JP2001190287A - 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体 - Google Patents

血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体

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JP2001190287A JP2000349824A JP2000349824A JP2001190287A JP 2001190287 A JP2001190287 A JP 2001190287A JP 2000349824 A JP2000349824 A JP 2000349824A JP 2000349824 A JP2000349824 A JP 2000349824A JP 2001190287 A JP2001190287 A JP 2001190287A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体を
提供する。 【解決手段】 血小板関連GPIIb−IIIaがフィ
ブリノーゲンに結合する際の抗原決定基を形成するGP
IIb重鎖(H鎖)(hGPIIb)の一部の構造遺伝
子をコードするDNA配列を含むDNA及び組換えDN
A分子、並びに、hGPIIbの潜在的抗原決定基であ
るポリペプチドアナログ及びこのポリペプチドと免疫反
応する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血小板関連GPI
Ib−IIIaがフィブリノーゲンに結合する際の抗原
決定基を形成するGPIIb重鎖(H鎖)(hGPII
b)の一部の構造遺伝子をコードするDNA配列を含む
DNA及び組換えDNA分子に関するものである。ま
た、本発明は、hGPIIbの潜在的抗原決定基である
ポリペプチドアナログ及びこのポリペプチドと免疫反応
する抗体に関するものである。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】一般的
に、細胞粘着(adhesion)は、細胞表面レセプターによ
る特異的粘着タンパク質の認識と関係している。本発明
に特に興味のもたれる一群の細胞表面レセプターは、イ
ンテグリン(integrin)である。ハインズ(Hynes)(セ
ル(Cell)、48、549−554(1987))によ
れば、インテグリンは、細胞外マトリクス糖タンパク
質、補体及び他の細胞と相互作用を起こす機能的及び構
造的に関連した一群のレセプターである。インテグリン
は、発生学的発生、止血、血栓症、傷害治癒、免疫及び
非免疫防御メカニズム、及び腫瘍遺伝子トランスホーメ
ーションを含む、多くの生理学的に重要なプロセスにお
ける、細胞−マトリクス及び細胞−細胞粘着に関与して
いる。2つのヒトの遺伝病、グラスマン・トロンバスセ
ニア及び白血球粘着欠損症は、インテグリン類のいくつ
かを冒している。
【0003】構造的に、インテグリンは、アルファ及び
ベータサブユニットが非共有的に会合したヘテロ二量体
的複合体である。インテグリン類の中には、同様のベー
タサブユニットが存在することによって、関連づけられ
るグループがあり、また、各グループの中のメンバー
は、独特のアルファサブユニットによって区別される。
例えば、GPIIb− IIIaは、アルファ及びベータサブ
ユニットからなる非共有性、Ca++依存性のヘテロ二量
体複合体である。ジェニングス(Jennings)等、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol.
Chem.)257、10458−10466(198
2)。アルファ・サブユニット、GPIIbは約120キ
ロダルトン(KDa)の相対分子量を有する重鎖(hGPII
b)及びジスルフィド結合でこれと結合している約20
KDa の軽鎖(lGPIIb)からなる。ベータサブユニッ
ト、GP IIIaは約100KDa の一本鎖ポリペプチドで
ある。フィリップス(Phillips)等、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)2
52、2121−2126(1977)。免疫学的に、
GPIIb− IIIaと関連する細胞表面分子は、多くの細
胞型で同定されてきている。チアガラジャン(Thagaraj
an)等(ジャーナル・オブ・クリニカル、インベスチゲ
ーション(J. Chem. Invest.)75、896−901
(1985)、プロー(Plow)等、プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pr
oc. Natl. Acsd. Sei.)USA、83、6002−60
06(1986)及びフィッツジエラルド(Fitzgeral
d)等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)260、10893−1089
6(1985)参照。
【0004】GPIIb− IIIaは、フィブリノーゲン
〔ベネット(Bennett)等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sei.)USA、80、2417−2421
(1983)〕、フィブロネクチン〔ギンスベルグ(Gi
nsberg)等、ジャーナル・オブ・クリニカル、インベス
チゲーション(J. Chem. Invest.)71、619−62
4(1983)〕及びフォン・ウィルブランド因子〔ル
ゲリ(Ruggeri)等、プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sei.)USA、79、6038−6041(198
2)〕などのRGD含有タンパク質との相互作用を通し
て血小板機能に寄与しており、従って、一般的血小板粘
着タンパク質レセプターの一成分である(ピテラ(Pyte
ra)等、サイエンス(Science)231、1559−15
62(1986)及びプロー(Plow)等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Che
m.)259、5388−5391(1984)。
【0005】最近、GPIIb− IIIaは、同様のベータ
サブユニット及びトリペプチドアミノ酸残基配列Arg−
Gly−Asp(一文字記号を用いるとRGD)を認識する
機能的性質をもつ、いくつかの粘着レセプターのうちの
1つであるという証拠が示された。ピテラ(Pytera)
等、サイエンス(Science)231、1559−1562
(1986)及びルオスラティ(Ruoslahti)等、セル
(Cell)、44、517−518(1986)。GPII
b− IIIaに加えて、関連するレセプターのグループに
は、オステオザルコーマから単離したヒドロネクチンレ
セプター(VnR)及びフィブロネクチンレセプター
(FnR)が含まれる(ピテラ(Pytera)等、セル(Ce
ll)、40、191−198(1985)、ピテラ(Py
tera)等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sei.)
USA、82、5766−5770(1985)及びサ
ンチェス・マドリッド(Sanches-Madrid)等、ジャーナ
ル・オブ・エススペリメンタル・メディシン(J. Exp.
Med.)158、1785−1803(1983))。
【0006】これらタンパク質の同様の機能的、構造的
及び抗原的性質は、GPIIb− IIIa及びVnRが、
“サイトアドヘシン”という名前が提唱された粘着レセ
プターグループのメンバーであることを示している。プ
ロー(Plow)等、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.S
ei.)USA、82、6002−6006(198
6)。サイトアドヘシングループでは、独特のアルファ
サブユニットが共通もしくは非常に類似しているベータ
サブユニットと結合しており、機能的に区別しうるレセ
プターとなる。ギンスバーグ(Ginsbsrg)等、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol. Ch
em.)262、5437−5440(1987)。ヘテ
ロ二量体粘着レセプターの少なくとも2つの他のグルー
プが同定されており、それらの場合、1つの共通ベータ
サブユニットは、独特のアルファ・サブユニットのいく
つかと結合している。1つのグループは、白血球で見ら
れるもので、白血球粘着群と呼ばれ、LFA−1、Mac
−1、P150、95が含まれる。サンチェス・マドリ
ッド(Sanchez-Madrid)等、ジャーナル・オブ・エスス
ペリメンタル・メディシン(J. Exp. Med.)158、1
785−1803(1983)及びスプリンガー(Spri
nger)等、(シバ・ファウンド・シンポジウム)(Cib
a, Found, Symp.)118、102−126(198
6)。その他のものはより広く分布しており、VLA族
と呼ばれている(ヘムラー(Hemler)等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Che
m.)262、3300−3309(1987))。チキ
ンのVLA族のベータサブユニット〔ヘムラー(Hemle
r)等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)262、3300−3309
(1987)がクローン化され、配列決定され、“イン
テグリン”と命名された(タムクン(Tamkun)等、セル
(Cell)、46、271−282(1986)〕。チキ
ン・インテグリンの配列はGP IIIaのもの〔フィッツ
ジエラルド(Fitzgerald)等、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)262、
3936−3939(1987)〕及び白血球粘着族の
ベータサブユニットのベータサブユニットのもの〔キシ
モト(Kishimoto)等、セル(Cell)48、681−69
0(1987)〕と同様である。さらに、いくつかのア
ルファサブユニットの部分配列も類似性を示している。
ギンスベーグ(ginsberg)等、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)262、
5437−5440(1987);スズキ(Suzuki)
等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sei.)US
A、82、8614−8698(1986)及びシャロ
(Charo)等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Se
i.)USA、83、8351−8356(1986)。
【0007】粘着レセプターとしてのそれらの機能に基
本的なGPIIb− IIIa又はその他のサイトアドヘシン
上の部位は、現在でも不明である。いくつかの観察は、
GPIIb− IIIa上の機能的に重要な部位は、モノクロ
ーナル抗体PMI−1で決定されるエピトープ付近にあ
ることを示している。この抗体は、GPIIbの重鎖に結
合し〔シャドル(Shadle)等、ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオロジー(J. Cell. Biol.)99、2056
−2060(1984)、いくつかの独特な機能活性に
関連するGPIIbの領域を限定する。第1に、PMI−
1は、洗浄した血小板のコラーゲンへの粘着を阻害す
る。シャドル(Shadle)等、ジャーナル・オブ・セルラ
ー・バイオロジー(J. Cell. Biol.)99、2056−
2060(1984)。第2に、本領域の表面での配向
は、カルシウム又はマグネシウムのミルモル濃度(mM)
がPMI−1エピトープの発現を抑制することから、二
価カチオンにより制御される。ギンスバーグ(Ginsber
g)等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲ
ーション(J. Clin. Invest.)78、1103−111
1(1986)。第3に、この部位の構造の異常な二価
カチオン制御は、機能的にトロンバスセニック状態と関
連している。ギンスバーグ(Ginsberg)等、ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスチゲーション(J. Clin.
Invest.)78、1103−1111(1986)。第
4に、100ミリモル濃度までのアデノシン二リン酸
(ADP)又はエピネフリン、ミリリットル当り1ユニ
ットのトロンビン、又は、ミリリットル当り50マイク
ログラムのウシ皮膚コラーゲンによる血小板の刺激は、
実質的に、血小板に対するPMI−1抗体の結合を、バ
ックグランド以上に増加させることはなかった。
【0008】
【課題を解決するための手段】現在、特異的にリガンド
と結合した細胞表面レセプターは、リガンド誘導抗体結
合部位(LIBS)の存在により、非占有レセプターと
区別できることが分っている。すなわち、細胞表面レセ
プターが特異的にリガンドと結合したときに発現する
が、非占有レセプター又は非結合領域リガンドのいずれ
かによっても発現されない一群の抗原決定基が発見され
ている。従って、ある態様において、本発明は、特異的
に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レ
セプター−リガンド複合体によって発現された、リガン
ド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を作
る方法を考案しており、この方法には、 (a) ホ乳類をこの複合体で免疫化すること; (b) 免疫化したホ乳類から抗体産生細胞を取り出し、
この細胞のサスペンジョンを作ること; (c) この細胞をトランスホーミング剤で処理して、ト
ランスホームした抗体産生細胞を生成すること; (d) 非トランスホーメーション細胞は生存できない組
織培養培地で制限希釈することにより、ステップ(c)
で処理した細胞をクローニングし、クローン化トランス
ホーマントを作ること; (e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、
いずれも非結合型の細胞表面レセプター又はリガンドと
は免疫反応しない分泌抗体分子の存否について、該クロ
ーン化トランスホーマントの組織培養培地の評価を行う
こと; (f) 分泌抗体分子を生産するクローン化トランスホー
マントを選択し、組織培養培地中で生育させること;及
び (g) 選択され、かつクローン化されたトランスホーマ
ントの培養培地から、分泌抗体分子を収穫すること、が
含まれる。
【0009】別の態様において、本発明は、特異的に結
合した細胞表面レセプター及びリガンドを含むレセプタ
ー−リガンド複合体によって発現される、リガンド誘導
結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を生成する
方法を考案しており、その方法には、 (a) マウスを該複合体で免疫化すること; (b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサス
ペンジョンを作ること; (c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウス
のミエローマ細胞と融合し、抗体分泌ハイブリドーマを
生成すること; (d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞を生育
させない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること; (e) レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、
非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免
疫反応しない、分泌抗体分子の存在について、ハイブリ
ドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること; (f) 抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、こ
れをクローニングすること;及び (g) 上記クローンの上清から、抗体分子を収穫するこ
とが含まれる。
【0010】さらに、特異的に結合した表面レセプター
及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体によ
り発現される、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモ
ノクローナル抗体を生成する方法を考案しており、その
方法には、 (a) マウスを該複合体で免疫化すること; (b) 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサス
ペンジョンを作ること; (c) 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウス
のミエローマ細胞と融合し、抗体分布ハイブリドーマを
生産すること; (d) 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞は生育
できない培地で希釈し、この融合細胞を培養すること; (e) 細胞表面レセプター−リガンド複合体とは免疫反
応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガンド
とは免疫反応しない分泌抗体分子の存在について、ハイ
ブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること; (f) この抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択
し、クローニングすること; (g) このクローンを、マウス腹腔内に移すこと、そし
て、 (h) 望ましい抗体を含む、マウスの腹水又は血清を収
穫すること;が含まれる。
【0011】また、特異的に結合した細胞表面レセプタ
ー及びリガンドを含む、レセプター−リガンド複合体の
存在を、インビボで検出する方法を考案しており、その
方法には、 (a) 生理学的に許容される希釈剤及びレセプター−リ
ガンド複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表面レ
セプター又はリガンドとは免疫反応しない、インビボの
指示手段を結合した抗体分子を含む、効果量のモノクロ
ーナル抗体組成物を被検者に静脈注射する、 (b) インビボで抗体分子がレセプター−リガンド複合
体と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な、
予め決めた時間、その被投与者を維持する、 (c) ステップ(b)で形成して免疫反応産物の存在及
びそれによる被検者中の複合体の存在を検定する、以上
のステップが含まれている。
【0012】また、さらに、血液サンプル中の、特異的
