CN113264995A - 一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用，同时提供了8株与相应的抗原表位肽特异性结合的抗人血小板GPIbα的杂交瘤细胞株。本发明通过ELISA方法检测所得8株单克隆抗体均具有较高的效价，同时经流式细胞术以及Western blot鉴定8株单克隆抗体对人血小板GPIbα均为特异性识别。其中7株细胞株所得到的抗体能够抑制血小板聚集，具有抗血栓药用前景，同时能够抑制肿瘤转移，从而为抗肿瘤转移药物的研制奠定基础，同时能够清除血小板，对血小板增多症的治疗具有一定价值。因此，本发明制得的抗人血小板GPIbα单克隆抗体为抗血栓、抗肿瘤转移和抗血小板增多症药物的研制奠定基础。

Description

一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用。
背景技术
血小板是由骨髓中造血干细胞分化成熟的巨核细胞发生膜凹陷后所产生的一种无细胞核的细胞碎片，在生物机体的血栓与止血功能中发挥重要作用，主要参与生理性止血与和病理性凝血过程来维持血液的正常流动。血小板膜表面存在多种糖蛋白(glycoprotein，GP)，例如血小板膜糖蛋白αⅡbβ3复合物，整联蛋白α2β1复合物，GPIbⅤ/Ⅸ复合物等，它们在血小板发挥功能时起重要作用。GPIbⅤ/Ⅸ复合物由GPIbα，GPIbβ，GPV和GPIX四个跨膜糖蛋白组成，它们都包括三个区域即胞浆、跨膜和胞外部分，GPIbα蛋白在GPIbⅤ/Ⅸ复合物中从结构上看是分子量最大的部分，同时从功能来看也是最重要的亚单位，它在与血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)、凝血酶等结合过程中发挥作用，是多个配体的结合位点。当vWF与GPIbα作用时会因为互相激活使构象发生变化，这一变化会增加血小板在流动状态以及高剪切力作用下的黏附并最终形成血栓。
血小板膜糖蛋白GPIbα的重要作用不仅体现在血栓与止血方面，它对炎症与肿瘤转移[19]也有很大的影响，血小板可通过膜糖蛋白GPIbα与白细胞表面的Mac-1进行相互作用，并将白细胞募集到炎症发生位置。
现有技术已经公开了SZ2以及AN51都是抗人血小板GPIbα的单克隆抗体，如今它们在血小板相关工作中被广泛使用。目前已研发如SZ2、AN51、AK2、HIP1、VM16d、VM23等多种抗人血小板GPIbα单克隆抗体，但它们与GPIbα的结合位点却各不相同，而不同的结合位点对于GPIbα的深入研究具有重要意义。因此我们以人血小板作为免疫原，使GPIbα保持天然状态下进行免疫，期望筛选到与之前研究以及拮抗位点不同的抗GPIbα单克隆抗体，该单克隆抗体可能会为血小板功能和信号研究提供新的工具，同时也为血小板的进一步研究提供一定的价值。
发明内容
为了实现上述目的，本发明的目的在于提供一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用，通过该抗原表位肽制备的抗体可用于抗血栓以及治疗血小板增多症，同时可抑制肿瘤转移。没有功能的抗体可作为标记蛋白使用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示。
进一步的，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的全长序列，或包括这些氨基酸序列任意长度的多肽。
一种融合蛋白，所述融合蛋白包含有本发明所述的抗原表位肽和任选的标签序列。
一种抗体，所述抗体特异性的结合本发明所述的抗原表位肽，并且所述抗体能够特异性地结合天然的血小板GPIbα蛋白，所述抗原表位肽的氨基酸序列SEQ ID NO:1-8分别对应的抗体命名为1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5、10H4。
进一步的，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。
一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明所述的抗原表位肽、本发明所述的包括这些抗原表位肽氨基酸序列任意长度的多肽、本发明所述的融合蛋白或本发明所述的抗体。
一种表达载体，所述表达载体含有本发明所述的核苷酸序列。
一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明所述的表达载体。
本发明所述的抗原表位肽、所述的融合蛋白、所述的核苷酸序列、所述的表达载体或者所述的宿主细胞在制备抗人血小板GPIbα抗体的用途。
进一步的，当抗体为1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5时，其在抗血栓以及其在抗肿瘤转移方面的用途，以及其在治疗血小板增多症方面的用途。
