CN1049864A - 抗吗啡单克隆抗体及其制备、吗啡的检测药盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种由小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞
进行细胞融合所得到的杂交瘤细胞株产生的抗吗啡
单克隆抗体,特征在于该抗体不与可待因反应,但与
吗啡有高度特异的反应活性;一种制备抗吗啡单克隆
抗体的方法,其包括培养上述杂交瘤细胞株;一种主
要包含
(a)携带与吗啡和去甲吗啡有高度特异免疫反应
活性之抗体的载体,及
(b)携带去甲吗啡的载体的吗啡检测药盒;及一
种检测去甲吗啡的方法。
Description
本发明涉及与止痛药吗啡有高度反应活性的单克隆抗体,制备该单克隆抗体的方法及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还涉及吗啡的检测药盒及检测的方法。
近年来,用于治疗晚期肿瘤的方法之一是使用吗啡以减轻病人的疼痛。按照这种方法,如果给药剂量太小,将不会产生镇痛效果,但如果剂量太大,又可能造成很大的付作用。因此,为了确定维持足够浓度的给药剂量,必须建立一种方法以简单而迅速地监测血液中吗啡的水平。
目前已知的一种简单方法是使用多克隆抗体(Spector及Parker,Science,168,1347-1348,1970;Catlin等,Clinical Chemistry,19,2,216-220,1973;Gintzler等,European Journal of Pharmacology,38,149-156,1976;及Findlay等,Research Communications in Chemical Phathology and Pharmacology,17,4,595-603,1977)或单克隆抗体(Glasel等,Molecular Immunology,20,12,1419-1422,1983;和Sawada等,Molecular Immunology,25,9,937-943,1988)的放射免疫检测法。
然而,因为用于这些方法的大部分多克隆和两种单克隆抗体均与可待因(镇咳药)有交叉反应性,所以此前还没有一种当血中存在可待因时,仍然与吗啡有很高的特异反应性因而能准确检测血中吗啡水平,又与可待因无反应性的单克隆抗体。
另外,当检测很大量的样品时,这些检测方法需要花费相当长的时间,而且检测程序也十分繁复。
因此有必要进一步改进上述检测方法,以简便而迅速地检测血中吗啡含量。
本发明的一个目的是提供一种与镇痛药吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体,其制备方法及用以产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的另一个目的提供一种检测药盒,其主要包含一种其上面携带与吗啡及去甲吗啡有高度特异之免疫反应活性的载体及一种携带去甲吗啡的载体;以及使用该检测药盒检测吗啡的方法。
为了解决上述问题,本发明人曾进行了广泛的研究,结果通过融合小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞得到了一株杂交瘤细胞,并经培养该杂交瘤细胞株制得一种与吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体,从而完成了本发明。
本发明人进一步发现,使用本发明的检测药盒检测吗啡含量,要比现有技术中使用的检测方法更为简便而且迅速。
更具体地说,本发明涉及一种抗吗啡单克隆抗体,其特征在于这种以小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合制得之杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体与吗啡有高度特异反应活性,但与可待因则基本上不发生反应。
另外,本发明涉及一种制备抗吗啡单克隆抗体的方法,该方法包括培养上述杂交瘤细胞株。