に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レ
セプター−リガンド複合体の存在を検定する方法を考案
しており、その方法には (a) 血液サンプルを、該レセプター−リガンド複合体
とは免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レセ
プター又はリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含む
モノクローナル抗体組成物と混合することにより免疫反
応混合物を作る; b) 抗体分子が、サンプル中に存在するレセプター−
リガンド複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を形成
するのに十分な時間、この混合物を維持する; c) ステップ(b)で形成した免疫反応産物の存在を
検出し、かつそれによりサンプル中の複合体の存在を検
出する、以上のステップが含まれる。
【0013】なお、ここでは、GPIIb− IIIa−リガ
ンド複合体を発現する血小板の存在について、血小板を
含む血液サンプルを検定する方法も開示され、その方法
には、 (a) 血液サンプルを、ハイブリドーマPMI−1又は
PMI−2によって生産されたGPIIb− IIIa抗体分
子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物と混合す
ることにより、免疫反応混合物を作る; (b) 該抗体がサンプル中に存在するフィブリノーゲン
結合血小板と免疫反応し、免疫反応産物を生成するのに
十分な時間、この混合物を維持する; (c) ステップ(b)で生成した免疫反応産物の存在を
検出する、以上のステップが含まれる。
【0014】また、インビボで血栓の存在を検定する、 (a) 生理学的に許容される希釈剤及びハイブリドーマ
PMI−1又はPMI−2から生産される、インビボ指
示手段と結合した抗GPIIb− IIIa抗体分子を含む、
効果量のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈注射
する; (b) 抗体分子がインビボでフィブリノーゲン結合血小
板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物が生成されるのに
十分な、予め決められた時間、被投与者を維持する; (c) ステップ(b)で生成した免疫反応産物の存在を
検出する、以上(a)〜(c)のステップを含む方法が
開示されている。特異的に結合した細胞表面レセプター
及びリガンドを含む血液中のレセプター−リガンド複合
体の存在を検定する、キット型の診断システムも開示さ
れており、そのシステムには、(a) 少なくとも1回の
検定を行なうのに十分な量の、該レセプター−リガンド
複合体と免疫反応するが、非結合形の細胞表面レセプタ
ーもしくはリガンドとは免疫反応しない抗体分子を含む
モノクローナル抗体組成物を含有するパッケージ、が含
まれている。
【0015】特異的に結合した細胞表面レセプター及び
リガンドを含む細胞レセプター−リガンド複合体の存在
を、インビボで検出するための、キット型の診断システ
ムが開示されており、そのシステムには、(a) 少なく
とも1回の検定を行なうのに十分な量の、該レセプター
−リガンド複合体とは免疫反応するが、非結合型の細胞
表面レセプターもしくはリガンドとは免疫反応しない、
インビボ指示手段と結合した抗体を含むモノクローナル
抗体組成物を含むパッケージ、が含まれている。GPII
b− IIIa−リガンド複合体を発現する血小板の存在に
ついて、血液サンプルを検定するための、キット型の診
断システムが開示されており、そのシステムには、(a)
少なくとも1回の検定を行なうのに十分な量の、ハイ
ブリドーマPMI−1又はPMI−2から生産された抗
GPIIb− IIIaの抗体分子を含むパッケージ、が含ま
れている。
【0016】インビボで血栓の存在を検定するための、
キット型の診断システムも開示されており、それには、
(a) 少なくとも1回の検定を行なうのに十分な量の、
ハイブリドーマPMI−1又はPMI−2から生産され
る、インビボの指示手段と結合した、抗GPIIb− III
a抗体分子を含むパッケージが含まれている。さらに、
現在、血小板GPIIb− IIIa−リガンド複合体は、ハ
イブリドーマPMI−1及びPMI−2によって生産さ
れる抗体分子によって認識される、2個の潜在的抗原決
定基型LIBSを発現することが分っている。さらに、
モノクローナル抗体PMI−1により認識される潜在的
決定基を真似ることができるポリペプチドがインビボ
で、潜在的決定基を形成しているGPIIbタンパク質の
一部をコードするDNA配列から誘導されている。
【0017】従って、本発明は、図1に示される、残基
約50番から約140番のアミノ酸残基配列を有するG
PIIbタンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義
している配列を含むせいぜい約12000個のヌクレオ
チド塩基対を含むDNA断片を考案している。別の態様
においては、図1における残基約50番から約145番
までの、アミノ酸残基配列を有する、GPIIbタンパク
質の一部をコードする構造遺伝子を定義しているDNA
断片と機能的に結合したベクターを含む組換えDNA分
子も開示されている。さらに、せいぜい約50アミノ酸
残基を含み、かつ、式 −PSPSPIHPAHHKRDRRQ− で表わされるアミノ酸残基配列を含む、hGPIIb潜在
的決定基ポリペプチドアナログも開示されている。ま
た、フィブリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗体分
子を生産する、PMI−1及びPMI−2と命名された
ハイブリドーマも考案している。ファブリノーゲン結合
血小板と免疫反応する、ハイブリドーマPMI−1によ
り生産される抗体分子を含む、モノクローナル抗体組成
物を考案している。
【0018】
【発明の実施の形態】A.定義 アミノ酸:ここで同定されているアミノ酸残基は、天然
のL型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従が
い(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J. Biol. Chem.)243、3557−59(196
9)、アミノ酸残基の略号は、下記の対応表に示した。 対応表 記号 アミノ酸 一文字 三文字 Y Tyr チロシン G Gly グリシン F Phe フェニルアラニン M Met メチオニン A Ala アラニン S Ser セリン I Ile イソロイシン L Leu ロイシン T Thr スレオニン V Val バリン P Pro プロリン K Lys リジン H His ヒスチジン Q Gln グルタミン E Glu グルタミン酸 W Trp トリプトファン R Arg アルギニン D Asp アスパラギン酸 N Asn アスパラギン C Cys システィン ここでは、全てのアミノ酸残基配列が左から右にアミノ
末端からカルボキシ末端の、伝統的に用いられている方
向の式で表わされていることに注意しなければならな
い。さらに、アミノ酸残基配列の始めと終りのダッシュ
は、ポリペプチド鎖中の1つ以上で全部で約50残基ま
での配列につながる結合を示していることにも注意しな
ければならない。
【0019】ポリペプチド及びペプチド;ポリペプチド
及びペプチドはここでは同時に用いられている語で、隣
り合うα−アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結
合により互いに連結しているせいぜい約50個の連続す
るアミノ酸残基を示している。 タンパク質;ここで用いられているタンパク質という語
は、ポリペプチドのように互いに連結している連続した
50個以上のアミノ酸残基を示している。ヌクレオシド
及びヌクレオチド;糖部分(ペントース)、リン酸、及
び窒素ヘテロ環塩基からなる、DNA及びRNAの単量
体ユニット。この塩基は、グリコシド炭素(ペントース
の1′炭素)を介して糖部分に結合しており、この塩基
と糖との組合せてヌクレオシドという。このヌクレオシ
ドが、そのペントースの3′位又は5′位に結合したリ
ン酸基を含むとき、これをヌクレオチドと呼ぶ。
【0020】塩基対(bp);二本鎖DNA分子中のアデ
ニン(A)とチミン(T)、またはシトシン(C)とグ
アニン(G)の水素結合の組合せ。 レセプター;ここで用いているレセプター及びレセプタ
ータンパク質とは他の分子に特異的に結合する生物学的
に活性なタンパク質性分子を示している。リガンド及び
同種リガンド;リガンドとは、特別なレセプタータンパ
ク質と特異的相互作用によって結合する構造部分を含む
分子を意味する。 リガンド誘導結合部位(LIBS);LIBSとは、細
胞表面レセプター−リガンド複合体によって発現される
が、非占有レセプター又は未結合リガンドによっては発
現されないネオ抗原決定基のことである。LIBSは、
“構造的”なものと“配列的”なものがある。LIBS
は、リガンド結合により誘導されるレセプターの特異的
修正の結果、すなわち、“潜在的抗原決定基”であり、
またこれは、レセプター−リガンド接触部位でのレセプ
ターとリガンドアミノ酸残基の組合せによって形成され
る。
【0021】潜在的抗原決定基;同種(特異的)リガン
ドとの結合により、レセプタータンパク質の構造又は膜
表面配位方向の変化によって生じたネオ抗原決定基を意
味する。ここで述べているレセプタータンパク質は、通
常、このレセプターが特異的にリガンドと結合しないか
ぎり、潜在的抗原決定基を発現しない。 B.DNA断片 生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸
残基配列は、タンパク質をコードする構造遺伝子のデオ
キシリボ核酸(DNA)と遺伝子コードを介して直接対
応している。従って、構造遺伝子は、それがコードする
アミノ酸残基配列、すなわち、タンパク質又はポリペプ
チドで定義することができる。遺伝子コードでよく知ら
れており、重要な性質は、その縮退である。すなわち、
タンパク質を構成する全んどのアミノ酸について、1つ
以上のコードヌクレオチドトリプレット(コドン)が、
1つのアミノ酸残基をコード、もしくは指定している。
それゆえ、特別のアミノ酸残基配列を、多種のヌクレオ
チド配列がコードしうる。このようなヌクレオチド配列
は、全ての生物において、同じアミノ酸残基配列の生産
を起こすことから、機能的には等価と考えることができ
る。場合によっては、プリン又はピリミジンのメチル化
体も、ヌクレオチド配列中に組込まれていることもあ
る。しかし、これらメチル化は、コード関係になんら影
響を与えることはない。
【0022】本発明のDNA断片には、GPIIb関連ア
ミノ酸残基配列、すなわち、GP IIIb関連タンパク質
を含むタンパク質をコードする構造遺伝子が含まれる。
GPIIb関連アミノ酸残基配列は、図1の約50番から
約227番で示される、アミノ酸残基配列の1部と相同
的、好ましくは同一の、少なくとも約10残基の配列で
ある。本発明のDNA断片には、図1の残基約50番か
ら約145番で示されるアミノ酸残基配列をコードする
DNA配列が含まれる。別の態様においては、図1の残
基約50番から約227番で示されているアミノ酸残基
配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を考案し
ている。また、図1の残基約146番から約227番で
示されているアミノ酸残基配列をコードするDNA配列
を含むDNA断片も考案している。本発明のDNA断片
は、図1の残基約1番から約227番で示されるアミノ
酸残基配列をコードしていることが望ましい。DNA配
列は、上述のアミノ酸残基配列中のアミノ酸残基をコー
ドするコドンが連続して存在する、すなわち、DNA配
列がイントロンを含まないことが望ましい。
【0023】基本的に図1の塩基約148番から約43
5番で示されるヌクレオチド配列からなるDNA断片
も、本発明の1態様を構成している。基本的に、図1の
塩基約148番から約435番で示されるヌクレオチド
配列からなるDNA断片は、本発明の別の態様を構成し
ている。基本的に本発明のDNA断片が図1の塩基約1
番から約1104番で示されるヌクレオチド配列からな
ることが好ましい。GPIIb関連アミノ酸残基配列をコ
ードする本発明のDNA断片は、化学的技術、例えばマ
チュウシ(Matteucci)等(ジャーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイアティ(J. Am. Chem. Soc.)10
3、3185(1981))のホスホトリエステル法に
よって容易に合成することができる。もちろん、コード
配列を化学的に合成することによって、天然のアミノ酸
残基配列をコードするものを適当な塩基に置換すること
によって、望ましい修正を容易に行うことができる。し
かし、図1に示したものと全く相同的な配列を含むDN
A分子であることが望ましい。
【0024】さらに、基本的に、GPIIb関連タンパク
質をコードする構造遺伝子からなるDNA断片は、これ
らの遺伝子を含む組換えDNA分子から得ることができ
る。例えば、プラスミド型組換えDNA分子HEL−4
1は、図1に示したDNA配列を含み、従って、図1の
残基1番から227番で示されるアミノ酸残基をコード
している。HEL−41でトランスホームした大腸菌
(E. coli)培養物を、ブダペスト条約要請事項に従が
い、1987年7月7日、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(ATCC)(20852、MD
州、ロックビル、パークローン・ドライブ、1230
1)に登録し、受理番号67456号を割当てられた。
GPIIb関連アミノ酸残基配列をコードするDNA配列
を含むDNA断片を、従来法に従がい、上記登録のプラ
スミド由来の適当な制限断片を機能的に結合(ライゲー
ション)することにより作ることができる。
【0025】典型的に、このようにして作った本発明の
DNA分子は、粘着末端、すなわち、この分子の二本鎖
部分を越えて伸びる“突出した”一本鎖部分を有してい
る。本発明のDNA分子上の粘着末端が存在することは
好ましいことである。また、上記DNA断片と等価なリ
ボ核酸(RNA)も本発明で考案されている。 C.組換えDNA分子 本発明の組換えDNA分子は、本発明のDNA断片にベ
クターを機能的に結合することにより作ることができ
る。ここで用いられるように、“ベクター”という語句
は、細胞中で自己増殖可能なDNA分子を意味し、別の
DNA断片を機能的に結合することにより、その付随す
る断片の複製をもたらすことができるものである。GP
IIb関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコード
する遺伝子の発現を司るベクターを、ここでは“発現ベ
クター”と呼ぶ。従って、組換えDNA分子(rDN
A)は、天然では、通常一緒に発見されることはない、
少なくとも2つのヌクレオチド配列を含むハイブリット
DNA分子である。
【0026】本発明のDNA断片が機能的に結合するベ
クターの選択は、この分野でよく知られているように、
望ましい機能的性質、例えばタンパク質の発現及びトラ
ンスホームされる宿主細胞に直接依存し、これらは、組
換えDNA分子を構築する分野において本質的な制限と
なっている。しかし、本発明で考案されているベクター
は、機能的に結合されたDNA断片中に含まれるGPII
b関連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードす
る遺伝子の少なくとも複製、そして好ましくは発現も司
ることができる。好ましい態様において、本発明で考案
されたベクターは、原核性レプリコン、すなわち、バク
テリア宿主細胞のような原核性宿主細胞において、染色
体外で組換えDNA分子を自己複製及び維持を司ること
ができる能力を有するDNA配列を含んでいる。このよ
うなレプリコンは当分野ではよく知られているものであ
る。さらに、原核性レプリコンを含む、これらの態様
は、それでトランスホームしたバクテリア宿主に薬剤耐
性を付与する遺伝子も含んでいる。典型的なバクテリア
の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリ
ン耐性を付与するものである。
【0027】原核性レプリコンを含む、これらベクター
は、大腸菌のようなバクテリア宿主細胞をトランスホー
ムすることで、GPIIb関連アミノ酸残基配列をコード
する遺伝子の発現(転写及び翻訳)を司る原核性プロモ
ーターも含む。プロモーターとは、RNAポリメラーゼ
の結合及び転写を可能とするDNA配列によって形成さ
れる発現コントロール要素である。バクテリア宿主に適
合するプロモーター配列は一般的に、本発明のDNA断
片の挿入のための、簡便な制限部位を含むプラスミドベ
クター中に提供されている。このようなベクタープラス
ミドの典型例には、バイオ・ラド・ラボラトリー(CA
州、リッチモンド)から市販されているpUC8、pU
C9、pBR322及びpBR329、及びファルマシ
ア(NJ州、ピスカタウェイ)から市販されているpP
L及びpKK223がある。
【0028】真核性細胞好ましくは脊椎動物細胞に適合
する発現ベクターは、本発明の組換えDNA分子を生成
するのに用いることができる。真核性細胞発現ベクター
は、当分野でよく知られており、また、いくつかの販売
元から市販されている。典型的に、このようなベクター
は、望ましいDNA断片の挿入するために便利な制限部
位を含むものが提供されている。このようなベクターの
典型例には、pSVL及びpKSV−10(ファルマシ
ア)、pBPV−1/pML2d(インターナショナル
バイオテクノロジーズ)及びpTDT1(ATCC、#
31255)がある。好ましい態様において、本発明の
組換えDNA分子を構築するのに使用される真核細胞発
現ベクターは、真核細胞中で効果的な選択マーカー、好
ましくは、薬剤耐性選択マーカーを含んでいる。好まし
い薬剤耐性マーカーは発現によりネオマイシン耐性とな
る遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ(neo)遺伝子である。サウザーン(Southern)
等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプラ
イド・ジェネティクス(J, Mol. Appl. Genet.)1、3
27−341(1982)。
【0029】本発明のrDNAを生成するのにレトロウ
ィルス発現ベクターを用いることも考案している。ここ
で用いているように“レトロウィルス発現ベクター”と
いう語句は、レトロウィルス・ゲノムのロング・ターミ
ナル・リピート(LTR)由来のプロモーター配列を含
むDNA分子を意味する。好ましい態様における、典型
的な発現ベクターは、好ましくは、真核細胞中で複製不
能なレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィル
スベクターの構築を使用例がソージ(Sorge)等(モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell.