进一步的，当抗体为10H4时，其作为标记蛋白的用途。
有益效果：本发明提供了一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用，并获得了8株与相应的抗原表位肽特异性结合的抗人血小板GPIbα的杂交瘤细胞株，分别命名为：1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5、10H4；本发明通过ELISA方法检测所得8株单克隆抗体均具有较高的效价，同时经流式细胞术以及Western blot鉴定8株单克隆抗体对人血小板GPIbα均为特异性识别。
血小板聚集实验证明8株单克隆抗体单抗对于抑制thrombin和ADP所诱导的聚集无明显作用，并且除了10H4以外的7株单抗1D5、4B7、6F3、9C9、6F3’、8C6和9E5都能在一定程度上抑制ristocetin诱导的血小板聚集，而对于抑制U46619和collagen诱导的聚集效果各不相同。同时，本发明所制得的抗体能够清除血小板，从而对血小板增多症的治疗具有一定的作用，除10H4以外的7株单抗也能够抑制肿瘤转移，从而为抗肿瘤转移药物的研制提供可能。10H4虽然不影响血小板的功能，然而，其可以作为标记蛋白进行使用，并且不干扰实验效果。
因此，本发明制得的抗人血小板GPIbα单克隆抗体为血小板的进一步研究以及临床诊断和治疗应用提供一定的价值。
附图说明
图1为流式细胞术检测单克隆抗体与人的血小板结合的结果图。
图2为流式细胞术检测单克隆抗体与GPIbα人源化基因敲除小鼠的血小板结合的结果图。
图3为Western blot分析单克隆抗体与人血小板结合的特异性分析图。
图4为单抗抑制ristocetin诱导的聚集统计图。
图5为单抗抑制thrombin诱导的聚集结果图。
图6为单抗抑制ADP诱导的聚集结果图。
图7为单抗抑制U46619诱导的聚集结果图。
图8为单抗抑制collagen诱导的聚集结果图。
图9为抗体对血小板清除结果图。
图10为抗体抑制肿瘤转移的结果图。
图11为抗体对LLC细胞皮下荷瘤自发转移模型治疗的结果图。
图12为使用ELISA鉴定抗原表位肽与抗体亲和结合的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1制备抗人血小板GPIbα抗体
(1)洗涤血小板制备抗原
在室温(22℃左右)条件下，采集健康志愿者的静脉血，男、女性各一名，分别洗涤血小板。以7：1的比例将全血与ACD抗凝剂混合，缓慢上下颠倒混匀。将混匀后的血液转移到离心管，通过离心轻轻吸出分层中的上清即为富血小板血浆(Platelet rich plasma，PRP)，将PRP按每个EP管一毫升分装，加入PGI2防止血小板活化。然后离心弃上清液，加入1mLCGS缓冲液(PGI2终浓度10ng/mL，37℃预热)重悬后，再次离心弃上清液，用CGS缓冲液重复洗一次后加入适量生理盐水(37℃预热)重悬血小板并调整浓度至1×108/mL，室温静置半小时后将男、女性血小板按1:1混合。
(2)小鼠免疫及细胞融合
用6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，一只小鼠每次注射混合血小板悬液0.2mL。前两次免疫进行腹腔注射，间隔28天，第3次免疫进行静脉注射，间隔14天。每次免疫前进行眼眶静脉采血通过ELISA法测定其血清效价再进行下一次免疫，最终一次免疫后的第四天开始进行细胞融合。
将免疫结束的小鼠眼球摘除并尽量使血流尽，当血流尽后脱颈，将小鼠冲洗干净放入75％的乙醇中浸泡一会。浸泡后的小鼠放入超净台并固定，打开腹腔取出脾脏并尽量分离成单个细胞，在PEG条件下与SP2/0细胞进行融合。用HAT选择性培养基培养融合后的细胞，将细胞吹匀后以100μL/孔的量加入96孔培养板中，使每个孔大约都有单个细胞，将96孔板放入培养箱中培养，培养箱环境为37℃，5％CO2。培养十天左右细胞开始成簇出现，吸取上清用间接ELISA法进行检测，根据结果将阳性单克隆挑出并在24孔培养板上接种扩大培养。待24孔培养板里的细胞克隆出现(约一周左右)再进行ELISA筛选，并以有限稀释法进行下一次亚克隆直到筛选出高效价的单克隆细胞株。半量更换上述HAT选培，逐步换成HT培养基，半量更换为20％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，逐步换成普通培养基。最终分别置液氮冻存或制备腹水。
(3)ELISA法进行筛选
将洗涤好的血小板加入聚乙烯酶联板中，100μL/孔，室温静置2小时；PBS缓冲液洗涤三次，加入200μL/孔的1％BSA/PBS于4℃静置封闭过夜；第二天取出酶标板，按100μL/孔的量加入待测上清，空白对照为封闭液，阴性对照为mouseIgG，阳性对照为mAbSZ2，室温孵育2小时；PBS缓冲液洗涤六次后加入100μL/孔的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，室温孵育1小时；同上洗六次，加入TMB显色液100μL/孔，37℃温育10分钟；加入2.5M硫酸终止反应，50μL/孔，在酶标检测仪上测定405nm波长时的OD值。
