−４、ラボラトリース社から
市販されている大腸菌ＤＨ５株のような大腸菌株であ
る。好ましい真核性宿主細胞には、イースト及び好まし
くは、マウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列
由来のもの等の脊椎細胞などホ乳類細胞が含まれる。好
ましい真核性宿主細胞には、ＣＣＬ６１のようなＡＴＣ
Ｃから入手できるチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞及びＣＲＬ１６５８のようなＡＴＣＣから入手
できるＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３が含
まれる。

【００３２】好ましいトランスホーム化細胞系列とは、
組換えＤＮＡ分子ＨＥＬ−４１を含む大腸菌であり、そ
の培養物は、１９８７年７月７日、ＭＤ州、ロックビ
ル、アメリカン・ティシュ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に登録され、受理番号６７４５６が割当て
られた。本発明の組換えＤＮＡ分子による、適当な宿主
細胞のトランスホーメーションは、典型的には、使用す
るベクターのタイプに依存する、従来法によって行なわ
される。原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関
しては、例えば、コーエン（Cohen)等、プロシーディン
グ・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、６９、２１１０
（１９７２）、及びマニアチス（Maniatis）等、モレキ
ュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ州、（１９８２）参照。ｒＤＮＡを
含むレトロウィルスベクターによる脊椎動物細胞のトラ
ンスホーメーションに関しては、例えば、ソージ（Sorg
e)等、モレキュラー−アンド・セルラーバイオロジー
（Mol. Cell. Biol.）４、１７３０−３７（１９８
４）；グラハム（Graham）等、ビロロジー(Virol.)５
２、４５６（１９７３）及びウィグラー（Wigler）等、
プロシーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、
７６、１３７３−７６（１９７９）参照。

【００３３】うまくトランスホームした細胞、すなわ
ち、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細胞は、従来法に
より同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡ
の導入により生じた細胞をクローン化し、モノクローナ
ルコロニーを作ることができる。これらのコロニー由来
の細胞を収穫し、溶解してから、そのＤＮＡ含有物につ
いて、サウザーン（Southern）（ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.)９８、５０
３（１９７５））及びベレント（Berent）等（バイオテ
クノロジー（Biotech)、３、２０８（１９８５））によ
って報告されているような方法を用い、ｒＤＮＡの有無
を試験した。ｒＤＮＡの存在の直接的検定に加えて、ｒ
ＤＮＡがＧＰIIｂ関連タンパク質を発現できる場合、ト
ランスホーメーションは、従来の免疫学的方法で確める
ことができる。例えば、発現ベクターでうまくトランス
ホームした細胞は、ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質を
生産する。トランスホームされた細胞サンプルを収穫
し、本発明のハイブリドーマによって生産されるよう
な、抗原に特異的な抗体を用いて、ＧＰII関連タンパク
質を検定した。

【００３４】このように、トランスホームした宿主細胞
自身に加え、本発明は、栄養培地中の、これら細胞培養
物、好ましくはモノクローナルな（クローン的に均一
な）培養物、又は、モノクローナルな培養物由来の培養
物も考案している。またこの培養物は、ＧＰIIｂ抗原性
を示していることが好ましい。トランスホームした宿主
細胞を培養するために有用な栄養培地は当分野でよく知
られているものであり、いくつかの販売業者から市販さ
れている。宿主細胞がホ乳類細胞である態様の場合、
“無血清”培地を用いることが好ましい。Ｅ．ＧＰIIｂ
関連タンパク質の生産方法本発明のもう１つの特徴に、
ＧＰIIｂ抗原性を示すタンパク質の生産方法がある。Ｇ
ＰIIｂ抗原性を示すタンパク質は、天然のＧＰIIｂで誘
導される抗体と免疫反応するタンパク質である。ＧＰII
ｂ抗原性を示すタンパク質は、抗原として、及び抗体を
生じさせるものとして有用であり、それらの各々は、本
発明の診断システム及び診断方法に用いることができ
る。

【００３５】本方法には、ＧＰIIｂ関連アミノ酸残基配
列をコードする遺伝子を発現できる本発明の組換えＤＮ
Ａ分子でトランスホームした、宿主細胞、好ましくはヒ
トの細胞を含有する栄養培地を含む培養の開始を伴う。
この培養を、そのトランスホームした細胞がＧＰIIｂ関
連アミノ酸残基配列を含むタンパク質を発現するのに十
分時間維持する。その後発現したタンパク質を培養物か
ら回収する。培養物から発現したタンパク質を回収する
方法は、当分野ではよく知られているものであり、従来
の生化学的技術を用いた培養物のタンパク質含有成分の
分画が含まれる。例えば、タンパク質を分画するのによ
く知られている、ゲルロ過、ゲルクロマトグラフィー、
限外ロ過、電気泳動法、イオン交換、アフィニティーク
ロマトグラフィー等の方法が培養物中に存在する発現タ
ンパク質を単離するのに用いることができる。さらに、
免疫親和性、免疫吸着等の免疫学的方法も従来の方法を
用いて行なわれる。

【００３６】せいぜい約５０個のアミノ酸残基までの、
以後特別に列挙する配列に付加する、本発明のポリペプ
チド中に存在するアミノ酸は、以後議論されているよう
なポリペプチドの基本的かつ新規な特性に実質的に影響
を与えない残基である。このような付加残基は、通常、
列挙したポリペプチドの一端又は両端に付加しており、
列挙したポリペプチド配列の反復及び部分的反復も含む
ことがある。 Ｆ．ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、せいぜい約５０個、より通常
には約３５個以下、そして、好ましくは、約２５個以下
のアミノ酸残基配を含み、少なくとも、約１０個の残基
を含む。さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ
酸残基配列及び新しい機能性を特徴としている。 １．ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ 広く言うと、本発明の１態様は、ＲＤＧ結合細胞粘着タ
ンパク質のアルファサブユニットの重鎖により発現され
る潜在的抗原決定基を真似るアミノ酸残基配列を含むポ
リペプチドを考案している。潜在的決定基ポリペプチド
アナログのアミノ酸残基配列は、サイトアドヘシンのア
ルファサブユニットの重鎖の約１５個のカルボキシ末端
アミノ酸残基の配列に対応している。

【００３７】好ましいサイトアドヘシンのアルファサブ
ユニット重鎖潜在的決定基ポリペプチドアナログは、ｈ
ＧＰIIｂがフィブリノーゲンと結合した時に形成され
る、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基に似ている。好ましい態様
において、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナロ
グは、図１のアミノ酸残基１３７〜１４５番を表わす、
次のアミノ酸残基配列、 −ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ− を少なくとも含んでいる。さらに、ｈＧＰIIｂ潜在的決
定基ポリペプチドアナログは、少なくとも、図１のアミ
ノ酸残基配列１２９〜１４５番を表わしている、次のア
ミノ酸残基配列、 −ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ− を含むことが好ましい。

【００３８】ｈＧＰIIｂ潜在的決定基アナログには、表
１に示されるアミノ酸残基配列を含むことが望ましい。

【００３９】

【表１】 表１ 名 称 アミノ酸残基配列 ｐ１３６−１４５ ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ１３３−１４５ ＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ１３１−１４５ ＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ１２９−１４５ ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ａ．各ポリペプチドの名称は、図１において、含有され
るアミノ酸残基配列を表わしている。表１に示したポリ
ペプチドは、さらに、ｈＧＰIIｂがＧＰIIｂ〜 IIIａ／
フィブリノーゲン複合体として存在するとき、以下に述
べるように、ＰＭＩ−１抗体分子とｈＧＰIIｂとの結合
を中和する（競合的に阻害する）能力により特徴づけら
れた。

【００４０】ここで用いる語“複合体”は、抗体−抗原
又はレセプター−リガンド反応のような特異的結合反応
産物を意味する。代表的複合体には、免疫反応産物、Ｇ
ＰIIｂ− IIIａ−フィブリノーゲン結合反応産物及びサ
イトアドヘシン−リガンド結合反応産物がある。好まし
い態様において、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基アナログは、
さらに、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競合的に
阻害する能力によって特徴づけられる。フィブリノーゲ
ン結合血小板凝集を阻害しうる代表的ｈＧＰIIｂ潜在的
決定基アナログは、ポリペプチドｐ１２９−１４５があ
る。本発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナ
ログは、フィブリノーゲン結合血小板凝集を競合的に阻
害し、そして、または、以下に述べるように、ｈＧＰII
ｂがＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体として
存在する時、ＰＭＩ−１抗体分子のｈＧＰIIｂへの結合
を競合的に阻害する限り、ｈＧＰIIｂのアミノ酸残基配
列と同一である必要はないことが理解されなければなら
ない。それゆえ、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチド
アナログは、保存的であれ、非保存的であれ、挿入、欠
失及び置換のような種々の変化を受けることが可能で、
そのような変化はその使用に際し、ある利点を提供する
こともある。

【００４１】保存的置換とは、１つのアミノ酸が別の、
生物学的に同様な残基に置き換るものである。保存的置
換の代表例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又は
メチオニンなどの疎水性残基の間の置換又は、アルギニ
ンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、グルタミ
ンとアスパラギンなどの極性残基の間の置換などが含ま
れる。“保存的置換”という語句もそのようなポリペプ
チドが必要とされる結合活性を示すなら、未置換の元の
アミノ酸の代りに置換したアミノ酸を使用することも含
まれる。本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的又
は非保存的置換が起っているため、ｈＧＰIIｂの配列と
同一ではない配列を有しているとき、本発明のポリペプ
チドが簡便にラベル又は固体マトリクス又は抗原性キャ
リヤーに固定できるように、“リンカー”を提供する目
的でその末端に付加的残基が付加される場合を除いて、
通常多くとも約２０％、より普通には、多くて１０％の
アミノ酸残基が置換される。本発明のポリペプチドに使
用できるラベル、固体マトリクス及びキャリヤーは以下
に説明する。

【００４２】通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくと
も１残基で、４０残基以上のこともあるが、普通には１
個乃至１０個の残基からなる。リンカーに用いる典型的
アミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グル
タミン酸及びアスパラギン酸などである。さらに、本発
明のポリペプチド配列は、例えばアセチル化などの末端
ＮＨ₂ アシル化又は例えばアンモニア、メチルアミンそ
の他の、チオグリコール酸アミデーション、末端カルボ
キシアミデーションによる修飾を受けることによる天然
の配列と異なるものであることもありうる。リンカーを
介してキャリヤーに結合し、当分野でキャリヤー−ハプ
テン結合体として知られているものを形成する場合、本
発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、ｈＧＰIIｂが血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブ
リノーゲン複合体として存在するとき、ｈＧＰIIｂと免
疫反応する抗体を誘導することができる。免疫学的交叉
反応性に関する確立された原則からみて、本発明は、ポ
リペプチドｐ１２９−１４９の抗原的関連変異体を考案
している。“抗原的関連変異体”とは、ポリペプチドｐ
１２９−１４５の少なくとも６個のアミノ酸残基配列部
分を含み、かつ、ｈＧＰIIｂが、血小板会合ＧＰIIｂ−
IIIａ／フィブリノーゲン複合体として存在するとき、
ｐ１２９−１４５及びｈＧＰIIｂと免疫反応する抗体分
子を誘導することができるポリペプチドのことである。 ２．ｌＧＰIIｂポリペプチド 別の態様において、本発明は、図１のアミノ酸残基１４
４〜１５６番で示される次のアミノ酸残基配列 −ＲＱＩＦＬＰＥＰＥＱＰＳＲ− を少なくとも含んでいるｌＧＰIIｂポリペプチドを考案
している。

【００４３】さらに、ｌＧＰIIｂポリペプチドは、ｌＧ
ＰIIｂとは免疫反応するがｈＧＰIIｂとは免疫反応しな
い抗体分子を誘導することができる特徴を有する。ｐ１
４４−１５６と命名される、好ましいｌＧＰIIｂポリペ
プチドは、次の式 ＲＱＩＦＬＰＥＰＱＰＳＲ で表わされるアミノ酸残基配列を有している。本発明の
ｈＧＰIIｂ及びｌＧＰIIｂポリペプチドの両方とも当分
野でよく知られている技術で合成することができる。使
用できる技術の秀れた概要が、Ｊ，Ｍ，スチワード（St
eward)及びＪ．Ｄ．ヤング（“固相ペプチド合成”、
Ｗ．Ｈ．フリーマン社、サンフランシスコ、１９６９）
及びＪ．メイエンホーファー（Meienhofer) （“ホルモ
ンタンパク質及びペプチド”、２巻、４６頁、アカデミ
ックプレス版（ニューヨーク）、１９８３年）によって
固相法について、及びＥ．シュローダー（Schroder）及
びＫ．クブケ（Kubke)（“ペプチド”１巻、アカデミッ
クプレス版（ニューヨーク）、１９６５年）によって、
古典的溶液合成について、まとめられている。