Biol.)4、1730−37(1984)によって報告
されている。相補的粘着末端を介して、ベクターにDN
Aを機能的に結合する多くの方法が開発されてきてい
る。例えば、相補的ホモポリマー鎖を、挿入するDNA
断片及びベクターDNAに付加することができる。それ
から、この相補的ホモポリマー末端間の水素結合によ
り、このベクター及びDNA断片を結合し組換えDNA
分子を生成する。
【0030】1つ以上の制限部位を含む合成リンカー
は、DNA断片とベクターを結合する別法を提供する。
先に説明したように、エンドヌクレアーゼによる制限消
化により生じたDNA断片を3′−5′エクソヌクレア
ーゼ活性により、突出する3′一本鎖末端を除去し、ま
た重合活性により、窪んだ3′末端を充填する酵素であ
る、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼ又は、
大腸菌DNAポリメラーゼIで処理する。それゆえ、こ
れら活性の組合せは、平滑末端DNA断片を生ずる。そ
れから、この平滑末端断片をバクテリオファージT4D
NAリガーゼ等の平滑末端DNA分子のライゲーション
を触媒しうる酵素の存在下、大過剰のリンカー分子とイ
ンキュベーションする。このようにしてできた反応産物
は、その末端に重合リンカー配列をもつDNA断片であ
る。これらDNA断片を適当な制限酵素で切断し、この
DNA断片の末端に適合する末端を生ずる酵素で切断し
た発現ベクターにライゲーションする。
【0031】多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む
合成リンカーは、CN州、ニュヘブンのインターナショ
ナル・バイオテクノロジーズ社を含む多くの業者から市
販されている。本発明は、上述の組換えDNA分子と等
価なRNAも考案している。 D.トランスホームした細胞及び培養 また、本発明は、本発明の組換えDNA分子でトランス
ホームした宿主にも関連している。宿主細胞は原核性の
ことも、真核性のこともある。バクテリア細胞が原核性
宿主細胞であることが好ましく、また典型的には、MD
州、ベセスダ、ベセスダ州−4、ラボラトリース社から
市販されている大腸菌DH5株のような大腸菌株であ
る。好ましい真核性宿主細胞には、イースト及び好まし
くは、マウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列
由来のもの等の脊椎細胞などホ乳類細胞が含まれる。好
ましい真核性宿主細胞には、CCL61のようなATC
Cから入手できるチャイニーズ・ハムスター卵巣(CH
O)細胞及びCRL1658のようなATCCから入手
できるNIHスイスマウス胎児細胞NIH/3T3が含
まれる。
【0032】好ましいトランスホーム化細胞系列とは、
組換えDNA分子HEL−41を含む大腸菌であり、そ
の培養物は、1987年7月7日、MD州、ロックビ
ル、アメリカン・ティシュ・カルチャー・コレクション
(ATCC)に登録され、受理番号67456が割当て
られた。本発明の組換えDNA分子による、適当な宿主
細胞のトランスホーメーションは、典型的には、使用す
るベクターのタイプに依存する、従来法によって行なわ
される。原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関
しては、例えば、コーエン(Cohen)等、プロシーディン
グ・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.)USA、69、2110
(1972)、及びマニアチス(Maniatis)等、モレキ
ュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリ
ングハーバー、NY州、(1982)参照。rDNAを
含むレトロウィルスベクターによる脊椎動物細胞のトラ
ンスホーメーションに関しては、例えば、ソージ(Sorg
e)等、モレキュラー−アンド・セルラーバイオロジー
(Mol. Cell. Biol.)4、1730−37(198
4);グラハム(Graham)等、ビロロジー(Virol.)5
2、456(1973)及びウィグラー(Wigler)等、
プロシーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA、
76、1373−76(1979)参照。
【0033】うまくトランスホームした細胞、すなわ
ち、本発明の組換えDNA分子を含む細胞は、従来法に
より同定することができる。例えば、本発明のrDNA
の導入により生じた細胞をクローン化し、モノクローナ
ルコロニーを作ることができる。これらのコロニー由来
の細胞を収穫し、溶解してから、そのDNA含有物につ
いて、サウザーン(Southern)(ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)98、50
3(1975))及びベレント(Berent)等(バイオテ
クノロジー(Biotech)、3、208(1985))によ
って報告されているような方法を用い、rDNAの有無
を試験した。rDNAの存在の直接的検定に加えて、r
DNAがGPIIb関連タンパク質を発現できる場合、ト
ランスホーメーションは、従来の免疫学的方法で確める
ことができる。例えば、発現ベクターでうまくトランス
ホームした細胞は、GPIIb抗原性を示すタンパク質を
生産する。トランスホームされた細胞サンプルを収穫
し、本発明のハイブリドーマによって生産されるよう
な、抗原に特異的な抗体を用いて、GPII関連タンパク
質を検定した。
【0034】このように、トランスホームした宿主細胞
自身に加え、本発明は、栄養培地中の、これら細胞培養
物、好ましくはモノクローナルな(クローン的に均一
な)培養物、又は、モノクローナルな培養物由来の培養
物も考案している。またこの培養物は、GPIIb抗原性
を示していることが好ましい。トランスホームした宿主
細胞を培養するために有用な栄養培地は当分野でよく知
られているものであり、いくつかの販売業者から市販さ
れている。宿主細胞がホ乳類細胞である態様の場合、
“無血清”培地を用いることが好ましい。E.GPIIb
関連タンパク質の生産方法本発明のもう1つの特徴に、
GPIIb抗原性を示すタンパク質の生産方法がある。G
PIIb抗原性を示すタンパク質は、天然のGPIIbで誘
導される抗体と免疫反応するタンパク質である。GPII
b抗原性を示すタンパク質は、抗原として、及び抗体を
生じさせるものとして有用であり、それらの各々は、本
発明の診断システム及び診断方法に用いることができ
る。
【0035】本方法には、GPIIb関連アミノ酸残基配
列をコードする遺伝子を発現できる本発明の組換えDN
A分子でトランスホームした、宿主細胞、好ましくはヒ
トの細胞を含有する栄養培地を含む培養の開始を伴う。
この培養を、そのトランスホームした細胞がGPIIb関
連アミノ酸残基配列を含むタンパク質を発現するのに十
分時間維持する。その後発現したタンパク質を培養物か
ら回収する。培養物から発現したタンパク質を回収する
方法は、当分野ではよく知られているものであり、従来
の生化学的技術を用いた培養物のタンパク質含有成分の
分画が含まれる。例えば、タンパク質を分画するのによ
く知られている、ゲルロ過、ゲルクロマトグラフィー、
限外ロ過、電気泳動法、イオン交換、アフィニティーク
ロマトグラフィー等の方法が培養物中に存在する発現タ
ンパク質を単離するのに用いることができる。さらに、
免疫親和性、免疫吸着等の免疫学的方法も従来の方法を
用いて行なわれる。
【0036】せいぜい約50個のアミノ酸残基までの、
以後特別に列挙する配列に付加する、本発明のポリペプ
チド中に存在するアミノ酸は、以後議論されているよう
なポリペプチドの基本的かつ新規な特性に実質的に影響
を与えない残基である。このような付加残基は、通常、
列挙したポリペプチドの一端又は両端に付加しており、
列挙したポリペプチド配列の反復及び部分的反復も含む
ことがある。 F.ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、せいぜい約50個、より通常
には約35個以下、そして、好ましくは、約25個以下
のアミノ酸残基配を含み、少なくとも、約10個の残基
を含む。さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ
酸残基配列及び新しい機能性を特徴としている。 1.hGPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナログ 広く言うと、本発明の1態様は、RDG結合細胞粘着タ
ンパク質のアルファサブユニットの重鎖により発現され
る潜在的抗原決定基を真似るアミノ酸残基配列を含むポ
リペプチドを考案している。潜在的決定基ポリペプチド
アナログのアミノ酸残基配列は、サイトアドヘシンのア
ルファサブユニットの重鎖の約15個のカルボキシ末端
アミノ酸残基の配列に対応している。
【0037】好ましいサイトアドヘシンのアルファサブ
ユニット重鎖潜在的決定基ポリペプチドアナログは、h
GPIIbがフィブリノーゲンと結合した時に形成され
る、hGPIIb潜在的決定基に似ている。好ましい態様
において、hGPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナロ
グは、図1のアミノ酸残基137〜145番を表わす、
次のアミノ酸残基配列、 −PAHHKRDRRQ− を少なくとも含んでいる。さらに、hGPIIb潜在的決
定基ポリペプチドアナログは、少なくとも、図1のアミ
ノ酸残基配列129〜145番を表わしている、次のア
ミノ酸残基配列、 −PSPSPIHPAHHKRDRRQ− を含むことが好ましい。
【0038】hGPIIb潜在的決定基アナログには、表
1に示されるアミノ酸残基配列を含むことが望ましい。
【0039】
【表1】 表1 名 称 アミノ酸残基配列 p136−145 PAHHKRDRRQ p133−145 PIHPAHHKRDRRQ p131−145 PSPIHPAHHKRDRRQ p129−145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ a.各ポリペプチドの名称は、図1において、含有され
るアミノ酸残基配列を表わしている。表1に示したポリ
ペプチドは、さらに、hGPIIbがGPIIb〜 IIIa/
フィブリノーゲン複合体として存在するとき、以下に述
べるように、PMI−1抗体分子とhGPIIbとの結合
を中和する(競合的に阻害する)能力により特徴づけら
れた。
【0040】ここで用いる語“複合体”は、抗体−抗原
又はレセプター−リガンド反応のような特異的結合反応
産物を意味する。代表的複合体には、免疫反応産物、G
PIIb− IIIa−フィブリノーゲン結合反応産物及びサ
イトアドヘシン−リガンド結合反応産物がある。好まし
い態様において、hGPIIb潜在的決定基アナログは、
さらに、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競合的に
阻害する能力によって特徴づけられる。フィブリノーゲ
ン結合血小板凝集を阻害しうる代表的hGPIIb潜在的
決定基アナログは、ポリペプチドp129−145があ
る。本発明のhGPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナ
ログは、フィブリノーゲン結合血小板凝集を競合的に阻
害し、そして、または、以下に述べるように、hGPII
bがGPIIb− IIIa/フィブリノーゲン複合体として
存在する時、PMI−1抗体分子のhGPIIbへの結合
を競合的に阻害する限り、hGPIIbのアミノ酸残基配
列と同一である必要はないことが理解されなければなら
ない。それゆえ、hGPIIb潜在的決定基ポリペプチド
アナログは、保存的であれ、非保存的であれ、挿入、欠
失及び置換のような種々の変化を受けることが可能で、
そのような変化はその使用に際し、ある利点を提供する
こともある。
【0041】保存的置換とは、1つのアミノ酸が別の、
生物学的に同様な残基に置き換るものである。保存的置
換の代表例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又は
メチオニンなどの疎水性残基の間の置換又は、アルギニ
ンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、グルタミ
ンとアスパラギンなどの極性残基の間の置換などが含ま
れる。“保存的置換”という語句もそのようなポリペプ
チドが必要とされる結合活性を示すなら、未置換の元の
アミノ酸の代りに置換したアミノ酸を使用することも含
まれる。本発明のポリペプチドが、1つ以上の保存的又
は非保存的置換が起っているため、hGPIIbの配列と
同一ではない配列を有しているとき、本発明のポリペプ
チドが簡便にラベル又は固体マトリクス又は抗原性キャ
リヤーに固定できるように、“リンカー”を提供する目
的でその末端に付加的残基が付加される場合を除いて、
通常多くとも約20%、より普通には、多くて10%の
アミノ酸残基が置換される。本発明のポリペプチドに使
用できるラベル、固体マトリクス及びキャリヤーは以下
に説明する。
【0042】通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくと
も1残基で、40残基以上のこともあるが、普通には1
個乃至10個の残基からなる。リンカーに用いる典型的
アミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グル
タミン酸及びアスパラギン酸などである。さらに、本発
明のポリペプチド配列は、例えばアセチル化などの末端
NH2 アシル化又は例えばアンモニア、メチルアミンそ
の他の、チオグリコール酸アミデーション、末端カルボ
キシアミデーションによる修飾を受けることによる天然
の配列と異なるものであることもありうる。リンカーを
介してキャリヤーに結合し、当分野でキャリヤー−ハプ
テン結合体として知られているものを形成する場合、本
発明のhGPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、hGPIIbが血小板会合GPIIb− IIIa/フィブ
リノーゲン複合体として存在するとき、hGPIIbと免
疫反応する抗体を誘導することができる。免疫学的交叉
反応性に関する確立された原則からみて、本発明は、ポ
リペプチドp129−149の抗原的関連変異体を考案
している。“抗原的関連変異体”とは、ポリペプチドp
129−145の少なくとも6個のアミノ酸残基配列部
分を含み、かつ、hGPIIbが、血小板会合GPIIb−
IIIa/フィブリノーゲン複合体として存在するとき、
p129−145及びhGPIIbと免疫反応する抗体分
子を誘導することができるポリペプチドのことである。 2.lGPIIbポリペプチド 別の態様において、本発明は、図1のアミノ酸残基14
4〜156番で示される次のアミノ酸残基配列 −RQIFLPEPEQPSR− を少なくとも含んでいるlGPIIbポリペプチドを考案
している。
【0043】さらに、lGPIIbポリペプチドは、lG
PIIbとは免疫反応するがhGPIIbとは免疫反応しな
い抗体分子を誘導することができる特徴を有する。p1
44−156と命名される、好ましいlGPIIbポリペ
プチドは、次の式 RQIFLPEPQPSR で表わされるアミノ酸残基配列を有している。本発明の
hGPIIb及びlGPIIbポリペプチドの両方とも当分
野でよく知られている技術で合成することができる。使
用できる技術の秀れた概要が、J,M,スチワード(St
eward)及びJ.D.ヤング(“固相ペプチド合成”、
W.H.フリーマン社、サンフランシスコ、1969)
及びJ.メイエンホーファー(Meienhofer) (“ホルモ
ンタンパク質及びペプチド”、2巻、46頁、アカデミ
ックプレス版(ニューヨーク)、1983年)によって
固相法について、及びE.シュローダー(Schroder)及
びK.クブケ(Kubke)(“ペプチド”1巻、アカデミッ
クプレス版(ニューヨーク)、1965年)によって、
古典的溶液合成について、まとめられている。
【0044】G.接種物 別の態様において、本発明のポリペプチドもしくは、そ
の抗原的関連変異体を、薬学的に許容しうる水性希釈組
成物中で用いて、その効果的投与したとき、hGPIIb
と免疫反応する抗体を誘導できる接種物を作った。種々
の文法型の“接種物”という語は、GPIIbの重鎖又は
軽鎖に対する抗体の調製に用いられる活性成分として、
本発明のポリペプチドを含む組成物を示して用いてい
る。ポリペプチドを抗体の誘導に用いる時、このポリペ
プチドは単独、又は結合体として、キャリヤーに結合し
て、又は、ポリペプチドポリマーとして使用されること
を理解すべきであるが、発現の簡便性のため、本発明の
種々の態様においては、集約的に“ポリペプチド”又
は、その種々の文法型のものを、その意味で用いてい
る。
【0045】約35残基以下のアミノ酸を含むポリペプ
チドは、すでに述べてきたように、抗体の産生を誘導す
る目的には、キャリヤーに結合したペプチドを使用する
ことが好ましい。すでに述べてきたように、1個以上の
付加的アミノ酸残基をポリペプチドのアミノ及びカルボ
キシ末端に付加して、そのポリペプチドのキャリヤーへ
の結合を助けることができる。ポリペプチドのアミノ及
びカルボキシ末端へ付加したシスティン残基は、ジスル
フィド結合を介した結合体を作る上で特に有用なもので
あることが分っている。しかし、結合体を作るための、
当分野でよく知られている他の方法も、使用することが
できる。代表的付加結合操作には、グルタルアルデヒド
のようなジアルデヒド、ミカエル付加の使用(クリプス
タイン(Klipstein)等、ジャーナル・オブ・インフエク
シャスデシーズ(J. Infect. Dis.)147、318−3
26(1983)もしくは、水溶性カルボジイミドを使
用して、キャリヤーへのアミド結合を生成するような、
カルボジイミド技術の使用が含まれる。タンパク質結合
体もしくは、活性化官能基を介しての結合のレヴューに
ついては、オーラメアス(Aurameas)等のスカンジナビ
アン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Scand. J. Im
munol.)8、補1、7、7〜23(1978)を参照せ
よ。
【0046】有用なキャリヤーは当分野ではよく知られ
ており、一般にタンパク質それ自体である。これらキャ
リヤーの代表例には、キーホールリンペット・ヘモシア
ニン(KLH)、エデスチン、チログロブリン、ウシ血
