NO300505B1

NO300505B1 - hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog og antistoffer som inhiberer blodplateadhesjon, samt hybridomer som produserer antistoffene, diagnostisk system i settform og anvendelser av antistoffene

Info

Publication number: NO300505B1
Application number: NO890981A
Authority: NO
Inventors: Edward F Plow; Mark H Ginsberg
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1987-07-08
Filing date: 1989-03-07
Publication date: 1997-06-09
Also published as: EP0326595B1; JP3420747B2; FI891078A; DK110189A; DK175655B1; EP0326595A4; DK110189D0; JPH10276778A; JPH02500085A; JP3541122B2; DE3854496D1; JP2001190287A; DE3854496T2; NO890981D0; US5470738A; WO1989000200A1; NO890981L; US5114842A; US5284751A; FI891078A0

Description

Teknisk område

Denne oppfinnelse vedrører en hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog og antistoffer som reagerer immunologisk med polypeptidanalogene. Oppfinnelsen vedrører også hybridomer som produserer antistoffene, diagnostisk system i settform for in vitro-analysering med hensyn på tilstedeværelsen av et GPII-b-IIIa-ligandkompleks i en blodvæskeprøve, samt anvendelser av antistoffene.

Bakgrunn

Celleadhesjon omfatter vanligvis gjenkjennelse av spesifikke adhesive proteiner av celleoverflatereseptorer. En familie av celleoverflatereseptorer med spesiell inter-esse for denne oppfinnelse er "integrinene".

Ifølge Hynes, Cell, 48:549-554 (1987) er integriner en funksjonelt og strukturelt beslektet gruppe av reseptorer som reagerer med en rekke ligander inkludert ekstracellulær matriks glycoproteiner, komplement og andre celler. Integriner deltar i celle-til-matriks og celle-til-celle-adhesjon i mange fysiologisk viktige prosesser, deriblant embryologisk utvikling, hemostase, trombose, sårtilheling, immunologiske og ikke-immunologiske forsvars-mekanismer og oncogen transformasjon. To humangenetiske sykdommer, Glazmanns trombasteni og leukocytt adhesjons-defekt, affiserer medlemmer av integrin-familien.

Strukturelt er integriner heterodimere komplekser bestående av alfa- og beta-subenheter som er ikke-kovalent bundet til hverandre. Innen integrinfamilien er det kjente grupper som er beslektet ved nærværet av en lik beta-enhet, og medlemmene innen hver gruppe er karakterisert ved unike alfa-subenheter.

F.eks. er GPIIb-IIIa et ikke-kovalent, calcium-avhengig, heterodimert kompleks som omfatter alfa- og beta-subenheter. Jennings et al., J. Biol. Chem., 257:10458-10466 (1982). Alfa-subenheten, GPIIb, består av en tung kjede (hGPIIb) som har en relativ molekylvekt på omkring 120 kilodalton (kda), og en lett kjede (lGPIIb) på omkring 20 kda som er bundet sammen ved disulfidbroer. Beta-subenheten, GPIIIa, er et enkeltkjedet polypeptid på omkring 100 kda. Phillips et al., J. Biol. Chem., 252:2121-2126 (1977). Celleoverflatemolekyler som er immunologisk beslektet med GPIIb-IIIa, er blitt identifisert på en rekke celletyper. Se Thi'agarajan et al., J. Clin. Invest., 75:896-901 (1985); Plow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6002-6006 (1986); og Fitzgerald et al., J. Biol. Chem., 260:10893-10896 (1985).

GPIIb-IIIa bidrar til platefunksjonen gjennom interaksjoner med RGD-holdige proteiner slik som fibrinogen (Bennett et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:2417-2421

(1983) ), fibronectin (Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 71:619-624 (1983)), og von Willebrand faktor (Ruggeri et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79:6038-6041 (1982)), og er derfor en komponent i den vanlige plateadhesive proteinreseptor (Pytela et al., Science, 231:1559-1562

(1986) og Plow et al., J. Biol. Chem., 259:5388-5391

(1984) ) .

Nye resultater indikerer at GPIIb-IIIA er en av flere adhesjonsreseptorer som har felles beta-subenhet og samme funksjonelle egenskap med hensyn til å gjenkjenne aminosyrerestsekvensen i tripeptidet Arg-Gly-Asp (eller representert ved enkeltbokstavsymboler, RGD). Pytela et al., Science, 231:1559-1562 (1986) og Ruoslahti et al., Cell, 44:517-518 (1986). I tillegg til GPIIb-IIIa inkluderer denne gruppen av beslektede reseptorer vitronectinreseptoren (VnR) og fibronectinreseptoren (FnR) som er isolert fra osteosarcomceller (Pytela et al., Cell, 40:191-198 (1985), Pytela et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:5766-5770 (1985) og Sanchez-Madrid et al., J. Exp. Med., 158:1785-1803 (1983)).

De like funksjonelle, strukturelle og antigene egenskaper som disse proteiner har, antyder at GPIIb-IIIa og VnR er medlemmer av en adhesjonsreseptorgruppe som er blitt kalt "cytoadhesin". Plow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6002-6006 (1986). Innen cytoadhesingruppen vil forskjellige alfa-subenheter binde seg til en felles eller meget lik beta-subenhet, og dette resulterer i funksjonelt forskjellige reseptorer. Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987).

Minst 2 andre grupper av heterodimere adhesjonsreseptorer er blitt identifisert der en felles beta-subenhet binder seg til flere forskjellige alfa-subenheter. En gruppe finnes på leukocytter og er blitt referert til som leukocytt-adhesjonsfamilien og inkluderer LFA-1, Mac-1, P150,95. Sanchez-Madrid et al., J. Exp. Med., 158:1785-1803

(1983) og Springer et al., Ciba. Found. Symp., 118:102-126

(1986). Den andre gruppen finnes mer utbredt og er blitt referert til som VLA-familien, Hemler et al., J. Biol. Chem., 262:3300-3309 (1987). Beta-subenheten i VLA-familien (Hemler et al., J. Biol. Chem., 262:3300-3309 (1987)) i kylling er blitt klonet og sekvensert og betegnes "Integrin"

(Tamkun et al., Cell, 46:271-282 (1986)). Sekvensen til kyllingintegrin er lik den man finner i GPIIIa (Fitzgerald et al., J. Biol. Chem., 262:3936-3939 (1987)) og beta-subenheten i leukocyttadhesjonsfamilien (Kishimoto et al., Cell, 48:681-690 (1987)). Dessuten viser en partiell sekvenser- ing av flere alfa-subenheter også homologier. Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987); Suzuki et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:8614-8618

(1986); og Charo et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:8351-8356 (1986).

De steder på GPIIb-IIIa, eller på de andre cytoadhesiner, som er avgjørende for deres funksjon som adhesjonsreseptorer, er i dag ukjente. Flere observasjoner antyder at et funksjonelt signifikant viktig sete på GPIIb-IIIa er nær den epitop som gjenkjennes av det monoklonale antistoff PMI-1. Dette antistoff binder til den tunge kjede av GPIIb (Shadle et al., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984)) og definerer en region på GPIIb som er assosiert med flere forskjellige funksjonelle aktiviteter. For det første så hemmer PMI-1 adhesjon mellom vaskede plater og collagen. Shadle et al., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984). For det andre reguleres overflate-orienteringen til denne regionen av divalente kationer fordi millimolar (mM)-konsentrasjoner av calcium eller magnesium hemmer manifesteringen av PMI-l-epitopen. Ginsberg et al.,

J. Clin. Invest., 78:1103-1111 (1986). For det tredje er en abnorm regulering av konformasjonen til dette sete av divalente kationer forbundet med en funksjonell trombastenisk tilstand. Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 78:1103-1111 (1986). For det fjerde vil ikke stimulering av plater med opptil 100 mikromolar adenosindifosfat (ADP)

eller adrenalin, 1 enhet pr. milliliter trombin, eller 50 mikrogram pr. milliliter kalvehudcollagen, vesentlig øke bindingen av PMI-l-antistoffer til plater over bakgrunnen.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Det er nå blitt funnet at celleoverflatereseptorer som spesifikt har bundet en ligand, kan skjelnes fra ikke-okkuperte reseptorer ved tilstedeværelsen av et ligandindusert antistoffbindingssete (LIBS). Det betyr at en klasse antigene determinanter som uttrykkes når en celleoverflatereseptor spesifikt binder en ligand, men som ikke uttrykkes verken av den ikke-okkuperte reseptor eller den ikke-bundne ligand, er blitt oppdaget.

Derfor kan det dannes et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et ligandindusert, bindende sete som ble uttrykt av et reseptor-ligandkompleks der komplekset inneholder en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og fremgangsmåten omfatter: (a) immunisering av et pattedyr med komplekset; (b) fjernelse av antistoffproduserende celler fra det immuniserte dyret og opparbeidelse av en cellesus-pensjon; (c) behandling av cellene med et transformerende middel for å produsere transformerte antistoffproduserende celler; (d) kloning ved avgrensende fortynning i et vevskulturmedium som ikke vil gi næring til ikke-

transformerte celler, av cellene behandlet i trinn (c), hvorved det fås klonede transformanter; (e) vurdering av vevskulturmediet til de klonede transformanter for nærvær av utskilte antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset, men som ikke immunreagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når hvert av dem er i en ikke-bundet form; (f) utvelgelse og dyrkning av en klonet transformant som produserer de utskilte antistoffmolekylene, i et vevskulturmedium; og (g) høsting av de utskilte antistoffmolekylene fra kulturmediet til den utvalgte og klonede transformant.

I en annen utførelsesform vedrører denne oppfinnelsen en fremgangsmåte for å danne et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et ligandindusert bindingssete som dannes ved et reseptor-ligandkompleks hvori komplekset inneholder en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og fremgangsmåten omfatter: (a) immunisering av en mus med komplekset; (b) fjernelse av milten fra musen og opparbeidelse av en suspensjon av miltcellene; (c) fusjon av miltcellene med musemyelomceller i nærvær av en fusjonspromotor for å produsere antistoff-utskillende hybridomer; (d) fortynning og oppdyrkning av de fusjonerte celler i separate brønner i et medium som ikke vil underholde vekst av ikke-fusjonerte myelomceller; (e) evaluering av supernatanten i hver brønn som inneholder et hybridom for nærvær av utskilte antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset, men som ikke immunreagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når disse befinner seg i en ikke-bundet form; (f) utvelgelse og kloning av en hybridomcelle som utskiller antistoffmolekylene; og (g) høsting av antistoffmolekylene fra supernatanten over klonene.

Videre er det beskrevet en fremgangsmåte for å lage et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et ligandindusert bindingssete som uttrykkes av et reseptor-ligandkompleks hvor komplekset inneholder en overflate-reseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og der fremgangsmåten omfatter: (a) immunisering av en mus med komplekset; (b) fjernelse av milten fra musen og tillagning av en suspensjon av miltcellene; (c) fusjon av miltcellene med musemyelomceller i nærvær av en fusjonspromotor for å produsere antistoff-utskillende hybridomer; (d) fortynning og oppdyrkning av de fusjonerte celler i separate brønner i et medium som ikke vil underholde vekst av de ikke-fusjonerte myelomceller; (e) undersøkelse av supernatanten i hver brønn som inneholder et hybridom, for nærværet av utskilte antistoffmolekyler som immunreagerer med celleoverflatereseptor-ligandkomplekset, men som ikke immunreagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når disse er i ikke-bundet form; (f) seleksjon og kloning av et hybridom som skiller ut antistoffmolekylene; (g) overføring av klonene intraperitonealt i en mus; og (h) høsting av ascites eller serum fra musen der ascites eller serum inneholder det ønskede antistoff.

Også beskrevet er en fremgangsmåte for å påvise in vivo nærvær av et reseptor-ligandkompleks der komplekset inneholder en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og som består av følgende trinn: a) intravenøs injeksjon i et menneske av en effektiv mengde med et monoklonalt antistoffpreparat som omfatter et fysiologisk fortynningsmiddel som tåles, og antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset, men som ikke reagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når disse er i ikke-bundet form, idet antistoffmolekylene er bundet til et in vivo indikasjonsmiddel:

b) å holde personen i en forutbestemt tid

som er tilstrekkelig til at antistoffmolekylene immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset in vivo og danner et immunreaksjonsprodukt; og

c) måle nærvær av immunreaksjonsproduktet som dannes i trinn b og derved tilstedeværelsen av komplekset i

personen.

Videre er det omtalt en fremgangsmåte for å måle nærværet av et reseptor-ligandkompleks i en blodprøve hvor komplekset omfatter en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og der fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) dannelse av en immunreaksjonsblanding ved å blande blodprøven med et monoklonalt antistoffpreparat som inneholder antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset, men som ikke immunreagerer med celleoverf-latereseptoren eller liganden når disse foreligger i en ikke-bundet form; b) oppbevaring av blandingen i en tidsperiode som er tilstrekkelig for at antistoffmolekylene kan reagere med ethvert reseptor-ligandkompleks som er til stede i prøven og danne et immunreaksjonsprodukt; og c) å måle nærværet av ethvert immunreaksjonsprodukt som dannes i trinn b og derved tilstedeværelsen av komplekset i prøven.

I en annen utførelsesform beskriver denne oppfinnelse en fremgangsmåte for å måle en blodprøve som inneholder plater, for tilstedeværelse av plater som uttrykker et GPIIb-IIIa-ligandkompleks, og der fremgangsmåten omfatter: a) dannelse av en immunreaksjonsblanding ved å blande blodprøven med en effektiv mengde med et monoklonalt

antistoffpreparat som inneholder anti-GPIIb-IIIa-antistoffmolekyler produsert av hybridom PMI-1 eller PMI-2;

b) opprettholdelse av immunreaksjonsblandingen i en periode som er tilstrekkelig for antistoffene til å

immunreagere med fibrinogenbundne plater som er til stede i prøven og danne et immunreaksjonsprodukt; og

c) påvisning av nærværet av ethvert immunreaksjons-

produkt dannet i trinn b.

Et diagnostisk system som foreligger i settform for å analysere med hensyn på nærværet av et reseptor-ligandkompleks i en blodprøve, idet komplekset inneholder en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og der systemet omfatter: a) en pakke som inneholder, i en mengde som er tilstrekkelig for å utføre minst-én analyse, et monoklonalt antistoffpreparat som inneholder antistoffmolekyler som immunreagerer med omtalte reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når disse er i ikke-bundet form.

Et diagnostisk system i settform for analysering med hensyn på tilstedeværelsen av cellereseptor-ligandkomplekset in vivo, idet komplekset inneholder en celleoverflatereseptor og en ligand som er spesifikt bundet, og der systemet omfatter: a) en pakke som inneholder, i en mengde som er tilstrekkelig for å utføre minst én analyse, og som består av et monoklonalt antistoffpreparat som inneholder antistoffmolekyler som immunreagerer med dette reseptor-ligandkomplekset, men som ikke immunreagerer med celleoverflatereseptoren eller liganden når disse er i en ikke-bundet form, idet antistoffmolekylene er bundet til et in vivo indikasj onsmiddel.