【００４４】Ｇ．接種物 別の態様において、本発明のポリペプチドもしくは、そ
の抗原的関連変異体を、薬学的に許容しうる水性希釈組
成物中で用いて、その効果的投与したとき、ｈＧＰIIｂ
と免疫反応する抗体を誘導できる接種物を作った。種々
の文法型の“接種物”という語は、ＧＰIIｂの重鎖又は
軽鎖に対する抗体の調製に用いられる活性成分として、
本発明のポリペプチドを含む組成物を示して用いてい
る。ポリペプチドを抗体の誘導に用いる時、このポリペ
プチドは単独、又は結合体として、キャリヤーに結合し
て、又は、ポリペプチドポリマーとして使用されること
を理解すべきであるが、発現の簡便性のため、本発明の
種々の態様においては、集約的に“ポリペプチド”又
は、その種々の文法型のものを、その意味で用いてい
る。

【００４５】約３５残基以下のアミノ酸を含むポリペプ
チドは、すでに述べてきたように、抗体の産生を誘導す
る目的には、キャリヤーに結合したペプチドを使用する
ことが好ましい。すでに述べてきたように、１個以上の
付加的アミノ酸残基をポリペプチドのアミノ及びカルボ
キシ末端に付加して、そのポリペプチドのキャリヤーへ
の結合を助けることができる。ポリペプチドのアミノ及
びカルボキシ末端へ付加したシスティン残基は、ジスル
フィド結合を介した結合体を作る上で特に有用なもので
あることが分っている。しかし、結合体を作るための、
当分野でよく知られている他の方法も、使用することが
できる。代表的付加結合操作には、グルタルアルデヒド
のようなジアルデヒド、ミカエル付加の使用（クリプス
タイン（Klipstein)等、ジャーナル・オブ・インフエク
シャスデシーズ（J. Infect. Dis.)１４７、３１８−３
２６（１９８３）もしくは、水溶性カルボジイミドを使
用して、キャリヤーへのアミド結合を生成するような、
カルボジイミド技術の使用が含まれる。タンパク質結合
体もしくは、活性化官能基を介しての結合のレヴューに
ついては、オーラメアス（Aurameas）等のスカンジナビ
アン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Scand. J. Im
munol.）８、補１、７、７〜２３（１９７８）を参照せ
よ。

【００４６】有用なキャリヤーは当分野ではよく知られ
ており、一般にタンパク質それ自体である。これらキャ
リヤーの代表例には、キーホールリンペット・ヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）もしくは、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）などのアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢ
Ｃ）のような赤血球、テタナス、トキソイド、コレラト
キソイド及びポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）な
どのポリアミノ酸などがある。キャリヤーの選択は、そ
の接種物の最終的使用により依存し、本発明に特に関係
しない事項に基づいている。例えば接種を受ける動物に
おいて、不都合な反応が起こらないキャリヤーを選択す
べきである。本接種物には、典型的には、キャリヤーに
結合した結合体として、効果的な免疫原的量の、本発明
のポリペプチドが含まれている。他の事項の中で、単位
投与当りのポリペプチドもしくはタンパク質の効果量
は、接種を受ける動物種、その動物の体重及び選択され
た接種管理に依存し、このことは、当分野でよく知られ
ていることである。典型的に、接種物は、接種当り約１
０マイクログラムから約５００ミリグラムのポリペプチ
ド又はタンパク質濃度、好ましくは、投与当り、約５０
マイクログラムから約５０ミリグラムのポリペプチドも
しくは、タンパク質を含んでいる。

【００４７】本発明の接種物に使われる限り、“単位投
与”という語句は、動物への単一投与に適した物理的に
分離した単位を意味し、各単位は必要とする希釈剤、す
なわち、キャリヤーもしくは、ビヒクルと合せて、望ま
しい免疫原的効果を産むと計算された、予め決められた
量の活性物質を含んでいる。本発明の接種物の新しい単
位投与に対する明細は、（ａ）活性物質の特性及び遂行
される特別の免疫学的効果、及び（ｂ）動物において、
免疫学的に使用するための、このような活性物質の調合
技術に本質的な制限、によって記述され、直接これらに
依存しており、それらは、ここに詳述されていると同時
に本発明の特徴となっている。典型的に、接種物は、
水、食塩水、又は、リン酸緩衝液のような生理学的に許
容される希釈剤又はビヒクル中にポリペプチド結合体を
分散して、水性組成物を作ることにより、乾燥した固体
ポリペプチド結合体から調製される。このような希釈剤
は、当分野でよく知られているものであり、例えば、レ
ミントン（Remington)の薬学、第１６編、マック・パブ
リッシング社、イーストン、ＰＡ州（１９８０）、１４
６５−１４６７頁で議論されている。

【００４８】また、接種物は、希釈剤の一部として、ア
ジュバントも含むことがある。完全フロイント・アジュ
バント（ＣＦＡ）、不完全フロイント・アジュバント
（ＩＦＡ）及びミョウバンのようなアジュバントは、当
分野でよく知られた物質であり、いくつかの販売業者よ
り、市販されている。 Ｈ．抗体及び抗体組成物 １．抗体組成物 ここで用いられている、種々の文法型の“抗体”という
語は、イムノグロブリン分子及び免疫学的に活性なイム
ノグロブリン分子の一部、すなわち、抗体結合部位もし
くは、パラトープを含む分子を意味している。代表的抗
体分子には、本来のイムノグロブリン分子、実質的な、
本来のイムノグロブリン分子及び当分野でＦａｂ、Ｆａ
ｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂ 及びＦ（Ｖ）として知られている
領域を含む、パラトープを含む、イムノグロブリン分子
の一部が含まれる。

【００４９】“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結
合する（免疫反応する）重鎖及び軽鎖の可変及び超可変
領域を含む抗体分子の構造領域のことである。種々の文
法型の“免疫反応”という語は、抗原決定基含有分子及
び全抗体分子もしくはその一部のような抗体結合部位を
含む分子の間の結合を意味する。“抗原決定基”とは、
抗体結合部位によって、免疫学的に結合をうける抗原の
実質的構造領域を意味する。また、この語句は、“エピ
トープ”と互換的に使用される。本発明の抗体組成物
は、ａ）ｈＧＰIIｂ又はｌＧＰIIｂ及びｂ）本発明の少
なくとも１つの特別なポリペプチドと免疫反応する抗体
分子を含むことを特徴とする。好ましい態様において、
本発明の抗体組成物は、ＧＰIIｂと免疫反応することが
できる１種以上のパラトープを含んでいる。

【００５０】例えば、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フ
ィブリノーゲン複合体及びｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリ
ペプチドアナログと免疫反応するが、そのアミノ酸残基
配列を表２に示した。ポリペプチドｐ５３−６４と、実
質的に免疫反応を起こさない抗体分子を含む本発明の抗
体組成物は、フィブリノーゲン結合血小板と、フィブリ
ノーゲンと結合していない血小板とを区別することがで
きる。したがって、好ましい抗体組成物は、ａ）それが
血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａ／フィブリノーゲン複合体
として存在するときの、ｈＧＰIIｂ、及びｂ）ポリペプ
チドｐ１２９−１４５、と免疫反応し、かつ、実質的
に、ポリペプチドｐ５３−６４との免疫反応を起こさな
い抗体分子を含むものである。典型的に本発明の抗体組
成物は、本発明の接種物でホ乳動物を免疫化し、それに
より、そのホ乳動物中に、適当なポリペプチド免疫特異
性を有する抗体分子を誘導することにより生産される。
それから、この抗体分子を、そのホ乳動物から回収し、
例えば、免疫親和性クロマトグラフィーなどの従来法に
より、望ましい程度の単離を行う。このようにして生成
した抗体組成物は、そのまま、本発明の診断法及び診断
システムに用いて、身体中のフィブリノーゲン結合血小
板の検出に使用される。 ２．モノクローナル抗体組成物 本発明は、抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体組成物も考案
している。種々の文法型の“モノクローナル抗体組成
物”という語句は、ある抗体と免疫反応することができ
る唯一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合体を意味
する。したがって典型的に、モノクローナル抗体組成物
は、それが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性
を示す。それゆえ、モノクローナル抗体組成物は、異な
る抗原に対して、各々が免疫特異性を有する、多種の抗
体結合部位をもつ、単一の抗体分子、例えば、二特異的
モノクローナル抗体が含まれている。

【００５１】典型的に、モノクローナル抗体組成物は、
ほんの一種の抗体分子を分泌（生産）するハイブリドー
マと呼ばれる単一細胞のクローンから生産される抗体を
含む。このハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞及びミ
エローマもしくは、自己生存細胞系列の融合によって生
成する。このような抗体は、最初に、コラー（Kohler）
及びミルスタイン（Milstein）により報告されており
（ネイチャー（Neture）、２５６、４９５−４９７（１
９７５））、その報告を参考としてここに組込んであ
る。１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体
組成物は、細胞表面レセプター−リガンド複合体により
発現されるＬＩＢＳ、好ましくは、その複合体中のレセ
プターの潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含
むことを特徴とする。

【００５２】別の態様において、モノクローナル抗体組
成物は、ｈＧＰIIｂ及びｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペ
プチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反
応する抗体分子を含む。これら組成物中に含まれる抗体
分子は、ＧＰIIｂ機能部位もしくはその付近のｈＧＰII
ｂと免疫反応するが、血小板会合ＧＰIIｂ− IIIａによ
るフィブリノーゲンの結合を阻害せず、また、それがフ
ィブリノーゲンと結合したときは、血小板会合ＧＰIIｂ
− IIIａと免疫学的に反応することができる。このタイ
プの好ましいモノクローナル抗体組成物には、ハイブリ
ドーマＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９４７６）によっ
て生産することができる抗体分子、すなわちＰＭＩ−１
抗体分子が含まれる。 ３．モノクローナル抗体組成物の産生方法 本発明は、（ａ）細胞表面レセプター−リガンド複合体
により発現されるリガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）と
免疫反応し、かつ、（ｂ）そのレセプター−リガンド複
合体の非占有レセプターもしくは、非結合リガンドとは
免疫反応しない、モノクローナル抗体の生成法を考案し
ている。この方法には、 (a) 動物の、細胞表面−レセプター複合体もしくはｈ
ＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログによる免疫
化。これは、典型的に、免疫学的受容ホ乳動物に免疫原
の免疫学的効果量、すなわち、免疫応答を起こすのに十
分な量投与することにより行なわれる。このホ乳動物
は、ウサギ、ラット又はマウス等のげっ歯動物であるこ
とが望ましい。これからこのホ乳動物を、レセプター−
リガンド複合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞
を作るのに十分な時間、維持する。

【００５３】(b) 免疫化したホ乳動物から取り出した
抗体産生細胞のサスペンジョンを調製する。これは典型
的には、そのホ乳動物の脾臓を取り出し、ついで個々の
脾細胞を機械的に分離し、生理的に許容される媒体に分
散するという、当分野でよく知られている方法によって
行なわれる。 (c) サスペンジョン化した抗体産生細胞を、トランス
ホームした（“生存化”）細胞系列を作ることができる
トランスホーム剤で処理する。トランスホーム剤及び生
存化細胞系列を作るための、その使用は、当分野ではよ
く知られていることであり、それには、エプスタイン・
バーウイルス（ＥＢＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ
４０）、ポリオマウイルス等のＤＮＡウイルス類、モロ
ニー・ムライン・リューケミア・ウイルス（ＭｏＭｕＬ
Ｖ）、ラウス・ザルコーマウイルス等のＲＮＡウイルス
類、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ 8,６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１
４等のミエローマ細胞類等が含まれる。

【００５４】好ましい態様において、トランスホーム剤
による処理は、適当な融合促進剤の使用による、適当な
細胞系列由来のマウスミエローマ細胞を、サスペンジョ
ン化脾細胞と融合することにより、ハイブリドーマを生
成する。ミエローマ細胞当り約５個の脾細胞を用いるこ
とが好ましい。総容積当り、約１０⁸ 個の脾細胞を使用
する。使用する細胞系列は、いわゆる“薬剤耐性”であ
ることが望ましく、その結果、未融合のミエローマ細胞
は、選択培地中で生存できず、一方、ハイブリッドは生
存できることになる。最も一般的なものには、８−アザ
グアニン耐性細胞系列があり、これは、酵素の、ヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼを欠失しており、そのため、ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジン）培地で生育すること
ができない。また、一般的に、使用するミエローマ細胞
系列は、分泌型を使用したとしても、それ自身、なんら
抗体を産生しないという点で、いわゆる“非分泌”型で
あることが望ましい。しかし、ある場合には、分泌型ミ
エローマ系列であることが好ましい。好ましい融合促進
剤は約１０００から約４０００の平均分子量をもつポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ１０００として市販されて
いる）である一方、この分野で知られている、その他の
融合促進剤も使用することができる。