GPIbα蛋白用PBS稀释至1μg/mL，以100μL/孔的量加入酶联板中，室温静置2小时后按照包被血小板的酶标板的方法进行同样操作。
(4)制备并纯化腹水
待细胞状态佳且数量足够时取出部分制备腹水，另一部分冻存。取8周左右的Balb/c小鼠按常规方法用于腹水的制备。收集到的腹水离心使油脂等杂质成分被去除，取适量采用ProteinG免疫亲和层析法纯化抗体，分装于-80℃保存。
实施例2单抗性能的鉴定
(1)单抗的特异性鉴定
酶联免疫吸附试验：分别用人的洗涤血小板固定后包板以及GPIbα蛋白包板，室温静置2小时后，洗板并封闭过夜。将抗体进行倍比稀释，次日在酶联板中每孔加入100μL的待测抗体，实验对照的设置以及具体实验操作同ELISA法筛选单克隆杂交瘤细胞。
流式细胞术：a.与人血小板的结合：用ACD抗凝正常人新鲜静脉全血，离心得到PRP，PRP离心弃上清后用CGS缓冲液洗涤血小板一次，再用MTB重悬底部沉淀并调整其终浓度至3×108/mL，加入钙、镁离子后放于室温静置2h。取出血小板，加入10μg/mL的抗体，IgG作为阴性对照，SZ2作为阳性对照，血小板与抗体孵育2h使其充分结合后用PBS缓冲液洗涤一次，再与FITC标记的山羊抗小鼠IgG室温避光条件下孵育1h，用PBS缓冲液将体系增加到400μL后用流式细胞仪进行检测。b.与hGPIbα小鼠血小板的结合：分别从GPIbα人源化小鼠以及对照的野生型小鼠眼眶静脉取血，以1:7的ACD抗凝，生理盐水1:1稀释。1100r离心11min，取出PRP。用CGS缓冲液洗血小板两次，用MTB调整至最终浓度3×108/mL，加入钙离子和镁离子，室温静置2h。加入10μg/mL的抗体，阴性对照为IgG，阳性对照管为SZ2，室温下充分反应2h。PBS洗涤1次，加入荧光标记的GAM-IgG，室温避光条件下反应1h，每管加入400μL的PBS缓冲液，用流式细胞仪检测。
Western blot：洗涤血小板中加入细胞裂解液混合均匀后放置在冰上裂解30分钟，每间隔五分钟取出样品用涡旋振荡器振荡10秒使裂解更加充分，裂解后加入loadingbuffer，混合均匀后用金属浴100℃加热5分钟，待蛋白样品冷却后上样。使用5％浓缩胶和12％分离胶配制聚丙烯酰胺凝胶，胶上每孔加入20μL制备好的蛋白样品以及10μL蛋白marker跑电泳，将电泳后的凝胶取出转到PVDF膜上，结束后取出膜放入封闭液中室温环境下封闭1小时，封闭结束将膜放入封闭液配制的单克隆抗体溶液中，在摇床上4℃孵育过夜使其充分结合。最后经辣根过氧化物标记的GAM-IgG二抗孵育，放入显影盒中，将配制好的ECL发光液滴加到膜上直至将膜覆盖，接下来在暗室中进行显影。
(2)血小板聚集实验
比浊法在聚集仪上分别测定单克隆抗体抑制ristocetin、thrombin、ADP、U46619、collagen诱导的聚集，诱导剂分别为ristocetin、thrombin、ADP、U46619、collagen。采集健康人全血并以枸橼酸钠抗凝，200g离心11min分离出PRP，剩下的部分继续离心得到PPP，并用PPP调整PRP中血小板的浓度至3×108/mL，室温静置1小时。用常规方法进行洗涤得到浓度为3×108/mL的洗涤血小板，并于室温静置。提前30min打开聚集仪电源开关，使得机器温度预热至37℃。打开聚集仪检测仓的盖子，取250μL抗体孵育5min后的血小板或PRP于聚集管中并加入转子，以250μL的MTB缓冲液或PPP作为对照。调整好基准线后分别加入血小板诱导剂：ristocetin、U46619、Thrombin、Collagen以及ADP于聚集管中，在剪切力条件下诱导血小板聚集，观测血小板聚集情况，8min左右停止反应并记录最大聚集率。
(3)抗体对小鼠黑色素瘤细胞B16F10肺部转移的影响
WTC57BL/6j小鼠腹腔注射抗体0.1μg/g，4小时后清除小鼠体内血小板，再给小时尾静脉注射1x105/mLB16F10细胞，两周后脱颈处死小鼠，取出肺观察B16F10细胞在肺部转移灶数量。
(4)抗体治疗LLC细胞皮下荷瘤自发转移模型的H&E染色实验
WTC57BL/6小鼠皮下注射1x106/mLLLC细胞，10天后手术切除原位肿瘤，以提高小鼠生存。然后每天给予手术后小鼠腹腔注射抗体0.1μg/g持续两周治疗，治疗完成20天后脱颈处死小鼠取肺部组织观察，切片H&E染色，显微镜观察。
(5)统计学分析