Et diagnostisk system i settform for analysering av en blodprøve med hensyn på tilstedeværelsen av plater som uttrykker et GPIIb-IIIa-ligandkompleks, og der systemet omfatter: a) en pakke som inneholder anti-GPIIb-IIIa, i en tilstrekkelig mengde til å kunne utføre minst én analyse, der anti-GPIIb-IIIa-antistoffmolekylene er produsert av hybridom PMI-1 eller PMI-2.

Et diagnostisk system i settform for analysering med hensyn på tilstedeværelsen av en trombe in vivo, og som omfatter:

a) en pakke som inneholder, i en mengde som

er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, et

monoklonalt antistoffpreparat som inneholder anti-GPIIb-

Illa-antistoffmolekyler produsert av hybridom PMI-1 eller PMI-2, idet antistoffmolekylene er bundet til et in vivo indikasjonsmiddel.

Det er videre blitt oppdaget at plate-GPIIb-IIIa-ligandkomplekser uttrykker to kryptiske, antigene determinanttyper LIBS som gjenkjennes av antistoffmolekyler som produseres av hybridomer PMI-1 og PMI-2. I tillegg er det utledet fra DNA-sekvensen et polypeptid som er i stand til å etterligne den kryptiske determinant som gjenkjennes av det monoklonale antistoff PMI-1. Denne DNA-sekvens koder for den del av GPIIb-proteinet som danner den kryptiske determinant in vivo.

Således vedrører denne oppfinnelse et

DNA-segment som omfatter ikke mer enn omkring 12.000 nucleotidbasepar som omfatter en sekvens som definerer et strukturelt gen som koder for en del av GPIIb-proteinet der aminosyrerestsekvensen er vist i figur 1 fra omtrent aminosyrerest 50 til omtrent aminosyrerest 140.

I en annen utførelsesform beskrives også et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en vektor som er operativt bundet til et DNA-segment som definerer et strukturelt gen med kodende sekvens for en del av GPIIb-proteinet som har en aminosyrerestsekvens som vist i figur 1 fra omtrent rest 50 til omtrent rest 145.

Videre beskrives en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog som omfatter ikke mer enn omkring 50 aminosyrerester og som inkluderer en aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

-PSPSPIHPAHHKRDRRO-.

Videre beskrives hybridomer som kalles PMI-1 og PMI-2, som produserer antistoffmolekyler og som immunreagerer med fibrinogenbundne plater.

Et monoklonalt antistoffpreparat som omfatter antistoffmolekyler produsert av hybridom PMI-1 som immunreagerer med fibrinogenbundne plater, er også beskrevet.

Kort beskrivelse av illustrasjonene

Figur 1 illustrerer nucleotidsekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens til et cDNA som koder for en del av forstadiumproteinet til GPIIb der nucleotidsekvensen er vist fra venstre til høyre og i retning fra 5'-ende til 3'-ende, og der enkeltbokstaver beskriver nucleotidbase-koden i en sammenhengende lineær basesekvens fra base 1 til base 1104. Aminosyresekvensen er vist fra venstre til høyre og i retning fra aminoende til carboxyende hvor enkeltbokstaver betegner aminosyrekoden, og der denne er vist i en kontinuerlig, lineær serie som starter fra rest 1 (R) ved aminoenden til rest 227 (S) ved carboxyenden.

Leserammen er indikert ved at den deduserte aminosyrerestsekvens er plassert under nucleotidsekvensen slik at enkeltbokstavene som representerer hver aminosyre, er lokalisert under den første base i det tilsvarende kodon.

Lokaliseringene innen GPIIb-forløperproteinet av aminosyrerestsekvensen som korresponderer til polypeptidet betegnet pl29-145 og polypeptidet betegnet pll4-156, er vist i hhv. store og små bokser. Lokaliseringene til polypeptidene betegnet pl9-34 og p53-65, er vist ved dobbelt eller enkel understrekning. Aminosyrerestsekvensen til en foreslått aminoende for den lette kjede av GPIIb er vist ved den stiplede linjen, og pilen markerer det potensielle sete for kløyving slik at de tunge og lette kjeder av GPIIb dannes. Figur 2 er et diagram som illustrerer effekten av polypeptid pl29-145 på antistoff PMI-l-binding til plater. Platene ble blandet med EDTA til en konsentrasjon på 5 mM for å tillate full utvikling av PMI-l-epitopen på hGPIIb. Deretter ble platene blandet med forskjellige konsentrasjoner av polypeptid pl29-149 i området 0 til 100 mikromolar (/um) og med ■<L>"I-merket PMI-l-antistof f som beskrevet i eksempel 9. Prosent av -'-^I-merket <p>mi-1 bundet til platene, ble plottet mot konsentrasjonen av polypeptid som ble tilsatt analysen. Figur 3 illustrerer utviklingen av PMI-l-epitopen på stimulerte, fibrinogenbundne plater målt som beskrevet i eksempel 10. Mengden -'-^I-merket PMI-1 som immunreagerer med fibrinogenbundne plater under betingelsene (1) ingen stimulering, (2) stimulering med 50 /uM ADP, eller (3) stimulering med 50 /uM adrenalin, ble bestemt og uttrykt som prosent i relasjon til den mengde av <1>^<5>I-PMI-1 som er immunologisk bundet til ikke-stimulerte plater i nærvær av 5 mM EDTA. Figur 4 er en registrering som illustrerer effekten av polypeptidene pl25-145 og pl44-156 på plateaggregering som beskrevet i eksempel 11. En lineær plot vises med hensyn til prosent transmittert lys mot tid i minutter, der 100% transmisjon indikerer maksimal plateaggregering. Panel A viser prosent transmittert lys i en kontrolløsning av platerikt plasma (PRP) i Tyrodes buffer (stiplet linje) og ved PRP som videre inneholder 1 mM polypeptid pl29-145 (helopptrukken linje). Panel B viser prosent transmittert lys i kontrolløsningen (stiplet linje) og ved PRP som inneholder 1 mM polypeptid pl44-156 (helopptrukken linje). Figur 5 er et diagram som illustrerer ekspresjonen av to distinkte ligandinduserte bindingsseter ved plate GPIIb-IIIa. Hver LIBS ble indusert ved den spesifikke binding av en ligand i form av et polypeptid som har aminosyrerestsekvensen RGDS slik at det dannes et GPIIb-IIIa-ligand (GPIIb-polypeptid)-kompleks. Prosent LIBS-ekspresjon ved forskjellige polypeptidkonsentrasjoner ble bestemt som beskrevet i eksempel 13A.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Aminosyre: Alle aminosyrerestene som identifiseres her, er i den naturlige L-konfigurasjon. I tråd med standard polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem.,

243:3557-59, (1969), vil forkortelser for aminosyrerester bli brukt som vist i den følgende synonymtabell:

Det bør bemerkes at alle aminosyrerestsekvenser her er angitt ved formler hvis venstre- til høyre-orientering er den konvensjonelle retning fra aminoende til carboxyende. Videre bør det merkes at en strek ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens indikerer en binding til en videre sekvens til én eller flere aminosyrerester opptil en total på omtrent femti rester i polypeptidkjeden. Polypeptid og peptid: Polypeptid og peptid er uttrykk som brukes om hverandre for å betegne en lineær serie av ikke fler enn omkring 50 aminosyrerester bundet til hverandre ved peptidbindinger mellom alfa-amino- og carboxygruppene på tilstøtende rester.

Protein: Protein er en betegnelse brukt her for å beskrive en lineær serie med flere enn 50 aminosyrerester som er bundet til hverandre som' i et polypeptid.

Nucleosid_ og nucleotid: En monomer enhet av DNA eller RNA som består av en sukkerdel (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig, heterocyklisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via glycosidcarbon (l'-carbon i pentosen) og at kombinasjon av base og sukker er et nucleosid. Når nucleosidet inneholder en fosfatgruppe bundet i 3'- eller 5<1->posisjonen i pentosen, er det referert til som et nucleotid.

Basepar (bp): En hydrogenbinding mellom adenin

(A) og thymin (T) eller mellom cytosin (C) og guanin (G) i et dobbelttrådet DNA-molekyl.

Reseptor: Reseptor og reseptorprotein er betegnelser brukt her for å indikere et biologisk aktivt proteinlignende molekyl som spesifikt binder til (eller med) andre molekyler.

Ligand og kognatligand: Ligand refererer seg til et molekyl som inneholder en strukturell del som er bundet via spesifikk interaksjon med et bestemt reseptorprotein.

Ligandindusert bindingssete ( LIBS): En LIBS er en neoantigen determinant som uttrykkes av et celleoverflatereseptor-ligandkompleks, men er ikke uttrykt av enten den ikke-opptatte reseptor eller den ikke-bundne ligand. En LIBS kan være enten "konformasjonell" eller "sekvensiell". En LIBS kan være resultatet av spesifikke forandringer i reseptoren som induseres ved ligandbinding, f.eks. "kryptisk antigen determinant", eller den kan bli dannet av en kombinasjon av reseptor og ligand-aminosyrerester ved et reseptor-ligandkontaktpunkt.

Kryptisk antigen determinant: Dette refererer seg til en neoantigen determinant som er dannet ved endringer i konformasjon eller membran-overflateorientering til et reseptorprotein når det binder til sin kognate (spesifikke) ligand. Reseptorproteinene beskrevet her, uttrykker normalt ikke en kryptisk antigen determinant med mindre reseptoren har en ligand spesifikt bundet.

B. DMA- segmenter

I levende organismer er aminosyrerestsekvensen til et protein eller polypeptid direkte beslektet via den genetiske koden til deoxyribonucleinsyre (DNA)-sekvensen til det strukturelle gen som koder for proteinet. Således kan et strukturelt gen bli definert med hensyn på dets aminosyrerestsekvens, f.eks. protein eller polypeptid, som det koder for.

En viktig og velkjent egenskap til den genetiske koden er dens mangetydighet. Det betyr at for de fleste av aminosyrene som benyttes til å bygge opp proteiner, kan flere enn én kodende nucleotidtriplett (kodon) kode for eller beskrive en bestemt aminosyrerest. Derfor kan en rekke forskjellige nucleotidsekvenser kode for en bestemt aminosyrerestsekvens. Slike nucleotidsekvenser blir betraktet å være funksjonelt like siden de kan resultere i produksjon av den samme aminosyrerestsekvensen i alle organismer. Av og til kan en methylert variant av et purin eller en pyrimidinbase bli inkorporert i en gitt nucleotidsekvens. Imidlertid vil slike methyleringer ikke affisere den kodende relasjon på noen måte.

Et DNA-segment ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer et strukturelt gen som koder for et protein som inneholder en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens, f.eks. et GPIIb-beslektet protein. En GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens er en sekvens med minst 10 rester hvis sekvens er homolog, og helst identisk med, en del av aminosyrerestsekvensen vist i figur 1 fra omtrent rest 50 til omtrent rest 227.

Et DNA-segment ifølge oppfinnelse inkluderer en

DNA-sekvens som koder for en aminosyrerestsekvens som vist i figur 1 fra omkring rest 50 til omkring rest 145. I en annen del beskrives et DNA-segment som inkluderer en DNA-sekvens som koder for en aminosyrerestsekvens som vist i figur 1 fra omkring rest 50 til omkring rest 227. Også beskrevet er et DNA-segment som inkluderer en DNA-sekvens som koder for en aminosyrerestsekvens som vist i figur 1 fra omkring rest 146 til omkring rest 227. Fortrinnsvis vil et DNA-segment fra denne oppfinnelse kode for en aminosyrerestsekvens som vist i figur 1 fra omkring rest 1 til omkring rest 227. Fortrinnsvis er DNA-sekvensen til stede som en uavbrutt, lineær serie av kodoner hvor hvert kodon koder for en aminosyrerest som finnes i de ovenfor beskrevne aminosyrerestsekvenser, f.eks. en DNA-sekvens som ikke inneholder noen introner.

Således omfatter et DNA-segment som består hovedsakelig av nucleotidsekvensen vist i figur 1 fra omkring base 148 til omkring base 435, en del av den foreliggende oppfinnelse. Et DNA-segment som består hovedsakelig av nucleotidsekvensen vist i figur 1 fra omkring base 148 til omkring base 681, omfatter en annen del av oppfinnelsen. Fortrinnsvis består et DNA-segment ifølge foreliggende oppfinnelse hovedsakelig av nucleotidsekvensen som er vist i figur 1 fra omtrent base 1 til omtrent base 1104.

Et DNA-segment ifølge foreliggende oppfinnelse som koder for en GPIIb-relatert aminosyrerestsekvens, kan lett bli syntetisert ved kjemiske teknikker, f.eks. fosfo-triestermetoden til Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 103:3185 (1981). Selvfølgelig kan ved en kjemisk syntese av den kodende sekvens enhver ønsket modifikasjon gjøres ved ganske enkelt å substituere de rette baser for dem som koder for den native aminosyrerestsekvens. Imidlertid blir DNA-molekylene som inkluderer sekvenser som er nøyaktig homologe med dem som er vist i figur 1, foretrukket.

Videre kan DNA-segmenter som består hovedsakelig av strukturelle gener som koder for GPIIb-beslektede proteiner, oppnås fra rekombinante DNA-molekyler som inneholder disse gener. F.eks. plasmidtype rekombinant DNA-molekyl HEL-41 inneholder DNA-sekvensen som er vist i figur 1 og koder således for aminosyrerestsekvensen som er vist i figur 1 fra rest 1 til rest 227. En kultur av Escherichia coli (E. coli) transformert med HEL-41, er blitt deponert ifølge Budapest-konvensjonens krav ved American Type Culture Collection, (ATCC)", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, 7. juli 1987, og ble gitt nummer 67456.

Et DNA-segment som inkluderer en DNA-sekvens som koder for en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens, kan bli fremstilt ved en operativ binding (ligering) av de riktige restriksjonsfragmenter fra de ovenfor deponerte plasmider ved bruk av velkjente metoder. DNA-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse og produsert på denne måte, har typisk kohesive ender, dvs. "overhengende" enkelttrådede deler som går ut over den dobbelttrådede del av molekylet. Nærværet av kohesive ender på DNA-molekylene i foreliggende oppfinnelse blir foretrukket.

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er ribonucleinsyre (RNA)-ekvivalenter til de ovenfor beskrevne DNA-segmenter.

C. Rekombinante DNA- molekyler

Et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli produsert ved en operativ sammenbinding av en vektor til et DNA-segment ifølge denne oppfinnelse.

Som brukt'her, refererer betegnelsen "vektor" til et DNA-molekyl som er i stand til autonom replikasjon i en celle og til hvilket et annet DNA-segment kan bli operativt bundet slik at det befordrer replikasjon av det påhengte segment. Vektorer som er i stand til å dirigere ekspresjon av genene som koder for proteinene som har GPIIb-beslektede aminosyrerestsekvenser, er referert til her som "ekspresjonsvektorer". Således er et rekombinant DNA-molekyl (rDNA) et hybrid-DNA-molekyl som omfatter i det minste to nucleotidsekvenser som normalt ikke er funnet sammen i naturen.

Valget av vektor til hvilket et DNA-segment

ifølge foreliggende oppfinnelse er operativt bundet, avhenger direkte, som det er velkjent innen teknikken,

av de funksjonelle egenskaper som ønskes, f.eks. protein-ekspresjon, og den vertscelle som skal transformeres, hvilke begrensninger er iboende i den teknikk som går ut på å konstruere rekombinante DNA-molekyler. Imidlertid er en vektor som omfattes av foreliggende, oppfinnelse, i det minste i stand til å dirigere replikasjon, og fortrinnsvis også ekspresjon, av genet som koder for et protein som har en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens inkludert i DNA-segmentene til hvilke den er operativt bundet.