【００５５】(d) その後、トランスホームした細胞
を、好ましくはモノクローナルにクローン化する。この
クローニングは、非トランスホーム細胞は生育できない
組織培養培地で行うことが望ましい。このトランスホー
ム細胞がハイブリドーマの場合は、一般的にこのこと
は、分離容器中、未融合脾細胞、未融合ミエローマ細胞
及び融合細胞（ハイブリドーマ）を、未融合ミエローマ
細胞が生存できない選択培地中に希釈し、ついで未融合
細胞が死滅するのに十分な時間（約１週間）、培養する
ことによって行なわれる。この希釈は、制限因子の１つ
であり、希釈体積は、各分離容器中にある個数の細胞
（例えば１〜４個）が分離されるように統計的に計算す
る（分離容器とは例えばマイクロプレートの各ウェルで
ある）。この培地は、薬剤耐性（例えば、８−アザグア
ニン耐性）未融合ミエローマ細胞系列を生育させないも
のである。

【００５６】(e) クローン化トランスホーマントの組
織培養培地について、よく知られている免疫学的技術を
用い、分泌された抗ＬＩＢＳ抗体分子の存在を評価す
る。 (f) ステップ（ｅ）で１度望ましいトランスホーマン
トが同定されれば、それを選択し、適当な時間、適当な
組織培養培地で生育させ、ついでその培養上清から、望
ましい抗体を回収する。適当な培地及び適当な培養時間
は、既知であるか、もしくは、容易に測定できる。より
高濃度の準精製モノクローナル抗体を生産するため、こ
の望ましいハイブリドーマを、マウス、好ましくは、同
種もしくは、準同種のマウスに注射する。このハイブリ
ドーマは、適当なインキュベーション時間の後、抗体産
生腫瘍を生成し、これは、この宿主マウスの血液及び腹
腔分泌物内に高い濃度の目的抗体を生ずる（約５−２０
mg／ml）。

【００５７】これら組成物の調製に適する培地は当分野
でよく知られ、かつ、市販されており、また、これに
は、合成培養培地、近交系マウス及びそれに類するもの
が含まれている。代表的合成培地は、4.５ｇ／ｌのグル
コース、２０mmグルタミン及び２０％ウシ胎児血清を捕
った、ダルベユ最小基礎培地である。代表的な近交系マ
ウス株はBalb／c である。上記の方法で調製したモノク
ローナル抗体組成物は、例えば、ＬＩＢＳ含有免疫反応
産物の生成が望まれるような、診断及び治療に用いるこ
とができる。代表的反応産物には、ＧＰIIｂもしくは、
ＧＰ IIIａの含有免疫反応産物が含まれる。 Ｉ．ハイブリドーマ及びその調製法 本発明のハイブリドーマは、抗ＬＩＢＳモノクローナル
抗体組成物を生産する能力を有することを特徴とするも
のである。

【００５８】本発明の好ましいハイブリドーマは、細胞
表面レセプター潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分
子を生産することを特徴とする。望ましい免疫特異性、
すなわち、特定のタンパク質、特定のタンパク質上の同
定可能なエピトープ、そして、または、ポリペプチド上
の同定可能なエピトープと、免疫反応する能力を有する
抗体分子を生産（分泌）するハイブリドーマの調製方法
は、当分野ではよく知られているものである。参考のた
めここに組入れられているナイマン（Niman)等（プロシ
ーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Pro. Natl. Acad. Sci. ）（ＵＳＡ、８
０、４９４９−４９５３、（１９８３））及びガルフレ
（Galfre）等（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
th. Enzymol.）７３、３−４６（１９８１））の報告に
あるハイブリドーマ技術は特に利用される。

【００５９】ハイブリドーマ培養物ＰＭＩ−１は、ブタ
ペスト協定要請物に基づき、１９８７年７月７日、アメ
リカ、２０８５２、ＭＤ州、ロックビル、アメリカン・
タイプ、ティシュ・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録さ
れ、受理番号ＨＢ９４７６が割当てられた。同様にハイ
ブリドーマ培養物ＰＭＩ−２は１９８７年、１２月２２
日ＡＴＣＣに登録され、受理番号ＨＢ９６１５を割当て
られた。 Ｊ．治療法及び治療組成物 本発明のｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、インビボにおけるフィブリノーゲン結合血小板の凝
集を緩和するのに用いることができる。例えば、ｈＧＰ
IIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログは、効果的量を
被検者に投与したとき、フィブリノーゲン結合血小板の
凝集を競合的に阻害しうる、医療的に許容しうる組成物
で用いることができる。この阻害は、血栓生成を減速さ
せると考えられている。従って、インビボでの、ｈＧＰ
IIｂ潜在的決定基ポリペプチドアナログの投与は、凝血
及びある炎症応答のような血小板凝集により開始される
生理学応答を緩和するのに用いることができる。

【００６０】他の態様において、フィブリノーゲン結合
血小板の凝集は、基本的に、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポ
リペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免
疫反応する抗体分子を含む医療的に許容しうる組成物を
効果量、静脈投与することにより阻害しうる。この抗体
分子は、モノクローナル抗体組成物として存在すること
が好ましく、また、ハイブリドーマＰＭＩ−１で生産さ
れるものがより好ましい。投与するポリペプチドもしく
は抗体分子含有組成物は、溶液もしくはサスペンジョン
としてであるが、ポリペプチドは、錠剤、丸薬、カプセ
ル、放出維持製剤又は粉末の形でも投与される。どの場
合にも、典型的な組成物は約0.１μＭから約1.０Ｍの活
性成分、好ましくは、約1.０μＭから約１０ミリモル濃
度（mM）の活性成分を含む。

【００６１】活性成分として、ポリペプチド又は、抗体
分子を含む治療組成物の調製は、当分野でよく理解され
ている。典型的に、これらの組成物は、溶液又はサスペ
ンジョンのような接種物として調製されるが、接種前の
液体である溶液もしくはサスペンジョンに適した固体も
調製されることもある。また、この調製物はエマルジョ
ン化することもある。しばしば、この活性治療成分は、
医療的に許容され、かつ、この活性成分と適合すること
が知られている賦形剤と混合される。例えば、適当な賦
形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、
エタノール等及びそれらの組合せたものがある。さら
に、もし、望ましいときは、この組成物は、活性成分の
効果を上げるための、湿潤剤又はエマルジョン化剤、ｐ
Ｈ緩衝剤のような少量の補助物質を含むこともある。

【００６２】ポリペプチドもしくは抗体分子組成物は、
中和した医療許容塩としての医療組成物に整えられるこ
ともある。医療的に許容される塩には、例えば塩酸、リ
ン酸のような無機酸、もしくは、酢酸、酒石酸、マンデ
ル酸のような有機酸で作られる酸付加塩（ポリペプチド
又は抗体分子の遊離アミノ基で形成される）が含まれ
る。また遊離カルボキシル基で形成される塩は、例え
ば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム
もしくは鉄の水酸化物のような無機塩基及びイソプロピ
ルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導さ
れることもある。このポリペプチド又は抗体含有医療組
成物は、例えば、単位投与量の静脈注射などの従来法で
投与される。本発明の医療組成物に対して用いられる
“単位投与量”という語句は、ヒトへの単一投与に適す
る物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要とさ
れる希釈剤すなわちキャリヤー又はビヒクルと合せて、
望ましい医療効果を産むよう計算され、予め決められた
量の活性物質を含んでいる。

【００６３】この組成物は、投与物の形状に適した方法
で、かつ、医療的に効果的量が投与される。投与量は、
治療される被検者、活性成分を利用する被検者の容量、
及び望ましいレセプター−リガンド結合の阻害度に依存
する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は医者の
判断に依存し、かつ、各個人に特異的なものである。し
かし、適当な投与範囲は、１日、１人当り活性成分１か
ら数ミリグラムのオーダーである。第１次及び第２次投
与の適正な処方も、様々であるが、典型的には、第１次
投与についでひきつづく注射又は他の投与法で、１時間
以上の間隔で反復投与する。別に、血液中の医療的に効
果的濃度を維持するのに十分な継続的な静脈への注入も
考案されている。ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチド
に関する。医療的に効果的な血液濃度は、約0.１mMから
約１０mMの範囲であり、約1.０mMが好ましい。本発明の
抗体の医療的に効果的な血液濃度は約0.１μＭから約１
０μＭの範囲であり、1.０μＭが好ましい。

【００６４】Ｋ．診断システム 本発明のキット型の診断システムには、分包された試薬
として、少なくとも１回の検定に十分な量の、本発明の
発現タンパク質、ポリペプチド、抗体組成物もしくはモ
ノクローナル抗体組成物が含まれている。この分包試薬
の使用説明書も含まれているのが普通である。典型的に
は、“使用説明書”には、その試薬濃度もしくは、混合
する試薬及びサンプルの相対的量、試薬／サンプル混合
物の維持時間、温度、バッファ条件などの、少なくとも
１回の検定法のパラメータを記述した明確な表現物が含
まれる。１つの態様において、血液又は血漿のような、
血小板含有血液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小
板を検定するための診断システムには、ｈＧＰIIｂ潜在
的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはｐ１２９−
１４５と免疫反応する分子を含むパッケージが含まれて
いる。さらに、この抗体分子は、ｈＧＰIIｂと免疫反応
するハイブリドーマＰＭＩ−１から生産されるものであ
ることがより好ましい。またこの抗体分子は、モノクロ
ーナル抗体組成物として存在することが好ましい。さら
に、この抗体分子が放射性核種ラベルに結合する、好ま
しくは、 ^{1 25}Ｉラベル化ＰＭＩ−１抗体を含むキットで
あることがより望ましい。

【００６５】別の態様における、本発明の診断システム
は、インビボで血栓の存在を検定するのに有用である。
このシステムには、ｈＧＰIIｂ潜在的決定基ポリペプチ
ドアナログ、好ましくはｐ１２９−１４５と免疫反応す
る抗体分子を含むパッケージが含まれる。この抗体分子
は、基本的にｈＧＰIIｂと免疫反応するＰＭＩ−１抗体
分子を含むモノクローナル抗体組成物として存在するこ
とがより好ましい。この抗体分子は、インビボ指示手段
と結合させておく。このように、好ましい態様におい
て、本発明の診断システムには、さらに、本発明の抗体
分子又はポリペプチドを含む複合体の生成を知らせるこ
とができるラベルもしくは指示手段が含まれている。こ
こで用いられているように、種々の文法型の、“ラベ
ル”及び“指示手段”という語句は、複合体の存在を示
す検出可能なシグナルの生成に直接もしくは間接的に関
係する単一原子及び分子を意味している。“インビボ”
ラベルもしくは指示手段は、被検者身体中で有効に働く
もので、それには、 ¹¹¹Ｉｎ、⁹⁹Ｔｃ、 ⁶⁷Ｇａ、 ¹⁸⁶Ｒ
ｅ及び ¹³²Ｉが含まれる。どのラベルもしくは指示手段
も、本発明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の
一部である、発現タンパク質、ポリペプチドもしくは抗
体分子と結合するか、又はそれらに組込まれることもあ
るし、もしくは、別々に使用されることもあり、またそ
れらの原子又は分子は、単独で用いられることもある
し、別の試薬と組合せで使用されることもある。このよ
うなラベルは、臨床診断化学の分野ではよく知られてい
るものであり、そして、これらが、ここで述べられてい
る新しいタンパク質を用いた方法そして、またはシステ
ムで使用される場合に限り、本発明の一部を構成してい
る。

【００６６】ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及
びタンパク質のラベル化は、当分野でよく知られている
ものである。例えば、ハイブリドーマによって生産され
る抗体分子は、培養培地中の成分として提供されるラジ
オアイソトープ含有アミノ酸の代謝的取込みによりラベ
ル化することができる。例えばガルフレ（Galfre）等、
ソメッズ・イン・エンザイモロジー（Meth, Enzymol)、
７３、３−４６（１９８１）参照。活性化官能基を介す
るタンパク質結合技術が特に利用される。例えば、オー
ラメアス（Aurameas）等、スカンジナビアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Scand. J, Immunol.）８、補
７、７−２３（１９７８）、ロットウェル（Rodwell)
等、バイオテクノロジー（Biotech)、３、８８９−８９
４（１９８４）及び米国特許第4,４９3,７９５号参照。

【００６７】また、この診断システムには、好ましくは
分包状態で特異的結合剤を含むことができる。“特異的
結合剤”は、本発明の試薬を選択的に結合できるが、本
発明のタンパク質発現物質、ポリペプチドもしくは抗体
分子それ自体ではない分子である。代表的な特異的結合
剤には、抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片、
プロテインＡ及びそれに類するものがある。この特異的
結合剤は本発明の抗体分子もしくはポリペプチドが複合
体の一部として存在するとき、これを結合することがで
きることが好ましい。好ましい態様においては、この特
異的結合剤はラベル化されている。しかし、この診断シ
ステムがラベル化されていない特異的結合剤を含んでい
る場合、典型的にこの結合剤は、増巾手段又は増巾試薬
として用いられている。これらの態様において、ラベル
化特異的結合剤は、その増巾手段が試薬含有複合体に結
合しているとき、その増巾手段と特異的に結合しうる。