再者,本发明涉及上述的杂交瘤细胞株。
第四,本发明涉及用于检测吗啡的药盒,其主要包含:
(a)一种在上面携带与吗啡和去甲吗啡具有高度特异反应活性之抗体的载体;及
(b)一种其上面载有去甲吗啡的载体。
第五,本发明涉及一种检测吗啡的方法,该方法包括使样品中的吗啡和载体上携带的去甲吗啡与携带于载体上的抗体发生竞争性反应。
第六,本发明涉及一种检测吗啡的方法,它包括将固定在一种固相支持物上的去甲吗啡结合大分子蛋白以及待检样品中的吗啡与一种试剂完全反应,该试剂包括一种对酶标吗啡具有高度特异的免疫反应活性的单克隆抗体。
本发明涉及的第七个方面是一种用于检测吗啡的检测盒,它主要包括:
(a)去甲吗啡结合大分子蛋白;
(b)一种试剂,它包括对酶标记的吗啡具有高度特异免疫反应性的单克隆抗体。
图1显示了利用“酶标记抗体”制作的吗啡标准曲线,图2显示了由ELISA法和HPLC法所测得的试验结果的相互关系。
有关本发明的细节现描述如下。
本发明的单克隆抗体是由小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤细胞株产生的,该单克隆抗体与吗啡有高度特异的反应活性。
对用于本发明的小鼠淋巴细胞并无特殊限制,条件是它与小鼠骨髓瘤细胞融合后所得到的杂交瘤细胞株能产生与吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体,但最好是使用经以适当免疫原免疫后得到的淋巴细胞。
作为本发明中用于免疫小鼠的适当免疫原也没有特殊限制,可以使用任何一种能制得与吗啡有高度特异反应活性之单克隆抗体的免疫原,如吗啡、吗啡的盐、与分子量为10,000或10,000以上之大分子载体结合的吗啡、去甲吗啡、与分子量为10,000或10,000以上之大分子载体结合的去甲吗啡等,最好使用与分子量为10,000或10,000以上之大分子载体结合的去甲吗啡。作为分子量在10,000或10,000以上的大分子载体,如可使用牛血清蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、钥孔 血兰蛋白(KLH)、免疫球蛋白等生物大分子化合物,以及多聚L-赖氨酸(PLL)等多聚氨基酸。
本发明的具有与吗啡高度特异反应的单克隆抗体与吗啡有高度特异的反应活性,但与可卡因、可待因、二氢可待因、乙基吗啡、芬太尼、美沙酮、M-3-G(吗啡-3-葡糖酸苷)等则基本上没有反应活性。可使用淋巴细胞培养基在培养瓶内静止培养MO-2(FERM-P No.1910)、MO-3(FERM-PNo.1911)、MO-4、MO-5(FERM-P No.1912)、MO-6等细胞株得到具有这种特异性的单克隆抗体,上述细胞株是用结合到生物大分子免疫球蛋白上的去甲吗啡作为免疫原免疫过的小鼠得到的小鼠淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤细胞株。另外,如需要与M-6-G(吗啡-6-葡糖酸苷)基本上无反应活性的单克隆抗体时,可通过培养MO-3、MO-4、MO-5或MO-6细胞株得到具有更高特异性的单克隆抗体。
可按照已知方法,如Milstein和K hler(Nature,256:495,1976)的方法制备上述杂交瘤细胞株。
下面进一步描述制备这类杂交瘤细胞株的优选方法。
产生单克隆抗体之杂交瘤细胞株的制备
(ⅰ)检测用免疫原及抗原的制备
可使用N-(4-溴丁基)苯邻二甲酰亚胺将去甲吗啡或去甲吗啡的盐等类似化合物转化成N-(4-溴丁基)衍生物,并使用1-环己基-3-(2-吗啡代乙基)-碳二亚胺-N-甲-对位-甲苯磺酸盐(下文简称CMEC)、1-乙基-3-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(下文简称EDPC)等碳二亚胺化合物将其结合到分子量为10,000或10,000以上的大分子载体(如BSA、OVA、KLH、免疫球蛋白等生物大分子、PLL等多聚氨基酸)上。
另一方面,可使用大分子载体和不同于大分子载体的碳二亚胺及用于制备免疫原的碳二亚胺,按上述制备免疫原的方法制备检测分析所使用的抗原。