I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse vil en beskrevet vektor inkludere et prokaryot replikon, dvs. en DNA-sekvens som har den egenskap at den kan dirigere autonom replikasjon og opprettholdelse av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosomalt i en prokaryot vertscelle, slik som en bakterievertscelle, som er transformert med denne. Slike replikoner er velkjente innen teknikken. I tillegg inkluderer de utførelsesformer som inkluderer et prokaryot replikon, også et gen hvis ekspresjon bringer med seg medikamentresistens til en bakteriell vert transformert med denne. Typiske bakteriemedikament-resistensgener er de som overfører resistens til ampicillin eller tetracyclin.

De vektorene som inkluderer et prokaryot replikon, kan også inkludere en prokaryot promotor som er i stand til å dirigere ekspresjonen (transkripsjon og translasjon) av genet som koder for en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens i en bakteriell vertscelle, slik som E. coli, transformert med de ovenfor nevnte. En promotor er et ekspresjons-kontrollelement som dannes av en DNA-sekvens som tillater binding av RNA-polymerase og starter transkripsjon. Promotorsekvensene som passer med bakterielle vertsceller, er typisk til stede i plasmidvektorer som inneholder passende restriksjonsseter for å sette inn et DNA-segment i foreliggende oppfinnelse. Typisk for slike vektorplasmider er pUC8, pUC9, pBR322 og pBR329 tilgjengelige fra Bio-Rad Laboratories, (Richmond, CA), og pPL og pKK233 tilgjengelige fra Pharmacia, Piscataway, NJ.

Ekspresjonsvektorer som er forenlige med eukaryote celler, særlig de som er forenlige med vertebratceller, kan også bli brukt for å danne de rekombinante DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. Eukaryote celleekspresjonsvektorer er velkjente innen teknikken og er tilgjengelige fra flere kommersielle kilder. Typisk kan slike vektorer som inneholder passende restriksjonsseter for innsetting av det ønskede DNA-segment, oppnås. Typisk for slike vektorer er pSVL og pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), og pTDTl (ATCC, nr. 31255).

I foretrukne utførelsesformer vil eukaryote celleekspresjonsvektorer benyttet til å konstruere de rekombinante DNA-molekyler i foreliggende oppfinnelse, inkludere en seleksjonsmarkør som er effektiv i en eukaryot celle, fortrinnsvis en medikament-resistens-seleksjons-markør. En foretrukket medikament-resistensmarkør er genet hvis ekspresjon resulterer i neomycinresistens, dvs. neomycinfosfotransferase (neo)-genet. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982).

Bruken av retrovirale ekspresjonsvektorer for å lage rDNA ifølge foreliggende oppfinnelse, er også beskrevet. Herved brukes betegnelsen "retroviral ekspresjonsvektor" for et DNA-molekyl som inkluderer en promotorsekvens som oppnås fra lange, terminale, repetitive regioner (LTR) i et retrovirusgenom.

I de foretrukne utførelsesformer er ekspresjons-vektoren typisk en retroviral ekspresjonsvektor som fortrinnsvis er replikasjonsinkompetent i eukaryote celler. Konstruksjonen og bruken av retrovirale vektorer er beskrevet av Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37

(1984).

En rekke fremgangsmåter er blitt utviklet for operativt å binde DNA til vektorer via komplementære, kohesive ender. F.eks. kan komplementære homopolymer-sekvenser bli bundet til DMA-segmentet som skal innsettes, og til vektor-DNA. Vektoren og DNA-segmentet blir så bundet sammen ved hydrogenbinding mellom de komplementære homopolymere ender og danner rekombinante DNA-molekyler.

Syntetiske linkere som inneholder ett eller flere restriksjonsseter, tilbyr en alternativ metode når det gjelder å binde DNA-segmentet til vektorene. DNA-segmentet som dannes ved endonucleaserestriksjonskløyving som beskrevet tidligere, er behandlet med bakteriofag T4-DNA-polymerase eller E. coli DNA-polymerase I, enzymer som fjerner overhengende 3<1->enkelttrådede ender med deres 3 '-5'-exonucleaseaktiviteter og fyller inn forkortede 3 '-ender med deres polymeraseaktiviteter. Kombinasjonen av disse aktivitetene danner derfor likeendede DNA-segmenter. De likeendede segmentene blir så inkubert med et stort molart overskudd av linkermolekyler i nærvær av et enzym som er i stand til å katalysere ligering av likeendede DNA-molekyler, slik som bakteriofag T4-DNA-ligase. Således blir produktene fra reaksjonen DNA-segmenter som har koblet til seg polymere linkersekvenser i endene. Disse DNA-segmenter blir så kløyvet med det rette restriksjonsenzym og ligert til en ekspresjonsvektor som er blitt kløyvet med et enzym som produserer ender som er kompatible med de i DNA-segmentet.

Syntetiske linkere som inneholder en rekke restriksjonsendonucleaseseter, er kommersielt tilgjengelige fra flere kilder, deriblant International Biotechnologies, Inc., New Haven, CN.

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er RNA-ekvivalenter til de ovenfor beskrevne, rekombinante DNA-molekyler.

D. Transformerte celler og kulturer

Foreliggende oppfinnelse vedrører.også en vertscelle som er transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. Vertscellen kan enten være prokaryot eller eukaryot. Bakteriecellene er fortrinnsvis prokaryote vertsceller, og er typisk en stamme av E. coli slik som f.eks. E. coli-stammen DH5 tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. De foretrukne eukaryote vertsceller inkluderer gjær- og pattedyrceller, fortrinnsvis vertebratceller slik som de fra en mus-, rotte-, ape- eller human fibroblastcellelinje. De foretrukne eukaryote vertsceller inkluderer "Chinese hamster ovary" (CHO)-celler som'er tilgjengelige fra ATCC som CCL61 og NI2 "Swiss mouse embryo"-celler NIH/3T3 tilgjengelige fra ATCC som CRL 1658.

En foretrukket transformert cellelinje er E. coli som inneholder det rekombinante DNA-molekyl HEL41, hvorav en kultur er blitt deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 7. juli 1987, og ble gitt registreringsnummer 67456.

Transformasjon av de rette vertsceller med et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved hjelp av kjente metoder som typisk er avhengig av den type vektor som blir brukt. Med hensyn til transformasjon av prokaryote vertsceller, se f.eks. Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69:2110 (1972); og Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold.Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Med hensyn til transformasjon av vertebratceller med retrovirale vektorer som inneholder rDNA, se f.eks. Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984); Graham et al., Virol., 52:456

(1973); og Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1979).

Vellykkede transformerte celler, f.eks. celler som inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli identifisert ved hjelp av velkjente teknikker. F.eks. kan celler som er et resultat av innføring av rDNA ifølge foreliggende oppfinnelse, bli klonet slik at de produserer monoklonale kolonier. Celler fra disse koloniene kan bli høstet, lysert og deres DNA-innhold undersøkt for nærværet av rDNA ved å bruke en fremgangsmåte slik som den beskrevet av Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) eller Berent et al., Biotech., 3:208

(1985).

I tillegg til å måle direkte tilstedeværelse av rDNA, kan vellykket transformasjon bli bekreftet ved hjelp av velkjente immunologiske metoder når rDNA er i stand til å dirigere ekspresjonen av et GPIIb-beslektet protein. F.eks. produserer celler som er vellykket transformert med en ekspresjonsvektor, proteiner som viser GPIIb-antigenisitet. Prøver av celler som man mistenker er transformert, kan høstes og undersøkes for GPIIb-beslektet protein ved å bruke antistoffer spesifikke for disse antigener, slik som de som er produsert av et hybridom ifølge foreliggende oppfinnelse.

I tillegg til å beskrive de transformerte vertsceller omfatter således foreliggende oppfinnelse også en kultur av disse celler, spesielt en monoklonal (en homogen klon) kultur, eller en kultur som oppstår fra en monoklonal kultur, i et næringsmedium. Fortrinnsvis innholder kulturen også et protein som viser GPIIb-antigenisitet.

Næringsmedier som er brukbare for å dyrke transformerte vertsceller, er velkjente i faget og kan oppnås fra flere kommersielle kilder. I deler der vertscellen er fra pattedyr, vil et "serumfritt" medium fortrinnsvis bli brukt.

E. Fremgangsmåter for å produsere GPIIb- beslektede

proteiner

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å produsere proteiner som viser GPIIb-antigenisitet. Proteiner som viser GPIIb-antigenisitet, er proteiner som immunreagerer med antistoffer indusert av naturlig GPIIb. Proteiner som viser GPIIb-antigenisitet, er brukbare som antigener og for å utvikle antistoffer, hvert av dem kan bli brukt i de diagnostiske systemer og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse.

Denne fremgangsmåte beskriver igangsetting av en kultur som består av et næringsmedium som inneholder vertsceller, fortrinnsvis humane celler, transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge denne oppfinnelse som er i stand til å uttrykke et gen som koder for en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens. Kulturen opprettholdes for en tidsperiode som er tilstrekkelig til at de transformerte celler kan uttrykke et protein som inneholder en GPIIb-beslektet aminosyrerestsekvens. Det uttrykte protein isoleres så fra kulturen.

Metodene for å isolere et uttrykt protein fra en kultur, er velkjente innen faget og inkluderer fraksjon-ering av den proteinholdige del av kulturen med bruk av velkjente biokjemiske teknikker. F.eks. kan gelfilt-reringsmetoder, gelkromatografi, ultrafiltrering, elektroforese, ionebytting, affinitetskromatografi og lignende, som er kjent for proteinfraksjoneringer, bli brukt for å isolere de uttrykte proteiner funnet i kulturen. I tillegg kan immunokjemiske metoder, slik som immuno- affinitet, immunadsorpsjon og lignende, bli utført ved å benytte velkjente fremgangsmåter.

Aminosyrerester som er tilstede i et polypeptid ifølge oppfinnelsen i tillegg til en sekvens som blir spesifikt oppgitt i det følgende opptil en total av ikke mer enn omkring 50 aminosyrerester, kan være enhver rest som ikke materielt affiserer de basale og nye egenskaper til et polypeptid som blir omtalt senere. Slike tilleggsrester blir vanligvis tilføyd den ene eller begge ender av et gitt polypeptid og kan inkludere repeterende deler og partielt repeterende deler av en gitt polypeptidsekvens.

F. Polypeptider

Et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder ikke mer enn omkring 50, oftere færre enn omkring 35 og fortrinnsvis færre enn omkring 25 aminosyrerester, og inneholder minst omkring 10 rester. I tillegg er et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse karakterisert ved dets aminosyrerestsekvens og nye, funksjonelle egenskaper.

1. hGPIIb kryptiske determinant- polypeptid-analoger

I vid forstand omfatter en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse et polypeptid som inkluderer en aminosyrerestsekvens som er i stand til å fungere som en kryptisk antigen determinant som uttrykkes av den tunge kjede i alfa-subenheten av et RDG-bindende cytoadhesivt protein. Aminosyrerestsekvensen av den kryptiske determinant-polypeptidanalog korresponderer til sekvensen på omkring 15 carboxyterminale aminosyrerester i den tunge kjede av alfa-subenheten i cytoadhesin.

En foretrukket cytoadhesin-alfa-subenhet tung kjede kryptisk determinant-polypeptidanalog er i stand til å etterligne en hGPIIb kryptisk determinant som er dannet når hGPIIb binder fibrinogen. Som en foretrukket utførelses-form inkluderer en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog i det minste den følgende aminosyrerestsekvens:

-PAHHKRDRRQ-,

hvilket representerer aminosyrerest 137-145 som vist i figur 1.

Det er å foretrekke at en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog inkluderer minst den følgende aminosyrerestsekvens:

-PSPSPIHPAHHKRDRRQ-,

hvilket representerer aminosyrerest 129-145 som vist i figur 1.

De foretrukne hGPIIb kryptiske determinant-analoger inkluderer de hvis aminosyrerestsekvenser er vist i tabell 1.

Polypeptidene vist i tabell 1, er videre karakterisert ved deres evne til å nøytralisere (kompetitivt hemme) bindingen av PiMI-l-antistoffmolekyler beskrevet nedenfor, med hGPIIb når hGPIIb er til stede som et GPIIb-IIIa/fibrinogenkompleks.

Order "kompleks" som brukt her, refererer seg til produktet av en spesifikk bindingsreaksjon slik som en antistoff-antigen- eller reseptor-ligand-reaksjon. Eksempler på disse kompleksene er immunreaksjonsprodukter GPIIb-IIIa-fibrinogenbindingsreaksjonsprodukter, og cytoadhesin-ligandbindingsreaksjonsprodukter.

I en foretrukket utførelsesform er en hGPIIb kryptisk determinairtanalog videre karakterisert ved dens egenskap til kompetitivt å hemme aggregering av fibrinogenbundne plater. Et eksempel på en hGPIIb kryptisk determinantanalog som er i stand til å hemme fibrinogenbundet plateaggregering, er polypeptid pl29-145.

Det skal forstås at en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog ifølge foreliggende oppfinnelse ikke må være identisk med aminosyrerestsekvensen av hGPIIb så lenge som den er i stand til kompetitivt å hemme fibrinogenbundet plateaggregering og/eller er i stand til kompetitivt å hemme bindingen av PMI-l-antistoffmolekyler beskrevet nedenfor, til hGPIIb når hGPIIb er til stede som et GPIIb-IIIa/fibrinogenkompleks. Derfor kan en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog være gjenstand for forskjellige forandringer, slik som innsettinger, delesjoner og substitusjoner, enten konservative eller ikke-konservative, hvor slike forandringer frembringer visse fordeler for deres bruk.

Konservative substitusjoner er de hvor en aminosyrerest er erstattet med en annen, biologisk lignende rest. Eksempler på konservative substitusjoner inkluderer substitusjon av en hydrofob rest slik som isoleucin, valin, leucin eller methionin med en annen, eller substitusjon av en polar rest med en annen slik som mellom arginin og lysin, mellom glutamin og asparaginsyre eller mellom glutamin og asparagin og lignende. Betegnelsen "konservativ substitusjon" inkluderer også bruken av substituerte aminosyrer istedenfor en ikke-substituert utgangsaminosyre forutsatt at et slikt polypeptid også viser den krevede bindingsaktivitet.

Når et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse har en sekvens som ikke er identisk med sekvensen til hGPIIb fordi én eller flere konservative eller ikke-konservative substitusjoner er blitt gjort, er vanligvis ikke fler enn omkring 20% og mer ordinært ikke mer enn 10% av aminosyrerestene substituert, unntatt hvor ekstra rester er blitt føyd til ved hver ende med det formål å gi en "linker" gjennom hvilken polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse med letthet kan bli koblet til en markør eller fast matriks, eller antigen bærer. Markører, faste matrikser og bærere som kan bli brukt sammen med polypeptidene ifølge denne oppfinnelse, blir beskrevet nedenfor.