【００６８】本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿
のような体液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板
の存在もしくはその量を検出するのに、“イライザ法”
様式で用いることができる。“イライザ法”とは、固相
に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原もしくは酵素−
抗体結合体を用いて、サンプル中に存在する抗原もしく
は抗体の量を検出及び定量する酵素結合免疫吸着検定法
のことである。イライザ法の説明は、参考として、組込
まれている、１９８２年、ＣＡ州、ロスアラモスのレン
ジメディカル出版社から出版されている、Ｄ．Ｐ．サイ
ツ（Sites)等の、“基礎及び臨床免疫学”の第４編、第
２２章及び米国特許第3,６５4,０９０号、第3,８５0,７
５２号及び第4,０１6,０４３号に報告されている。この
ように、好ましい態様において、本発明の発現タンパク
質、ポリペプチド又は抗体分子は、固体マトリクスに固
定され、本診断システム中、分包されている固体サポー
トとなっている。

【００６９】この試薬は、当分野ではよく知られている
その他の固定様式が使われることもあるが、水性媒体中
から吸着により、固体マトリクスに固定化されるのが一
般的である。当分野において、有用な固体マトリクスは
よく知られている。このような物質には、ファルマシ
ア、フィインケミカルス（ＮＪ．ピスカタウェイ）から
ＳＥＰＨＡＤＥＸの商標で市販されている架橋デキスト
ラン、アガロース；ＩＬ州、北シカゴのアボット・ラボ
ラトリーズ社から市販されている約１ミクロンから約５
ミリメートル径のポリスチレンビーズ、シート、小片又
はヘラ状の、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベ
ースの織物、もしくは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニ
ルから出来ているチューブ、プレートもしくは、マイク
ロプレートのウェルが含まれる。

【００７０】ここで述べられている診断システムの試
薬、ラベル化特異的結合剤もしくは増巾剤は、液体分散
物のような溶解もしくは、例えば凍結乾燥形のような実
質的に乾燥した粉末として提供される。指示手段が酵素
の場合、その酵素基質もこのシステムの分包の形で提供
される。先に述べたマイクロプレートのような固体サポ
ート及び１種以上のバッファ類も本診断検定システムに
おける分包要素として含まれている。この診断システム
に関してここで議論されているパッケージは、通常、診
断システムで使用されているものである。このようなパ
ッケージには、ガラス製及びプラスチック製（例えば、
ポリエチレン、ポリプロピレン／及びポリカーボネー
ト）のボトル、バイアル、プラスチック及びプラスチッ
クホイルでラミネートした包装等が含まれている。

【００７１】Ｌ．検定法 本発明は、本発明の抗体もしくは抗体分子組成物中に含
まれる抗体、発現タンパク質もしくはポリペプチドを含
む複合体を生成することにより、ＧＰIIｂ及び特に血栓
もしくは、フィブリノーゲン結合血小板中に見られるよ
うなフィブリノーゲン結合ＧＰIIｂを含む複合体を検出
する方法を考案している。当業者は、これら複合体を形
成するのに利用することができる、よく知られた臨床的
診断化学操作が多く存在することをよく理解できよう。
従って代表的検定法をここに示すが、これにより本発明
が制限されることはない。 １．血栓の検出 被検者中の血栓の存在を検出する方法が考案されてい
る。インビボ指示手段を結合した、抗ｈＧＰIIｂ抗体分
子を含む、本発明の、効果的量の抗体組成物もしくは、
モノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する。好
ましい態様において、ラベル化抗体分子は、ｈＧＰIIｂ
及びポリペプチドｐ１２５−１４５とは免疫反応する
が、ｐ５３−６４とは免疫反応しないもので、ハイブリ
ドーマＰＭＩ−１によって生産されるものであればより
好ましい。

【００７２】その後、この被検者を、ラベル化抗体が血
栓の一部として存在するｈＧＰIIｂと反応し、複合体を
生成するのに十分な予め決めた時間、及び好ましくは、
非結合抗体分子の実質的量が身体から一掃されるのに必
要な付加的時間維持する。さらにこの被検者を、生成し
たラベル化複合体の存在、及び好ましくその位置につい
て検定する。 ２．身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検
出 好ましくは血液や血液の血小板含有画分のような体液サ
ンプルなどの、血小板含有身体サンプル中のフィブリノ
ーゲン結合血小板の存在及び好ましくはその量を検出す
るために、競合的、非競合的にかかわらず、種々の不均
一及び均一検定プロトコールが使用できる。例えば、ヘ
パリン保存（非凝血化）血液サンプル及び ¹²⁵Ｉラベル
化ＰＭＩ−１抗体分子を混合する。このようにして生成
した免疫反応混合物を、生物検定条件下、フィブリノー
ゲン結合血小板がラベル化抗体と免疫反応し、ラベル化
免疫反応産物を生成するのに十分な時間維持する。それ
から、このラベル化免疫反応産物を典型的には、サンプ
ル中に存在する全ての血小板がペレット化するのに十分
な遠心により、未反応ラベル化抗体から分離する。その
後、この生成したラベル化免疫反応産物の量を検定す
る。生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及びポリ
ペプチド分子及び検定しようとするフィブリノーゲン結
合血小板の生物学的活性を維持する条件である。これら
の条件には、約４℃から約４５℃の範囲で、好ましくは
約３７℃の温度、約５から約９の範囲で、好ましくは約
７のｐＨ値、及び蒸留水から、約１モル濃度塩化ナトリ
ウムまでの範囲で、好ましくはおよそ生理的食塩水のイ
オン強度が含まれる。このような条件を至適化する方法
は、当分野ではよく知られている。

【００７３】

【実施例】例 次に示す例は、本発明を説明するものでその制限を意図
したものではない。 １．ＧＰIIｂ−III ａの単離 Ａ．血小板の単離 最終濃度、ミリリットル当り0.０６ユニットのヒルビン
（ＭＯ州、セントルイス、シグマケミカル社）を含むＡ
ＣＤ５ml（0.０６５Ｍクエン酸、0.０８５Ｍクエン酸ナ
トリウム、２％デキストロース）にヒトの血液６ミリリ
ットル（ml）を採取し、これを１２０×ｇで１５分間遠
心する。富血小板血漿（ＰＲＰ）と命名した。この上清
を回収し、単離してから、さらに、１２００×ｇで１５
分間遠心して、単離血小板のペレットを作った。 Ｂ．血小板からのＧＰIIｂ−III ａの単離 例１Ａにおけるように調製した血小板ペレットを５mlの
ＴＢＳ（0.１５Ｍ ＮａＣｌ、0.２Ｍトリス、pH7.４、
５×１０^-4Ｍ ＣａＣｌ₂ 、１０^-5Ｍロイペプチン）に
懸濁し、モデルＭ−３７５ソンケーターを用い、最高強
度で１０分間、氷上で超音波処理した（ＮＹ州、プレイ
ンビュー、ヒートーシステム・ウルトラソニックス）。
この超音波処理したサスペンジョンを、ドライアイス−
メタノールアイスバスを用いて２度凍結融解を行ない、
ついでマイナス２０℃で保存した。この凍結融解したペ
レット超音波処理物を５mlのスクロース溶液（ＴＢＳ中
４０％ｖ／ｖ）上に重層し、ついで、ＳＷ４１遠心ロー
ター（ＣＡ州、フラートン、ベックマン・インスツラメ
ンツ）を用いて、４℃、毎分３８０００回転で１時間遠
心すると、ミルク色の下層が生ずる。その後、このミル
ク色の下層を回収し、ＳＷ５0.１遠心ローター（ベック
マン）を用い、４℃で１時間、４３，０００ＲＰＭで遠
心した。生成したペレットを典型的には１〜２mlＴＢＳ
に懸濁して、血小板メンブレン溶液を作り、そのタンパ
ク質濃度を典型的には、バイオ−ラドタンパク質検定キ
ット（ＣＡ州、リッチモンド、バイオ−ラド）を、業者
の説明書に従って用いて、１０−２５mg／mlの範囲での
測定を行った。

【００７４】再度、この血小板メンブレン溶液を、ＳＷ
５0.１遠心ローターを用いて、上述のように遠心し、つ
いで生成したペレットを、２mlの抽出バッファ（0.０３
Ｍトリス、pH7.４、１×１０^-5Ｍロイペプチン、２００
ｍＭ ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；
ＣＡ州、ラジョラ、カルバイオケム−ベーリング）に懸
濁した。このようにして作った血小板メンブレン抽出物
を渦巻攪拌により完全に混合し、そして室温に３０分
間、維持した。その後、この抽出物をＳＷ５0.１遠心ロ
ーターを用いて、４℃、４５０００rpm で１時間遠心
し、そして、このようにして生成した血小板メンブレン
抽出物上清を回収した。この回収した上清を、１リット
ルのカラムバッファ（0.０３Ｍトリス、pH7.４、0.１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ 、0.１％ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グ
ルコピラノシド）で平衡化した。ＬＫＢウルトロゲル、
アクタ３４ゲル濾過カラム（３×９７cm、ＭＤ州、ゲイ
サーズバーグ、ＬＫＢインスツルメント社）にかけ、こ
のカラム溶出物から５mlづつのフラクションを採取し
た。各フラクションの２８０ナノメーターの光学密度を
測定し、いくつかのピーク付近のフラクションを合せ
て、各ピークのプールを作った。各プール由来のサンプ
ルを、還元バッファ及びレムリ（Laemmli)（ネイチャー
（Nature）（ロンドン）、２２７、６８０−６８５（１
９７０））によって報告された操作、及び１4.４キロダ
ルトン（ＫＤａ）から９2.５ＫＤａのサイズ範囲の低分
子量タンパク質標準物質（ＣＡ、リッチモンド、バイオ
−ラド）を用いて、６％ポリアクリルアミド・スラブゲ
ルによる電気泳動で分析した。

【００７５】ＧＰIIｂ及びＧＰIII ａに相当する分子
量、すなわち、各々１２０ＫＤａ及び１００ＫＤａの主
要な２種のタンパク質を含むプールが回収された。この
ように調製した、単離ＧＰIIｂ−III ａ調製物のタンパ
ク質濃度は、典型的に、バイオ−ラドタンパク質検定キ
ットを用いて、0.３から0.８mg／mlの範囲であると測定
された。 ２．ポリクローナル抗ＧＰIIｂ−III ａの抗血清の調製 例１で説明したように調製した、完全フロイント・アジ
ュバント及び単離したＧＰIIｂ−III ａタンパク質１０
０マイクログラム（μｇ）を含む組成物による免疫化に
より、ウサギ抗ＧＰIIｂ−III ａ抗体を調製した。ＧＰ
IIｂ−III ａの二次免疫注射を三週間の間、一週間スケ
ジュールに従い、不完全フロイントアジュバントを用
い、いくつかのイントラダーマル部位に投与し（典型的
には４部位に１００μｇを分配する）、ついでさらに３
ケ月間、二週間スケジュールに従って投与した。 ３．ｃＤＮＡライブラリー構築、抗体スクリーニング及
びｃＤＮＡの同定 全細胞性ＲＮＡを、グアニジニウム・イソチオシアネー
ト／塩化セシウム法を用い、ＨＥＬ細胞から調製した。
ポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを２サイクルのオリゴ（ｄＴ）セル
ロース・クロマトグラフィーにより、全ＲＮＡフラクシ
ョンから精製した。二本鎖ｃＤＮＡは、標準操作に従
い、ＡＭＶ逆転写酵素（ＦＬ州、セント・ピータースバ
ーグ、ライクサイエンス社）及びランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、１０μｇのＨＥＬポリ（Ａ
⁺ ）ＲＮＡから合成した。サイズ選択したｃＤＮＡを、
ファージｇｔ１１のＥcoＲＩ部位にライゲーションし、
ストラタジーン・クローニクングシステムズ社から市販
されているギガパック・パッキング抽出物を用い、その
業者のプロトコールに従ってそのファージ中に包み込ん
でから、大腸菌Ｙ１０８８にプレーティングし、増巾し
た。大腸菌Ｙ１０９０へのファージのプレーティング、
融合タンパク質合成の誘導、ニトロセルロースフィルタ
ーへの転移及び、例２で調製したウサギのポリクローナ
ルＧＰIIｂ−III ａ抗血清による、そのフィルターのス
クリーニングは、イムノパーオキシダーゼに基づくベク
タスタインＡＢＣ法（ＣＡ州、バーリンガム、ベクター
ラボラトリーズ社）を業者の説明書に従って用いた、ヤ
ング（Young)等（プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci.) ＵＳＡ、８０、１１９４−１１９８（１９８
３））によって報告されたように行った。陽性の組換え
クローンをプラーク精製し、増巾してから、プレート溶
解物として採取した。

【００７６】ウサギのポリクローナルＧＰIIｂ−III ａ
の抗血清による、２００，０００個の組換え体の最初の
スクリーニングで６個の免疫反応クローンが同定され
た。陽性クローンのベーターガラクトシダーゼーｃＤＮ
Ａ融合タンパク質と、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１と
の免疫反応性を試験するため、ファージ溶原体を、ヤン
グ（Young)等（サイエンス（Science)、２２２、７７８
−７８２（１９８３））の報告に従い大腸菌Ｙ１０８９
株で作った。ＩＰＴＧ誘導培養物由来の溶解物を、還元
性ゲルサンプルバッファ中に、そのバクテリア細胞ペレ
ットを懸濁することにより調製し、その後、このサンプ
ルを、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動して
から、トービン（Towbin) 等（プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、２６、４３５０−４３５４
（１９７９））により報告されているように、ニトロセ
ルロースフィルターに転移し、ついでベカスタインＡＢ
Ｃ法を用い、ＰＭＩ−１で探った。