清アルブミン(BSA)もしくは、ヒト血清アルブミン
(HSA)などのアルブミン、ヒツジ赤血球(SRB
C)のような赤血球、テタナス、トキソイド、コレラト
キソイド及びポリ(D−リジン:D−グルタミン酸)な
どのポリアミノ酸などがある。キャリヤーの選択は、そ
の接種物の最終的使用により依存し、本発明に特に関係
しない事項に基づいている。例えば接種を受ける動物に
おいて、不都合な反応が起こらないキャリヤーを選択す
べきである。本接種物には、典型的には、キャリヤーに
結合した結合体として、効果的な免疫原的量の、本発明
のポリペプチドが含まれている。他の事項の中で、単位
投与当りのポリペプチドもしくはタンパク質の効果量
は、接種を受ける動物種、その動物の体重及び選択され
た接種管理に依存し、このことは、当分野でよく知られ
ていることである。典型的に、接種物は、接種当り約1
0マイクログラムから約500ミリグラムのポリペプチ
ド又はタンパク質濃度、好ましくは、投与当り、約50
マイクログラムから約50ミリグラムのポリペプチドも
しくは、タンパク質を含んでいる。
【0047】本発明の接種物に使われる限り、“単位投
与”という語句は、動物への単一投与に適した物理的に
分離した単位を意味し、各単位は必要とする希釈剤、す
なわち、キャリヤーもしくは、ビヒクルと合せて、望ま
しい免疫原的効果を産むと計算された、予め決められた
量の活性物質を含んでいる。本発明の接種物の新しい単
位投与に対する明細は、(a)活性物質の特性及び遂行
される特別の免疫学的効果、及び(b)動物において、
免疫学的に使用するための、このような活性物質の調合
技術に本質的な制限、によって記述され、直接これらに
依存しており、それらは、ここに詳述されていると同時
に本発明の特徴となっている。典型的に、接種物は、
水、食塩水、又は、リン酸緩衝液のような生理学的に許
容される希釈剤又はビヒクル中にポリペプチド結合体を
分散して、水性組成物を作ることにより、乾燥した固体
ポリペプチド結合体から調製される。このような希釈剤
は、当分野でよく知られているものであり、例えば、レ
ミントン(Remington)の薬学、第16編、マック・パブ
リッシング社、イーストン、PA州(1980)、14
65−1467頁で議論されている。
【0048】また、接種物は、希釈剤の一部として、ア
ジュバントも含むことがある。完全フロイント・アジュ
バント(CFA)、不完全フロイント・アジュバント
(IFA)及びミョウバンのようなアジュバントは、当
分野でよく知られた物質であり、いくつかの販売業者よ
り、市販されている。 H.抗体及び抗体組成物 1.抗体組成物 ここで用いられている、種々の文法型の“抗体”という
語は、イムノグロブリン分子及び免疫学的に活性なイム
ノグロブリン分子の一部、すなわち、抗体結合部位もし
くは、パラトープを含む分子を意味している。代表的抗
体分子には、本来のイムノグロブリン分子、実質的な、
本来のイムノグロブリン分子及び当分野でFab、Fa
b′、F(ab′)2 及びF(V)として知られている
領域を含む、パラトープを含む、イムノグロブリン分子
の一部が含まれる。
【0049】“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結
合する(免疫反応する)重鎖及び軽鎖の可変及び超可変
領域を含む抗体分子の構造領域のことである。種々の文
法型の“免疫反応”という語は、抗原決定基含有分子及
び全抗体分子もしくはその一部のような抗体結合部位を
含む分子の間の結合を意味する。“抗原決定基”とは、
抗体結合部位によって、免疫学的に結合をうける抗原の
実質的構造領域を意味する。また、この語句は、“エピ
トープ”と互換的に使用される。本発明の抗体組成物
は、a)hGPIIb又はlGPIIb及びb)本発明の少
なくとも1つの特別なポリペプチドと免疫反応する抗体
分子を含むことを特徴とする。好ましい態様において、
本発明の抗体組成物は、GPIIbと免疫反応することが
できる1種以上のパラトープを含んでいる。
【0050】例えば、血小板会合GPIIb− IIIa/フ
ィブリノーゲン複合体及びhGPIIb潜在的決定基ポリ
ペプチドアナログと免疫反応するが、そのアミノ酸残基
配列を表2に示した。ポリペプチドp53−64と、実
質的に免疫反応を起こさない抗体分子を含む本発明の抗
体組成物は、フィブリノーゲン結合血小板と、フィブリ
ノーゲンと結合していない血小板とを区別することがで
きる。したがって、好ましい抗体組成物は、a)それが
血小板会合GPIIb− IIIa/フィブリノーゲン複合体
として存在するときの、hGPIIb、及びb)ポリペプ
チドp129−145、と免疫反応し、かつ、実質的
に、ポリペプチドp53−64との免疫反応を起こさな
い抗体分子を含むものである。典型的に本発明の抗体組
成物は、本発明の接種物でホ乳動物を免疫化し、それに
より、そのホ乳動物中に、適当なポリペプチド免疫特異
性を有する抗体分子を誘導することにより生産される。
それから、この抗体分子を、そのホ乳動物から回収し、
例えば、免疫親和性クロマトグラフィーなどの従来法に
より、望ましい程度の単離を行う。このようにして生成
した抗体組成物は、そのまま、本発明の診断法及び診断
システムに用いて、身体中のフィブリノーゲン結合血小
板の検出に使用される。 2.モノクローナル抗体組成物 本発明は、抗LIBSモノクローナル抗体組成物も考案
している。種々の文法型の“モノクローナル抗体組成
物”という語句は、ある抗体と免疫反応することができ
る唯一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合体を意味
する。したがって典型的に、モノクローナル抗体組成物
は、それが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性
を示す。それゆえ、モノクローナル抗体組成物は、異な
る抗原に対して、各々が免疫特異性を有する、多種の抗
体結合部位をもつ、単一の抗体分子、例えば、二特異的
モノクローナル抗体が含まれている。
【0051】典型的に、モノクローナル抗体組成物は、
ほんの一種の抗体分子を分泌(生産)するハイブリドー
マと呼ばれる単一細胞のクローンから生産される抗体を
含む。このハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞及びミ
エローマもしくは、自己生存細胞系列の融合によって生
成する。このような抗体は、最初に、コラー(Kohler)
及びミルスタイン(Milstein)により報告されており
(ネイチャー(Neture)、256、495−497(1
975))、その報告を参考としてここに組込んであ
る。1つの態様において、本発明のモノクローナル抗体
組成物は、細胞表面レセプター−リガンド複合体により
発現されるLIBS、好ましくは、その複合体中のレセ
プターの潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含
むことを特徴とする。
【0052】別の態様において、モノクローナル抗体組
成物は、hGPIIb及びhGPIIb潜在的決定基ポリペ
プチドアナログ、好ましくはp129−145と免疫反
応する抗体分子を含む。これら組成物中に含まれる抗体
分子は、GPIIb機能部位もしくはその付近のhGPII
bと免疫反応するが、血小板会合GPIIb− IIIaによ
るフィブリノーゲンの結合を阻害せず、また、それがフ
ィブリノーゲンと結合したときは、血小板会合GPIIb
− IIIaと免疫学的に反応することができる。このタイ
プの好ましいモノクローナル抗体組成物には、ハイブリ
ドーマPMI−1(ATCC HB 9476)によっ
て生産することができる抗体分子、すなわちPMI−1
抗体分子が含まれる。 3.モノクローナル抗体組成物の産生方法 本発明は、(a)細胞表面レセプター−リガンド複合体
により発現されるリガンド誘導結合部位(LIBS)と
免疫反応し、かつ、(b)そのレセプター−リガンド複
合体の非占有レセプターもしくは、非結合リガンドとは
免疫反応しない、モノクローナル抗体の生成法を考案し
ている。この方法には、 (a) 動物の、細胞表面−レセプター複合体もしくはh
GPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナログによる免疫
化。これは、典型的に、免疫学的受容ホ乳動物に免疫原
の免疫学的効果量、すなわち、免疫応答を起こすのに十
分な量投与することにより行なわれる。このホ乳動物
は、ウサギ、ラット又はマウス等のげっ歯動物であるこ
とが望ましい。これからこのホ乳動物を、レセプター−
リガンド複合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞
を作るのに十分な時間、維持する。
【0053】(b) 免疫化したホ乳動物から取り出した
抗体産生細胞のサスペンジョンを調製する。これは典型
的には、そのホ乳動物の脾臓を取り出し、ついで個々の
脾細胞を機械的に分離し、生理的に許容される媒体に分
散するという、当分野でよく知られている方法によって
行なわれる。 (c) サスペンジョン化した抗体産生細胞を、トランス
ホームした(“生存化”)細胞系列を作ることができる
トランスホーム剤で処理する。トランスホーム剤及び生
存化細胞系列を作るための、その使用は、当分野ではよ
く知られていることであり、それには、エプスタイン・
バーウイルス(EBV)、シミアンウイルス40(SV
40)、ポリオマウイルス等のDNAウイルス類、モロ
ニー・ムライン・リューケミア・ウイルス(MoMuL
V)、ラウス・ザルコーマウイルス等のRNAウイルス
類、P3X63−Ag 8,653、Sp2/0−Ag1
4等のミエローマ細胞類等が含まれる。
【0054】好ましい態様において、トランスホーム剤
による処理は、適当な融合促進剤の使用による、適当な
細胞系列由来のマウスミエローマ細胞を、サスペンジョ
ン化脾細胞と融合することにより、ハイブリドーマを生
成する。ミエローマ細胞当り約5個の脾細胞を用いるこ
とが好ましい。総容積当り、約108 個の脾細胞を使用
する。使用する細胞系列は、いわゆる“薬剤耐性”であ
ることが望ましく、その結果、未融合のミエローマ細胞
は、選択培地中で生存できず、一方、ハイブリッドは生
存できることになる。最も一般的なものには、8−アザ
グアニン耐性細胞系列があり、これは、酵素の、ヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼを欠失しており、そのため、HAT(ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジン)培地で生育すること
ができない。また、一般的に、使用するミエローマ細胞
系列は、分泌型を使用したとしても、それ自身、なんら
抗体を産生しないという点で、いわゆる“非分泌”型で
あることが望ましい。しかし、ある場合には、分泌型ミ
エローマ系列であることが好ましい。好ましい融合促進
剤は約1000から約4000の平均分子量をもつポリ
エチレングリコール(PEG1000として市販されて
いる)である一方、この分野で知られている、その他の
融合促進剤も使用することができる。
【0055】(d) その後、トランスホームした細胞
を、好ましくはモノクローナルにクローン化する。この
クローニングは、非トランスホーム細胞は生育できない
組織培養培地で行うことが望ましい。このトランスホー
ム細胞がハイブリドーマの場合は、一般的にこのこと
は、分離容器中、未融合脾細胞、未融合ミエローマ細胞
及び融合細胞(ハイブリドーマ)を、未融合ミエローマ
細胞が生存できない選択培地中に希釈し、ついで未融合
細胞が死滅するのに十分な時間(約1週間)、培養する
ことによって行なわれる。この希釈は、制限因子の1つ
であり、希釈体積は、各分離容器中にある個数の細胞
(例えば1〜4個)が分離されるように統計的に計算す
る(分離容器とは例えばマイクロプレートの各ウェルで
ある)。この培地は、薬剤耐性(例えば、8−アザグア
ニン耐性)未融合ミエローマ細胞系列を生育させないも
のである。
【0056】(e) クローン化トランスホーマントの組
織培養培地について、よく知られている免疫学的技術を
用い、分泌された抗LIBS抗体分子の存在を評価す
る。 (f) ステップ(e)で1度望ましいトランスホーマン
トが同定されれば、それを選択し、適当な時間、適当な
組織培養培地で生育させ、ついでその培養上清から、望
ましい抗体を回収する。適当な培地及び適当な培養時間
は、既知であるか、もしくは、容易に測定できる。より
高濃度の準精製モノクローナル抗体を生産するため、こ
の望ましいハイブリドーマを、マウス、好ましくは、同
種もしくは、準同種のマウスに注射する。このハイブリ
ドーマは、適当なインキュベーション時間の後、抗体産
生腫瘍を生成し、これは、この宿主マウスの血液及び腹
腔分泌物内に高い濃度の目的抗体を生ずる(約5−20
mg/ml)。
【0057】これら組成物の調製に適する培地は当分野
でよく知られ、かつ、市販されており、また、これに
は、合成培養培地、近交系マウス及びそれに類するもの
が含まれている。代表的合成培地は、4.5g/lのグル
コース、20mmグルタミン及び20%ウシ胎児血清を捕
った、ダルベユ最小基礎培地である。代表的な近交系マ
ウス株はBalb/c である。上記の方法で調製したモノク
ローナル抗体組成物は、例えば、LIBS含有免疫反応
産物の生成が望まれるような、診断及び治療に用いるこ
とができる。代表的反応産物には、GPIIbもしくは、
GP IIIaの含有免疫反応産物が含まれる。 I.ハイブリドーマ及びその調製法 本発明のハイブリドーマは、抗LIBSモノクローナル
抗体組成物を生産する能力を有することを特徴とするも
のである。
【0058】本発明の好ましいハイブリドーマは、細胞
表面レセプター潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分
子を生産することを特徴とする。望ましい免疫特異性、
すなわち、特定のタンパク質、特定のタンパク質上の同
定可能なエピトープ、そして、または、ポリペプチド上
の同定可能なエピトープと、免疫反応する能力を有する
抗体分子を生産(分泌)するハイブリドーマの調製方法
は、当分野ではよく知られているものである。参考のた
めここに組入れられているナイマン(Niman)等(プロシ
ーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. )(USA、8
0、4949−4953、(1983))及びガルフレ
(Galfre)等(メソッズ・イン・エンザイモロジー(Me
th. Enzymol.)73、3−46(1981))の報告に
あるハイブリドーマ技術は特に利用される。
【0059】ハイブリドーマ培養物PMI−1は、ブタ
ペスト協定要請物に基づき、1987年7月7日、アメ
リカ、20852、MD州、ロックビル、アメリカン・
タイプ、ティシュ・コレクション(ATCC)に登録さ
れ、受理番号HB9476が割当てられた。同様にハイ
ブリドーマ培養物PMI−2は1987年、12月22
日ATCCに登録され、受理番号HB9615を割当て
られた。 J.治療法及び治療組成物 本発明のhGPIIb潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、インビボにおけるフィブリノーゲン結合血小板の凝
集を緩和するのに用いることができる。例えば、hGP
IIb潜在的決定基ポリペプチドアナログは、効果的量を
被検者に投与したとき、フィブリノーゲン結合血小板の
凝集を競合的に阻害しうる、医療的に許容しうる組成物
で用いることができる。この阻害は、血栓生成を減速さ
せると考えられている。従って、インビボでの、hGP
IIb潜在的決定基ポリペプチドアナログの投与は、凝血
及びある炎症応答のような血小板凝集により開始される
生理学応答を緩和するのに用いることができる。
【0060】他の態様において、フィブリノーゲン結合
血小板の凝集は、基本的に、hGPIIb潜在的決定基ポ
リペプチドアナログ、好ましくはp129−145と免
疫反応する抗体分子を含む医療的に許容しうる組成物を
効果量、静脈投与することにより阻害しうる。この抗体
分子は、モノクローナル抗体組成物として存在すること
が好ましく、また、ハイブリドーマPMI−1で生産さ
れるものがより好ましい。投与するポリペプチドもしく
は抗体分子含有組成物は、溶液もしくはサスペンジョン
としてであるが、ポリペプチドは、錠剤、丸薬、カプセ
ル、放出維持製剤又は粉末の形でも投与される。どの場
合にも、典型的な組成物は約0.1μMから約1.0Mの活
性成分、好ましくは、約1.0μMから約10ミリモル濃
度(mM)の活性成分を含む。
【0061】活性成分として、ポリペプチド又は、抗体
分子を含む治療組成物の調製は、当分野でよく理解され
ている。典型的に、これらの組成物は、溶液又はサスペ
ンジョンのような接種物として調製されるが、接種前の
液体である溶液もしくはサスペンジョンに適した固体も
調製されることもある。また、この調製物はエマルジョ
ン化することもある。しばしば、この活性治療成分は、
医療的に許容され、かつ、この活性成分と適合すること
が知られている賦形剤と混合される。例えば、適当な賦
形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、
エタノール等及びそれらの組合せたものがある。さら
に、もし、望ましいときは、この組成物は、活性成分の
効果を上げるための、湿潤剤又はエマルジョン化剤、p
H緩衝剤のような少量の補助物質を含むこともある。
【0062】ポリペプチドもしくは抗体分子組成物は、
中和した医療許容塩としての医療組成物に整えられるこ
ともある。医療的に許容される塩には、例えば塩酸、リ
ン酸のような無機酸、もしくは、酢酸、酒石酸、マンデ
ル酸のような有機酸で作られる酸付加塩(ポリペプチド
又は抗体分子の遊離アミノ基で形成される)が含まれ
る。また遊離カルボキシル基で形成される塩は、例え
ば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム
もしくは鉄の水酸化物のような無機塩基及びイソプロピ
ルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導さ
れることもある。このポリペプチド又は抗体含有医療組
成物は、例えば、単位投与量の静脈注射などの従来法で
投与される。本発明の医療組成物に対して用いられる
“単位投与量”という語句は、ヒトへの単一投与に適す
る物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要とさ