Aminosyrerestlinkerne er vanligvis i det minste én rest og kan være 40 eller flere rester, oftest 1 til 10 rester. Typiske aminosyrerester brukt for kobling, er tyrosin, cystein, lysin, glutamin- og asparaginsyre, eller lignende. I tillegg kan en polypeptidsekvens ifølge oppfinnelsen være forskjellig fra den naturlige sekvens ved sekvensen som blir modifisert ved terminal-NH2-acylering, f.eks. acetylering, eller thioglycolsyreamidering, terminal-carboxylamidering, f.eks. ammoniakk, methylamin, osv.

Etter kobling til en bærer via en linker for å danne det som er kjent innenfor faget som et bærer-hapten-konjugat, er en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog ifølge foreliggende oppfinnelse i stand til å indusere antistoffer som immunreagerer med hGPIIb når hGPIIb er til stede som et plate-bundet GPIIb-IIIa/fibrinogenkompleks. Ut ifra det veletablerte prinsipp for immunologisk kryss-reaktivitet, beskriver foreliggende oppfinnelse derfor antigenrelaterte varianter av polypeptid pl29-149. En "antigent relatert variant" er et polypeptid som inkluderer minst en seks aminosyrerest-sekvensdel av polypeptid pl29-145 og som er i stand til å indusere antistoffmolekyler som immunreagerer med polypeptid pl29-145 og hGPIIb når hGPIIb er til stede som et platebundet GPIIb-IIIa/fibrino-genkompleks .

2. lGPIIb- polypeptider

I en annen utførelsesform beskriver foreliggende oppfinnelse et lGPIIb-polypeptid som inkluderer minst den følgende aminosyrerestsekvens:

-RQIFLPEPEQPSR-,

som representerer aminosyrerester 144-156 som vist i figur 1.

Et lGPIIb-polypeptid er videre karakterisert ved dets egenskap til å indusere antistoffmolekyler som immunreagerer med lGPIIb, men ikke immunreagerer med hGPIIb. Et foretrukket lGPIIb-polypeptid som betegnes pl44-156, har en aminosyrerestsekvens som er representert ved formelen:

ROIFLPEPQPSR.

Både et hGPIIb- og et lGPIIb-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli syntetisert ved enhver teknikk som er kjent for dem som er dyktige i polypeptid-kunsten. En utmerket oppsummering av de mange teknikker som er tilgjengelige, kan bli funnet i J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983 for fast-fase peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press (New York), 1965 for klassisk løsningssyntese.

G. Inokula

I en annen utførelsesform er et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse eller en antigent relatert variant av dette, brukt i en farmasøytisk akseptabel, vandig fortynningsblanding for å danne et inokulum som når det blir gitt i en effektiv mengde, er i stand til å indusere antistoffer som immunreagerer med hGPIIb.

Ordet "inokulum" og dets forskjellige grammatikalske former blir brukt her for å beskrive en blanding som inneholder et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som en aktiv ingrediens brukt for å fremstille antistoffer mot den tunge eller lette kjede av GPIIb.

Når et polypeptid blir brukt for å indusere antistoffer, må det forstås slik at polypeptidet kan bli brukt alene, eller bundet til en bærer som et konjugat, eller som en polypeptidpolymer, men for å underlette uttrykkingen, refereres det her kollektivt til de forskjellige utførelsesformer av polypeptidene ifølge denne oppfinnelse ved termen "polypeptid" og dens forskjellige grammatikalske former.

For et polypeptid som inneholder færre enn omkring 35 aminosyrerester, er det å foretrekke å bruke peptidet bundet til en bærer med det formål å indusere produksjonen av antistoffer som allerede angitt.

Som allerede angitt, kan én eller flere tilleggs-aminosyrerester bli bundet til amino- eller carboxyendene av polypeptidet for å underlette bindingen av polypeptidet til bæreren. Cysteinrester bundet til amino- eller carboxyendene av polypeptidet, er blitt funnet å være spesielt nyttige for å danne konjugater via disulfidbindinger. Imidlertid kan andre metoder som er velkjente i faget for å fremstille konjugater, også bli brukt. F.eks. kan tilleggs-koblingsprosedyrer inkludere bruken av Michael-addisjonsreaksjonsprodukter, dialdehyder slik som glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983) og lignende, eller bruken av carbodiimid-teknologi som brukes som et vannløselig carbodiimid for å danne amidbindinger til bæreren. For en oversikt over proteinkonjugering eller kobling gjennom aktiverte, funksjonelle grupper, se Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, Supp-1. 7, 7-23 (1978).

Brukbare bærere er velkjente innen faget og er generelt sagt proteiner selv. Eksempler på slike bærere er "keyhole limpet" hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer slik som bovint serumalbumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA), røde blodlegemer slik som saueerythro-cytter (SRBC), tetanus toxoid, koleratoxoid og også poly-aminosyrer slik som poly (D-lysin: D-glutaminsyre) og lignende.

Valget av bærer er mer avhengig av den endelige bruk av inokulum og er basert på kriterier som ikke er spesielt presentert i denne oppfinnelse. F.eks. bør det velges en bærer som ikke frembringer en uheldig reaksjon i det spesielle dyr som inokuleres.

Det foreliggende inokulum inneholder en effektiv, immunogen mengde av et polypeptid ifølge

foreliggende oppfinnelse, og er typisk et konjugat bundet til en bærer. Den effektive mengden av polypeptid eller protein pr. enhetsdose avhenger blant annet av arten av dyret som inokuleres, kroppsvekten til dyret og det valgte inokuleringsregime som er velkjent i faget. Inokula inneholder typisk polypeptid- eller proteinkonsentrasjoner på omkring 10 mikrogram til omkring 500 milligram pr. inokulering (dose), fortrinnsvis omkring 50 mikrogram til omtrent 50 milligram pr. dose.

Betegnelsen "enhetsdose" slik det relaterer til inokula i foreliggende oppfinnelse, refererer seg til fysisk avgrensede enheter som passer som en enhetsdosering for dyr, idet hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av det aktive materiale som beregnes for å produsere den ønskede immunogene effekt i tilknytning til det nødvendige fortynningsmiddel, f.eks. bærer eller tilset-ningsstoff. Spesifikasjonene for den nye enhetsdose av et inokulum ifølge denne oppfinnelse er diktert ved og er direkte avhengige av (a) de unike egenskaper til det aktive materiale og den spesielle immunologiske effekt som ønskes oppnådd, og (b) begrensninger som er iboende i faget som går ut på å komponere slikt aktivt materiale for immunologisk bruk i dyr, som beskrevet i detalj her, idet dette er trekk ved foreliggende oppfinnelse.

Inokula fremstilles typisk fra tørret, fast polypeptid-konjugat ved å dispergere polypeptidkonjugatet i et fysiologisk tolererbart (akseptabelt) fortynningsmiddel eller bærer, slik som vann, saltvann eller fosfatbufret saltvann, slik at det dannes en vandig løsning. Slike fortynningsmidler er velkjente i faget og er diskutert f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980), på sidene 1465-1467.

Inokula kan også inkludere en adjuvans som del av fortynningsmidlet. Adjuvantia slik som komplett Freunds adjuvans (CFA), ukomplett Freunds adjuvans (IFA) og alun, er materialer som er velkjente i faget, og er tilgjengelige kommersielt fra forskjellige kilder.

H. Antistoffer og antistoffpreparater

1. Antistoffpreparater

Betegnelsen "antistoff" i dens forskjellige grammatikalske former er brukt her for å referere til immunglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, f.eks. molekyler som inneholder et antistoff-bindingssete eller paratop. Eksempler på antistoffmolekyler er intakte immunglobulinmolekyler, immunglobulinmolekyler som for størstedelen er intakte og de deler av et immunglobulinmolekyl som inneholder paratopen, inkludert de deler som er kjent i faget, som Fab, Fab<1>, F(ab')2 og F(v).

Et "antistoffbindende sete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl som omfattes av en tung og lett kjede med variable og hypervariable regioner som spesifikt binder (immunreagerer med) antigen. Betegnelsen "immunreagerer" i dens forskjellige former betyr binding mellom et antigent determinantholdig molekyl og et molekyl som inneholder et antistoff-bindingssete slik som et intakt antistoffmolekyl eller en del av dette.

"Antigen determinant" refererer seg til den egentlige strukturelle del av antigenet som immunologisk bindes av et antistoff-bindingssete. Betegnelsen er også brukt likeverdig med "epitop".

Et antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse er karakterisert ved å inneholde antistoffmolekyler som immunreagerer med: a) hGPIIb eller lGPIIb, og b) i det minste ett spesifikt polypeptid i foreliggende oppfinnelse. I en foretrukket utførelsesform inneholder et antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse mer enn én type av paratop som er i stand til å immunreagere med GPIIb.

F.eks. inneholder et antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse antistoffmolekyler som immunreagerer med plate-assosierte GPIIb-IIIa/fibrinogen-komplekser og en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog, men som ikke i sterk grad immunreagerer med polypeptid p53-64, hvis aminosyrerestsekvens er vist i tabell 2, og er i stand til å skille fibrinogenbundne plater fra plater som ikke har bundet fibrinogen. Således er de foretrukne antistoffpreparater de som inneholder antistoffmolekyler som immunreagerer med: a) hGPIIb når det er til stede som et plate-bundet GPIIb-IIIa/fibrinogen-kompleks, og b) polypeptid pl29-145, og som hovedsakelig ikke immunreagerer med polypeptid p53-64.

Et antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles typisk ved å immunisere et pattedyr med et inokulum ifølge foreliggende oppfinnelse og induserer derved i pattedyret antistoffmolekyler som har den rette polypeptid-immunspesifisitet. Antistoffmolekylene blir så oppnådd fra pattedyret og isolert til den grad som ønskes ved velkjente teknikker slik som f.eks. ved immun-affinitetskromatografi. Antistoffpreparatet som herved er utviklet, kan blant annet brukes i diagnostiske metoder og systemer ifølge foreliggende oppfinnelse for å påvise fibrinogenbundne plater i en kroppsprøve.

2. Monoklonale antistoffpreparater

Et anti-LIBS monoklonalt antistoffpreparat omfattes også av foreliggende oppfinnelse. Uttrykket "monoklonalt antistoffpreparat" i dets forskjellige grammatikalske former refererer seg til en populasjon av antistoffmolekyler som inneholder bare én art av antistoff-bindingssete som er i stand til å immunreagere med et bestemt antigen. Et monoklonalt antistoffpreparat viser typisk en enkelt bindingsaffinitet for alle antigener som den immunreagerer med. Et monoklonalt antistoffpreparat kan derfor inneholde et antistoffmolekyl som har flere antistoff-bindingsseter, hvert immunospesifikt for et forskjellig antigen, f.eks. et bispesifikt, monoklonalt antistoff.

Et monoklonalt antistoffpreparat er typisk sammensatt av antistoffer produsert i kloner av enkeltceller kalt et hybridom som utskiller (produserer) bare én slags antistoffmolekyl. Hybridomcellen er dannet ved fusjon mellom en antistoffproduserende celle og et myelom eller andre permanente cellelinjer. Slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature 256:495-497 (1975), hvis beskrivelse er inkorporert ved referanse.

I en utførelsesform er et monoklonalt antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse karakterisert ved å inneholde antistoffmolekyler som immunreagerer med en LIBS uttrykt ved et celleoverflatereseptor-ligandkompleks, fortrinnsvis en kryptisk antigendeterminant til reseptoren i komplekset.

I en annen utførelsesform inneholder et monoklonalt antistoffpreparat antistoffmolekyler som immunreagerer med hGPIIb og en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog, fortrinnsvis pl29-145. Antistoffmolekylene som finnes i disse preparater, immunreagerer med hGPIIb på eller ved et GPIIb funksjonelt sete, men hemmer ikke bindingen av fibrinogen ved platebundet GPIIb-IIIa og kan immunologisk reagere med platebundet GPIIb-IIIa når det har bundet fibrinogen. Et foretrukket monoklonalt antistoffpreparat av denne type inneholder antistoffmolekyler som er i stand til å bli produsert av hybridom PMI-1 (ATCC HB 9476), dvs. PMI-l-antistoffmolekyler.

3. Metoder for å produsere monoklonale antistof f preparater

Foreliggende oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte for å danne et monoklonalt antistoff som (a) immunreagerer med et ligandindusert bindingssete (LIBS) uttrykt ved et celleoverflatereseptor-ligandkompleks, og (b) immunreagerer ikke med enten den ikke-opptatte reseptor eller den ikke-bundne ligand i reseptor-ligandkomplekset. Fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) Immunisering av et dyr med et celleoverflate-reseptorkompleks eller en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog. Dette oppnås typisk ved å gi en immunologisk effektiv mengde, dvs. en mengde tilstrekkelig til å gi en immunrespons, av immunogen til et immunologisk kompetent pattedyr. Fortrinnsvis er pattedyret en gnager slik som en kanin, rotte eller mus. Pattedyret blir så holdt i en tidsperiode som er tilstrekkelig for at pattedyret utvikler celler som utskiller antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset. (b) En suspensjon av antistoffproduserende celler blir så fjernet fra det immuniserte dyr og så preparert. Dette oppnås typisk ved å fjerne milten til pattedyret og mekanisk separere de individuelle miltcellene i et fysiologisk tolererbart medium med bruk av velkjente metoder i faget. (c) De suspenderte antistoffproduserende celler blir behandlet med et transformerende middel som er i stand

til å produsere en transformert ("immortalisert") cellelinje. Transformerende midler og deres bruk for å utvikle immortaliserte cellelinjer, er velkjente i faget og inkluderer DNA-virus slik som Epstein Barr-virus (EBV), simianvirus 40 (SV40), polyomavirus og lignende, RNA-virus slik som Moloney murint leukemivirus (MoMuLV), Rous sarcomvirus og lignende, myelomceller slik som P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 og lignende.

I en foretrukket utførelsesform resulterer behandling med det transformerende middel i produksjon av et hybridom ved å fusjonere de suspenderte miltceller med musemyelomceller fra en passende cellelinje ved bruk av en egnet fusjonspromotor. Det foretrukne forhold er omtrent 5 miltceller pr. myelomcelle. Et totalt volum på omkring 10^ splenocytter.

Cellelinjen som ble brukt, skulle fortrinnsvis være av den såkalte "medikamentresistente type" slik at ikke-fusjonerte myelomceller ikke vil overleve i et selektivt medium, mens hybrider vil overleve. Den mest vanlige type er 8-azaguaninresistente cellelinjer som mangler enzymet hypoxanthinguaninfosforibosyltransferase og derfor ikke kunne leve i HAT (hypoxanthin, aminopterin og thymidin)-medium. Det er også vanligvis foretrukket at myelomcellelinjen som brukes, er av den såkalte "ikke-utskillende" type slik at den ikke selv produserer noe antistoff, skjønt utskillende typer kan bli brukt. I visse tilfeller kan imidlertid utskillende myelomlinjer være foretrukket. Mens den foretrukne fusjonspromotor er polyethylenglycol som har en gjennomsnittlig molekylvekt fra omkring 1000 til omkring 4000 (kommersielt tilgjengelig som PEG 1000, etc), kan andre f us j onspromotorer kjent i faget, bli brukt.