【００７７】１．１キロベース（ｋｂ）の挿入物を含
む、これらのクローンの１つ、ＨＥＬ４１は、ＧＰIIｂ
エピトープを有するものと一致する特徴を有する１４０
ＫＤａのバクテリア融合タンパク質の合成を行うことが
分った。これらの特徴には、(1) ＨＥＬ４１クローンに
よりコードされる融合タンパク質との、ポリクローナル
抗ＧＰIIｂ−III ａの抗体組成物の阻害可能な反応性
は、単離したＧＰIIａ−III ａによる予備吸着により阻
害されること、(2) 血小板溶解物及び精製ＧＰIIｂ−II
I ａのイムノブロットにおいて、融合タンパク質に関し
アフィニティー精製した抗体とＧＰIIｂとの特異的反
応、及び(3) 表面ラベル化血小板由来のＧＰIIｂ−III
ａの、アフィニティー精製抗血清による免疫沈殿化が含
まれる。アフィニティー精製抗体は、ウェスタンブロッ
ティングによるビトロネクチンレセプター（ＶｎＲ）の
アルファサブユニットとの反応を起こすことができず、
また関連する内皮細胞サイトアドヘシンを免疫沈殿化す
ることができない。さらに、ＨＥＬ４１によりコードさ
れる融合タンパク質は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１
との免疫反応性を有し、このことは、このクローンがＧ
ＰIIｂ上にあるエピトーマをコードしている証拠を提供
している。 ４．ＤＮＡの配列決定及び配列解析 ＨＥＬ４１由来の組換えファージＤＮＡを液体培養技術
により精製し、ＥcoＲＩで消化してからＭ１３mp１８に
サブクローン化した。各鎖のＤＮＡ配列は、ビギン（Bi
ggin) 等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.)
ＵＳＡ、８０、３９６３−３９６５（１９８３））によ
り報告されているような、³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ及びバッファ
勾配ゲルを用い、サンガー（Sanger) 等（プロシーディ
ング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７４、５４６３
−５４６７（１９７７））のダイデオキシ・チェーン・
ターミネーション法により決定した。ｃＤＮＡ配列は、
ストラウス（Stranss)等（アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Anal. Biochem.) 、１５４、３５３−３６０
（１９８６））により報告されている特異的プライマー
依存ＤＮＡ配列決定法を用いて伸長した。オリゴヌクレ
オチド２０マーシーケンシングプライマーは、アプライ
ド・バイオシステムズ、モデル３８０Ａ ＤＮＡシンセ
サイザーを用いて合成した。不明瞭さを除くため両鎖と
も配列決定を行った。

【００７８】クローンＨＥＬ４１のヌクレオチド配列を
図１に示したが、それは、次のような特性を有してい
る。挿入物は、部位６８２番から始まるＴＡＧ終止コド
ンとそれに続く４２０塩基の３′非翻訳配列を伴う、６
８１塩基の読み取り枠からなる。このクローンの５′末
端の初めの１２０ヌクレオチドは、コンセンサスＡｌｕ
反復配列の特徴を有しており、このことは、このクロー
ンが不完全なプロセッシングを受けたｍＲＮＡに由来す
ることを示している。クローンＨＥＬ４１のｃＤＮＡ配
列は、２２７個のアミノ酸の読み取り枠をコードしてい
る（図１）。シャロ（Charo)等（プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８３、８３５１−８３
５６（１９７６））により報告されているように、ＧＰ
IIｂの軽鎖の配列決定されたＮ末端配列は、このクロー
ン内のアミノ酸残基１５７番から１７１番として同定さ
れる。このコンセンサスＡｌｕ反復配列が読み枠どおり
に翻訳されると、これは、ＨＥＬ４１にコードされてい
る最初の４０個のアミノ酸に対応することを示してい
る。

【００７９】マトリクス分析（ジョージ（George) 等、
ＰＩＲレポート＃ＲＥＬ−０２８６、ナショナル・バイ
オメディカル・リサーチ・ファンデーション（１９８
６））によるＧＰIIｂ及びＶｎＲアルファサブユニット
の誘導されたアミノ酸配の比較（スズキ（Suzuki）等、
プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、８
３、８６１４−８６１８（１９８６））は、保存的置換
を可能とする類似性を有する２つの領域を検出した。お
よそ５０個のアミノ酸残基にわたる１つの領域は、重鎖
のカルボキシ末端付近に位置する。約１５残基の第２の
領域は、軽鎖のアミノ末端付近に位置し、両タンパク質
の重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合の形成に関係する
システィン残基を含んでいる。突然変異データマトリク
スを用いたリレート・プログラムによる、ＧＰIIｂ及び
ＶｎＲアルファサブユニットの配列間の関係の統計的意
義の評価は、２つの配列に存在する、この類似性の度合
を偶然に見つける確率の低さを示している（Ｐ＜0.００
０１）。ＧＰIIｂ及びＦｎＲアルファサブユニットの配
列間の関係を分析すると（アーグレイブス（Argraves）
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）２６１、１２９２２−１２９２４
（１９８６））、この２つの配列中に存在する類似性の
度合を偶然に見つける確率が同様に低いことが示された
（Ｐ＜0.０００５）。

【００８０】コンピュータ調査では、ＧＰIIｂのこの領
域とＮＢＲＦタンパク質データーベースに存在する他の
配列間にその他の明白な類似性は明らかにされなかっ
た。さらに、神経細胞粘着分子、Ｎ−ＣＡＭの、報告さ
れている部分配列との直接の比較で有意な一致は検出さ
れなかった。５．ポリペプチド合成ヌクレオチド配列か
ら誘導されたアミノ酸残基に基づいて、ここで使用され
ている種々のＧＰIIｂ領域に対応するポリペプチドを、
ハーゲンメイヤー（Hagenmaier) 等（ポプセイラーズ・
Ｚ．フィジオロジカル・ケミストリー（Hoppe-Seyler's
Z. Phisiol. Chem.）３５３、１９７３（１９８２））
の対称無水物法を用い、アプライド・バイオシステムズ
社モデル４３０ペプチドシンセタイザーで化学合成し
た。

【００８１】合成したポリペプチドのアミノ酸残基配列
及び図１に示したＧＰIIｂの誘導されたアミノ酸残基配
列内のそれらの位置を表２にリストした。

【００８２】

【表２】 表２ 名称 アミノ酸残基配列 ｐ１９−３４ ＷＥＡＫＡＧＲＳＰＥＶＲＳＳＲＳ ｐ５３−６５ ＲＥＱＮＳＬＤＳＷＧＰＫＶ ｐ１２９−１４５ ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ１３６−１４５ ＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ ｐ１４４−１５６ ＲＱＩＦＬＰＥＰＥＱＰＳＲ ６．モノクローナル抗体組成物の調製 単離したイムノグロブリンＩｇＧ（ＩｇＧ）を含むモノ
クローナル抗体組成物を、典型的にファルマシア社（Ｎ
Ｊ．ピスカタウェイ）から市販されており、業者の説明
書に従って用いられるプロティンＡ−セファロースを用
いて、マウスのハイブリドーマ細胞系列ＰＭＩ−１（Ａ
ＴＣＣ番号ＨＢ９４７６）を含むマウスの腹水から単離
した。単離したＩｇＧのタンパク質濃度を、バイオラド
のプロティンアセッセイ・キットを業者の説明書に従っ
て使用することにより測定した。

【００８３】¹²⁵ Ｉラベル化抗体を含むＰＭＩ−１モノ
クローナル抗体組成物を調製するため、１ミリリットル
当り１ミリグラムの上記単離ＰＭＩ−１ＩｇＧを含む、
３５０マイクロリットル（μｌ）のＰＢＳ（0.１５Ｍ
ＮａＣｌ、0.０１Ｍリン酸ナトリウム、pH7.０９）を、
４０マイクログラム（μｇ）のクロラミン−Ｊ及び１ミ
リキューリー（ｍ Ｃｉ）の無キャリィーＮａ ¹²⁵Ｉ
（ＩＬ州、アーリントン・ハイツ、アマーシャム）と混
合した。この混合物を約２０℃に５分間維持し、その
後、２０μｌの２mg／mlメタ重亜硫酸ナトリウム溶液及
び２０μｌのヨウ化カリウム溶液と混合する。それか
ら、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ８００μｌを混合し、さ
らに最終濃度１０ｍＭとなるように、ジイソプロピルフ
ルオロホスフェートを混合する。この混合物を２２℃で
６０分維持してから、ＰＢＳに対して透析する。生成し
た ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１の比活性はμｇ当り約4.５
マイクロキューリーであった。

【００８４】上述の単離１ｇＧ由来のＦａｂ断片を含む
組成物は、パパインによる、３７℃、６時間の消化（パ
パインに対するＩｇＧの重量比、１：２００）する、メ
ージ（Mage）等の方法に従って調製した（メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology)７０、
１４２−１５０（１９８０）。未消化のＩｇＧ及びＦｃ
断片を、プロティンＡ−セファロースによるクロマトグ
ラフィーで除去した。こうしてできたＦａｂ断片含有組
成物は使用準備ができており、もしくは、必要なとき
は、上述のモノクローナル抗体組成物で報告した操作と
同様に、 ¹²⁵Ｉラベルした。ＰＭＩ−１と異なる免疫特
異性を有する、本発明のモノクローナル抗体も、ＰＭＩ
−１と同様に調製される。たとえば、このうな組成物
は、マウスのハイブリドーマ細胞系列ＰＭＩ−２を用い
て調製した（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９６１５）。 ７．イライザ検定法（ＥＬＩＳＡ） Ａ．ポリペプチドイライザ法 ＰＭＩ−１及びＴａｂモノクローナル抗体組成物中に含
まれる抗体分子を、ポリペプチドｐ１２９−１４５及び
ｐ１４４−１５６と免疫反応する能力について調べた。
（Ｔａｂは、コントロールとして用いた無関連モノクロ
ーナル抗体である。）２０μＭのポリペプチドを含む５
０マイクロリットル（μｌ）コーティング溶液（0.１Ｍ
ＮａＨＣＯ₃ 、pH8.５、0.１％ ＮａＮ₃ ）を、平底
９６穴マイクロプレート（イムロン２、ＶＡ州、チャン
ティリー、ダイナテク・ラボラトリーズ社）のウェルに
入れた。その後、このプレートを３７℃に６０分間維持
し、ポリペプチドをウェルの壁上に吸着させる。振っ
て、このコーティク溶液を除き、このウェルを、洗浄バ
ッファ（0.０１Ｍトリス、pH7.４、0.０５％トウィーン
２０、0.１５Ｍ ＮａＣｌ、２００mg／mlメルチオレー
ト）で２度すすぎ、さらに各ウェル（固体サポート）に
５０μｌのブロッキングバッファ（コーティング溶液中
の５％ウシ血清アルブミン溶液）を加えて、過剰のタン
パク質部位をブロックした。

【００８５】このウェルを約３７℃に６０分間維持して
から、このブロッキング溶液を除去した。各ウェルに、
(a) 例８で調製し、かつ希釈バッファ（５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ及び１mg／mlＢＳＡを含む洗浄バッファ）で２００倍
に希釈した、ウサギ抗ポリペプチド抗体、(b) 例６で報
告したように調製した、1.５ナノモル濃度（ｎＭ）のＰ
ＭＩ−１モノクローナル抗体ＩｇＧ、もしくは希釈バッ
ファで３２０，０００倍に希釈した、ＴＡＢハイブリド
ーマ腹水（ＴＸ州、サンアントニオ、テキサス大学、
Ｒ．マクエバー博士より提供された）を含む溶液５０μ
ｌを加えた。このようにしてできた固／液相免疫反応混
合物を６０分間、室温に維持して、固相結合ポリペプチ
ド及び添加された抗体との第１の固相結合免疫反応産物
を形成させた。それから、この固液相を分離し、このウ
ェルを洗浄バッファで２度すすいでから、過剰の液体を
振って除去した。

【００８６】希釈バッファで２０００倍に希釈した、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（ＣＡ州、バーリンガム、タゴ社）、もしく
は、希釈バッファで２０００倍に希釈したヤギ抗ウサギ
ＩｇＧ（ＣＡ州、リッチモンド、バイオ・ラド・ラボラ
トリーズ社）を含む溶液５０μｌを各ウェルに添加し、
第２の固／液相免疫反応混合物（ラベル化免疫反応混合
物）を形成させた。このウェルを５０分間、室温に維持
して、ラベル化抗体及び第１の免疫反応産物の固相結合
抗体間の第２免疫反応産物を形成させた後、洗浄バッフ
ァで２度すすいで、固相結合ラベル含有免疫反応産物を
単離した。それから、過剰の液体をウェルから除去し
た。ＣＰバッファ（水１リットル当り、0.１Ｍクエン酸
２４３ml及び0.２Ｍリン酸二ナトリウム２５０ml）中、
0.４mg／ml ｏ−フェニレンジアミン及び0.０１２％
（ｖ／ｖ）過酸化水素を含む発色基質溶液５０μｌを各
ウェルに加え、発色反応混合物を作る。この発色反応混
合物を、約２０℃に１０分間維持した後、２ＮＨ₂ ＳＯ
₄ ５０μｌを各ウェルに添加して、この発色反応をを停
止してから、この溶液の４９０ナノメーター（ｎｍ）の
吸光度を、モデル３１０イライザ・プレート・リーダー
（ＶＴ州、ウィノスキー、バイオテク・インスツルメン
ト社）を用いて測定した。