统计分析数据差异采用GraphPadPrism8.0软件，所有数据均为平均数±标准差。两组数据的差异分析采用配对t检验，多组数据采用单因素方差分析，P<0.05表示两组数据的差异有统计学意义。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示不同的差异水平，数值越小差异程度越大。
实施例3实验结果
(1)细胞株的建立
Balb/c小鼠经周期免疫后进行细胞融合，并于融合后的第十天左右杂交瘤细胞克隆开始出现。采用间接ELISA法进行双筛，即筛选出并保留下既与包被的GPIbα蛋白结合又与包被的人血小板结合的细胞株，以有限稀释法亚克隆多次直至达到完全阳性就是所需的稳定有效分泌抗体的目的细胞株。共获得8株抗人血小板GPIbα单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5和10H4。
(2)效价的测定
将制备所得的腹水分别纯化后，通过间接ELISA法测定并计算其抗体效价分别为1D5(1：64000)、4B7(1：64000)、6F3(1：64000)、8C6(1：32000)、9C9(1：64000)、6F3’(1：128000)、9E5(1：64000)、10H4(1：32000)。
表1 8株抗人血小板GPIbα单克隆抗体的效价
Figure BDA0003085354230000061
Figure BDA0003085354230000071
(3)单抗的特异性鉴定
a.流式细胞术检测单克隆抗体与人血小板结合的特异性
首先采集健康人的洗涤血小板来研究这8株单克隆抗体与人血小板的结合。流式结果显示，与阴性抗体小鼠IgG相比，这8株单克隆抗体以及阳性抗体SZ2、SZ21均能与人血小板结合(图1)。统计结果提示，所得到的8株单克隆抗体都是人血小板的单克隆抗体。
b.流式细胞术检测hGPIbα基因敲除小鼠血小板与单抗结合的特异性
用同样的方法来研究人源化GPIbα基因敲除小鼠的洗涤血小板与8株单克隆抗体的结合，同时用同周龄的野生型小鼠做平行试验作为阴性对照。流式结果显示，与阴性抗体小鼠IgG相比较，8株单克隆抗体和阳性抗体SZ2均能与hGPIbα小鼠的洗涤血小板结合，而同样作为对照的SZ21却没有检测到与hGPIbα小鼠的洗涤血小板结合(图2)。统计结果提示，得到的8株单克隆抗体都是人血小板GPIbα的单克隆抗体。
c.Western blot分析
Western blot分析八株单克隆抗体与人洗涤血小板结合的特异性。Western分析结果表明，这8株单抗所识别的蛋白分子量都在110kDa左右，并与SZ2单抗识别的条带一致(图3)。结果表明这8株单克隆抗体都具有很好的特异性。
(4)抗人GPIbα单抗的功能鉴定
a.单抗抑制ristocetin诱导的聚集
瑞斯托霉素(ristocetin)可在血管性血友病因子(vWF)的存在下诱导血小板聚集。实验结果显示，与IgG相比，1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’以及9E5这7株单抗都能达到抑制ristocetin诱导的血小板聚集作用，而10H4则不能抑制ristocetin诱导的聚集。并且相较于1D5、6F3、8C6、6F3’和9E5在1.25μg/mL时已经开始抑制ristocetin诱导的血小板聚集，4B7和9C9在单抗的浓度达到2.5μg/mL时抑制ristocetin诱导的血小板聚集的效果才开始显著提高，其中8C6的抑制程度稍低，在5μg/mL时才能达到显著抑制的效果(图4)。
表2.单抗抑制ristocetin诱导的聚集统计表
Figure BDA0003085354230000072
Figure BDA0003085354230000081
b.单抗抑制thrombin诱导的聚集
凝血酶(thrombin)是一种可诱导血小板聚集的强刺激剂，它通过与人血小板膜受体PAR(protease-activated receptors)家族中的PAR-1和PAR-4结合诱导血小板聚。实验结果显示(图5)，8株单克隆抗体与IgG相比，在凝血酶的三种浓度条件下，抑制凝血酶诱导血小板聚集的差异都没显现出来，但0.01U，0.02U和0.03U三个浓度的thrombin可呈浓度依赖性诱导单抗抑制的血小板聚集。
c.单抗抑制ADP诱导的聚集
二磷酸腺苷(ADP)是一种血小板聚集的弱刺激剂，在纤维蛋白原和钙离子存在时通过释放颗粒内容物与血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)的形成诱导血小板聚集。实验结果发现，ADP在2.5μmol/L，5μmol/L(结果未显示)和10μmol/L三种浓度下诱导单抗封闭的血小板聚集没有浓度依赖性，8株单抗10μg/mL时都不能抑制ADP诱导的血小板聚集。并且与IgG相比，8株单克隆抗体对于抑制这三种浓度的ADP诱导血小板聚集无显著差异(ADP在5μmol/L诱导的结果未在统计图中显示，2.5μmol/L和10μmol/L的ADP诱导结果见图6)。
d.单抗抑制U46619诱导的聚集