(d) De transformerte celler blir da klonet, fortrinnsvis til monoklonalitet. Kloningen blir foretrukket utført i et vevskulturmedium som ikke vil underholde ikke-transformerte celler. Når de transformerte cellene er hybridomer, blir dette typisk utført ved å fortynne og dyrke

i separate containere, blandingen av ikke-fusjonerte miltceller, ikke-fusjonerte myelomceller og fusjonerte celler (hybridomer) i et selektivt medium som ikke vil underholde de ikke-fusjonerte myelomceller i en tid som er tilstrekkelig til å tillate at de ikke-fusjonerte celler dør (omtrent en uke). Fortynningen kan være av en begrensende type hvor volumet av fortynningsmidlet blir beregnet statistisk for å isolere et visst antall celler (f.eks. 1-4) i separate containere (f.eks. hver brønn i en mikrotiterplate). Mediet er et (f.eks. HAT-medium) som ikke vil underholde medikamentresistent (f.eks. 8-azaguanin-resistent), ikke-fusjonert myelomcellelinje. (e) Vevskulturmediet til de klonede transformanter. blir evaluert for nærværet av utskilte anti-LIBS-antistoffmolekyler med bruk av velkjente immunologiske teknikker. (f) Når en ønsket transformant er blitt identifisert i trinn (e), blir det selektert og dyrket i et passende vevsdyrkningsmedium i en passende tid etterfulgt av høsting av det ønskede antistoffet fra kultursupernatanten. Det passende medium og den passende lengde av dyrkningstid er kjent eller bestemmes greit. For å produsere en meget

større konsentrasjon av noe mindre rene monoklonale antistoffer kan det ønskede hybridom bli injisert i mus, fortrinnsvis syngene eller semisyngene mus. Hybridomet vil utvikle en antistoffproduserende tumor etter en passende inkubasjonstid, som vil resultere i en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (omkring 5-20 mg/ml) i blodsirkula-sjonen og peritonealt eksudat (ascites) i vertsmusen.

Medier som er brukbare for å preparere disse sammensetninger, er både velkjente i faget og kommersielt tilgjengelige og inkluderer syntetisk kulturmedium, innavlede mus og lignende. Et eksempel på syntetisk medium er Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) supplert med 4,5 g/l glucose, 20 mm glutamin og 20% føtalt kalveserum. Et eksempel på innavlet musestamme er Balb/c.

Ds monoklonale antistoffblandingene som blir produsert ved den ovenfor nevnte fremgangsmåte, kan bli benyttet, f.eks. i diagnostiske og terapeutiske modaliteter der dannelse av LIBS-holdig immunreaksjonsprodukt er ønsket. Eksempel på reaksjonsprodukter inkluderer et GPIIb- eller et GPIIIa-holdig immunreaksjonsprodukt.

I. Hybridomer og fremgangsmåter for preparering

Hybridomer ifølge foreliggende oppfinnelse er de som er karakterisert ved å ha evne til å produsere en anti-LIBS monoklonal antistoffblanding.

Et foretrukket hybridom ifølge foreliggende oppfinnelse er karakterisert ved å produsere antistoffmolekyler som immunreagerer med en celleoverflatereseptor kryptisk antigendeterminant.

Fremgangsmåter for å produsere hybridomer som produserer (utskiller) antistoffmolekyler som har en forønsket immunspesifisitet, dvs. har den egenskap at de kan immunreagere med et bestemt protein, en identifiserbar epitop på et bestemt protein og/eller et polypeptid, er velkjente i faget. Særlig velegnet er hybridomteknologien beskrevet av Niman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:4949-4953 (1983), og av Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), med beskrivelser som er inkorporert her ved referanse.

Hybridomkultur PMI-1 er blitt deponert ifølge Budapest-konvensjonens krav i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, U.S.A., 7. juli 1987, og ble gitt registreringsnummer HB 9476. Hybridomkultur PMI-2 ble på lignende måte deponert med ATCC den 22. desember 1987 og ble gitt registreringsnummer HB 9615.

J. Diagnostiske systemer

Et diagnostisk system i settform ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer, i en mengde tilstrekkelig for i det minste en analyse, et uttrykt protein, polypeptid, antistoffpreparat eller monoklonaltantistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse som et separat pakket reagens. Instruksjoner for bruk av det pakkede reagens, er også typisk inkludert.

"Instruksjoner for bruk" inkluderer typisk i leselig form en beskrivelse av reagenskonsentrasjonen eller i det minste en analysemetodeparameter slik som de relative mengder av reagenset og midler som skal tilsettes, levetid for reagens, prøveblandinger, temperatur, bufferbetingelser og lignende.

I en utførelsesform omfatter et diagnostisk system for å måle fibrinogenbundne plater i en plateholdig blod-prøve, slik som blod eller plasma, en pakke som inneholder molekyler som immunreagerer med en hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog, fortrinnsvis pl29-145. Mer foretrukket er antistoffmolekyler som produseres av hybridom PMI-1 som immunreagerer med hGPIIb. Det er å ønske at antistoffmolekylene er til stede som et monoklonalt antistoffpreparat. Videre er det foretrukket sett hvor antistoffmolekylene er bundet til en radionuclid— markør, fortrinnsvis <125>I-merkede PMI-l-antistoffmolekyler.

I en annen utførelsesform er det beskrevet et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse som er brukbart for å måle nærværet av en trombe in vivo. Systemet omfatter en pakke som inneholder antistoffmolekyler som immunreagerer med hGPIIb kryptisk determinant-polypeptidanalog, fortrinnsvis pl29-145. Mer ønskelig er antistoffmolekylene til stede som et monoklonalt antistoffpreparat som består hovedsakelig av PMI-l-antistoffmolekyler som immunreagerer med hGPIIb. Antistoffmolekylene er bundet til et in vivo indikasjonsmiddel.

I de foretrukne utførelsesformer inkluderer således et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse en markør eller et indikerende middel som er i stand til å signalisere dannelsen av et kompleks som inneholder et antistoffmolekyl eller polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som brukt her, vil uttrykkene "markør" og "indikerende middel" i deres forskjellige grammatikalske former referere seg til enkeltatomer og molekyler som er enten direkte eller indirekte involvert i produksjonen av et målbart signal som kan indikere nærværet av et kompleks. "In vivo"-markører eller indikerende midler er de som er anvendbare for bruk i kroppen til et menneske og inkluderer <111>In/ 9<9>Tc, <67>Ga, 18<6>Re og 13<2>I. Enhver markør eller ethvert indikerende middel kan være bundet til eller inkorporert i et uttrykt protein, polypeptid eller antistoffmolekyl som er del av et antistoff eller monoklonalt antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse eller brukt separat, og disse atomer eller molekyler kan bli benyttet alene eller i samband med tilleggsreagenser. Slike markører er selv velkjente i klinisk diagnostisk kjemi og utgjør en del av denne oppfinnelse bare i den grad de benyttes sammen med andre nye proteinfremgangsmåter og/eller

-systemer.

Koblingen av markører, f.eks. merking av polypeptider og proteiner, er velkjent i faget. F.eks. kan antistoffmolekyler som produseres av et hybridom, bli merket ved,metabolsk inkorporering av radioisotopholdige aminosyrer gitt som en komponent i kulturmediet. Se f.eks. alfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Teknikkene for proteinkonjugering eller kobling gjennom aktiverte, funksjonelle grupper er særlig brukbare. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) og U.S. patent nr. 4.493.795.

De diagnostiske systemene kan også inkludere, fortrinnsvis som separate pakker, et bestemt bindingsmiddel. Et "spesifikt bindingsmiddel" er en molekylenhet som er i stand til selektivt å binde reagensformer ifølge foreliggende oppfinnelse, men er ikke selv et proteineks-presjonsprodukt, polypeptid eller antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. Som eksempel på spesifikke bindingsmidler er antistoffmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter av dette, protein A og lignende. Fortrinnsvis kan det spesifikke bindingsmiddel binde antistoff-molekylet eller polypeptidet ifølge denne oppfinnelse når det er til stede som del av et kompleks.

I de spesielt omtalte deler er det spesifikke bindingsmiddel merket. Når det diagnostiske system inkluderer et spesifikt bindingsmiddel som ikke er merket, er imidlertid middelet typisk brukt som et forsterk-ningsmiddel eller reagens. I disse deler er det merkede, spesifikke bindingsmiddel i stand til spesifikt å binde det forsterkende middel når det forsterkende middel er bundet til en reagenstype som inneholder komplekset.

De diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli brukt i et "ELISA"-format for å påvise nærvær eller mengde av fibrinogenbundne plater i en kroppsvæske-prøve slik som serum, plasma eller urin. "ELISA" refererer seg til en enzymbundet immunsorbentanalyse som benytter et antistoff eller antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen eller enzym-antistoffkonjugat for å oppdage og kvantitere mengden til et antigen eller antistoff tilstede i prøven. En beskrivelse av ELISA-teknikken er funnet i kapittel 22 i den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publications i Los Altos, CA i 1982, og i U.S. patent-skrifter nr. 3.654.090, nr. 3.850.752 og nr. 4.016.043 som alle er inkorporert her ved referanse.

I foretrukne utførelsesformer kan således det uttrykte protein, polypeptid eller antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse bli bundet til en fast matriks for å danne en fast bærer som er separat pakket i de person-rettede, diagnostiske systemer.

Reagenset bindes typisk til den faste matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium, skjønt andre måter av binding som er velkjente for fagmannen, kan bli brukt.

Brukbare, faste matrikser er velkjente i faget. Slike materialer inkluderer kryssbundet dextran tilgjengelig under handelsnavnet Sephadex fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; kuler av polystyren som er omkring 1 mikron til omkring 5 millimeter i diameter tilgjengelige fra Abbott Laboratories, North Chicago, IL; polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet polyacrylamid, nitrocellulose- eller nylon-baserte materialer slik som ark, strimler eller blader; eller rør, plater eller brønner i en mikrotiterplate slik som de laget fra polystyren eller polyvinylklorid.

De forskjellige reagenstyper, merkede, spesifikke bindingsmidler eller forsterkende reagenser av ethvert diagnostisk system beskrevet her, kan bli gitt i form av en løsning, som en flytende dispersjon eller som et i det vesentlige tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Hvor det indikerende middel er et enzym, kan enzymets substrat også bli tilveiebrakt i en separat pakke som hører til systemet. En fast bærer slik som den tidligere beskrevne mikrotiterplate og én eller flere buffere, kan også inkluderes som separate elementer i pakken i dette diagnostiske system.

Pakkene som diskuteres her i relasjon til de diagnostiske systemer, er de som vanligvis benyttes i diagnostiske systemer. Slike pakker inkluderer glass og plast- (dvs. polyethylen, polypropylen og polycarbonat) flasker, små glass, plast og plast-deriverte, laminerte innpakninger og lignende.

K. Analysefremgangsmåter

Foreliggende oppfinnelse omfatter enhver fremgangsmåte som resulterer i å påvise GPIIb, og særlig et kompleks som inneholder fibrinogenbundet GPIIb som er funnet i en trombe eller i fibrinogenbundne plater ved å produsere et kompleks som består av et uttrykt protein, polypeptid eller antistoffmolekyl som er innbefattet i et antistoff- eller monoklonalt antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse. Fagmannen vil forstå at det er tallrike, velkjente, diagnostisk-kjemiske prosedyrer som kan benyttes for å danne disse kompleksene. Mens det er gitt eksempler på analyse-fremgangsmåtene her, er oppfinnelsen ikke begrenset til disse.

1. Trombepåvisning

En fremgangsmåte for å påvise nærvær av en trombe i et menneske, er beskrevet. En effektiv mengde av et antistoffpreparat eller et monoklonalt antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder anti-hGPIIb-antistoffmolekyler bundet til et in vivo indikerende middel, gis intravenøst til personen. I de foretrukne utførelses-former er de merkede antistoffmolekylene de som immunreagerer med hGPIIb og polypeptid pl29-145, men ikke p53-64, og er spesielt de som er produsert av hybridom PMI-1.

Personen observeres i en på forhånd bestemt tidsperiode som er tilstrekkelig til at de merkede antistoffmolekyler kan reagere med hGPIIb som er til stede som del av en trombe og danne et kompleks, og fortrinnsvis i ytterligere en tid som er tilstrekkelig for at en

betydelig mengde av ethvert ikke-reagert antistoffmolekyl kan forsvinne fra kroppen. Personen blir så undersøkt med tanke på nærvær og fortrinnsvis lokalisering av ethvert merket kompleks som er dannet.

2. Påvisning av fibrinogenbundne plater i en kroppsvæske

Forskjellige heterogene og homogene analysefremgangsmåter kan benyttes, enten kompetitive eller ikke-kompetitive for å påvise nærværet og fortrinnsvis mengden av fibrinogenbundne plater i en plateholdig kroppsprøve, fortrinnsvis en kroppsvæskeprøve slik som blod eller en plateholdig del av blod. F.eks. blandes en heparin-tilsatt (ikke-koagulert) blodprøve og <125>I-merkede PMI-l-antistoffmolekyler. Immunreaksjonsblandingen som på denne måte er dannet, blir inkubert under de biologiske analysebetingelser for en tidsperiode som er tilstrekkelig for at alle fibrinogenbundne plater kan immunreagere med de merkede antistoffer og danne et merket immunreaksjons- produkt. De merkede immunreaksjonsproduktene blir så separert fra de ikke-reagerte, merkede antistoffene, typisk ved sentrifugering som er tilstrekkelig til å pelletere alle plater til stede i prøven. Mengden av merket immunreaksjonsprodukt som er dannet, blir så målt.

De biologiske analysebetingelser er de som opprettholder den biologiske aktivitet til antistoffmolekylene og polypeptidmolekylene ifølge denne oppfinnelse og fibrinogenbundne plater som ønskes å bli målt. Disse betingelser inkluderer et temperaturområde på omkring 4°C til omkring 45°C, fortrinnsvis omkring 37°C, et pH-verdi-område fra omkring 5 til omkring 9, fortrinnsvis rundt 7, og en ionestyrke som varierer fra den som finnes i destillert vann til omkring 1 molar natriumklorid, fortrinnsvis omkring det som finnes i fysiologisk saltvann. Metoder for å

optimalisere slike forhold er velkjente i faget.

Eksempler

1. Isolering av GPIIb- IIIa

A. Plateisolering

60 milliliter (ml) av humant helblod ble samlet i

5 ml av ACD (0,065 M sitronsyre, 0,085 M natriumcitrat, 2% dextrose) inneholdende hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i en endelig konsentrasjon av 0,06 enheter pr. milliliter (U/ml) og sentrifugert i 15 minutter ved 120xg. Den resulterende supernatant, betegnet platerikt plasma (PRP), ble samlet, isolert og videre sentrifugert i 15 minutter ved 1200xg for å gi en pellet med isolerte plater.