【００８７】表３に示した、本研究の結果は、モノクロ
ーナル抗体ＰＭＩ−１が、ポリペプチドｐ１２９−１４
５と免疫反応するが、ポリペプチドｐ１４４−１５６と
は免疫反応しないことを示している。以下に議論してい
るように、ＰＭＩ−１は、ＧＰIIｂ−III ａがフィブリ
ノーゲンと結合したとき、ｈＧＰIIｂにより形成されて
いる（上に露出している）潜在的決定基と免疫反応する
ため、本研究の結果は、ｐ１２９−１４５がｈＧＰIIｂ
潜在的決定基を真似る能力を有していることを示してい
る。

【００８８】

【表３】 表３ ポリペプチド モノクローナル抗体 抗原 ＰＭＩ−１ Ｔａｂ ｐ１２９−１４５ 1.３１０±0.１３² 0.０６８±0.００９ ｐ１４４−１５６ 0.０６９±0.００５ 0.０６１±0.００５ ＢＳＡ¹ 0.０６８±0.００５ 0.０６０±0.００４ ¹ ＢＳＡ＝ネガティブコントロールとして使用されたウシ血清 アルブミンコーティングしたウェル。 ２．三回の測定から得られた平均光学密度の値±標準偏
差 Ｂ．競合イライザ法 ポリペプチド及び単離ＧＰIIｂ−III ａについて、ＰＭ
Ｉ−１及びＴａｂモノクローナル抗体組成物中に含まれ
る抗体分子との免疫反応に対し、固相ＧＰIIｂ−III ａ
と抗原として競合する能力を調べた。

【００８９】競合イライザ法は、１）ポリペプチドの代
りに、例１で報告したように単離したＧＰIIｂ−III ａ
をコーティング溶液中２０μｇ／mlで用いてマイクロプ
レートのウェルをコートすること、及び２）抗体を添加
し、免疫反応混合物を作る直前にウェルにＧＰIIｂ−II
I ａもしくはポリペプチドを各々、0.７３μＭもしくは
２５μＭ濃度でウェルに添加すること、以外は、例７Ａ
で述べたように行った。表４で示した、本研究の結果
は、ｐ１２９−１４５及びＧＰIIｂ−III ａが競合的
に、固相ＧＰIIｂ−III ａに対するＰＭＩ−１抗体分子
の免疫学的結合を阻害する一方、ｐ１４４−１５６は阻
害しないことを示している。加えて、ポリペプチドは、
ＧＰIIｂ−III ａと免疫反応するＴａｂ抗体分子の能力
に有意な影響を示さなかった。これらの結果は、ポリペ
プチドｐ１２９−１４５がｐ１２９−１４５アミノ酸残
基配列を含むｈＧＰIIｂ領域の二次構造及び抗原決定基
を真似る能力を有することを示している。

【００９０】

【表４】 表４ 競合者 モノクローナル抗体 ＰＭＩ−１ Ｔａｂ ｐ１２９−１４５ 0.０６７±0.００２¹ 1.００２±0.０２６ ｐ１４４−１５６ 0.８１４±0.０１２ 1.１１７±0.０２４ なし 0.８０４±0.００２ 1.０４０±0.０５ ＧＰIIｂ−III ａ 0.４３３±0.０１３ 1.１３４±0.０１０ １．三回の測定から得られた平均光学密度値±標準偏差 ８．抗ペプチド抗血清の調製 抗ペプチド抗血清は、例５で調製したペプチドでウサギ
を免疫化することにより作った。グルタルアルデヒドを
用いた、抗原キャリヤーとしてチログロブリン（ＭＯ
州、セントルイス、シグマケミカル社、ウシＩ型）への
ペプチドの結合を、参考として、ここに組込んだＪ．
Ｇ．ドクレー（Dockray)の報告（制御ペプチド（Regula
tory Peptides)、１、１６９−１８６（１９８０））に
従って行った。その後、一次免疫に、４００μｇのチロ
グロブリン結合ペプチドを用いたこと以外は、例２で述
べたように免疫化を行った。 ９．ポリペプチドによる、血小板会合ＧＰIIｂへの抗体
結合の阻害 Ａ．血小板の調製 例１Ａで示したように調製した単離血小板を、１mg／ml
のＢＳＡ及び１mg／mlデキストロースを含む無カルシウ
ムタイローズバッファ（0.１３Ｍ ＮａＣｌ、0.００２
６Ｍ ＫＣｌ、0.００２Ｍ ＭｇＣｌ₂ −６Ｈ₂ Ｏ、５
ｍＭヘペス、0.０１２Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、pH7.２）２ml
に懸濁した。この血小板サスペンジョンを、同様のタイ
ローズバッファで平衡化したセファロースＣＬ２Ｂカラ
ム（ＮＪ州、ピスカタウェイ、ファルマシア社、４０ml
全吸着床容積）にかけた。血小板を、最終容積約４〜５
mlの、ＣＬ２Ｂカラムの空隙容量から回収し、洗浄血小
板及びこの洗浄血小板サスペンジョンと命名し、コール
ター社モデルIIカウンター（ＦＬ州、ハイアリーフ、コ
ールターエレクトロニクス社）で計数した。全血小板調
製操作は、プラスチック容器中及び室温で行った。 Ｂ．血小板競合検定法 例９Ａで述べた、タイローズバッファ中に調製した洗浄
血小板（２×１０⁸ ／ml）を、最終濃度５ｍＭとなるよ
うなテトラエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）と混合し、３０
分間３７℃に維持して、ＰＭＩ−１結合エピトープに露
した。その後、この血小板を図２に示した濃度のポリペ
プチドと混合し、さらに、例６で調製した。 ¹²⁵Ｉラベ
ル化ＰＭＩ−１と混合させて、生成した免疫反応混合物
中、１μＭのラベル化抗体を作る。この混合物を２２℃
に３０分間維持し、免疫反応産物を形成させる。その
後、 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１／血小板免疫反応産物
は、その維持した全混合物を、ベックマン・マイクロフ
ュージＢ（ＣＡ州、フラートン、ベックマン・インスツ
ルメント社）中、0.３mlの２０％スクロース中での遠心
により未結合の ¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１から単離され、血小
板ペレットとした。血小板ペレットに会合した放射活性
¹²⁵Ｉ−ＰＭＩ−１の量を、シンチレーションスペクト
ロメトリーにより測定した。

【００９１】図２に示した、本研究の結果は、ポリペプ
チドｐ１２９−１４５が、二価カチオンの非存在下、血
小板メンブレン会合ＧＰIIｂへの、抗体分子結合を競合
的に阻害しうることを示している。また、図２は、抗体
分子濃度が１μＭのとき、５０％阻害が、1.６μＭのポ
リペプチド濃度で起こることから、ｐ１２９−１４５／
ＰＭＩ−１相互作用のおよそのＫｄ値が1.２μＭである
ことを示している。 １０．フィブリノーゲン結合血小板による、ｈＧＰIIｂ
潜在的決定基の発現 例１ａで示したように、富血小板血漿（ＰＲＰ）を調製
し、３つの部分標本に分けた。１つの部分標本におい
て、血小板を最終濃度５０μＭとなるようアデノシン二
リン酸は添加することにより刺激して、官能性ＧＰIIｂ
−III ａ（フィブリノーゲンレセプター）を発現させ、
ＡＤＰ刺激血小板を生成した。第２の部分標本におい
て、最終濃度５０μＭのエピネフリンの添加によりＧＰ
IIｂ−III ａの発現の刺激を行った。両方の場合、刺激
を受けた血小板上に発現したＧＰIIｂ−III ａフィブリ
ノーゲンレセプターは、血漿中に存在するフィブリノー
ゲンと結合し、フィブリノーゲン結合血小板となる。ネ
ガティブコントロールとして、ＰＲＰの第３の部分標本
は刺激せず、非刺激血小板とした。

【００９２】通常の技術で、例６で述べた、 ¹²⁵Ｉラベ
ル化抗体から調製した、 ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１ Ｆ
ａｂ断片を、最終濃度0.８μＭとなるよう各ＰＲＰ部分
標本に添加した。このようにして生成した免疫反応混合
物を３０分間３７℃に維持し、ラベル化した免疫反応産
物、すなわち、フィブリノーゲン結合血小板／ ¹²⁵Ｉ−
ＰＭＩ−１複合体を形成させた。それから、ラベル含有
免疫反応産物を、例９Ｂで述べたようなスクロースクッ
ションを介した血小板の遠心により、未結合 ^{1 25}Ｉ−Ｐ
ＭＩ−１から分離した。図３は、本研究の結果を示して
おり、ＰＭＩ−１抗体分子が、刺激化フィブリノーゲン
結合血小板とは免疫反応するが、実質的に、非刺激化血
小板とは免疫反応しないことを示している。非刺激化Ｐ
ＲＰ部分標本中“結合”していると見なされる ¹²⁵Ｉ−
ＰＭＩ−１は、非特異的結合（“スティッキング”）、
そして、または、天然のバックグランドレベルの刺激化
フィブリノーゲン結合血小板もしくは、取扱いの結果と
して結合及び刺激化された血小板の存在によるものであ
ると考えられている。それゆえ、これらの結果は、ＧＰ
IIｂ−III ａサイトアトヘシンによる、フィブリノーゲ
ン、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸残基配
列含有リガンドの結合は、その他の潜在的抗原決定基を
発現させることを示している。このように、ＰＭＩ−１
抗体分子及び同様の免疫特異性を有する抗体分子は、血
液サンプル中の刺激化フィブリノーゲン結合血小板の存
在及びその量の検定に使用することができる。 １１．ポリペプチドによる血小板凝集の阻害 例１Ａで述べたように調製した富血小板血漿（ＰＲＰ）
２００μｌを、ＢＳＡ及びテキストロース（各々１mg／
ml）を含むタイローズバッファ１９０μｌ及び表４で示
した種々の量のポリペプチドｐ１２９−１４５もしくは
ｐ１４４−１５６と混合した。それから１０μｌのＡＤ
Ｐ（タイローズバッファ中８０μＭ）を添加して、血小
板凝集を刺激した。この混合物を３７℃に維持しなが
ら、デュアルサンプルアグリゲーションメーター（ＣＯ
州、モリソン、シエンコ社、モデルＤＰ−２４７Ｅ）を
用い、この混合物の透過率の時間変化をモニターした。

【００９３】アグリゲーションメーターは、２００μｌ
のＰＲＰ及び２００μｌのタイローズバッファを含む溶
液を用い、コントロールアグリゲーションに対しては５
％、及びポリペプチド存在下のアグリゲーションに対し
ては１０％に透過率のベースラインをセットすることに
より補正した。１００％透過率の上限は、１００mlＰＲ
Ｐ及び３００μｌのタイローズバッファの混合物を用い
て一律に設定した。 １２．抗ペプチド抗血清を用いたＧＰIIｂ軽鎖の免疫反
応 例１Ａで述べたように調製した約１兆個の血小板を１ml
の冷ＰＢＳ（すなわち４℃）懸濁し、ついで、２００μ
ｇのラクトパーオキシダーゼ（シグマ社）及び２ｍ Ci
の無キャリヤーＮａ ¹²⁵Ｉ（１６ｍ Ci ／μｇ、ＩＬ
州、アーリントンハイツ、アマーシャム）と混合し血小
板ラベル化サスペンジョンを調製した。それから、５分
間隔で２回、0.０６％ストック溶液から５μｌのパーオ
キサイドをこのサスペンジョンに添加し、４℃に維持し
て、ラベル化反応を開始させた。その後、２００μｇの
チロシンを加えて、この反応を停止させ、１２００ｘ
ｇ、１５分の遠心を５回繰り返して洗浄し、さらに冷Ｐ
ＢＳに懸濁して、ラベル化血小板サスペンジョンを調製
した。５番目の遠心ステップの後、このラベル化血小板
を、４０mlの溶解バッファ１（0.５％トライトンＸ−１
００（ｖ／ｖ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／mlベ
ンズアミジン及び１００ユニット／mlのトラシロール；
全てシグマ社製）に懸濁することにより、ラベル化血小
板溶解物を調製した。