れる希釈剤すなわちキャリヤー又はビヒクルと合せて、
望ましい医療効果を産むよう計算され、予め決められた
量の活性物質を含んでいる。
【0063】この組成物は、投与物の形状に適した方法
で、かつ、医療的に効果的量が投与される。投与量は、
治療される被検者、活性成分を利用する被検者の容量、
及び望ましいレセプター−リガンド結合の阻害度に依存
する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は医者の
判断に依存し、かつ、各個人に特異的なものである。し
かし、適当な投与範囲は、1日、1人当り活性成分1か
ら数ミリグラムのオーダーである。第1次及び第2次投
与の適正な処方も、様々であるが、典型的には、第1次
投与についでひきつづく注射又は他の投与法で、1時間
以上の間隔で反復投与する。別に、血液中の医療的に効
果的濃度を維持するのに十分な継続的な静脈への注入も
考案されている。hGPIIb潜在的決定基ポリペプチド
に関する。医療的に効果的な血液濃度は、約0.1mMから
約10mMの範囲であり、約1.0mMが好ましい。本発明の
抗体の医療的に効果的な血液濃度は約0.1μMから約1
0μMの範囲であり、1.0μMが好ましい。
【0064】K.診断システム 本発明のキット型の診断システムには、分包された試薬
として、少なくとも1回の検定に十分な量の、本発明の
発現タンパク質、ポリペプチド、抗体組成物もしくはモ
ノクローナル抗体組成物が含まれている。この分包試薬
の使用説明書も含まれているのが普通である。典型的に
は、“使用説明書”には、その試薬濃度もしくは、混合
する試薬及びサンプルの相対的量、試薬/サンプル混合
物の維持時間、温度、バッファ条件などの、少なくとも
1回の検定法のパラメータを記述した明確な表現物が含
まれる。1つの態様において、血液又は血漿のような、
血小板含有血液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小
板を検定するための診断システムには、hGPIIb潜在
的決定基ポリペプチドアナログ、好ましくはp129−
145と免疫反応する分子を含むパッケージが含まれて
いる。さらに、この抗体分子は、hGPIIbと免疫反応
するハイブリドーマPMI−1から生産されるものであ
ることがより好ましい。またこの抗体分子は、モノクロ
ーナル抗体組成物として存在することが好ましい。さら
に、この抗体分子が放射性核種ラベルに結合する、好ま
しくは、 1 25Iラベル化PMI−1抗体を含むキットで
あることがより望ましい。
【0065】別の態様における、本発明の診断システム
は、インビボで血栓の存在を検定するのに有用である。
このシステムには、hGPIIb潜在的決定基ポリペプチ
ドアナログ、好ましくはp129−145と免疫反応す
る抗体分子を含むパッケージが含まれる。この抗体分子
は、基本的にhGPIIbと免疫反応するPMI−1抗体
分子を含むモノクローナル抗体組成物として存在するこ
とがより好ましい。この抗体分子は、インビボ指示手段
と結合させておく。このように、好ましい態様におい
て、本発明の診断システムには、さらに、本発明の抗体
分子又はポリペプチドを含む複合体の生成を知らせるこ
とができるラベルもしくは指示手段が含まれている。こ
こで用いられているように、種々の文法型の、“ラベ
ル”及び“指示手段”という語句は、複合体の存在を示
す検出可能なシグナルの生成に直接もしくは間接的に関
係する単一原子及び分子を意味している。“インビボ”
ラベルもしくは指示手段は、被検者身体中で有効に働く
もので、それには、 111In、99Tc、 67Ga、 186
e及び 132Iが含まれる。どのラベルもしくは指示手段
も、本発明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の
一部である、発現タンパク質、ポリペプチドもしくは抗
体分子と結合するか、又はそれらに組込まれることもあ
るし、もしくは、別々に使用されることもあり、またそ
れらの原子又は分子は、単独で用いられることもある
し、別の試薬と組合せで使用されることもある。このよ
うなラベルは、臨床診断化学の分野ではよく知られてい
るものであり、そして、これらが、ここで述べられてい
る新しいタンパク質を用いた方法そして、またはシステ
ムで使用される場合に限り、本発明の一部を構成してい
る。
【0066】ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及
びタンパク質のラベル化は、当分野でよく知られている
ものである。例えば、ハイブリドーマによって生産され
る抗体分子は、培養培地中の成分として提供されるラジ
オアイソトープ含有アミノ酸の代謝的取込みによりラベ
ル化することができる。例えばガルフレ(Galfre)等、
ソメッズ・イン・エンザイモロジー(Meth, Enzymol)、
73、3−46(1981)参照。活性化官能基を介す
るタンパク質結合技術が特に利用される。例えば、オー
ラメアス(Aurameas)等、スカンジナビアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Scand. J, Immunol.)8、補
7、7−23(1978)、ロットウェル(Rodwell)
等、バイオテクノロジー(Biotech)、3、889−89
4(1984)及び米国特許第4,493,795号参照。
【0067】また、この診断システムには、好ましくは
分包状態で特異的結合剤を含むことができる。“特異的
結合剤”は、本発明の試薬を選択的に結合できるが、本
発明のタンパク質発現物質、ポリペプチドもしくは抗体
分子それ自体ではない分子である。代表的な特異的結合
剤には、抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片、
プロテインA及びそれに類するものがある。この特異的
結合剤は本発明の抗体分子もしくはポリペプチドが複合
体の一部として存在するとき、これを結合することがで
きることが好ましい。好ましい態様においては、この特
異的結合剤はラベル化されている。しかし、この診断シ
ステムがラベル化されていない特異的結合剤を含んでい
る場合、典型的にこの結合剤は、増巾手段又は増巾試薬
として用いられている。これらの態様において、ラベル
化特異的結合剤は、その増巾手段が試薬含有複合体に結
合しているとき、その増巾手段と特異的に結合しうる。
【0068】本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿
のような体液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板
の存在もしくはその量を検出するのに、“イライザ法”
様式で用いることができる。“イライザ法”とは、固相
に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原もしくは酵素−
抗体結合体を用いて、サンプル中に存在する抗原もしく
は抗体の量を検出及び定量する酵素結合免疫吸着検定法
のことである。イライザ法の説明は、参考として、組込
まれている、1982年、CA州、ロスアラモスのレン
ジメディカル出版社から出版されている、D.P.サイ
ツ(Sites)等の、“基礎及び臨床免疫学”の第4編、第
22章及び米国特許第3,654,090号、第3,850,7
52号及び第4,016,043号に報告されている。この
ように、好ましい態様において、本発明の発現タンパク
質、ポリペプチド又は抗体分子は、固体マトリクスに固
定され、本診断システム中、分包されている固体サポー
トとなっている。
【0069】この試薬は、当分野ではよく知られている
その他の固定様式が使われることもあるが、水性媒体中
から吸着により、固体マトリクスに固定化されるのが一
般的である。当分野において、有用な固体マトリクスは
よく知られている。このような物質には、ファルマシ
ア、フィインケミカルス(NJ.ピスカタウェイ)から
SEPHADEXの商標で市販されている架橋デキスト
ラン、アガロース;IL州、北シカゴのアボット・ラボ
ラトリーズ社から市販されている約1ミクロンから約5
ミリメートル径のポリスチレンビーズ、シート、小片又
はヘラ状の、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベ
ースの織物、もしくは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニ
ルから出来ているチューブ、プレートもしくは、マイク
ロプレートのウェルが含まれる。
【0070】ここで述べられている診断システムの試
薬、ラベル化特異的結合剤もしくは増巾剤は、液体分散
物のような溶解もしくは、例えば凍結乾燥形のような実
質的に乾燥した粉末として提供される。指示手段が酵素
の場合、その酵素基質もこのシステムの分包の形で提供
される。先に述べたマイクロプレートのような固体サポ
ート及び1種以上のバッファ類も本診断検定システムに
おける分包要素として含まれている。この診断システム
に関してここで議論されているパッケージは、通常、診
断システムで使用されているものである。このようなパ
ッケージには、ガラス製及びプラスチック製(例えば、
ポリエチレン、ポリプロピレン/及びポリカーボネー
ト)のボトル、バイアル、プラスチック及びプラスチッ
クホイルでラミネートした包装等が含まれている。
【0071】L.検定法 本発明は、本発明の抗体もしくは抗体分子組成物中に含
まれる抗体、発現タンパク質もしくはポリペプチドを含
む複合体を生成することにより、GPIIb及び特に血栓
もしくは、フィブリノーゲン結合血小板中に見られるよ
うなフィブリノーゲン結合GPIIbを含む複合体を検出
する方法を考案している。当業者は、これら複合体を形
成するのに利用することができる、よく知られた臨床的
診断化学操作が多く存在することをよく理解できよう。
従って代表的検定法をここに示すが、これにより本発明
が制限されることはない。 1.血栓の検出 被検者中の血栓の存在を検出する方法が考案されてい
る。インビボ指示手段を結合した、抗hGPIIb抗体分
子を含む、本発明の、効果的量の抗体組成物もしくは、
モノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する。好
ましい態様において、ラベル化抗体分子は、hGPIIb
及びポリペプチドp125−145とは免疫反応する
が、p53−64とは免疫反応しないもので、ハイブリ
ドーマPMI−1によって生産されるものであればより
好ましい。
【0072】その後、この被検者を、ラベル化抗体が血
栓の一部として存在するhGPIIbと反応し、複合体を
生成するのに十分な予め決めた時間、及び好ましくは、
非結合抗体分子の実質的量が身体から一掃されるのに必
要な付加的時間維持する。さらにこの被検者を、生成し
たラベル化複合体の存在、及び好ましくその位置につい
て検定する。 2.身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検
出 好ましくは血液や血液の血小板含有画分のような体液サ
ンプルなどの、血小板含有身体サンプル中のフィブリノ
ーゲン結合血小板の存在及び好ましくはその量を検出す
るために、競合的、非競合的にかかわらず、種々の不均
一及び均一検定プロトコールが使用できる。例えば、ヘ
パリン保存(非凝血化)血液サンプル及び 125Iラベル
化PMI−1抗体分子を混合する。このようにして生成
した免疫反応混合物を、生物検定条件下、フィブリノー
ゲン結合血小板がラベル化抗体と免疫反応し、ラベル化
免疫反応産物を生成するのに十分な時間維持する。それ
から、このラベル化免疫反応産物を典型的には、サンプ
ル中に存在する全ての血小板がペレット化するのに十分
な遠心により、未反応ラベル化抗体から分離する。その
後、この生成したラベル化免疫反応産物の量を検定す
る。生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及びポリ
ペプチド分子及び検定しようとするフィブリノーゲン結
合血小板の生物学的活性を維持する条件である。これら
の条件には、約4℃から約45℃の範囲で、好ましくは
約37℃の温度、約5から約9の範囲で、好ましくは約
7のpH値、及び蒸留水から、約1モル濃度塩化ナトリ
ウムまでの範囲で、好ましくはおよそ生理的食塩水のイ
オン強度が含まれる。このような条件を至適化する方法
は、当分野ではよく知られている。
【0073】
【実施例】例 次に示す例は、本発明を説明するものでその制限を意図
したものではない。 1.GPIIb−III aの単離 A.血小板の単離 最終濃度、ミリリットル当り0.06ユニットのヒルビン
(MO州、セントルイス、シグマケミカル社)を含むA
CD5ml(0.065Mクエン酸、0.085Mクエン酸ナ
トリウム、2%デキストロース)にヒトの血液6ミリリ
ットル(ml)を採取し、これを120×gで15分間遠
心する。富血小板血漿(PRP)と命名した。この上清
を回収し、単離してから、さらに、1200×gで15
分間遠心して、単離血小板のペレットを作った。 B.血小板からのGPIIb−III aの単離 例1Aにおけるように調製した血小板ペレットを5mlの
TBS(0.15M NaCl、0.2Mトリス、pH7.4、
5×10-4M CaCl2 、10-5Mロイペプチン)に
懸濁し、モデルM−375ソンケーターを用い、最高強
度で10分間、氷上で超音波処理した(NY州、プレイ
ンビュー、ヒートーシステム・ウルトラソニックス)。
この超音波処理したサスペンジョンを、ドライアイス−
メタノールアイスバスを用いて2度凍結融解を行ない、
ついでマイナス20℃で保存した。この凍結融解したペ
レット超音波処理物を5mlのスクロース溶液(TBS中
40%v/v)上に重層し、ついで、SW41遠心ロー
ター(CA州、フラートン、ベックマン・インスツラメ
ンツ)を用いて、4℃、毎分38000回転で1時間遠
心すると、ミルク色の下層が生ずる。その後、このミル
ク色の下層を回収し、SW50.1遠心ローター(ベック
マン)を用い、4℃で1時間、43,000RPMで遠
心した。生成したペレットを典型的には1〜2mlTBS
に懸濁して、血小板メンブレン溶液を作り、そのタンパ
ク質濃度を典型的には、バイオ−ラドタンパク質検定キ
ット(CA州、リッチモンド、バイオ−ラド)を、業者
の説明書に従って用いて、10−25mg/mlの範囲での
測定を行った。
【0074】再度、この血小板メンブレン溶液を、SW
50.1遠心ローターを用いて、上述のように遠心し、つ
いで生成したペレットを、2mlの抽出バッファ(0.03
Mトリス、pH7.4、1×10-5Mロイペプチン、200
mM n−オクチル−ベータ−D−グルコピラノシド;
CA州、ラジョラ、カルバイオケム−ベーリング)に懸
濁した。このようにして作った血小板メンブレン抽出物
を渦巻攪拌により完全に混合し、そして室温に30分
間、維持した。その後、この抽出物をSW50.1遠心ロ
ーターを用いて、4℃、45000rpm で1時間遠心
し、そして、このようにして生成した血小板メンブレン
抽出物上清を回収した。この回収した上清を、1リット
ルのカラムバッファ(0.03Mトリス、pH7.4、0.1m
M CaCl2 、0.1%n−オクチル−ベータ−D−グ
ルコピラノシド)で平衡化した。LKBウルトロゲル、
アクタ34ゲル濾過カラム(3×97cm、MD州、ゲイ
サーズバーグ、LKBインスツルメント社)にかけ、こ
のカラム溶出物から5mlづつのフラクションを採取し
た。各フラクションの280ナノメーターの光学密度を
測定し、いくつかのピーク付近のフラクションを合せ
て、各ピークのプールを作った。各プール由来のサンプ
ルを、還元バッファ及びレムリ(Laemmli)(ネイチャー
(Nature)(ロンドン)、227、680−685(1
970))によって報告された操作、及び14.4キロダ
ルトン(KDa)から92.5KDaのサイズ範囲の低分
子量タンパク質標準物質(CA、リッチモンド、バイオ
−ラド)を用いて、6%ポリアクリルアミド・スラブゲ
ルによる電気泳動で分析した。
【0075】GPIIb及びGPIII aに相当する分子
量、すなわち、各々120KDa及び100KDaの主
要な2種のタンパク質を含むプールが回収された。この
ように調製した、単離GPIIb−III a調製物のタンパ
ク質濃度は、典型的に、バイオ−ラドタンパク質検定キ
ットを用いて、0.3から0.8mg/mlの範囲であると測定
された。 2.ポリクローナル抗GPIIb−III aの抗血清の調製 例1で説明したように調製した、完全フロイント・アジ
ュバント及び単離したGPIIb−III aタンパク質10
0マイクログラム(μg)を含む組成物による免疫化に
より、ウサギ抗GPIIb−III a抗体を調製した。GP
IIb−III aの二次免疫注射を三週間の間、一週間スケ
ジュールに従い、不完全フロイントアジュバントを用
い、いくつかのイントラダーマル部位に投与し(典型的
には4部位に100μgを分配する)、ついでさらに3
ケ月間、二週間スケジュールに従って投与した。 3.cDNAライブラリー構築、抗体スクリーニング及
びcDNAの同定 全細胞性RNAを、グアニジニウム・イソチオシアネー
ト/塩化セシウム法を用い、HEL細胞から調製した。
ポリ(A+ )RNAを2サイクルのオリゴ(dT)セル
ロース・クロマトグラフィーにより、全RNAフラクシ
ョンから精製した。二本鎖cDNAは、標準操作に従
い、AMV逆転写酵素(FL州、セント・ピータースバ
ーグ、ライクサイエンス社)及びランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、10μgのHELポリ(A
+ )RNAから合成した。サイズ選択したcDNAを、
ファージgt11のEcoRI部位にライゲーションし、
ストラタジーン・クローニクングシステムズ社から市販
されているギガパック・パッキング抽出物を用い、その
業者のプロトコールに従ってそのファージ中に包み込ん
でから、大腸菌Y1088にプレーティングし、増巾し
た。大腸菌Y1090へのファージのプレーティング、
融合タンパク質合成の誘導、ニトロセルロースフィルタ
ーへの転移及び、例2で調製したウサギのポリクローナ
ルGPIIb−III a抗血清による、そのフィルターのス
クリーニングは、イムノパーオキシダーゼに基づくベク
タスタインABC法(CA州、バーリンガム、ベクター
ラボラトリーズ社)を業者の説明書に従って用いた、ヤ
ング(Young)等(プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.