B. GPIIb- IIIa- isolering fra plater

En platepellet preparert som i eksempel IA, ble resuspendert i 5 ml TBS (0,15 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,4, 5xlO"<4> m CaCl2, 10~^ M leupeptin) og sonikert på is i 10 minutter ved maksimal innstilling og bruk av en modell W-375 sonikator (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY). Den sonikerte suspensjon ble frosset to ganger og tint ved hjelp av et tørris-methanol-isbad og lagret ved -20°C. Det frosne-tinte platesonikat ble lagt på toppen av 5 ml av en sucroseløsning (40% vekt/volum i TBS) og sentrifugert ved 4°C i 1 time ved 38.000 rotasjoner pr. minutt (RPM) i en SV41-sentrifugerotor (Beckman Instruments, Fullerton, CA) for å danne en melkefarget infranatant. Den melkelignende infranatent ble så samlet og sentrifugert ved 43.000 RPM i SW50.1-sentrifugerotor (Beckman) ved 4°C i 1 time. Den resulterende pellet ble resuspendert i typisk 1-2 ml TBS for å gi en platemembranløsning, proteinkonsentrasjonen av denne ble bestemt å være i området av 10-25 mg/ml, typisk ble det brukt Bio-Rad protein-analysekit (Bio-Rad, Richmond, CA) ifølge produsentens instruksjoner.

Platemembranløsningen ble igjen sentrifugert i en SW50.1-sentrifugerotor som ovenfor beskrevet, og den resulterende pellet ble resuspendert i 2 ml av ekstrak-sjonsbuffer (0,03 M Tris, pH 7,4, lxlO-<5> M leupeptin, 200 mM n-octyl-beta-D-glucopyranosid; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA). Platemembranekstraktet som således ble dannet, ble blandet grundig ved vortexing og så holdt ved romtemperatur i 30 minutter. Ekstraktet ble deretter sentrifugert ved 45. 000 rpm i en SW50-l-sentrifugerotor i 1 time ved 4°C, og platemembranekstraktsuperntatanten som da ble dannet, ble samlet.

Den oppsamlede supernatant ble satt på en LKB Ultrogel Aca 34 gelfiltreringskolonne (3x97 cm, LKB Instruments, Gaithersburg, MD) som hadde vært ekvilibrert med 1 liter av kolonnebuffer (0,03 M Tris, pH 7,4, 0,1 mM CaCl2, 0,1% n-octyl-beta-D-glucopyranosid), og 5 ml fraksjoner ble samlet opp fra væsken som kom gjennom kolonnen. Den optiske tetthet ved 280 nanometer til hver fraksjon ble bestemt, og fraksjonene rundt flere topper ble kombinert for å gi en blanding for hver topp. Prøvene fra hver blanding ble analysert ved elektroforese i 6% polyacrylamid-slabgeler ved bruk av reduserende buffere og fremgangsmåter som beskrevet av Laemmli, Nature (London), 227:680-685 (1970), og lavmolekylvekt-proteinstandarder i området 14,4 kilodalton (kda) i 92,5 kda (Bio-Rad, Richmond, CA). Blandingen som inneholdt hovedsakelig to proteintyper som har molekylvekter korresponderende til GPIIb og GPIIIa, dvs. hhv. 120 kda og 100 kda, ble samlet opp. Proteinkonsentrasjonen til det isolerte GPIIb-IIIa-preparat som ble fremstilt på denne måte, ble typisk bestemt ved hjelp av Bio-Rad proteinanalysesettet til å være i området 0,3 til 0,8 mg/ml.

2. Fremstilling av polyklonalt anti- GPIIb- IIIa-antiserum

Kanin-anti-GPIIb-IIIa-antistoffer ble fremstilt ved immunisering med- en blanding som inneholdt komplett Freunds adjuvans og 100 mikrogram (/ug) av isolert GPIIb-IIIa-protein, preparert som beskrevet i eksempel 1. Booster-injeksjoner av GPIIb-IIIa ble tilført på multiple, interdermale steder (typisk 100 /ug fordelt over 4 steder) i ukomplett Freunds adjuvans i et ukentlig program i totalt tre uker etterfulgt av et to-ukers program for ytterligere tre måneder.

3. cDNA- bibliotekkonstruksjon, antistoffscreening

og identifisering av cDNA- kloner

Totalt cellulært RNA ble preparert fra HEL-celler ved guanidiniumisothiocyanat/cesiumkloridmetoden. Poly

(A<+>)RNA ble renset fra total-RNA-fraksjonen ved to sykler av kromatografi på oligo (dT)-cellulose. Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert fra 10 /ug HEL poly (A<+>)RNA med bruk av AMV revers transkriptase (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, FL) og vilkårlige oligodeoxynucleotidprimere ifølge standard fremgangsmåter. Størrelseselektert cDNA ble ligert inn i EcoRI-setet til fag Agtll, som ble pakket i fagen ifølge produsentens protokoll der det ble brukt Gigapack pakke-estrakt tilgjengelig fra Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, og så platet ut og amplifisert på E. coli Y1088. Utsåing av fag på E. coli Y1090, induksjon av fusjons-proteinsyntese, overføring til nitrocellulosefiltere, og screening av filtrene med kanin-polyklonalt GPIIb-IIIa antiserum preparert i eksempel 2, ble utført som beskrevet av Young et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:1194-1198

(1983) ved bruk av immunperoxydase basert på Vectastain ABC-metoden (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Positive, rekombinante kloner ble plakkrenset, amplifisert og samlet som et skållysat.

Initial screening av 200.000 rekombinanter med kanin-polyklonalt GPIIb-IIIa-antiserum identifiserte seks immunreaktive kloner. For å undersøke immunreaktiviteten til beta-galactosidase-cDNA-fusjonsproteinet i de positive kloner med monoklonalt antistoff PMI-1, ble faglysogener produsert i E. coli-stamme Y1089 som beskrevet av Young et al., Science, 222:778-782 (1983). Lysater fra IPTG-induserte kulturer ble preparert ved å resuspendere de bakterielle cellepelleter i en reduserende gelprøvebuffer, og deretter ble prøvene kjørt på 6% SDS-polyacrylamidgeler, overført til nitrocellulose som beskrevet av Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 26:4350-4354 (1979), og probet med PMI-1 der Vectastain ABC-metoden ble brukt.

En av disse kloner, HEL41, som inneholdt 1,1 kilo-baser (kb) innskudd, ble funnet å dirigere syntesen av et bakterielt fusjonsprotein på 140 kda som hadde egenskaper forenlige med at det hadde GPIIb-epitoper. Disse karakteristika inkluderte: (1) når den polyklonale anti-GPIIb-Illa-antistoffblandingen var på forhånd absorbert med isolert GPIIb-IIIa, ble reaktiviteten mot fusjonsproteinet som ble kodet for av HEL41-klonen, blokkert. (2) Spesifikk reaksjon mellom antistoffer som var affinitetsrenset på fusjonsproteinet, og GPIIb i immunblot fra platelysater og renset GPIIb-IIIA; og (3) immunpresipitasjon av GPIIb-IIIa fra overflatemerkede plater ved det affinitetsrensede antiserum. Det af f initetsrensede antistoff reagerte ikke^ med alfa-subenheten av vitronectinreseptor (VnR) ved Western blot og immunpresipiterte ikke det relaterte, endoteliale cellecytoadhesin. I tillegg var fusjonsproteinet kodet for av HEL41, immunreaktivt mot det monoklonale antistoff PMI-1, hvilket gir videre bevis for at denne klon kodet for epitoper tilgjengelige på GPIIb.

4. DNA- sekvensering og sekvensanalyse

Rekombinant fag-DNA fra HEL41 ble renset ved hjelp av løsningskulturteknikk, fordøyet med EcoRI og subklonet i M13mpl8. DMA-sekvensen for hver tråd ble bestemt ved dideoxykjedetermineringsmetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467 (1977) med bruk av <3>^S-dATP og buffergradientgeler som er beskrevet av Biggin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:3963-3965 (1983). cDNA-sekvensen ble ekstendert ved hjelp av spesifikk primer-dirigert DNA-sekvenseringsmetoden som beskrevet av Strauss et al., Anal. Biochem., 154:353-360 (1986). Oligonucleotid 20-mer-sekvenseringsprimere ble syntetisert på en Applied Biosystems "Model 380A DNA Synthesizer". Begge trådene ble sekvensert for å løse usikkerheter.

Nucleotidsekvensen til klon HEL41 er vist i figur 1 og har de følgende karakteristika. Innskuddet består av en åpen leseramme på 681 baser med en TAG-termineringskodon som begynner ved posisjon 682 fulgt av 420 baser av den 3<1->ikke-translaterte sekvens. De første 120 nucleotider ved 5'-enden av klonen har karakteristika til konsensus Alu repetitive sekvenser som indikerer at denne klon kan ha oppstått fra en ufullstendig prosessert mRNA.

cDNA-sekvensen til klon HEL41 koder for en åpen leseramme på 227 aminosyrer (figur 1). Den bestemte N-terminale sekvens for den lette kjede til GPIIb, som rapportert av Charo et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

83:8351-8356 (1986), kan identifiseres innen klonen som aminosyrerest 157 til 171. De konsensus Alu repetitive sekvenser translaterer i leseramme og utgjør de første 40 aminosyrerester som kodes for av HEL41.

Sammenligning mellom den deduserte aminosyresekvens av GPIIb og VnR-alfa-subenheter (Suzuki et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:8614-8618 (1986)) ved matriksanalyse (George et al., PIR Report #REL-0286, National Biomedical Research Foundation (1986)) påviste to regioner med likhet hvis man tillater konservative substitusjoner. En region som omfatter omtrent 50 aminosyrerester, er lokalisert nær carboxylenden av de tunge kjeder. Den andre regionen er omtrent på 15 rester og lokalisert nær aminoenden i de lette kjeder og inkluderer cysteinrester som kan være involvert.i å danne disulfidbånd mellom de tunge og lette kjeder i begge proteiner. Evaluering av den statistiske signifikans av forholdet mellom sekvensen til GPIIb og VnR-alfa-subenheter med bruk av Relate-programmet som benytter mutasjonsdatamatriks, indikerer en liten sannsynlighet for å finne denne grad av likhet til stede i to sekvenser ved tilfeldighet (p<0,0001). Analyse av forholdet mellom sekvensen av GPIIb og FnR-alfa-subenheter (Argraves et al., J. Biol. Chem., 261:12922-12924 (1986)) indikerte en lignende liten sannsynlighet for å finne graden av likhet til stede i de to sekvenser ved tilfeldighet (P<0,0005).

En "computer search" avslørte ingen klare likheter mellom denne del av GPIIb og andre sekvenser til stede i NBRF-protein-databasen. I tillegg ble ingen signifikante identiteter oppdaget ved en direkte sammenligning med den publiserte, partielle sekvens for det neurale celleadhesjonsmolekyl, N-CAM.

5. Polypeptidsyntese

Basert på aminosyrerestsekvensen dedusert fra nucleotidsekvensen, ble polypeptider som korresponderte til de forskjellige GPIIb-regioner benyttet her, kjemisk syntetisert på en Applied Biosystems "Model 430A Peptide Synthesizer" ved bruk av den symmetriske anhydridmetoden til Hagenmaier et al., Hoppe-Seylers Z. Phisiol. Chem., 353:1973 (1982).

Aminosyrerestsekvensen til de syntetiserte polypeptider og deres lokalisering innen den deduserte aminosyrerestsekvens av GPIIb som vist i figur 1, er oppført i tabell 2.

6. Fremstilling av monoklonale_ antistoffpreparater

Monoklonale antistoffpreparater bestående av isolert immunoglobulin IgG (IgG), ble isolert fra ascitesvæske til en mus som inneholdt musenybridomcellelinj en PMI-1 (ATCC nr. HB 9476) ved hjelp av protein A-Sepharose typisk oppnådd fra Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) og brukt ifølge produsentens instruksjoner. Proteinkonsentrasjonen til det isolerte IgG ble bestemt ved å bruke Bio-Rad "Protein Assay Kit" (3io-Rad, Richmond, CA) ifølge produsentens instruksjoner.

For å lage et PMI-1 monoklonalt antistoffpreparat som inneholdt -'-25I-merkede antistoffmolekyler, ble 350 mikroliter (/ul) av PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M natriumfosfat, pH 7,09) inneholdende 1 milligram pr. milliliter (mg/ml) av den ovenfor isolerte PMI-1 IgG, blandet med 40 mikrogram (/ug) av kloramin-T og 1 milliCurie (mCi) av bærerfritt Na^^j (Amersham, Arlington Heights, IL). Den resulterende blanding ble holdt i 5 minutter i omkring 20°C og så blandet med 20 /ul av en 2 mg/ml natriumbisulfittløsning (2 mg/ml) og 20 /ul av en kaliumjodidløsning. Deretter ble 800 /ul av PBS som inneholdt 1% BSA, blandet til etterfulgt av en videre tilblanding av diisopropylfluorfosfat til en endelig konsentrasjon av 10 mM. Den resulterende blanding ble opprettholdt i 60 minutter ved 22°C og så dialysert mot PBS. Den spesifikke aktivitet til det resulterende <l>^I-merkede PMI-1 var omkring 4,5 mikroCurie (/uCi) pr. /ug.

Preparater som inneholdt Fab-fragmenter fra det ovenfor isolerte IgG, ble laget ved oppløsning med papain (200:1 vekt pr. vekt av IgG til papain) i 6 timer ved 37°C etterfulgt av fremgangsmåtene til Mage et al., Methods in Enzymology, 70:142-150 (1980). Ikke-oppløst IgG og Fc-fragment ble fjernet ved kromatografi på protein A-Sepharose. De resulterende Fab-fragmentholdige preparater var så klare for bruk, eller ble merket med <125>j etter behov, der man brukte de samme fremgangsmåter som beskrevet ovenfor for monoklonale antistoffpreparater.

Monoklonale antistoffpreparater ifølge foreliggende oppfinnelse som hadde forskjellig immunspesifisitet fra den til PMI-1, ble også fremstilt som beskrevet ovenfor for PMI-1. F.eks. ble slike blandinger fremstilt der man brukte musehybridomcellelinjen PMI-2 (ATCC nr. HB 9615).

7. ELISA- analyser

A. Polypeptid- ELISA

Antistoffmolekyler til stede i PMI-1 og Tab monoklonale antistoffpreparater, ble undersøkt for deres egenskap til å immunreagere med polypeptidene pl29-145 og pl44-156. (Tab er et ikke-relatert monoklonalt antistoff brukt som kontroll.) 50 mikroliter (/ul) av en dekkløsning (0,1 M NaHC03, pH 8,5, 0,1% NaN3) som inneholdt 20 /uM polypeptid, ble blandet i brønner av flatbunnede 96-brønns mikrotiterplater (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Platene ble oppbevart i 60 minutter ved 37°C for å tillate polypeptidet å adsorbere til veggene i brønnene. Dekkløsningen ble fjernet ved risting, brønnene ble renset to ganger med vaskebuffer (0,01 M Tris, pH 7,4, 0,05% Tween 20, 0,15 M NaCl, 200 mg/ml merthiolat) og 50 /ul av blokkerende løsning (5% bovint serumalbumin (BSA; vekt/volum) i dekkløsningen) ble blandet til hver brønn (fast støtte) for å blokkere ekstra proteinseter.