【００９４】１mlのラベル化血小板溶解物を１５μｌの
加熱失活化正常ウサギ血清（ＮＲＳ）と混合し、２２℃
に３０分間維持し、さらに、免疫反応バッフぁ（ＩＰ
Ｂ：0.０２Ｍトリス塩酸、pH7.４、0.１５６Ｍ ＮａＣ
ｌ、0.０１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンスアミジン−塩
酸、１０μｇ／mlソイビーン・トリプシン・インヒビタ
ー、0.２ｍＭフェニルメチルスルホニル・フルオライ
ド、１％（ｖ／Ｖ）トライトンＸ−１００、0.０５％
〔ｖ／Ｖ〕トウィーン２０、0.０２％〔ｗ／Ｖ〕ＮａＮ
₃ 、５ユニット／mlトラシロール；全てシグマ社製）中
に調製した。１０％（ｖ／Ｖ）ハイソービル（ＣＡ州、
ラジョラ、ベーリング、ダィアグ／スティクス社）溶液
１００μｌを添加し、ベックマン、マイクロフュージＢ
中で１分間遠心し、ついで生成した上清を単離して、透
明な溶解物を調製した。このＮＲＳの添加、維持、パン
ソービンの添加及び遠心の透明化操作を２度繰り返して
から、再び、ＮＲＳ及び維持ステップを省いた、パンソ
ービンを用いる同様の操作を行ない、三回透明化溶解物
を調製した。

【００９５】その後、この三回透明化溶解物を、２５０
μｌのＩＰＢ、例８で調製した抗ポリペプチド抗血清４
μｌ、例２で調製した抗ＧＰIIｂ−III ａもしくはＮＲ
Ｓ、及び最終濃度１％となるようなウシ血清アルブミン
と混合した。この混合物を、４℃に１２〜１８時間維持
してから、１０％パンソービン１００μｌと混合し、そ
の後、２２℃に１時間維持した。その後、この混合物を
マイクロフュージＢで１分間遠心してから、生成したペ
レットを単離した。この単離ペレットをＩＰＢで２回、
0.５Ｍ ＬｉＣｌで１回、再びＩＰＢで１回洗浄した。
この洗浄操作には、指示したバッファ約１mlへの懸濁、
マイクロフュージＢでの１分間の遠心及び生成したペレ
ットの単離が含まれる。ついでこの洗浄ペレットを溶解
して、レムリ（Laemmli)により報告されているように、
サンプルバッファ約１００ml中、３分間１００℃に加熱
することにより、存在する免疫複合体を脱離させる。例
えば、レムリ（Laemmli)、Ｕ．Ｋ．ネイチャー（Natur
e）（ロンドン）、２２７−６８０−６８５（１９７
０）参照。その後、溶解免疫複合体をマイクロフュージ
Ｂで１分間遠心してから、免疫沈殿化タンパク質を含む
上清を、５％２−メルカプトエタノールを含むレムリ
（Laemmli)バッファーを用い、１５％ポリアクリルアミ
ドスラブゲルでの電気泳動で分析した。さらに、このゲ
ルを乾燥し、そこに含まれているタンパク質をコダック
Ｘ−オマット(Omat)ＡＲフィルム（ＮＹ州、ロチェスタ
ー・イーストマン・コダック社）への放射線露光により
可視化した。この可視化タンパク質の分子量を、１２，
３００及び９７，４００ダルトンの範囲の分子量をも
つ、¹⁴Ｃラベル化タンパク質標準物質に相対的な電気泳
動移動度に基づいて見積った（標準物質；ＭＡ州、ボス
トン、ニューイングランドニュークリアー製）。

【００９６】この方法で分析したラベル化溶解物は、約
２０ＫＤａの分子量をもつ、ゲル上に可視化されたタン
パク質を生じ、このタンパク質は、ポリクローナル抗Ｇ
ＰIIｂ−III ａ抗血清もしくはＮＲＳを用いたときは実
質的には検出されない、抗ポリペプチドｐ１４４−１５
６抗血清使用時のＧＰIIｂ軽鎖タンパク質（ｌＧＰII
ｂ）に対応している。それゆえ、抗ポリペプチドｐ１４
４−１５６抗血清及び同免疫特異性を有する抗体組成物
は、ｌＧＰIIｂを検出するのに用いることができる。 １３．リガンド結合による、ＧＰIIｂ−III ａ潜在的抗
原決定基の発現 Ａ．混合による、潜在的抗原決定基を発現する血小板へ
の抗体結合の検定法 使用するタイローズバッファを始めに、キレックス１０
０（２００−４００メッシュ、ナトリウム型、ＣＡ州、
リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ社）との混
合し、タイローズバッファ中に存在する二価カチオンと
錯体を作るよう維持し、ついでバッファから、錯体を作
った二価カチオンを濾過して除去する処理を行うこと以
外、例９Ａで述べた方法により、洗浄血小板を、ml当り
１×１０ ⁸ 個の濃度となるように調製した。

【００９７】上記の洗浄化血小板含有調製溶液を部分標
本に分けた後、各部分標本中の血小板を、最終濃度５μ
ＭとなるようにＡＤＰを添加することにより刺激してＡ
ＤＰ刺激化血小板を調製した。また、刺激を行なわない
ものも用意した。まず、例６で述べたように調製した、
¹²⁵Ｉラベル化全抗体分子もしくは、 ^{1 25}Ｉラベル化Ｆ
ａｂ断片を含むモノクローナル抗体組成物を種々のポリ
ペプチド及び二価カチオンもくしはＥＤＴＡと混合し
た。さらに、この ¹²⁵Ｉラベル化抗体／ポリペプチド混
合物を、刺激化もしくは非刺激血小板部分標本と、結果
として、抗体もしくはＦａｂ断片濃度が約0.８μＭとな
るように混合した。それから、この免疫反応混合物を３
０分間３７℃に維持し、潜在的抗原決定基を発現させ，
かつ、 ¹²⁵Ｉラベル化免疫反応産物、すなわち、リガン
ド結合血小板／ ¹²⁵Ｉ−抗体もしくは ¹²⁵Ｉ−Ｆａｂ断
片複合体を形成させた。さらに、ラベル含有免疫反応産
物は、例９Ｂで報告されているように、スクロースクッ
ションを介しての部分標本の遠心により、未結合 ¹²⁵Ｉ
ラベル化抗体又はＦａｂ断片から分離した。

【００９８】表５は、モノクローナル抗体ＰＭＩ−１を
用いた、リガンド存在下の、血小板へのラベル化抗体の
結合を検定した結果を示す。

【００９９】

【表５】 表５ ＰＭＩ−１ ＩｇＧ又はＦａｂの血小板への結合におけるリガンド依存の増加 抗体種 リガンド² 結合ＰＭＩ−１の増加¹ 未刺激 刺激化 ＰＭＩ−１ ＩｇＧ ＫＹＧＲＧＤＳ ６３７８±７５３ ６０００±７１４ ＧＲＧＤＳＰ ５３１３±５２２ ５５６１±１５８ ＧＲＧＥＳＰ ８９８±３５７ ８３７±３７４ Ｈ−１２ Ｎ．Ｄ．³ ３６６３±８７８ ＥＤＴＡ ６０６４±５９３ ５６７４±５１２ ＰＭＩ−１ Ｆａｂ ＫＹＧＲＧＤＳ ７７２２±１１８９ ５６６１±３７３ ＧＲＧＤＳＰ ４４３７±８５２ ５２５０±３００ ＧＲＧＥＳＰ −２７９±２８１ １４７±１６５ Ｈ−１２ Ｎ．Ｄ． ３０１４±４３０ ＥＤＴＡ ５２９９±２２５ ６５０５±６６０ １．結合したＰＭＩ−１量の増加は、リガンド存在下で
の結合量から、リガンドは含まないが２ｍＭ ＣａＣｌ
₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 存在下での結合量を引いた値
として観測される増加を、血小板当りに結合したＰＭＩ
−１分子数±標準偏差として表現されている。非刺激又
は刺激化血小板に対する、二価カチオン存在かつリガン
ド非存在下での結合量は、各々、ＰＭＩ−１ ＩｇＧに
対し、６７６９±８４又は６６４３±１５７分子／血小
板であり、また、ＰＭＩ−１ Ｆａｂに対し、各々、３
９１７±２１２又は３７８５±１５０分子／血小板であ
った。

【０１００】２．使用するリガンドは例５で述べたよう
に調製した。指示されたポリペプチドの１つであり、例
１３Ａで述べた免疫反応混合物中の最終濃度が１ｍＭと
なるよう添加するか、又は、アミノ酸配列ＨＨＬＧＧＡ
ＫＱＡＧＤＶを有し、残基３９９−４１０番のフィブリ
ノーゲンガンマ鎖由来のものである。コントロールポリ
ペプチドＨ−１２で、これも１ｍＭ添加される。コント
ロールとしてのリガンドポリペプチドの非存在下では、
4.５ｍＭ ＥＤＴＡが添加された。ＥＤＴＡを含まない
全ての場合に、２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ が含まれる。 ３．測定せず。 表６は、ハイブリドーマＰＭＩ−２より生産される全モ
ノクローナル抗体又はＦａｂ断片（すなわち、ＰＭＩ−
２モノクローナル抗体）を含むモノクローナル抗体組成
物を用いた、リガンド存在下での、抗体の血小板への結
合の実験結果を示している。

【０１０１】

【表６】 表６ 結合ＰＭＩ−２¹ リガンド² 二価イオン³ 未刺激 刺激化 なし ＣａＣｌ₂ １２２０ 2,４８０ ＲＧＤＳ ＣａＣｌ₂ ２２１０ １0,７８０ ＳＤＧＲ ＣａＣｌ₂ １９６０ 2,３６０ ＧＲＧＥＳＰ ＣａＣｌ₂ １５６０ 4,６８０ ４００−４１１ ＣａＣｌ₂ １８４０ 9,６５０ Ｆｇ ＣａＣｌ₂ ２３００ １3,８００ なし ＥＤＴＡ ８６６０ １0,６７０ ＲＧＤＳ ＥＤＴＡ ８５４０ １0,０８０ １．ＰＭＩ−２ ＩｇＧの結合量は例１３Ａで示したよ
うに測定し、指示して条件下、血小板当り結合したＰＭ
Ｉ−２分子数として表現されている。

【０１０２】２．使用したリガンドは、例５で述べたよ
うに調製した。指示されるポリペプチドの１つであり、
最終濃度0.５ｍＭとなるよう添加するか、もしくは、こ
れも、0.５ｍＭとなるよう添加される。残基部位４００
から４１１番のフィブリノーゲンガンマ鎖の配列に相当
する配列を有するポリペプチド、もしくは最終濃度１５
μＭで使用する、マーグエリー（Marguerie)等（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.) 、２５４、５３５７−５３６３（１９７９））
により報告されているように単離したフィブリノーゲン
・タンパク質（Ｆｇ）である。またコントロールとし
て、リガンドの添加がないものも行った。 ３．添加二価カチオンとは、１ｍＭ ＣａＣｌ₂ か、又
は５ｍＭ ＦＤＴＡの二通りの条件を意味する。

【０１０３】表５及び表６に示した結果は、フィブリノ
ーゲン（Ｆｇ）Ｆｇ由来ペプチド、４００−４１１及び
ＲＧＤ含有ペプチドがＧＰIIｂ−III ａを結合し、か
つ、通常、抗原決定基が抑制される条件下、すなわち、
ＣａＣｌ₂ の生理学的濃度存在下、ＰＭＩ−１又はＰＭ
Ｉ−２により認識される潜在的抗原決定基を露出させる
能力を示している。また、この結果は、ＰＭＩ−２によ
り認識される潜在的抗原決定基は刺激化血小板とのリガ
ンド結合で誘導れるが、非刺激化血小板では誘導されな
いことを示している。一方、ＰＭＩ−１により認識され
る潜在的抗原決定基は、刺激化、もしくは非刺激化血小
板の両方との、ポリペプチドリガンドの結合により誘導
される。

【０１０４】さらに、この結果は、ＧＰIIｂ−III ａに
対するこのリガンドの構造特異性も示している。逆配列
ペプチド、ＳＤＧＲは、ＰＭＩ−２認識抗原決定基を誘
導せず、また、通常見うけられるアスパラギン酸残基
（Ｄ）の代りに、グルタミン酸（Ｅ）を用いる保存的置
換は、潜在的抗原決定基誘導リガンドとして、かなり効
果の小さいペプチドを生ずる。このポリペプチドリガン
ド、ＲＧＤＳ濃度を、上記の抗体の血小板結合検定法で
変化させた時、刺激化又は、非刺激化血小板上の潜在的
抗原決定基のリガンド誘導に対する投与−応答曲線が得
られた。潜在的抗原決定基を検出するためにＰＭＩ−１
又はＰＭＩ−２を用いた、投与−応答曲線の結果をＬＩ
ＢＳ誘導率として表現した、図５に示す。ポリペプチド
存在下結果したＩｇＧ量は、完全なリガンド誘導結合部
位（ＬＩＢＳ）の誘導の際の、ＩｇＧの最高結合量の割
合として表現されており、そこでは、4.５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ存在下及びペプチド非存在下での血小板当りのＩｇＧ
分子量として測定したＩｇＧ結合は、１００％誘導とし
て考え、また、２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 存在下、かつ、ペプチド非存在下でのＩｇＧ結合
は、０％誘導と考えた。