Sci.) USA、80、1194−1198(198
3))によって報告されたように行った。陽性の組換え
クローンをプラーク精製し、増巾してから、プレート溶
解物として採取した。
【0076】ウサギのポリクローナルGPIIb−III a
の抗血清による、200,000個の組換え体の最初の
スクリーニングで6個の免疫反応クローンが同定され
た。陽性クローンのベーターガラクトシダーゼーcDN
A融合タンパク質と、モノクローナル抗体PMI−1と
の免疫反応性を試験するため、ファージ溶原体を、ヤン
グ(Young)等(サイエンス(Science)、222、778
−782(1983))の報告に従い大腸菌Y1089
株で作った。IPTG誘導培養物由来の溶解物を、還元
性ゲルサンプルバッファ中に、そのバクテリア細胞ペレ
ットを懸濁することにより調製し、その後、このサンプ
ルを、6%SDS−ポリアクリルアミドゲルで泳動して
から、トービン(Towbin) 等(プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci.) USA、26、4350−4354
(1979))により報告されているように、ニトロセ
ルロースフィルターに転移し、ついでベカスタインAB
C法を用い、PMI−1で探った。
【0077】1.1キロベース(kb)の挿入物を含
む、これらのクローンの1つ、HEL41は、GPIIb
エピトープを有するものと一致する特徴を有する140
KDaのバクテリア融合タンパク質の合成を行うことが
分った。これらの特徴には、(1) HEL41クローンに
よりコードされる融合タンパク質との、ポリクローナル
抗GPIIb−III aの抗体組成物の阻害可能な反応性
は、単離したGPIIa−III aによる予備吸着により阻
害されること、(2) 血小板溶解物及び精製GPIIb−II
I aのイムノブロットにおいて、融合タンパク質に関し
アフィニティー精製した抗体とGPIIbとの特異的反
応、及び(3) 表面ラベル化血小板由来のGPIIb−III
aの、アフィニティー精製抗血清による免疫沈殿化が含
まれる。アフィニティー精製抗体は、ウェスタンブロッ
ティングによるビトロネクチンレセプター(VnR)の
アルファサブユニットとの反応を起こすことができず、
また関連する内皮細胞サイトアドヘシンを免疫沈殿化す
ることができない。さらに、HEL41によりコードさ
れる融合タンパク質は、モノクローナル抗体PMI−1
との免疫反応性を有し、このことは、このクローンがG
PIIb上にあるエピトーマをコードしている証拠を提供
している。 4.DNAの配列決定及び配列解析 HEL41由来の組換えファージDNAを液体培養技術
により精製し、EcoRIで消化してからM13mp18に
サブクローン化した。各鎖のDNA配列は、ビギン(Bi
ggin) 等(プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)
USA、80、3963−3965(1983))によ
り報告されているような、35S−dATP及びバッファ
勾配ゲルを用い、サンガー(Sanger) 等(プロシーディ
ング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA、74、5463
−5467(1977))のダイデオキシ・チェーン・
ターミネーション法により決定した。cDNA配列は、
ストラウス(Stranss)等(アナリティカル・バイオケミ
ストリー(Anal. Biochem.) 、154、353−360
(1986))により報告されている特異的プライマー
依存DNA配列決定法を用いて伸長した。オリゴヌクレ
オチド20マーシーケンシングプライマーは、アプライ
ド・バイオシステムズ、モデル380A DNAシンセ
サイザーを用いて合成した。不明瞭さを除くため両鎖と
も配列決定を行った。
【0078】クローンHEL41のヌクレオチド配列を
図1に示したが、それは、次のような特性を有してい
る。挿入物は、部位682番から始まるTAG終止コド
ンとそれに続く420塩基の3′非翻訳配列を伴う、6
81塩基の読み取り枠からなる。このクローンの5′末
端の初めの120ヌクレオチドは、コンセンサスAlu
反復配列の特徴を有しており、このことは、このクロー
ンが不完全なプロセッシングを受けたmRNAに由来す
ることを示している。クローンHEL41のcDNA配
列は、227個のアミノ酸の読み取り枠をコードしてい
る(図1)。シャロ(Charo)等(プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c. Natl. Acad. Sci.) USA、83、8351−83
56(1976))により報告されているように、GP
IIbの軽鎖の配列決定されたN末端配列は、このクロー
ン内のアミノ酸残基157番から171番として同定さ
れる。このコンセンサスAlu反復配列が読み枠どおり
に翻訳されると、これは、HEL41にコードされてい
る最初の40個のアミノ酸に対応することを示してい
る。
【0079】マトリクス分析(ジョージ(George) 等、
PIRレポート#REL−0286、ナショナル・バイ
オメディカル・リサーチ・ファンデーション(198
6))によるGPIIb及びVnRアルファサブユニット
の誘導されたアミノ酸配の比較(スズキ(Suzuki)等、
プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA、8
3、8614−8618(1986))は、保存的置換
を可能とする類似性を有する2つの領域を検出した。お
よそ50個のアミノ酸残基にわたる1つの領域は、重鎖
のカルボキシ末端付近に位置する。約15残基の第2の
領域は、軽鎖のアミノ末端付近に位置し、両タンパク質
の重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合の形成に関係する
システィン残基を含んでいる。突然変異データマトリク
スを用いたリレート・プログラムによる、GPIIb及び
VnRアルファサブユニットの配列間の関係の統計的意
義の評価は、2つの配列に存在する、この類似性の度合
を偶然に見つける確率の低さを示している(P<0.00
01)。GPIIb及びFnRアルファサブユニットの配
列間の関係を分析すると(アーグレイブス(Argraves)
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J. Biol. Chem.)261、12922−12924
(1986))、この2つの配列中に存在する類似性の
度合を偶然に見つける確率が同様に低いことが示された
(P<0.0005)。
【0080】コンピュータ調査では、GPIIbのこの領
域とNBRFタンパク質データーベースに存在する他の
配列間にその他の明白な類似性は明らかにされなかっ
た。さらに、神経細胞粘着分子、N−CAMの、報告さ
れている部分配列との直接の比較で有意な一致は検出さ
れなかった。5.ポリペプチド合成ヌクレオチド配列か
ら誘導されたアミノ酸残基に基づいて、ここで使用され
ている種々のGPIIb領域に対応するポリペプチドを、
ハーゲンメイヤー(Hagenmaier) 等(ポプセイラーズ・
Z.フィジオロジカル・ケミストリー(Hoppe-Seyler's
Z. Phisiol. Chem.)353、1973(1982))
の対称無水物法を用い、アプライド・バイオシステムズ
社モデル430ペプチドシンセタイザーで化学合成し
た。
【0081】合成したポリペプチドのアミノ酸残基配列
及び図1に示したGPIIbの誘導されたアミノ酸残基配
列内のそれらの位置を表2にリストした。
【0082】
【表2】 表2 名称 アミノ酸残基配列 p19−34 WEAKAGRSPEVRSSRS p53−65 REQNSLDSWGPKV p129−145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ p136−145 PAHHKRDRRQ p144−156 RQIFLPEPEQPSR 6.モノクローナル抗体組成物の調製 単離したイムノグロブリンIgG(IgG)を含むモノ
クローナル抗体組成物を、典型的にファルマシア社(N
J.ピスカタウェイ)から市販されており、業者の説明
書に従って用いられるプロティンA−セファロースを用
いて、マウスのハイブリドーマ細胞系列PMI−1(A
TCC番号HB9476)を含むマウスの腹水から単離
した。単離したIgGのタンパク質濃度を、バイオラド
のプロティンアセッセイ・キットを業者の説明書に従っ
て使用することにより測定した。
【0083】125 Iラベル化抗体を含むPMI−1モノ
クローナル抗体組成物を調製するため、1ミリリットル
当り1ミリグラムの上記単離PMI−1IgGを含む、
350マイクロリットル(μl)のPBS(0.15M
NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.09)を、
40マイクログラム(μg)のクロラミン−J及び1ミ
リキューリー(m Ci)の無キャリィーNa 125
(IL州、アーリントン・ハイツ、アマーシャム)と混
合した。この混合物を約20℃に5分間維持し、その
後、20μlの2mg/mlメタ重亜硫酸ナトリウム溶液及
び20μlのヨウ化カリウム溶液と混合する。それか
ら、1%のBSAを含むPBS800μlを混合し、さ
らに最終濃度10mMとなるように、ジイソプロピルフ
ルオロホスフェートを混合する。この混合物を22℃で
60分維持してから、PBSに対して透析する。生成し
125Iラベル化PMI−1の比活性はμg当り約4.5
マイクロキューリーであった。
【0084】上述の単離1gG由来のFab断片を含む
組成物は、パパインによる、37℃、6時間の消化(パ
パインに対するIgGの重量比、1:200)する、メ
ージ(Mage)等の方法に従って調製した(メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)70、
142−150(1980)。未消化のIgG及びFc
断片を、プロティンA−セファロースによるクロマトグ
ラフィーで除去した。こうしてできたFab断片含有組
成物は使用準備ができており、もしくは、必要なとき
は、上述のモノクローナル抗体組成物で報告した操作と
同様に、 125Iラベルした。PMI−1と異なる免疫特
異性を有する、本発明のモノクローナル抗体も、PMI
−1と同様に調製される。たとえば、このうな組成物
は、マウスのハイブリドーマ細胞系列PMI−2を用い
て調製した(ATCC番号HB9615)。 7.イライザ検定法(ELISA) A.ポリペプチドイライザ法 PMI−1及びTabモノクローナル抗体組成物中に含
まれる抗体分子を、ポリペプチドp129−145及び
p144−156と免疫反応する能力について調べた。
(Tabは、コントロールとして用いた無関連モノクロ
ーナル抗体である。)20μMのポリペプチドを含む5
0マイクロリットル(μl)コーティング溶液(0.1M
NaHCO3 、pH8.5、0.1% NaN3 )を、平底
96穴マイクロプレート(イムロン2、VA州、チャン
ティリー、ダイナテク・ラボラトリーズ社)のウェルに
入れた。その後、このプレートを37℃に60分間維持
し、ポリペプチドをウェルの壁上に吸着させる。振っ
て、このコーティク溶液を除き、このウェルを、洗浄バ
ッファ(0.01Mトリス、pH7.4、0.05%トウィーン
20、0.15M NaCl、200mg/mlメルチオレー
ト)で2度すすぎ、さらに各ウェル(固体サポート)に
50μlのブロッキングバッファ(コーティング溶液中
の5%ウシ血清アルブミン溶液)を加えて、過剰のタン
パク質部位をブロックした。
【0085】このウェルを約37℃に60分間維持して
から、このブロッキング溶液を除去した。各ウェルに、
(a) 例8で調製し、かつ希釈バッファ(5mM EDT
A及び1mg/mlBSAを含む洗浄バッファ)で200倍
に希釈した、ウサギ抗ポリペプチド抗体、(b) 例6で報
告したように調製した、1.5ナノモル濃度(nM)のP
MI−1モノクローナル抗体IgG、もしくは希釈バッ
ファで320,000倍に希釈した、TABハイブリド
ーマ腹水(TX州、サンアントニオ、テキサス大学、
R.マクエバー博士より提供された)を含む溶液50μ
lを加えた。このようにしてできた固/液相免疫反応混
合物を60分間、室温に維持して、固相結合ポリペプチ
ド及び添加された抗体との第1の固相結合免疫反応産物
を形成させた。それから、この固液相を分離し、このウ
ェルを洗浄バッファで2度すすいでから、過剰の液体を
振って除去した。
【0086】希釈バッファで2000倍に希釈した、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウ
スIgG(CA州、バーリンガム、タゴ社)、もしく
は、希釈バッファで2000倍に希釈したヤギ抗ウサギ
IgG(CA州、リッチモンド、バイオ・ラド・ラボラ
トリーズ社)を含む溶液50μlを各ウェルに添加し、
第2の固/液相免疫反応混合物(ラベル化免疫反応混合
物)を形成させた。このウェルを50分間、室温に維持
して、ラベル化抗体及び第1の免疫反応産物の固相結合
抗体間の第2免疫反応産物を形成させた後、洗浄バッフ
ァで2度すすいで、固相結合ラベル含有免疫反応産物を
単離した。それから、過剰の液体をウェルから除去し
た。CPバッファ(水1リットル当り、0.1Mクエン酸
243ml及び0.2Mリン酸二ナトリウム250ml)中、
0.4mg/ml o−フェニレンジアミン及び0.012%
(v/v)過酸化水素を含む発色基質溶液50μlを各
ウェルに加え、発色反応混合物を作る。この発色反応混
合物を、約20℃に10分間維持した後、2NH2 SO
4 50μlを各ウェルに添加して、この発色反応をを停
止してから、この溶液の490ナノメーター(nm)の
吸光度を、モデル310イライザ・プレート・リーダー
(VT州、ウィノスキー、バイオテク・インスツルメン
ト社)を用いて測定した。
【0087】表3に示した、本研究の結果は、モノクロ
ーナル抗体PMI−1が、ポリペプチドp129−14
5と免疫反応するが、ポリペプチドp144−156と
は免疫反応しないことを示している。以下に議論してい
るように、PMI−1は、GPIIb−III aがフィブリ
ノーゲンと結合したとき、hGPIIbにより形成されて
いる(上に露出している)潜在的決定基と免疫反応する
ため、本研究の結果は、p129−145がhGPIIb
潜在的決定基を真似る能力を有していることを示してい
る。
【0088】
【表3】 表3 ポリペプチド モノクローナル抗体 抗原 PMI−1 Tab p129−145 1.310±0.132 0.068±0.009 p144−156 0.069±0.005 0.061±0.005 BSA1 0.068±0.005 0.060±0.004 1 BSA=ネガティブコントロールとして使用されたウシ血清 アルブミンコーティングしたウェル。 2.三回の測定から得られた平均光学密度の値±標準偏
差 B.競合イライザ法 ポリペプチド及び単離GPIIb−III aについて、PM
I−1及びTabモノクローナル抗体組成物中に含まれ
る抗体分子との免疫反応に対し、固相GPIIb−III a
と抗原として競合する能力を調べた。
【0089】競合イライザ法は、1)ポリペプチドの代
りに、例1で報告したように単離したGPIIb−III a
をコーティング溶液中20μg/mlで用いてマイクロプ
レートのウェルをコートすること、及び2)抗体を添加
し、免疫反応混合物を作る直前にウェルにGPIIb−II
I aもしくはポリペプチドを各々、0.73μMもしくは
25μM濃度でウェルに添加すること、以外は、例7A
で述べたように行った。表4で示した、本研究の結果
は、p129−145及びGPIIb−III aが競合的
に、固相GPIIb−III aに対するPMI−1抗体分子
の免疫学的結合を阻害する一方、p144−156は阻
害しないことを示している。加えて、ポリペプチドは、
GPIIb−III aと免疫反応するTab抗体分子の能力
に有意な影響を示さなかった。これらの結果は、ポリペ
プチドp129−145がp129−145アミノ酸残
基配列を含むhGPIIb領域の二次構造及び抗原決定基
を真似る能力を有することを示している。
【0090】
【表4】 表4 競合者 モノクローナル抗体 PMI−1 Tab p129−145 0.067±0.0021 1.002±0.026 p144−156 0.814±0.012 1.117±0.024 なし 0.804±0.002 1.040±0.05 GPIIb−III a 0.433±0.013 1.134±0.010 1.三回の測定から得られた平均光学密度値±標準偏差 8.抗ペプチド抗血清の調製 抗ペプチド抗血清は、例5で調製したペプチドでウサギ
を免疫化することにより作った。グルタルアルデヒドを
用いた、抗原キャリヤーとしてチログロブリン(MO
州、セントルイス、シグマケミカル社、ウシI型)への
ペプチドの結合を、参考として、ここに組込んだJ.