Brønnene ble holdt i 60 minutter ved omtrent 37°C, og så ble blokkeringsløsningen fjernet. Til hver brønn ble det tilsatt 50 /ul av en løsning som inneholdt (a) kanin-antipolypeptidantistoff preparert i eksempel 8 og fortynnet 1:200 i fortynningsbuffer (vaskebuffer som inneholdt 5 mM EDTA og 1 mg/ml BSA), (b) 1,5 nanomolar (nM), PMI-1 monoklonalt antistoff IgG preparert som beskrevet i eksempel 6, eller (c) TAB-hybridom ascitesvæske (tilveiebrakt av dr. R. McEver, University of Texas, San Antonio, TX) fortynnet 1:320.000 i fortynningsbuffer. De resulterende fast/væskefase-immunreaksjonsblandingene ble så holdt ved romtemperatur i 60 minutter for å tillate dannelse av et første fast fase-bundet immunreaksjonsprodukt mellom det fast fase-bundne polypeptid og tilsatte antistoffer. Den faste fase og væskefåsene ble så separert, brønnene ble renset to ganger med vaskebuffer, og overskudd væske ble fjernet ved risting.

50 /ul av en løsning som inneholder pepperrotperoxydase-merket geit-anti-muse-IgG (Tago Inc., Burlingame, CA), fortynnet 1:2000 i fortynningsbuffer, eller geit-anti-kanin-IgG (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA), fortynnet 1:2000 i fortynningsbuffer, ble satt til hver brønn for å gi en sekundær fast/væskefase-immunreaks j onsblanding (merkende immunreaksjonsblanding). Brønnene ble holdt i 50 minutter ved romtemperatur for å tillate dannelse av et sekundært immunreaksjonsprodukt mellom det merkede antistoff og ethvert fast fase-bundet antistoff i det første immunreaksjonsproduktet og så renset to ganger med vaskebuffer for å isolere den fast fase-bundne

markør som inneholdt immunreaksjonsproduktene. Overskudd væske ble så fjernet fra brønnene. 50 /ul av kromogen substratløsning som inneholder 0,4 mg/ml o-fenylendiamin og 0,012% (volum/volum) hydrogenperoxyd i CP-buffer (243 ml 0,1 M sitronsyre og 250 ml 0,2 M dibasisk natriumfosfat pr. liter H2O), ble så tilsatt hver brønn for å danne en fargeutviklende reaksjonsblanding. Den fargeutviklende reaksjonsblanding ble holdt i 10 minutter ved omkring 20°C, og 50 /ul av 2 N H2SO4 ble satt til hver brønn for å stoppe reaksjonen, og den resulterende løsning ble undersøkt for adsorpsjon ved 490 nanometer (nm) lysbølgelengde ved hjelp av modell 310 ELISA-plateleser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Resultatene fra denne studie vist i tabell 3, viser at monoklonalt antistoff PMI-1 immunreagerer med polypeptid pl29-145, men reagerer ikke med polypeptid pl44-156. Fordi PMI-1 som diskutert nedenfor, immunreagerer med en kryptisk determinant dannet ved (eksponert på) hGPIIb når GPIIb-IIIa binder fibrinogen, indikerer resultatene fra denne studie at pl29-145 har evnen til å etterligne hGPIIb kryptiske determinant.

BSA = bovint serumalbumin-dekkede brønner brukt som

negativ kontroll.

<2> Gjennomsnittlige optiske tetthetsverdier t standardavvik oppnådd fra målinger in triplo.

B. Konkurranse- ELISA

Polypeptider og isolerte GPIIb-IIIA ble undersøkt for deres evne til å konkurrere som antigen med fast fase-GPIIb-IIIa for immunreaksjon med antistoffmolekyler til stede i PMI-1 og Tab-monoklonale antistoffblandinger.

Konkurranse-ELISA ble utført som beskrevet i eksempel 7A, bortsett fra at 1) istedenfor polypeptid, GPIIb-IIIa, isolert som beskrevet i eksempel 1, ble det brukt i 20 /ug/ml i dekkløsning for å tildekke mikrotiter-platebrønnene, og 2) GPIIb-IIIa eller polypeptid ble tilsatt i en konsentrasjon av hhv. 0,73 /um eller 25/uM til brønnene umiddelbart før antistoffet ble tilsatt for å danne immun-reaks jonsblandingen.

Resultatene i denne studie vist i tabell 4, demonstrerer at mens pl29-145 og GPIIb-IIIa kompetitivt hemmer den immunologiske binding av PMI-l-antistoffmolekylene til fastfase-GPIIb-IIIa, gjør pl44-156 ikke det. I tillegg ble ingen av polypeptidene funnet å ha en signifikant effekt på funksjonen til Tab-antistoffmolekylene når det gjelder immunreaksjon med GPIIb-IIIa. Disse resultater indikerer at polypeptid pl29-145 har den egenskap at det kan etterligne den sekundære struktur og de antigene determinanter til hGPIIb-regionen som inneholder pl29-145-aminosyrerestsekvensen.

Gjennomsnittlige optiske tetthetsverdier standardavvik oppnådd fra målinger in triplo.

8. Fremstilling av anti- peptid- antisera Anti-peptid-antistoffer ble fremstilt ved

immunisering av kaniner med peptidene fremstilt i eksempel 5. Kobling av peptidene med glutaraldehyd til thyroglobulin som antigen bærer ("Bovine Type I", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ble utført som beskrevet av J. G. Dockray, Regulatory Peptides, 1:169-186 (1980), hvis referanse herved er inkorporert i referanselisten. Deretter ble immunisering utført som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at 400 /ug av thyroglobulin-koblet peptid ble brukt i den primære immunisering.

9. Hemning av antistoffbinding til plate-assosiert GPIIb ved polypeptider A. Platepreparering

Isolerte plater fremstilt som i eksempel IA, ble resuspendert i 2 ml calciumfri Tyrodes buffer (0,13 M NaCl, 0,0026 M KC1, 0,002 M MgCl2-6H20, 5 mM Hepes, 0,012 M NaHC03, pH 7,2) som inneholdt 1 mg/ml BSA og 1 mg/ml dextrose. Platesuspensjonen ble så satt på en Sepharose CL2B-kolonne (40 ml totalt gelvolum, Pharmacia Inc., Piscataway, N J) ekvilibrert med den samme Tyrodes buffer. Plater ble samlet fra voidvolumet av CL2B-kolonnen i et endelig volum på 4 til 5 ml, og ble betegnet vaskede plater, og suspensjoner av de resulterende vaskede plater ble tellet med en Coulter modell II-teller (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL). Hele plateprepareringsprosedyren ble utført i plastbeholdere og foregikk ved romtemperatur.

B. Platekonkurranseanalyse

Vaskede plater (2xl0<8>/ml) preparert i Tyrodes buffer som beskrevet i eksempel 9A, ble blandet med ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) slik at det ble laget en endelig konsentrasjon på 5 mM som ble inkubert i 30 minutter ved 37°C for å tillate utvikling av PMI-l-bindingsepitopen. Platene ble så blandet med polypeptid pl29-145 med de konsentrasjoner som er indikert i figur 2, og så videre tilsatt -<1-2>5I-merket PMI-1 preparert i eksempel 6, slik at det ga 1 /uM merket antistoff i den resulterende immunreaksjonsblanding. Blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 22°C for å tillate et immunreaksjonsprodukt å dannes. Deretter ble l^I-PMI-l/plate-immunreaksjonsproduktene isolert fra det ikke-bundne j_pMI_^ ved sentrifugering av hele løsningen gjennom 0,3 ml av 20% sucrose i en Beckman mikrofuge 3 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, GA) for å danne en platepellet. Mengden av radioaktivt <l>^I-PMI-l bundet til platepelleten, ble bestemt ved scintillasjons-spektrometri.

Resultatene i denne studie vist i figur 2, demonstrerer at polypeptid pl29-145 kan kompetitivt hemme bindingen av PMI-l-antistoffmolekylene, til platemembranassosiert GPIIb i fravær av divalente kationer. Figur 2 indikerer også at den omtrentlige kd av pl29-145/PMI-l-interaksjon er 1,2 /uM fordi 50% hemning ble oppnådd ved 1,6 /uM polypeptidkonsentrasjon når antistoffmolekylene var til stede i en konsentrasjon av 1 /uM.

10. Ekspresjon av hGPIIb kryptisk determinant

ved fibrinogenbundne plater

Platerikt plasma (PRP) ble fremstilt som beskrevet i eksempel la, og delt i 3 prøver. I en prøve ble platene stimulert til å uttrykke funksjonelt GPIIb-IIIa (fibrino-genreseptorer) etter tilsetning av adenosindifosfat (ADP) til 50 /uM endelig konsentrasjon for å produsere ADP-stimulerte plater. I den andre prøve ble GPIIb-IIIa-ekspresjon stimulert ved tilsetning av adrenalin til 50 /uM endelig konsentrasjon. I begge tilfeller bandt GPIIb-IIIa-fibrinogenreseptorer uttrykt på de stimulerte platene, fibrinogen til stede i plasmaet og dannet fibrinogenbundne plater. Som en negativ kontroll mottok den tredje prøve av PRP ingen stimulering og dannet derved ikke-stimulerte plater.

■'•<2>^1-merket PMI-1 Fab-fragmenter preparert ved vanlige teknikker fra 2 -merkede antistoffer beskrevet i eksempel 6, ble så tilsatt i en endelig konsentrasjon av 0,8 /uM til hver av PRP-prøvene. Immunreaksjonsblandingene som således ble dannet, ble inkubert ved 37°C i 30 minutter for å tillate dannelse av merkede immunreaksjonsprodukter, f.eks. fibrinogenbundne plater/<l>^i-PMi-i-komplekser• De markørholdige immunreaksjonsprodukter ble så separert fra ubundet ^<2>^I-PMI-1 ved sentrifugering av platene gjennom et sucroselag som beskrevet i eksempel 9B.

Figur 3 illustrerer resultatene av denne studie og demonstrerer at PMI-l-antistoffmolekylene immunreagerer med stimulerte, fibrinogenbundne plater, men reagerer ikke nevneverdig med ikke-stimulerte plater. Det er en oppfatning at -^^I-PMI-1 observert som "bundet" i den ikke-stimulerte PRP-prøve, skyldtes ikke-spesifikk binding ("tilklebing") og/eller nærværet av et naturlig bakgrunns-nivå av stimulerte, fibrinogenbundne plater eller plater stimulert og bundet som et resultat av håndtering. Disse resultatene indikerer derfor at binding av fibrinogen, en arg-gly-asp (RGD)-aminosyrerestsekvensholdig ligand ved GPIIb-IIIa-cytoadhesin, resulterer i ekspresjon av en ellers kryptisk antigendeterminant. Således kan PMI-1-antistoffmolekyler og antistoffmolekyler av lignende immunspesifisitet bli brukt for å måle tilstedeværelse og mengde av stimulerte, fibrinogenbundne plater i væskeprøve

fra blod.

11. Hemning av plateaggregering med polypeptider

200 /ul av platerikt plasma (PRP) fremstilt som beskrevet i eksempel IA, ble blandet med 190 /ul Tyrodes buffer som inneholdt BSA og dextrose (hver i 1 mg/ml), og forskjellige mengder polypeptider pl29-145 eller pl44-156 som indikert i figur 4. 10 /ul ADP (80 /uM i Tyrodes buffer) ble tilsatt for å stimulere plateaggregering. Blandingen ble inkubert ved 37°C mens forandring i lystransmisjon i blandingen ble avlest med tiden ved hjelp av et "Dual Sample Aggregation Meter" (modell DP-247E, Sienco Inc., Morriston, CO).

Aggregeringsmeteret var kalibrert ved hjelp av en løsning som inneholdt 200 /ul PRP og 200 /ul Tyrodes buffer for å sette en lav basallinje av lystransmisjon på 5% for kontrollaggregeringer og ved 10% for aggregeringer i nærvær av polypeptidene. Den øvre grense på 100% lystransmisjon ble ensartet satt ved å bruke en blanding av 100 /ul PRP og 300 /ul Tyrodes buffer.

12. Immunreaksjon av GPIIb- lettkjede ved bruk av

anti- peptid- antisera

Omkring en milliard plater fremstilt som i eksempel IA, ble resuspendert i 1 ml av kaldt (dvs. 4°C) PBS og blandet med 200 /ug av lactoperoxydase (Sigma) og 2 mCi av bærerfritt Na^<25>I (16 mCi//ug, Amersham, Arlington Heights, IL) for å danne en platemerket suspensjon. Peroxyd ble så blandet til denne suspensjon i to 5 /ul tilsetninger fra en 0,06% stamløsning ved 5 minutters intervaller og opprettholdt gjennom en 4°C inkubasjon for å tillate at merkingsreaksjonen skal skje. Deretter ble reaksjonen stoppet ved å sette til 200 /ug tyrosin og vasket fem ganger ved hjelp av gjentatte sentrifugeringer på 1200xg i 15 minutter etterfulgt av resuspensjon i kaldt PBS for å lage en merket platesuspensjon. Etter det femte sentrifuger-ingstrinn ble de merkede platene lysert ved resuspensjon i 40 ml lysisbuffer (0,5% Triton X-100 (volum/volum), 10 mM EDTA, 10 /ug/ml benzamidin og 100 enheter/ml Trasylol, alle

fra Sigma) for å danne et merket platelysat.

1 ml merket platelysat ble blandet med 15 /ul av varme-inaktivert, normalt kaninserum (NRS) og inkubert i 30 minutter ved 22°C etterfulgt av videre tilsetning av 100 /ul av 10% (volum/volum) løsning av Pansorbin (Behring Diagnostics, La Jolla, CA) fremstilt i immunreaksjonsbuffer (IPB: 0,02 M Tris-Cl, pH 7,4, 0,156 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM benzamidin-HCl, 10 /ug/ml soyabønnetrypsininhibitor, 0,2 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 1% (volum/volum) Triton X-100/ 0,05% (volum/volum) Tween 20, 0,02% (vekt/volum) NaNj, 5 enheter/ml Trasylol; alle fra Sigma) og sentrifugering i 1 minutt i en Beckman mikrofuge B og isolering av den resulterende supernatant for å danne et klart lysat. Denne oppklaringsfremgangsmåten ved å blande NRS, inkubasjon, tilsetning av Pansorbin og sentrifugering ble gjentatt to ganger og så etterfulgt av de samme fremgangsmåter igjen ved å bruke Pansorbin, men utelate NRS og inkubasjonstrinnene for å danne et klart lysat for tredje gang.

Det tre ganger behandlede og klare lysat ble så blandet med 250 /ul av IPB, 4 /ul av anti-polypeptid-pl44-156-antiserum fremstilt i eksempel 8, anti-GPIIb-IIIa fremstilt i eksempel 2, eller MRS og bovint serumalbumin (BSA) til en endelig konsentrasjon av 1% BSA i den endelige blanding. Den resulterende blanding ble så inkubert ved 4°C i 12-18 timer og videre tilsatt 100 /ul av 10% Pansorbin og så inkubert i 1 time ved 22°C. Deretter ble blandingen sentrifugert i en mikrofuge B i ett minutt, og den resulterende pellet ble isolert. Den isolerte pellet ble så vasket to ganger i IPB, én gang i 0,5 M LiCl og en gang igjen i IPB hvori vaskingen inkluderer resuspensjon i omtrent 1 ml av den beskrevne buffer etterfulgt av sentrifugering i 1 minutt i en mikrofuge B og isolering av den resulterende pellet.