U46619是血栓素A2的类似物，能有效诱导血栓素受体介导的聚集反应。实验结果显示(图7)，0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.3μmol/L三个浓度的刺激剂U46619呈浓度依赖性诱导血小板聚集，统计发现，在诱导剂U46619为0.1μmol/L时，1D5和9C9两株单克隆抗体相较于其它六株与IgG有较为显著的差异，0.2μmol/L的U46619作为刺激剂时，1D5、8C6、6F3’以及10H4与IgG相比稍有差异，而U46619为0.3μmol/L时，则不具有统计学意义。
表3.单抗抑制U46619诱导的聚集统计表
Figure BDA0003085354230000082
Figure BDA0003085354230000091
e.单抗抑制collagen诱导的聚集
胶原(collagen)是血小板聚集不可逆的刺激剂，其释放前列腺素-血栓素与ADP的代谢产物。实验结果显示，在0.5μg/mL的collagen，1μg/mL的collagen以及1.5μg/mL的collagen对于诱导血小板的聚集呈浓度依赖性，并且统计结果分析，当诱导剂collagen为0.5μg/mL时，1D5、4B7、6F3、6F3’和10H4与IgG相比，对于抑制collagen诱导的聚集的作用较为明显，当collagen为1μg/mL时，4B7和9C9的抑制作用显著，6F3也稍有抑制作用，而collagen为1.5μg/mL时，这8株单抗的抑制作用都无显著差异(图8)。
表4.单抗抑制collagen诱导的聚集统计表
Figure BDA0003085354230000092
(5)抗体对体内血小板清除的影响
图9为抗体对体内血小板清除实验的结果图，从图9可以得出，抗体10H4对血小板的清除效果较差，其它几种抗体在0.5h即产生对血小板的清除效果，随着时间的延长，清除率越来越高，然后达到平台期，最后恢复正常水平。因此本发明制备的除10H4之外的几种单抗对血小板均具有一定的清除作用。
(6)抗体抑制肿瘤转移
不同抗体对小鼠黑色素瘤细胞B16F10肺部转移的影响结果如图10所示，图中第一排为未使用抗体处理的小鼠黑色素瘤细胞，第二排为分别使用抗体1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5处理的小鼠黑色素瘤细胞，从图中得出，小鼠黑色素瘤细胞经抗体处理后，B16F10细胞在肺部转移灶数量明显减少，这7株抗体起到了抑制肿瘤转移的作用。
对LLC细胞皮下荷瘤自发转移模型注射抗体(1D5、4B7、9C9)进行治疗，肺部组织切片H&E染色结果如图11所示，从图11中得出，经抗体治疗的样本产生较少的肿瘤细胞，从而说明这3株抗体对肿瘤具有一定的抑制作用。
实施例4血小板GPIbα蛋白所制备的8株抗体的抗原表位肽的确定
(1)抗原表位肽的确定
本发明所述8种抗体的抗原表位通过以下步骤进行确定：
1、抗体准备。利用超滤管Vltra-2Amiconvltra将抗体buffer由PBS置换为Na2CO3(PH＝8.3)，体积200μL，终浓度为5mg/ml。
2、处理beads。准备待偶联的beads，用无菌枪头取100μLbeads悬液至无菌EP管，用1ml 1mM HCL浸泡beads后，200rpm，2min离心，弃上清，加入50μLNa2CO3平衡待用。
3、偶联抗体。将200μL抗体加入处理好的beads，补体系至600μL，室温四向旋转偶联3h。
4、封闭。补足Na2CO3至1ml。加入1M Tris-HCL(PH＝8.3)，至终浓度为0.1M，室温四向旋转封闭3h。
5、洗涤beads。收集反应溶液①(Na2CO3)；用0.5MNaCL冲洗两遍，收集流出液②(NaCL)；用ddH2O冲洗两遍，不收集。加入100μL20％乙醇水溶液封存，4°保存。
6、偶联效率计算。测定溶液①和②的蛋白浓度，计算抗体偶联beads的偶联量。
7、GPIba蛋白结合。将偶联抗体的beads用PBS重悬取出。200rpm，2min离心，弃上清，加入GPIba蛋白溶液(70-100ug)，室温四向旋转结合2h。200rpm，2min离心，取上清测OD280，计算蛋白结合量。利用100mM Tris-HCL(PH＝8.3)洗beads三遍。PBS重悬。
8、第一步酶切。用50mM NH4HCO3(PH＝8.0)置换beads底液并离心，加入100μL含Trypsin的NH4HCO3溶液，(Trypsin：GPIba蛋白＝1：500)，室温四向旋转过夜。
9、第二步酶切。偶联蛋白的beads用NH4HCO3清洗一次，弃上清，加入100μL NH4HCO3平衡，加入DTT(100mM)，37°四向旋转反应1.5h。加入IAA(500mM)，避光四向旋转反应30min。加入4倍体积的UA-Tris-HCL溶液(62.5mM Tris-HCL+2.5MUA)、Trypsin(Trypsin：GPIba蛋白＝1：50)。37°四向旋转反应15-18h。