G.ドクレー(Dockray)の報告(制御ペプチド(Regula
tory Peptides)、1、169−186(1980))に
従って行った。その後、一次免疫に、400μgのチロ
グロブリン結合ペプチドを用いたこと以外は、例2で述
べたように免疫化を行った。 9.ポリペプチドによる、血小板会合GPIIbへの抗体
結合の阻害 A.血小板の調製 例1Aで示したように調製した単離血小板を、1mg/ml
のBSA及び1mg/mlデキストロースを含む無カルシウ
ムタイローズバッファ(0.13M NaCl、0.002
6M KCl、0.002M MgCl2 −6H2 O、5
mMヘペス、0.012M NaHCO3 、pH7.2)2ml
に懸濁した。この血小板サスペンジョンを、同様のタイ
ローズバッファで平衡化したセファロースCL2Bカラ
ム(NJ州、ピスカタウェイ、ファルマシア社、40ml
全吸着床容積)にかけた。血小板を、最終容積約4〜5
mlの、CL2Bカラムの空隙容量から回収し、洗浄血小
板及びこの洗浄血小板サスペンジョンと命名し、コール
ター社モデルIIカウンター(FL州、ハイアリーフ、コ
ールターエレクトロニクス社)で計数した。全血小板調
製操作は、プラスチック容器中及び室温で行った。 B.血小板競合検定法 例9Aで述べた、タイローズバッファ中に調製した洗浄
血小板(2×108 /ml)を、最終濃度5mMとなるよ
うなテトラエチレン四酢酸(EDTA)と混合し、30
分間37℃に維持して、PMI−1結合エピトープに露
した。その後、この血小板を図2に示した濃度のポリペ
プチドと混合し、さらに、例6で調製した。 125Iラベ
ル化PMI−1と混合させて、生成した免疫反応混合物
中、1μMのラベル化抗体を作る。この混合物を22℃
に30分間維持し、免疫反応産物を形成させる。その
後、 125Iラベル化PMI−1/血小板免疫反応産物
は、その維持した全混合物を、ベックマン・マイクロフ
ュージB(CA州、フラートン、ベックマン・インスツ
ルメント社)中、0.3mlの20%スクロース中での遠心
により未結合の 125I−PMI−1から単離され、血小
板ペレットとした。血小板ペレットに会合した放射活性
125I−PMI−1の量を、シンチレーションスペクト
ロメトリーにより測定した。
【0091】図2に示した、本研究の結果は、ポリペプ
チドp129−145が、二価カチオンの非存在下、血
小板メンブレン会合GPIIbへの、抗体分子結合を競合
的に阻害しうることを示している。また、図2は、抗体
分子濃度が1μMのとき、50%阻害が、1.6μMのポ
リペプチド濃度で起こることから、p129−145/
PMI−1相互作用のおよそのKd値が1.2μMである
ことを示している。 10.フィブリノーゲン結合血小板による、hGPIIb
潜在的決定基の発現 例1aで示したように、富血小板血漿(PRP)を調製
し、3つの部分標本に分けた。1つの部分標本におい
て、血小板を最終濃度50μMとなるようアデノシン二
リン酸は添加することにより刺激して、官能性GPIIb
−III a(フィブリノーゲンレセプター)を発現させ、
ADP刺激血小板を生成した。第2の部分標本におい
て、最終濃度50μMのエピネフリンの添加によりGP
IIb−III aの発現の刺激を行った。両方の場合、刺激
を受けた血小板上に発現したGPIIb−III aフィブリ
ノーゲンレセプターは、血漿中に存在するフィブリノー
ゲンと結合し、フィブリノーゲン結合血小板となる。ネ
ガティブコントロールとして、PRPの第3の部分標本
は刺激せず、非刺激血小板とした。
【0092】通常の技術で、例6で述べた、 125Iラベ
ル化抗体から調製した、 125Iラベル化PMI−1 F
ab断片を、最終濃度0.8μMとなるよう各PRP部分
標本に添加した。このようにして生成した免疫反応混合
物を30分間37℃に維持し、ラベル化した免疫反応産
物、すなわち、フィブリノーゲン結合血小板/ 125I−
PMI−1複合体を形成させた。それから、ラベル含有
免疫反応産物を、例9Bで述べたようなスクロースクッ
ションを介した血小板の遠心により、未結合 1 25I−P
MI−1から分離した。図3は、本研究の結果を示して
おり、PMI−1抗体分子が、刺激化フィブリノーゲン
結合血小板とは免疫反応するが、実質的に、非刺激化血
小板とは免疫反応しないことを示している。非刺激化P
RP部分標本中“結合”していると見なされる 125I−
PMI−1は、非特異的結合(“スティッキング”)、
そして、または、天然のバックグランドレベルの刺激化
フィブリノーゲン結合血小板もしくは、取扱いの結果と
して結合及び刺激化された血小板の存在によるものであ
ると考えられている。それゆえ、これらの結果は、GP
IIb−III aサイトアトヘシンによる、フィブリノーゲ
ン、arg−gly−asp(RGD)アミノ酸残基配
列含有リガンドの結合は、その他の潜在的抗原決定基を
発現させることを示している。このように、PMI−1
抗体分子及び同様の免疫特異性を有する抗体分子は、血
液サンプル中の刺激化フィブリノーゲン結合血小板の存
在及びその量の検定に使用することができる。 11.ポリペプチドによる血小板凝集の阻害 例1Aで述べたように調製した富血小板血漿(PRP)
200μlを、BSA及びテキストロース(各々1mg/
ml)を含むタイローズバッファ190μl及び表4で示
した種々の量のポリペプチドp129−145もしくは
p144−156と混合した。それから10μlのAD
P(タイローズバッファ中80μM)を添加して、血小
板凝集を刺激した。この混合物を37℃に維持しなが
ら、デュアルサンプルアグリゲーションメーター(CO
州、モリソン、シエンコ社、モデルDP−247E)を
用い、この混合物の透過率の時間変化をモニターした。
【0093】アグリゲーションメーターは、200μl
のPRP及び200μlのタイローズバッファを含む溶
液を用い、コントロールアグリゲーションに対しては5
%、及びポリペプチド存在下のアグリゲーションに対し
ては10%に透過率のベースラインをセットすることに
より補正した。100%透過率の上限は、100mlPR
P及び300μlのタイローズバッファの混合物を用い
て一律に設定した。 12.抗ペプチド抗血清を用いたGPIIb軽鎖の免疫反
応 例1Aで述べたように調製した約1兆個の血小板を1ml
の冷PBS(すなわち4℃)懸濁し、ついで、200μ
gのラクトパーオキシダーゼ(シグマ社)及び2m Ci
の無キャリヤーNa 125I(16m Ci /μg、IL
州、アーリントンハイツ、アマーシャム)と混合し血小
板ラベル化サスペンジョンを調製した。それから、5分
間隔で2回、0.06%ストック溶液から5μlのパーオ
キサイドをこのサスペンジョンに添加し、4℃に維持し
て、ラベル化反応を開始させた。その後、200μgの
チロシンを加えて、この反応を停止させ、1200x
g、15分の遠心を5回繰り返して洗浄し、さらに冷P
BSに懸濁して、ラベル化血小板サスペンジョンを調製
した。5番目の遠心ステップの後、このラベル化血小板
を、40mlの溶解バッファ1(0.5%トライトンX−1
00(v/v)、10mM EDTA、10μg/mlベ
ンズアミジン及び100ユニット/mlのトラシロール;
全てシグマ社製)に懸濁することにより、ラベル化血小
板溶解物を調製した。
【0094】1mlのラベル化血小板溶解物を15μlの
加熱失活化正常ウサギ血清(NRS)と混合し、22℃
に30分間維持し、さらに、免疫反応バッフぁ(IP
B:0.02Mトリス塩酸、pH7.4、0.156M NaC
l、0.01M EDTA、10mMベンスアミジン−塩
酸、10μg/mlソイビーン・トリプシン・インヒビタ
ー、0.2mMフェニルメチルスルホニル・フルオライ
ド、1%(v/V)トライトンX−100、0.05%
〔v/V〕トウィーン20、0.02%〔w/V〕NaN
3 、5ユニット/mlトラシロール;全てシグマ社製)中
に調製した。10%(v/V)ハイソービル(CA州、
ラジョラ、ベーリング、ダィアグ/スティクス社)溶液
100μlを添加し、ベックマン、マイクロフュージB
中で1分間遠心し、ついで生成した上清を単離して、透
明な溶解物を調製した。このNRSの添加、維持、パン
ソービンの添加及び遠心の透明化操作を2度繰り返して
から、再び、NRS及び維持ステップを省いた、パンソ
ービンを用いる同様の操作を行ない、三回透明化溶解物
を調製した。
【0095】その後、この三回透明化溶解物を、250
μlのIPB、例8で調製した抗ポリペプチド抗血清4
μl、例2で調製した抗GPIIb−III aもしくはNR
S、及び最終濃度1%となるようなウシ血清アルブミン
と混合した。この混合物を、4℃に12〜18時間維持
してから、10%パンソービン100μlと混合し、そ
の後、22℃に1時間維持した。その後、この混合物を
マイクロフュージBで1分間遠心してから、生成したペ
レットを単離した。この単離ペレットをIPBで2回、
0.5M LiClで1回、再びIPBで1回洗浄した。
この洗浄操作には、指示したバッファ約1mlへの懸濁、
マイクロフュージBでの1分間の遠心及び生成したペレ
ットの単離が含まれる。ついでこの洗浄ペレットを溶解
して、レムリ(Laemmli)により報告されているように、
サンプルバッファ約100ml中、3分間100℃に加熱
することにより、存在する免疫複合体を脱離させる。例
えば、レムリ(Laemmli)、U.K.ネイチャー(Natur
e)(ロンドン)、227−680−685(197
0)参照。その後、溶解免疫複合体をマイクロフュージ
Bで1分間遠心してから、免疫沈殿化タンパク質を含む
上清を、5%2−メルカプトエタノールを含むレムリ
(Laemmli)バッファーを用い、15%ポリアクリルアミ
ドスラブゲルでの電気泳動で分析した。さらに、このゲ
ルを乾燥し、そこに含まれているタンパク質をコダック
X−オマット(Omat)ARフィルム(NY州、ロチェスタ
ー・イーストマン・コダック社)への放射線露光により
可視化した。この可視化タンパク質の分子量を、12,
300及び97,400ダルトンの範囲の分子量をも
つ、14Cラベル化タンパク質標準物質に相対的な電気泳
動移動度に基づいて見積った(標準物質;MA州、ボス
トン、ニューイングランドニュークリアー製)。
【0096】この方法で分析したラベル化溶解物は、約
20KDaの分子量をもつ、ゲル上に可視化されたタン
パク質を生じ、このタンパク質は、ポリクローナル抗G
PIIb−III a抗血清もしくはNRSを用いたときは実
質的には検出されない、抗ポリペプチドp144−15
6抗血清使用時のGPIIb軽鎖タンパク質(lGPII
b)に対応している。それゆえ、抗ポリペプチドp14
4−156抗血清及び同免疫特異性を有する抗体組成物
は、lGPIIbを検出するのに用いることができる。 13.リガンド結合による、GPIIb−III a潜在的抗
原決定基の発現 A.混合による、潜在的抗原決定基を発現する血小板へ
の抗体結合の検定法 使用するタイローズバッファを始めに、キレックス10
0(200−400メッシュ、ナトリウム型、CA州、
リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ社)との混
合し、タイローズバッファ中に存在する二価カチオンと
錯体を作るよう維持し、ついでバッファから、錯体を作
った二価カチオンを濾過して除去する処理を行うこと以
外、例9Aで述べた方法により、洗浄血小板を、ml当り
1×10 8 個の濃度となるように調製した。
【0097】上記の洗浄化血小板含有調製溶液を部分標
本に分けた後、各部分標本中の血小板を、最終濃度5μ
MとなるようにADPを添加することにより刺激してA
DP刺激化血小板を調製した。また、刺激を行なわない
ものも用意した。まず、例6で述べたように調製した、
125Iラベル化全抗体分子もしくは、 1 25Iラベル化F
ab断片を含むモノクローナル抗体組成物を種々のポリ
ペプチド及び二価カチオンもくしはEDTAと混合し
た。さらに、この 125Iラベル化抗体/ポリペプチド混
合物を、刺激化もしくは非刺激血小板部分標本と、結果
として、抗体もしくはFab断片濃度が約0.8μMとな
るように混合した。それから、この免疫反応混合物を3
0分間37℃に維持し、潜在的抗原決定基を発現させ,
かつ、 125Iラベル化免疫反応産物、すなわち、リガン
ド結合血小板/ 125I−抗体もしくは 125I−Fab断
片複合体を形成させた。さらに、ラベル含有免疫反応産
物は、例9Bで報告されているように、スクロースクッ
ションを介しての部分標本の遠心により、未結合 125
ラベル化抗体又はFab断片から分離した。
【0098】表5は、モノクローナル抗体PMI−1を
用いた、リガンド存在下の、血小板へのラベル化抗体の
結合を検定した結果を示す。
【0099】
【表5】 表5 PMI−1 IgG又はFabの血小板への結合におけるリガンド依存の増加 抗体種 リガンド2 結合PMI−1の増加1 未刺激 刺激化 PMI−1 IgG KYGRGDS 6378±753 6000±714 GRGDSP 5313±522 5561±158 GRGESP 898±357 837±374 H−12 N.D.3 3663±878 EDTA 6064±593 5674±512 PMI−1 Fab KYGRGDS 7722±1189 5661±373 GRGDSP 4437±852 5250±300 GRGESP −279±281 147±165 H−12 N.D. 3014±430 EDTA 5299±225 6505±660 1.結合したPMI−1量の増加は、リガンド存在下で
の結合量から、リガンドは含まないが2mM CaCl
2 及び1mM MgCl2 存在下での結合量を引いた値
として観測される増加を、血小板当りに結合したPMI
−1分子数±標準偏差として表現されている。非刺激又
は刺激化血小板に対する、二価カチオン存在かつリガン
ド非存在下での結合量は、各々、PMI−1 IgGに
対し、6769±84又は6643±157分子/血小
板であり、また、PMI−1 Fabに対し、各々、3
917±212又は3785±150分子/血小板であ
った。
【0100】2.使用するリガンドは例5で述べたよう
に調製した。指示されたポリペプチドの1つであり、例
13Aで述べた免疫反応混合物中の最終濃度が1mMと
なるよう添加するか、又は、アミノ酸配列HHLGGA
KQAGDVを有し、残基399−410番のフィブリ
ノーゲンガンマ鎖由来のものである。コントロールポリ
ペプチドH−12で、これも1mM添加される。コント
ロールとしてのリガンドポリペプチドの非存在下では、
4.5mM EDTAが添加された。EDTAを含まない
全ての場合に、2mM CaCl2 及び1mM MgC
2 が含まれる。 3.測定せず。 表6は、ハイブリドーマPMI−2より生産される全モ
ノクローナル抗体又はFab断片(すなわち、PMI−
2モノクローナル抗体)を含むモノクローナル抗体組成
物を用いた、リガンド存在下での、抗体の血小板への結
合の実験結果を示している。
【0101】
【表6】 表6 結合PMI−21 リガンド2 二価イオン3 未刺激 刺激化 なし CaCl2 1220 2,480 RGDS CaCl2 2210 10,780 SDGR CaCl2 1960 2,360 GRGESP CaCl2 1560 4,680 400−411 CaCl2 1840 9,650 Fg CaCl2 2300 13,800 なし EDTA 8660 10,670 RGDS EDTA 8540 10,080 1.PMI−2 IgGの結合量は例13Aで示したよ
うに測定し、指示して条件下、血小板当り結合したPM
I−2分子数として表現されている。
【0102】2.使用したリガンドは、例5で述べたよ
うに調製した。指示されるポリペプチドの1つであり、
最終濃度0.5mMとなるよう添加するか、もしくは、こ
れも、0.5mMとなるよう添加される。残基部位400
から411番のフィブリノーゲンガンマ鎖の配列に相当
する配列を有するポリペプチド、もしくは最終濃度15
μMで使用する、マーグエリー(Marguerie)等(ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol.