De vaskede pelletene ble så solubilisert for å frigjøre ethvert immunkompleks som er til stede ved oppvarm-ing i 3 minutter til 100°C i omkring 100 ml av prøvebuffer beskrevet av Laemmli. Se f.eks. Laemmli, U.K., Nature (London), 227:680-685 (1970). Solubiliserte immunkomplekser ble så sentrifugert i 1 minutt i en mikrofuge B, og den resulterende supernatant som inneholdt immunpresipiterte proteiner, ble analysert ved elektroforese i en 15% polyacrylamid-slabgel med bruk _av Laemmli-buffere som inneholdt 5% 2-mercaptoethanol. Deretter ble gelene tørret, og proteinene som var til stede, ble visualisert ved autoradiografisk eksponering til Kodak X-Omat AR-film (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.). Molekylvektene til de resulterende, visualiserte proteiner ble vurdert på basis av den elektroforetiske mobilitet relativ til -*-4C-merkede proteinstandarder som varierte mellom 12.300 og 97.400 dalton i molekylvekt (New England Nuclear, Boston, MA).

Merkede lysater analysert på denne måte, ga et protein som kom til syne på gelene og hadde en molekylvekt på omtrent 20 kda som korresponderer til GPIIb lett kjedeprotein (lGPIIb), når anti-polypeptid pl44-156-antiserum ble brukt og som ble ikke oppdaget i nevneverdig grad når polyklonalt anti-GPIIb-IIIa-antiserum eller NRS ble brukt. Derfor kan anti-polypeptid pl44-156-antiserum og antistoffblandinger av lignende immunspesifisitet bli brukt til å oppdage lGPIIb.

13. Ekspresjon av GPIIb- IIIa kryptiske antigendeterminanter ved ligandbinding A. Analyse for antistoffbinding til plater som uttrykker kryptiske antigendeterminanter i blanding

Vaskede plater ble fremstilt til en konsentrasjon av 1x10° Q pr. ml som beskrevet i eksempel 9A, bortsett fra at Tyrodes buffer som ble benyttet, først var behandlet med tilsetning av Chelex 100 (200-400 mesh natriumform, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) for å kompleksbinde ethvert divalent kation som er til stede i Tyrodes buffer og filtrert for å fjerne de kompleksbundne, divalente kationer fra bufferen.

Den ovenfor fremstilte, vaskede plateholdige løsning ble delt opp i prøver, og platene i hver prøve ble så enten stimulert ved tilblanding med ADP til en 50 /uM endelig konsentrasjon for å danne ADP-stimulerte plater eller ble ikke stimulert.

Monoklonale antistoffblandinger som inneholdt enten <l>^I-merkede helantistoffmolekyler eller -^^I-merkede Fab-fragmenter, fremstilt som beskrevet i eksempel 6, ble tilsatt først med forskjellige polypeptider og enten divalente kationer eller EDTA. De -^^I-merkede anti-off/peptidblandingene ble så blandet med enten stimulerte eller ikke-stimulerte plateprøver slik at antistoffet eller Fab-fragmentene var til stede i en konsentrasjon på omkring 0,8 /uM. De resulterende immunreaksjonsblandinger ble så inkubert i 30 minutter ved 37°C for å tillate ekspresjon av den kryptiske antigene determinant og for å tillate dannelsen av -'-<2>5I-merkede immunreaksjonsprodukter, f.eks. ligand-bundet plate/^^I-antistoff eller -^^I-Fab-fragment-komplekser. De merkede immunreaksjonsprodukter ble så separert fra ikke-bundet -^^i-merket antistoff eller Fab-fragment ved sentrifugering av plateprøven gjennom en sucrosepute som beskrevet i eksempel 9B.

Tabell 5 viser resultatene av måling av merket antistoffbinding til plater i nærvær av ligander ved bruk av monoklonalt antistoff PMI-1.

Økninger i mengde av PMI-l-bundet er uttrykt som molekyler av PMI-l-bundet pr. plate £ standardavvik hvor økningen er mengde bundet i nærvær av ligand minus mengde bundet i fravær av ligand, men i nærvær av 2 mM CaCl2 og 1 mM MgC^. Mengden bundet i nærvær av divalente kationer, men uten ligand for ikke-stimulerte eller stimulerte plater, var hhv. 6769<+>84 eller 6643±157 molekyler/plate for PMI-1 IgG, og var 3917±212 eller 3785±150 molekyler/plate for PMI-1 Fab.

<2>Ligand som ble benyttet, var et av de indikerte polypeptidene, syntetisert som beskrevet i eksempel 5 og tilsatt til en endelig konsentrasjon av 1 mM i immunreaksjonsblandingen beskrevet i eksempel 13A, eller var kontroll-peptidet H-12 som har aminosyresekvensen HHLGGAKOAGDV og stammet fra fibrinogen-gammakjeden innen restene 399-410, også i 1 mM, eller var 4,5 mM EDTA tilsatt i fravær av ligand-polypeptid som en kontroll. I alle tilfeller hvor EDTA ikke var inkludert, var 2 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2 inkludert.

<3> Ikke bestemt.

Tabell 6 viser resultatene når det gjelder å studere antistoffbinding til plater i nærvær av ligander der det brukes en monoklonal antistoffblanding som inneholder hele antistoffmolekyler eller Fab-fragmenter produsert ved hybridom PMI-2 (f.eks. et PMI-2 monoklonalt antistoff).

Mengde PMI-2 IgG-bundet ble bestemt som beskrevet i eksempel 13A og er uttrykt som molekyler av PMI-2-bundet pr. plate under de indikerte immunreaksjonsbetingelser.. <2>Ligand som ble benyttet, var et av de indikerte polypeptider, fremstilt som beskrevet i eksempel 5 og tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 mM, eller var et polypeptid som hadde en sekvens korresponderende til sekvensen i fibrinogen-gammakjeden fra resten i posisjon 400 til resten i posisjon 411 (400-411) også tilsatt til 0,5 mM, fibrinogenprotein (Fg)isolert som beskrevet av Marguerie et al., J. Biol. Chem., 254:5357-5363 (1979) og benyttet i en endelig konsentrasjon på 15 /uM, eller ingen tilsatt ligand ble benyttet som kontroll. <3> Divalent kation var enten 1 mM CaCl2 eller 5 mM EDTA.

Resultatene vist i tabell 5 og 6, viser kapasiteten til fibrinogen (Fg), det Fg-deriverte peptid, 400-411, og RGD-holdige peptider til å binde GPIIb-IIIa og forårsake eksponering av kryptiske antigendeterminanter som gjenkjennes av enten PMI-1 eller PMI-2, under forhold hvor disse antigene determinanter normalt er supprimert, nemlig i nærvar av fysiologiske konsentrasjoner av CaC^.

Resultatene viser også at den kryptiske antigene determinant gjenkjent av PMI-2, bare er induserbar ved ligandbinding med stimulerte, men ikke med ikke-stimulerte plater. I motsetning kan den kryptiske antigene determinant som gjenkjennes av PMI-1, induseres etter polypeptid-ligandbinding til både stimulerte eller ikke-stimulerte plater.

Videre indikerer også resultatene den strukturelle spesifisiteten til ligand for GPIIb-IIIa. Et revers-peptid, SDGR, induserer ikke den antigene determinant som gjenkjennes av PMI-2, og en konservativ substitusjon som bytter ut en glutaminsyre (E) istedenfor den normalt forefinnende asparaginsyrerest (D), resulterer i et peptid som er betraktelig mindre effektivt som kryptisk antigendeterminant-induserende ligand.

Når konsentrasjonen av polypeptidliganden, RGDS, ble variert i den ovenfor beskrevne analyse for antistoffbinding til plater, oppnådde man en doseresponskurve for ligandinduksjon av kryptiske antigene determinanter til stede på enten stimulerte eller ikke-stimulerte plater. Resultater fra en doseresponskurve er vist i figur 5 der det brukes enten PMI-1 eller PMI-2 IgG for å oppdage den kryptiske antigene determinant, og resultatene uttrykkes som prosent av LIBS-induksjon. Mengden av IgG bundet i nærvær av polypeptid, ble uttrykt som en prosentdel av den maksimale mengde av IgG bundet ved komplett ligandindusert bindings-sted (LIBS)-induksjon, hvor IgG-binding ble målt som molekyler IgG pr. plate i nærvær av 4,5 mM EDTA, og i fravær av peptider, var vurdert som 100% induksjon, og IgG-binding, i nærvær av 2 mM CaC^ og 1 mM MgCl2 og i fravær av peptider, var vurdert å være 0% induksjon.

Resultatene vist i figur 5, indikerer at polypeptidliganden induserer to distinkte kryptiske antigendeterminanter ved tilsvarende halv-rnaksimale ligandkon-sentrasjoner på omtrent 2 mM. I tillegg viser resultatene at mens determinanten gjenkjent av PMMI-2 var induserbar på stimulerte, men ikke på ikke-stimulerte plater, var den kryptiske antigene determinant gjenkjent av PMI-1, induserbar på både stimulerte og ikke-stimulerte plater når RGDS-polypeptidet ble brukt.

Det burde bemerkes at mens både PMI-1- og PMI-2-monoklonale antistoffer er anti-LIBS-monoklonale antistoffer, kan spesifisitetene til disse to antistoffene skilles. Når en reseptor har bundet en ligand, kan dette således føre til induksjon av mer enn én LIBS. Som et resultat kan metodene i foreliggende oppfinnelse bli brukt til å produsere mer enn én distinkt monoklonal antistoffart som immunreagerer med et celleoverflatereseptor-ligandkompleks.

B. Analyse for antistoffbinding til løselig renset GPIIb- IIIa som uttrykker kryptiske antigene determinanter

Egenskapen til forskjellige polypeptidligander til å indusere ekspresjon av en kryptisk antigendeterminant ble studert ved bruk av løselig isolert GPIIb-IIIa.

For det formål ble konkurranse-ELISA benyttet som beskrevet i eksempel 7B, med de følgende unntak.

Mikrotiterplater ble dekket med bruk av en dekkløsning som inneholdt GPIIb-IIIa, isolert som beskrevet i eksempel 1, i en konsentrasjon av 10 /ug pr. ml. Etter blokkeringen ble alle løsninger som ble benyttet, behandlet med Chelex 100 først, som beskrevet for Tyrodes_buffer i eksempel 13A. Immunreaksjonsblandinger ble fremstilt som inneholdt (1) 1,5 nanomolar PMI-1 IgG laget som beskrevet i eksempel 5, eller Tab-hybridom, som beskrevet i eksempel 7A, (2) 2 mM CaCl2/ (3) GPIIb-IIIa, isolert som beskrevet i eksempel 1, og tilsatt i en endelig konsentrasjon av 40 /ug/ml for PMI-l-analysen og i 4 /ug/ml for Tab-analysen, og (4) polypeptid i 1 mM. Immunreaksjonsblandingene ble inkubert ved 22°C i 16-20 timer for å tillate dannelse av et første fast fase-bundet immunreaksjonsprodukt mellom den fast fase-bundne GPIIb-IIIa og de tilblandede antistoffer.

Resultatene av de ovenfor nevnte studier er vist i tabell 7 nedenfor.

<1> Den prosentvise ekspresjon er et mål på den kryptiske antigene determinant til stede på GPIIb-IIIa indusert ved polypeptid-ligandbinding. Resultatene er presentert som prosentdel av den maksimale determinantekspresjon som kan oppnås ved bruk av GPIIb-IIIa i nærvær av 5 mM EDTA. Antall målinger som ble gjort under hver beting-else, er indikert i parentes, og resultatene er gjennom-snitt i standarddeviasjon av målingene.

^ Liganden tilsatt var et polypeptid, syntetisert som beskrevet i eksempel 5, hvis sekvens er indikert ved enkeltbokstavkoder som vist. "Kontroll" betyr at ikke noe polypeptid ble tilsatt.

Resultatene i tabell 7 viser at RGD-holdige polypeptidligander induserer ekspresjon av en kryptisk antigendeterminant på GPIIb-IIIa på en måte som er analog med den som observeres ved bruk av ..intakte plater (se f.eks. eksempel 6). Spesifisiteten til den ligandinduserte ekspresjon ble bekreftet ved bruk av polypeptider som hadde omsnudde sekvenser (SDGR) eller konservative substitusjoner (GRGESP), og ble videre bekreftet ved observasjonen at det var ingen signifikant innflytelse av liganden med hensyn til Tab monoklonal antistoffbinding. Disse resultatene indikerer at ligandindusert ekspresjon av den kryptiske antigene determinant som gjenkjennes ved monoklonalt antistoff PMI-1, er en iboende egenskap til GPIIb-IIIa, og ikke avhengig av GPIIb-IIIa-assosiasjon med plater.

Claims

1. hGPIIb kryptisk determinant polypeptidanalog, karakterisert ved at den omfatter ikke mer enn 25 aminosyrerester og inkluderer en aminosyrerestsekvens som korresponderer til sekvensen representert ved formelen: -PSPSPIHPAHHKRDRRQ-, og har en evne til å nøytralisere (kompetitivt hemme) bindingen av antistoffer ifølge krav 3 med hGPIIb når hGPIIb er til stede som et GPIIb-IIIa-fibrinogen-kompleks, samt en evne til kompetitivt å hemme aggregering av fibrinogenbundne blodplater ln vltro.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polypeptid er en aminosyrerestsekvens representert ved formelen: PSPSPIHPAHHKRDRRQ.

3. Antistoff, karakterisert ved at det: a) binder til et polypeptid representert ved formelen: PSPSPIHPAHHKRDRRQ (pl29-145), men hovedsakelig ikke til et polypeptid med formelen REQNSLDSWGPK (p53-64), eller b) binder platemembranassosiert GPIIb, eller c) binder fibrinogenreseptorkompleks (GPIIb-IIIa) på stimulerte, fibrinogenbundne blodplater.

4. Antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

5. Hybridom, kalt PMI-1, karakterisert ved at det produserer antistoffer ifølge kravene 3-4, og er deponert ved ATCC under nr. HB 9476.

6. Hybridom, kalt PMI-2, karakterisert ved at det produserer antistoffer ifølge kravene 3-4, og er deponert ved ATCC under nr.

7. Diagnostisk system i settform for ln vitro-analysering med hensyn på tilstedeværelsen av et GPIIb-IIIa-ligandkompleks i en blodvæskeprøve, der nevnte kompleks inneholder celleoverflatereseptoren GPIIb-IIIa og en ligand som er spesifikt bundet, karakterisert ved: en pakke som inneholder, i en mengde tilstrekkelig til å utføre i det minste én analyse, et monoklonalt antistoff ifølge krav 4 som immunreagerer med nevnte GPIIb-IIIa-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med GPIIb-IIIa eller liganden når disse er i en ikke-bundet form.

8. Diagnostisk system ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffmolekylene er produsert av PMI-1 (ATCC HB 9476) eller PMI-2 (ATCC HB 9615).

9. Diagnostisk system ifølge hvilket som helst av krav 7 eller 8, karakterisert ved at antistoffmolekylene er bundet til et radionuklid som et indikatorsystem.

10. Anvendelse av antistoffene ifølge krav 3 for å måle tilstedeværelsen av et GBIIb-IIIa-ligandkompleks i en blod-væskeprøve .

11. Anvendelse av antistoffene ifølge krav 3 for å måle en blodplateholdig blodvæskeprøve med hensyn på nærværet av plater som uttrykker et GPIIb-IIIa-ligandkompleks.