10、蛋白洗脱。用50mMNH4HCO3洗三次，200rpm，2min离心，弃上清。加入20μLTFA(10ml/L，PH＝2.0)，手动震荡5min，200rpm，2min离心，取上清送质谱检测。
通过以上步骤得出的抗体1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5、10H4所对应的抗原表位肽分别为氨基酸序列SEQ ID NO:1-8。1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5、10H4SEQ ID NO:1：TLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGS；
SEQ ID NO:2：NPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKF；
SEQ ID NO:3：CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTV；
SEQ ID NO:4：PVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRT；
SEQ ID NO:5：VNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLN；
SEQ ID NO:6：LDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELK；
SEQ ID NO:7：GLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELP；
SEQ ID NO:8：EVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPY。
(2)抗原表位肽的鉴定
将筛选出的抗原表位肽作为抗原，采用ELISA实验使用对应的抗体测定不同浓度抗原表位肽下的OD450值，确定抗体与相应抗原表位肽是否具有特定的特异性结合作用。其ELISA检测结果如图12所示，从图12中可以得出，随着抗原表位肽浓度的增加，OD450值随之升高，从而说明每种抗体与所筛选到的抗原表位肽具有良好的亲和效果，抗原表位肽的筛选是正确的。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽及其应用
<141> 2021-05-26
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu
1 5 10 15
Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn
20 25 30
Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr
35 40 45
Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe Gly Ser
50 55
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
Asn Pro Trp Leu Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu
1 5 10 15
Gln Asp Asn Ala Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Gly Val Asp Val
20 25 30
Lys Ala Met Thr Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp
35 40 45
Lys Phe
50
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
Cys Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly
20 25 30
Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val
35 40
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
Pro Val Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gly Asp Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly
20 25 30