【０１０５】図５に示した結果は、ポリペプチドリガン
ドが同じハーフマキシマムリガンド濃度約２ｍＭで２つ
の異なる潜在的抗原決定基を誘導することを示してい
る。さらに、この結果は、ＰＭＩ−２により認識れる決
定基は、刺激化血小板では誘導されるが、非刺激血小板
では誘導されないが、一方、ＰＭＩ−１により認識され
る潜在的抗原決定基は、ＲＧＤＳを用いたとき、刺激化
血小板及び非刺激血小板の両方で誘導されることを示し
ている。ＰＭＩ−１及びＰＭＩ−２モノクローナル抗体
の両方が抗ＬＩＢＳモノクローナル抗体である一方、こ
れら２つの抗体の特異性は区別可能なものであることに
注意すべきである。従って、リガンドによるレセプター
の占有は１つ以上のＬＩＢＳを誘導しうる。結果とし
て、本発明の方法は、細胞表面レセプターリガンド複合
体と免疫反応する１種以上のモノクローナル抗体を生産
するのに使用することができる。

【０１０６】Ｂ．潜在的抗原決定基を発現する可溶性精
製ＧＰIIｂ−III ａへの抗体結合の検定 潜在的抗原決定基の発現を誘導する、種々のポリペプチ
ドの能力を、可溶性の単離ＧＰIIｂ−III ａを用いて研
究した。最後に、次に示すこと以外は、例７Ｂで述べた
様に、競合イライザ法を行った。マイクロプレートは、
ml当り１０μｇ濃度の、例１で述べた様に単離したＧＰ
IIｂ−III ａを含むコート溶液を用いてコーティングし
た。ブロッキング後、全ての使用される溶液は、その使
用前、例１３Ａでタイローズバッファについて述べたよ
うに、キレックス１００で処理した。(1) 例５で述べた
ように調製した1.５ナノモル濃度のＰＭＩ−１ Ｉｇ
Ｇ、又は、例７Ａで述べた、Ｔａｂハイブリドーマ、
(2) ２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、(3) 例１で述べたように単離
し、ＰＭＩ−１検定に対しては、４０μｇ／mlの濃度、
また、Ｔａｂ検定に対しては４μｇ／mlの濃度となるよ
うに添加されるＧＰIIｂ−III ａ及び(4) １ｍＭのポリ
ペプチドを含む免疫反応混合物を調製した。この免疫反
応混合物を１６〜２０時間、２２℃に維持して、固相結
合ＧＰIIｂ−III ａ及び添加した抗体間の、第１の固相
結合免疫反応産物を形成させる。

【０１０７】上述の実験結果を以下の表７に示した。

【０１０８】

【表７】 表７ 溶液中でのＧＰIIｂ−III ａへのリガンド結合により誘導されるＰＭＩ−１依 存潜在的抗原決定基の発現 発現率¹ リガンド² ＰＭＩ−１ Ｔａｂ ＫＹＧＲＧＤＳ ６５±２２（３） ９８±２５（３） ＧＲＧＤＳＰ ５３±２２（５） ８５±２７（３） ＲＧＤＳ ４２±１６（３） ９２±１１（３） ＧＲＧＥＳＰ １８±１３（３） １０６±２４（３） ＳＤＧＲ １８±１３（３） ７９±２５（３） コントロール ２０± ９（５） ８４±１３（４） １．発現率は、ポリペプチドリガンド結合により、誘導
されるＧＰIIｂ−IIIａ上に存在する潜在的決定基の尺
度となる。このデータは、５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、
ＧＰIIｂ−III ａを用いて得られた最高の決定基発現の
割合として表わされている。各条件下で行った測定数を
カッコ中に示し、また、その結果は、それらの測定値の
平均値±標準偏差で示した。

【０１０９】２．添加したリガンドは、例５で述べたよ
うに合成し、その配列は、一文字コードで示したポリペ
プチドである。“コントロール”とは、ポリペプチドを
添加しなかったことを意味する。表７に示した結果は、
ＲＧＤ含有ポリペプチドリガンドは本来の血小板を用い
て観察されたのと同じような方法で（例えば表６に参
照）、ＧＰIIｂ−III ａによる、潜在的抗原決定基の発
現を誘導することを示している。リガンド誘導の発現の
特異性は、逆配列（ＳＤＧＲ）又は、保存的置換（ＧＲ
ＧＥＳＰ）を有するポリペプチドを用いることにより確
証され、またさらに、Ｔａｂモノクローナル抗体結合に
関して有意なリガンドの影響が観察されなかったことに
より確証された。これらの結果は、モノクローナル抗体
ＰＭＩ−１により認識される潜在的抗原決定基のリガン
ド誘導の発現は、ＧＰIIｂ−III ａの本質的性質であり
また、ＧＰIIｂ−III ａの血小板の会合に依存しないこ
とを示している。例を要する特別な態様を含む、先に示
した明細は本発明を説明するためのもので、制限を意図
したものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱するこ
となしに、多くの変化及び修正を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＰIIｂの前駆体タンパク質の一部をコード
するｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸
残基配列。ヌクレオチド配列は、塩基１番から１１０４
番まで連続して表わされている様に、一文字ヌクレオチ
ド塩基コードを用いて左から右に、５′末端から３′未
満の方向で示されている。アミノ酸残基配列は、アミノ
末端の残基１番（Ｒ）から、カルボキシ末端の残基２２
７番（Ｓ）まで連続して示されているように、一文字ア
ミノ酸残基コードを用い、左から右へ、アミノ末端から
カルボキシ末端の方向で表わされている。読み枠は、ヌ
クレオチド配列の下の誘導されるアミノ酸配列の位置で
示されており、各アミノ酸残基を示す一文字は対応する
コドンの第１塩基の下に位置している。ｐ１２９−１４
５と命名されるポリペプチド及びｐ１１４−１５６と命
名されるポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列の、
ＧＰIIｂ前駆体タンパク質中の位置は、各々、大小のボ
ックスで示した。ｐ１９−３４及びｐ５３−６５と命名
されたポリペプチドの位置は各々、二重又は一本の下線
で示されている。ＧＰIIｂの軽鎖に対し、提唱されてい
るアミノ末端のアミノ酸残基配列は、点線で示し、矢印
は、ＧＰIIｂの重鎖及び軽鎖を作る潜在的切断部位を示
している。

【図２】 血小板に結合する抗体ＰＭＩ−１に関するポ
リペプチドｐ１２９−１４５の影響を示すグラフ。血小
板に、５mM濃度となるようＥＤＴＡを混ぜ、ｈＧＰIIｂ
上のＰＭＩ−１エピトープを十分に露出させる。その
後、この血小板を０〜１００マイクロモル濃度（μＭ）
の範囲の種々の濃度のポリペプチドｐ１２９−１４９及
び ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１抗体と、例９で説明するよ
うに混合した。血小板に結合した ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ
−１の割合を、検定物に加えたポリペプチド濃度に対し
てプロットした。

【図３】 例１０で説明されるように測定された刺激を
受けたファブリノーゲン結合血小板上のＰＭＩ−１エピ
トープの露出を示す図。(1) 刺激なし、(2) ５μＭ Ａ
ＤＰによる刺激又は(3) ５０μＭエペネフリンによる刺
激、条件下、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応す
る ¹²⁵Ｉラベル化ＰＭＩ−１量を測定し、５μＭ ＥＤ
ＴＡ存在下、非刺激血小板と免疫学的に結合する ¹²⁵Ｉ
−ＰＭＩ−１量に対する割合として発現した。

【図４】 例１１で説明されるような、血小板凝集に関
する、ポリペプチドｐ１２９−１４５及びｐ１４４−１
５６の影響を示したレコーダの写し。時間（分）に対す
る透過率をリニアー・プロットで示してあり、１００パ
ーセント透過は最高の血小板凝集を示している。パネル
Ａは、タイロード（Tyrode′s)バッファ中の富血小板血
漿（ＰＲＰ）のコントロール溶液（破線）及びさらに、
１mMポリペプチドｐ１２９−１４５を含むＰＲＰ（実
線）の透過率を描いてある。パネルＢは、コントロール
溶液（破線）及びさらに１mMポリペプチドｐ１４４−１
５６を含むＰＲＰ（実線）の透過率を描いてある。

【図５】 血小板ＧＰIIｂ− IIIａによる、２個の別々
のリガンド誘導結合部位の発現を示す図。各ＬＩＢＳ
は、アミノ酸残基配列ＲＧＤＳを有するポリペプチド型
のリガンドとの特異的結合による誘導により、ＧＰIIｂ
− IIIａリガンド（ＧＰIIｂ−ポリペプチド）複合体を
形成する。種々のポリペプチド濃度によるＬＩＢＳ発現
率は例１３Ａで説明されているように測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/50 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (72)発明者 プラウ エドワード エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ ラウス ストリ ート 4359 (72)発明者 ギンズバーグ マーク エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レノート プレ イス 2944

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 潜在的抗原決定基を構成する以下のアミ
   ノ酸残基配列を有するｈＧＰＩＩｂタンパク質の一部を
   コードする構造遺伝子を規定する配列を含む、多くとも
   １２，０００個のヌクレオチド塩基対を含むことを特徴
   とするＤＮＡ断片。 【化１】
2. 【請求項２】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
   塩基配列を有する、請求項１記載のＤＮＡ断片。 【化２】
3. 【請求項３】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
   塩基配列を有する、請求項１記載のＤＮＡ断片。 【化３】
4. 【請求項４】 潜在的抗原決定基を構成する以下のアミ
   ノ酸残基配列を有するｈＧＰＩＩｂの一部をコードする
   構造遺伝子を規定するＤＮＡ断片と機能的に結合したベ
   クターを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 【化４】
5. 【請求項５】 上記構造遺伝子が、以下のアミノ酸残基
   配列を有するタンパク質をコードする、請求項４記載の
   組換えＤＮＡ分子。 【化５】
6. 【請求項６】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
   塩基配列を有する、請求項５記載の組換えＤＮＡ分子。 【化６】
7. 【請求項７】 上記ベクターが宿主細胞中で上記構造遺
   伝子を発現することができる、請求項５記載の組換えＤ
   ＮＡ分子。
8. 【請求項８】 多くとも５０個のアミノ酸残基を含み、
   かつ、式： −ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ− で表される配列に対応するアミノ酸残基配列を含むこと
   を特徴とする、ｈＧＰＩＩｂ潜在的抗原決定基ポリペプ
   チドアナログ。
9. 【請求項９】 式： ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ で表されるアミノ酸残基配列を有する、請求項８記載の
   ポリペプチドアナログ。
10. 【請求項１０】 基本的に、ａ）式： ＰＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱ で表される潜在的抗原決定基ポリペプチドと免疫反応
    し、そして、 ｂ）式： ＲＥＱＮＳＬＤＳＷＧＰＫＶ で表されるポリペプチドと、実質的に免疫反応しない抗
    体分子を含むことを特徴とする抗体組成物。
11. 【請求項１１】 刺激されたフィブリノーゲン結合血小
    板と免疫反応する抗体分子を生成することを特徴とする
    ＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９４７６）と命名される
    ハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】 刺激された、フィブリノーゲン結合血
    小板と免疫反応する、ハイブリドーマＰＭＩ−１（ＡＴ
    ＣＣ ＨＢ ９４７６）により生成される抗体分子を含
    むことを特徴とするモノクローナル抗体組成物。
13. 【請求項１３】 ａ）少なくとも１回の検定を行うのに
    十分な量の、ハイブリドーマＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ Ｈ
    Ｂ ９４７６）により生成された抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩ
    ａ抗体分子を含むパッケージ、を含み、血液サンプル中
    のＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ−リガンド複合体を発現する血
    小板の存在を検定するための、診断キット。
14. 【請求項１４】 上記抗体分子が放射性核種でラベル化
    され、かつモノクローナル抗体組成物として存在する、
    請求項１３記載の診断キット。
15. 【請求項１５】 ａ）少なくとも１回の検定を行うのに
    十分な量の、ハイブリドーマＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ Ｈ
    Ｂ ９４７６）により生成された、インビボ指示手段と
    結合した抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体分子を含むモノク
    ローナル抗体組成物を含むパッケージ、を含む、インビ
    ボで血栓の存在を検定するための診断キット。
16. 【請求項１６】 血小板含有血液サンプルを、ＧＰＩＩ
    ｂ−ＩＩＩａ−リガンド複合体を発現する血小板の存在
    について検定する方法であって、 ａ）ハイブリドーマＰＭＩ−１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９４
    ７６）により生成された抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体分
    子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物を、血液
    サンプルと混合することにより、免疫反応混合物を作
    る、 ｂ）該抗体が、サンプル中に存在するフィブリノーゲン
    結合血小板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物を生成す
    るのに十分な時間、この混合物を維持する、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定
    する、以上のａ）〜ｃ）のステップを含むことを特徴と
    する方法。