Chem.) 、254、5357−5363(1979))
により報告されているように単離したフィブリノーゲン
・タンパク質(Fg)である。またコントロールとし
て、リガンドの添加がないものも行った。 3.添加二価カチオンとは、1mM CaCl2 か、又
は5mM FDTAの二通りの条件を意味する。
【0103】表5及び表6に示した結果は、フィブリノ
ーゲン(Fg)Fg由来ペプチド、400−411及び
RGD含有ペプチドがGPIIb−III aを結合し、か
つ、通常、抗原決定基が抑制される条件下、すなわち、
CaCl2 の生理学的濃度存在下、PMI−1又はPM
I−2により認識される潜在的抗原決定基を露出させる
能力を示している。また、この結果は、PMI−2によ
り認識される潜在的抗原決定基は刺激化血小板とのリガ
ンド結合で誘導れるが、非刺激化血小板では誘導されな
いことを示している。一方、PMI−1により認識され
る潜在的抗原決定基は、刺激化、もしくは非刺激化血小
板の両方との、ポリペプチドリガンドの結合により誘導
される。
【0104】さらに、この結果は、GPIIb−III aに
対するこのリガンドの構造特異性も示している。逆配列
ペプチド、SDGRは、PMI−2認識抗原決定基を誘
導せず、また、通常見うけられるアスパラギン酸残基
(D)の代りに、グルタミン酸(E)を用いる保存的置
換は、潜在的抗原決定基誘導リガンドとして、かなり効
果の小さいペプチドを生ずる。このポリペプチドリガン
ド、RGDS濃度を、上記の抗体の血小板結合検定法で
変化させた時、刺激化又は、非刺激化血小板上の潜在的
抗原決定基のリガンド誘導に対する投与−応答曲線が得
られた。潜在的抗原決定基を検出するためにPMI−1
又はPMI−2を用いた、投与−応答曲線の結果をLI
BS誘導率として表現した、図5に示す。ポリペプチド
存在下結果したIgG量は、完全なリガンド誘導結合部
位(LIBS)の誘導の際の、IgGの最高結合量の割
合として表現されており、そこでは、4.5mM EDT
A存在下及びペプチド非存在下での血小板当りのIgG
分子量として測定したIgG結合は、100%誘導とし
て考え、また、2mM CaCl2 及び1mM MgC
2 存在下、かつ、ペプチド非存在下でのIgG結合
は、0%誘導と考えた。
【0105】図5に示した結果は、ポリペプチドリガン
ドが同じハーフマキシマムリガンド濃度約2mMで2つ
の異なる潜在的抗原決定基を誘導することを示してい
る。さらに、この結果は、PMI−2により認識れる決
定基は、刺激化血小板では誘導されるが、非刺激血小板
では誘導されないが、一方、PMI−1により認識され
る潜在的抗原決定基は、RGDSを用いたとき、刺激化
血小板及び非刺激血小板の両方で誘導されることを示し
ている。PMI−1及びPMI−2モノクローナル抗体
の両方が抗LIBSモノクローナル抗体である一方、こ
れら2つの抗体の特異性は区別可能なものであることに
注意すべきである。従って、リガンドによるレセプター
の占有は1つ以上のLIBSを誘導しうる。結果とし
て、本発明の方法は、細胞表面レセプターリガンド複合
体と免疫反応する1種以上のモノクローナル抗体を生産
するのに使用することができる。
【0106】B.潜在的抗原決定基を発現する可溶性精
製GPIIb−III aへの抗体結合の検定 潜在的抗原決定基の発現を誘導する、種々のポリペプチ
ドの能力を、可溶性の単離GPIIb−III aを用いて研
究した。最後に、次に示すこと以外は、例7Bで述べた
様に、競合イライザ法を行った。マイクロプレートは、
ml当り10μg濃度の、例1で述べた様に単離したGP
IIb−III aを含むコート溶液を用いてコーティングし
た。ブロッキング後、全ての使用される溶液は、その使
用前、例13Aでタイローズバッファについて述べたよ
うに、キレックス100で処理した。(1) 例5で述べた
ように調製した1.5ナノモル濃度のPMI−1 Ig
G、又は、例7Aで述べた、Tabハイブリドーマ、
(2) 2mM CaCl2 、(3) 例1で述べたように単離
し、PMI−1検定に対しては、40μg/mlの濃度、
また、Tab検定に対しては4μg/mlの濃度となるよ
うに添加されるGPIIb−III a及び(4) 1mMのポリ
ペプチドを含む免疫反応混合物を調製した。この免疫反
応混合物を16〜20時間、22℃に維持して、固相結
合GPIIb−III a及び添加した抗体間の、第1の固相
結合免疫反応産物を形成させる。
【0107】上述の実験結果を以下の表7に示した。
【0108】
【表7】 表7 溶液中でのGPIIb−III aへのリガンド結合により誘導されるPMI−1依 存潜在的抗原決定基の発現 発現率1 リガンド2 PMI−1 Tab KYGRGDS 65±22(3) 98±25(3) GRGDSP 53±22(5) 85±27(3) RGDS 42±16(3) 92±11(3) GRGESP 18±13(3) 106±24(3) SDGR 18±13(3) 79±25(3) コントロール 20± 9(5) 84±13(4) 1.発現率は、ポリペプチドリガンド結合により、誘導
されるGPIIb−IIIa上に存在する潜在的決定基の尺
度となる。このデータは、5mM EDTAの存在下、
GPIIb−III aを用いて得られた最高の決定基発現の
割合として表わされている。各条件下で行った測定数を
カッコ中に示し、また、その結果は、それらの測定値の
平均値±標準偏差で示した。
【0109】2.添加したリガンドは、例5で述べたよ
うに合成し、その配列は、一文字コードで示したポリペ
プチドである。“コントロール”とは、ポリペプチドを
添加しなかったことを意味する。表7に示した結果は、
RGD含有ポリペプチドリガンドは本来の血小板を用い
て観察されたのと同じような方法で(例えば表6に参
照)、GPIIb−III aによる、潜在的抗原決定基の発
現を誘導することを示している。リガンド誘導の発現の
特異性は、逆配列(SDGR)又は、保存的置換(GR
GESP)を有するポリペプチドを用いることにより確
証され、またさらに、Tabモノクローナル抗体結合に
関して有意なリガンドの影響が観察されなかったことに
より確証された。これらの結果は、モノクローナル抗体
PMI−1により認識される潜在的抗原決定基のリガン
ド誘導の発現は、GPIIb−III aの本質的性質であり
また、GPIIb−III aの血小板の会合に依存しないこ
とを示している。例を要する特別な態様を含む、先に示
した明細は本発明を説明するためのもので、制限を意図
したものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱するこ
となしに、多くの変化及び修正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 GPIIbの前駆体タンパク質の一部をコード
するcDNAのヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸
残基配列。ヌクレオチド配列は、塩基1番から1104
番まで連続して表わされている様に、一文字ヌクレオチ
ド塩基コードを用いて左から右に、5′末端から3′未
満の方向で示されている。アミノ酸残基配列は、アミノ
末端の残基1番(R)から、カルボキシ末端の残基22
7番(S)まで連続して示されているように、一文字ア
ミノ酸残基コードを用い、左から右へ、アミノ末端から
カルボキシ末端の方向で表わされている。読み枠は、ヌ
クレオチド配列の下の誘導されるアミノ酸配列の位置で
示されており、各アミノ酸残基を示す一文字は対応する
コドンの第1塩基の下に位置している。p129−14
5と命名されるポリペプチド及びp114−156と命
名されるポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列の、
GPIIb前駆体タンパク質中の位置は、各々、大小のボ
ックスで示した。p19−34及びp53−65と命名
されたポリペプチドの位置は各々、二重又は一本の下線
で示されている。GPIIbの軽鎖に対し、提唱されてい
るアミノ末端のアミノ酸残基配列は、点線で示し、矢印
は、GPIIbの重鎖及び軽鎖を作る潜在的切断部位を示
している。
【図2】 血小板に結合する抗体PMI−1に関するポ
リペプチドp129−145の影響を示すグラフ。血小
板に、5mM濃度となるようEDTAを混ぜ、hGPIIb
上のPMI−1エピトープを十分に露出させる。その
後、この血小板を0〜100マイクロモル濃度(μM)
の範囲の種々の濃度のポリペプチドp129−149及
125Iラベル化PMI−1抗体と、例9で説明するよ
うに混合した。血小板に結合した 125Iラベル化PMI
−1の割合を、検定物に加えたポリペプチド濃度に対し
てプロットした。
【図3】 例10で説明されるように測定された刺激を
受けたファブリノーゲン結合血小板上のPMI−1エピ
トープの露出を示す図。(1) 刺激なし、(2) 5μM A
DPによる刺激又は(3) 50μMエペネフリンによる刺
激、条件下、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応す
125Iラベル化PMI−1量を測定し、5μM ED
TA存在下、非刺激血小板と免疫学的に結合する 125
−PMI−1量に対する割合として発現した。
【図4】 例11で説明されるような、血小板凝集に関
する、ポリペプチドp129−145及びp144−1
56の影響を示したレコーダの写し。時間(分)に対す
る透過率をリニアー・プロットで示してあり、100パ
ーセント透過は最高の血小板凝集を示している。パネル
Aは、タイロード(Tyrode′s)バッファ中の富血小板血
漿(PRP)のコントロール溶液(破線)及びさらに、
1mMポリペプチドp129−145を含むPRP(実
線)の透過率を描いてある。パネルBは、コントロール
溶液(破線)及びさらに1mMポリペプチドp144−1
56を含むPRP(実線)の透過率を描いてある。
【図5】 血小板GPIIb− IIIaによる、2個の別々
のリガンド誘導結合部位の発現を示す図。各LIBS
は、アミノ酸残基配列RGDSを有するポリペプチド型
のリガンドとの特異的結合による誘導により、GPIIb
− IIIaリガンド(GPIIb−ポリペプチド)複合体を
形成する。種々のポリペプチド濃度によるLIBS発現
率は例13Aで説明されているように測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/15 G01N 33/53 K 33/50 33/577 B C12P 21/08 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/577 5/00 B // C12P 21/08 15/00 C (72)発明者 プラウ エドワード エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ ラウス ストリ ート 4359 (72)発明者 ギンズバーグ マーク エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レノート プレ イス 2944

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 潜在的抗原決定基を構成する以下のアミ
    ノ酸残基配列を有するhGPIIbタンパク質の一部を
    コードする構造遺伝子を規定する配列を含む、多くとも
    12,000個のヌクレオチド塩基対を含むことを特徴
    とするDNA断片。 【化1】
  2. 【請求項2】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
    塩基配列を有する、請求項1記載のDNA断片。 【化2】
  3. 【請求項3】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
    塩基配列を有する、請求項1記載のDNA断片。 【化3】
  4. 【請求項4】 潜在的抗原決定基を構成する以下のアミ
    ノ酸残基配列を有するhGPIIbの一部をコードする
    構造遺伝子を規定するDNA断片と機能的に結合したベ
    クターを含むことを特徴とする組換えDNA分子。 【化4】
  5. 【請求項5】 上記構造遺伝子が、以下のアミノ酸残基
    配列を有するタンパク質をコードする、請求項4記載の
    組換えDNA分子。 【化5】
  6. 【請求項6】 上記構造遺伝子が、以下のヌクレオチド
    塩基配列を有する、請求項5記載の組換えDNA分子。 【化6】
  7. 【請求項7】 上記ベクターが宿主細胞中で上記構造遺
    伝子を発現することができる、請求項5記載の組換えD
    NA分子。
  8. 【請求項8】 多くとも50個のアミノ酸残基を含み、
    かつ、式: −PSPSPIHPAHHKRDRRQ− で表される配列に対応するアミノ酸残基配列を含むこと
    を特徴とする、hGPIIb潜在的抗原決定基ポリペプ
    チドアナログ。
  9. 【請求項9】 式: PSPSPIHPAHHKRDRRQ で表されるアミノ酸残基配列を有する、請求項8記載の
    ポリペプチドアナログ。
  10. 【請求項10】 基本的に、a)式: PSPSPIHPAHHKRDRRQ で表される潜在的抗原決定基ポリペプチドと免疫反応
    し、そして、 b)式: REQNSLDSWGPKV で表されるポリペプチドと、実質的に免疫反応しない抗
    体分子を含むことを特徴とする抗体組成物。
  11. 【請求項11】 刺激されたフィブリノーゲン結合血小
    板と免疫反応する抗体分子を生成することを特徴とする
    PMI−1(ATCC HB 9476)と命名される
    ハイブリドーマ。
  12. 【請求項12】 刺激された、フィブリノーゲン結合血
    小板と免疫反応する、ハイブリドーマPMI−1(AT
    CC HB 9476)により生成される抗体分子を含
    むことを特徴とするモノクローナル抗体組成物。
  13. 【請求項13】 a)少なくとも1回の検定を行うのに
    十分な量の、ハイブリドーマPMI−1(ATCC H
    B 9476)により生成された抗GPIIb−III
    a抗体分子を含むパッケージ、を含み、血液サンプル中
    のGPIIb−IIIa−リガンド複合体を発現する血
    小板の存在を検定するための、診断キット。
  14. 【請求項14】 上記抗体分子が放射性核種でラベル化
    され、かつモノクローナル抗体組成物として存在する、
    請求項13記載の診断キット。
  15. 【請求項15】 a)少なくとも1回の検定を行うのに
    十分な量の、ハイブリドーマPMI−1(ATCC H
    B 9476)により生成された、インビボ指示手段と
    結合した抗GPIIb−IIIa抗体分子を含むモノク
    ローナル抗体組成物を含むパッケージ、を含む、インビ
    ボで血栓の存在を検定するための診断キット。
  16. 【請求項16】 血小板含有血液サンプルを、GPII
    b−IIIa−リガンド複合体を発現する血小板の存在
    について検定する方法であって、 a)ハイブリドーマPMI−1(ATCC HB 94
    76)により生成された抗GPIIb−IIIa抗体分
    子を含む、効果量のモノクローナル抗体組成物を、血液
    サンプルと混合することにより、免疫反応混合物を作
    る、 b)該抗体が、サンプル中に存在するフィブリノーゲン
    結合血小板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物を生成す
    るのに十分な時間、この混合物を維持する、 c)ステップb)で生成した免疫反応産物の存在を検定
    する、以上のa)〜c)のステップを含むことを特徴と
    する方法。
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