Asp Lys Val Arg Ala Thr Arg Thr
35 40
<210> 5
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 5
Val Asn Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe
20 25 30
Ser Leu Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn
35 40 45
<210> 6
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 6
Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu
20 25 30
Lys
<210> 7
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 7
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys
1 5 10 15
Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu
20 25 30
Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu Thr Glu Leu Pro
35 40
<210> 8
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 8
Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn Cys Asp Lys Arg
1 5 10 15
Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp Thr Thr Ile Leu
20 25 30
His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu Ala Thr Leu Met
35 40 45
Pro Tyr
50

Claims (11)

1. 一种血小板GPIbα蛋白相关的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示的全长序列，或包括这些氨基酸序列任意长度的多肽。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含有权利要求1所述的抗原表位肽和任选的标签序列。
4. 一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性的结合权利要求1所述的抗原表位肽，并且所述抗体能够特异性地结合天然的血小板GPIbα蛋白，所述抗原表位肽的氨基酸序列SEQID NO:1-8分别对应的抗体命名为1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5、10H4。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。
6.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的包括这些抗原表位肽氨基酸序列任意长度的多肽。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体。
9.权利要求1或权利要求2所述的抗原表位肽、权利要求3所述的融合蛋白、权利要求6所述的核苷酸序列、权利要求7所述的表达载体或者权利要求8所述的宿主细胞的用途，其特征在于，其用于制备抗人血小板GPIbα抗体。
10.权利要求4所述的抗体的用途，其特征在于，当抗体为1D5、4B7、6F3、8C6、9C9、6F3’、9E5时，其在抗血栓以及其在抗肿瘤转移方面的用途，以及其在治疗血小板增多症方面的用途。
11.权利要求4所述的抗体的用途，其特征在于，当抗体为10H4时，其作为标记蛋白的用途。
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CAUWENBERGHS N等: "Epitope mapping of inhibitory antibodies against platelet glycoprotein Ibα reveals interaction between the leucine-rich repeat N-terminal and C-terminal flanking domains of glycoprotein Ibα", 《BLOOD》 *

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