(ⅱ)免疫的小鼠淋巴细胞的制备
或一次或分几次(每次间隔数周)给小鼠注射溶解于PBS(Dulbecco′s磷酸缓冲盐水)之上述(ⅰ)的免疫原(10-400μg),对小鼠进行免疫。
第一次免疫也可以不给予含明矾、死结核菌细胞等免疫促进剂的佐剂,但最好给予用佐剂制得的乳剂。
最后一次免疫后几天,如检测证实免疫小鼠体内产生了足够的抗体即可由血液、淋巴结、脾脏等组织(最好是脾脏)中得到淋巴细胞。
(ⅲ)骨髓瘤细胞的制备:
为进行细胞融合,可使用来自小鼠的MPC-11、P3-X63-Ag 8.653(653)、P3-X63-Ag 8-U1(P3U1)、P3-NS-1(NS-1)、SP2/0-Ag 14(SP2/0)等骨髓瘤细胞以及来自大鼠的210.RC Y3.Ag1.2.3(Y3)骨髓瘤细胞,但最好是使用不向细胞外分泌抗体的653、P3U1、NS-1、SP2/0等骨髓瘤细胞。
(ⅳ)细胞融合
可使用不给细胞融合带来麻烦的细胞悬浮液,如通常用于培养淋巴细胞的培养基成分(如MEM、DMEM、MCCoy、RPMI1640等)的溶液,并加入离心后的细胞团块、HVJ(仙台病毒)或PEG(聚乙二醇)溶液(但最好是使用平均分子量为1,000至8,000的PEG的30-60%(重量)溶液),使细胞数目比为(5-20)∶1的上述免疫的淋巴细胞与上述骨髓瘤细胞充分混合,以完成细胞融合。此时,为促进细胞融合也可加入适当量的corhitine、二甲亚砜、聚-L-精氨酸等。
来自与被免疫小鼠不同种动物的骨髓瘤细胞也又用于细胞融合,但从单克隆抗体产生量及其稳定性的角度看,最好使用与被免疫小鼠同种动物,特别是用一细胞株的骨髓瘤细胞。
(ⅴ)杂交瘤细胞的选择:
可在细胞融合后在HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷、胎牛血清(FCS)的培养基;构成HAT培养基成分,可为通常用于培养淋巴细胞的培养基成分)中培养细胞以选择杂交瘤。
将细胞置于培养板中培养,该培养板具有的小井数目适于筛选抗体产生细胞杂交瘤,此时如果有必要的话可能应用细胞生长促进物质或产生该物的细胞(如得自胸腺、脾、淋巴结等的淋巴细胞)作为喂养细胞。
可将在HAT培养基中选择的骨髓瘤细胞随后在HT培养基(含有次黄嘌呤、胸苷、FCS的培养基;作为该培养基成分的是通常用于培养淋巴细胞之培养基成分)培养几天,并进一步在通常用于培养淋巴细胞的含FCS之培养基中培养。
(ⅵ)产生抗体之杂交瘤细胞的筛选
可使用ELISA法(酶联免疫吸附法)、空斑形成法、凝集反应法、PIA法(即使用放射性同位素的方法)、间接荧光抗体法(IFA)等来检测按上述方法(ⅴ)制得的杂交瘤是否产生所需的抗体,但待检的数目很多时最好使用ELISA法。
可按下述步骤进行ELISA试验。
将如上(ⅰ)制得之抗原吸附于ELISA板各小井(试验小井)上,加入杂交瘤培养悬浮液。然后静止预定的时间。再向这些试验小井内加入一种酶标记的抗体,该酶标抗体能与得自某种动物的抗体反应并结合于其上,并通过其与各测试小井结合,这些小井已经经过冲洗(作为用于标记的酶,可包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等;用于酶标记的抗体没有特殊限制,条件是它只能够通过已结合到试验小井上的动物抗体反应并与该抗体结合,这些抗体包括得自小鼠、大鼠、兔、羊等的抗血清,或由小鼠细胞等制得的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体)。然后洗涤这些测试小井,并加入一种相应于所用酶的底物检测酶活性。如果检出酶活性,即可知道提供培养物悬浮液的培养小井内已存在能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
如此可确认细胞生长,并得到产生抗体的杂交瘤细胞。
(ⅶ)杂交瘤细胞的克隆:
可依照有限稀释法,单细胞操作法(即在倒置显微镜下将一个杂交瘤细胞置于一个小井内)、使用软琼脂凝胶挑选群落的方法、使用FACS(萤光活化细胞检出器Fluorescent Activated Cell Sorter)的方法等克隆已在培养中充分鉴定的可产生抗体的杂交瘤细胞。此时可依据上述任一种克隆方法培养前述步骤(ⅵ)中选出的产生抗体的杂交瘤细胞,并使用细胞在其中生长的培养小井内的上清液,按照步骤(ⅵ)中筛选出产生抗体的杂交瘤细胞的ELISA法筛选产生的抗体小井。
从而可选择出能产生对吗啡有高度特异性并有高抗体效价之单克隆抗体的杂交瘤。
单克隆抗体的制备方法
可在培养瓶内或在动物腹腔内培养上述步骤(ⅶ)中制得的杂交瘤细胞株,以得到独吗啡有高度特异性及高抗体效价的单克隆抗体。
可在含有0-20%胎牛血清之适于培养淋巴细胞的培养基(如MEM、DMEM、Me Coy、RPMI1640等)中用培养瓶培养上述(ⅶ)中制得的杂交瘤细胞株直至细胞浓度达到上限,以产生所说的单克隆抗体。然后可经离心得到细胞悬浮液中含有的单克隆抗体。
另一方面,也可在与得到用于细胞融合之细胞的动物不同种的动物腹腔内培养上述(ⅶ)中制得的杂交瘤细胞株,以产生所说的单克隆抗体,但最好是使用同种、特别是同一品系的动物。
可给小鼠、大鼠、仓鼠等适宜动物腹腔内注射矿物油如姥鲛烷等降低免疫能力的物质,几周后给予注射10至10个杂交瘤细胞(如上述步骤ⅵ中制得的),并使之在几周内生长达到很高的细胞密度,从而产生对吗啡有高度特异性及高抗体效价的所说的单克隆抗体。此时可通过离心获得腹水悬浮液中含有的所说的单克隆抗体。其抗体浓度约为在培养瓶内培养所得培养物悬液中抗体浓度的10至1000倍。
可使用盐析、透析、离子交换层析、亲合层析等用于纯化蛋白质的一般方法纯化由培养瓶或动物腹腔内生长杂交瘤细胞株所得到的上述单克隆抗体,从而获得高纯度的单克隆抗体。
按上述方法制得的单克隆抗体与吗啡有高度特异的反应活性。
本发明用于检测吗啡的吗啡检测药盒主要包含一种其上面载有与吗啡和去甲吗啡有很高特异免疫反应性之抗体的载体(下称“抗体载体”),及一种其上面载有去甲吗啡(吗啡的同系物)的载体(下称“去甲吗啡载体”)。为了检测吗啡,除了这些试剂外还需要有适于放置这些试剂的反应板、已知量的吗啡溶液(下称“标准吗啡溶液)、搅拌棒等,这些东西可以是在吗啡检测药盒中预先装好的,也可以是临用前准备的。
对用于制备本发明吗啡检测药盒中“抗体载体”的抗吗啡和去甲吗啡抗体并无特殊限制,条件是它与吗啡和去甲吗啡有高度特异的免疫反应活性,可以使用抗血清或单克隆抗体等,但最好是单克隆抗体。这种对吗啡或去甲吗啡有高度特异性的单克隆抗体可包括至少含一种如日本专利申请号234826/1988中所公开之来自用去甲吗啡免疫接种的小鼠的杂交瘤细胞株[如MO-2(FERM-PNo.1910)、MO-3(FERM-PNo.1911)、MO-4、MO-5(FERM-PNo.1912)、MO-6等细胞株]所分泌的单克隆抗体。
如果本发明中检测吗啡时使用的“抗体载体”是粉末形式提供的,则可于使用前以适当浓度将其分散于水、缓冲液(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等)中。
在制备本发明检测药盒中的“抗体载体”或“去甲吗啡载体”时,用于携带抗体或去甲吗啡的载体材料可包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、硝基纤维素、玻璃、尼龙、PMMA(聚甲基异丁烯酸酯)、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物等,优选的是聚苯乙烯。
这些载体的形状可以是园形、棒状、针状、方形等,但最好是园形的。
这些载体的大小可以是0.01至5μm,较好为0.1至3μm,最好0.2至2μm。另外,这些载体的大小和形状最好是均匀的。可根据检测时所用反应板的颜色,也将这些载体染上适当的颜色。
可按下述方法制备本发明中使用的“抗体载体”。
将对吗啡有高度特异性的抗体溶解于调至中性pH左右的缓冲液(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等)中,以制备有适当抗体浓度的溶液,并可采用将溶液静止或振荡一定时间的方法以发生接触反应,使抗体携带于载体上。接触期间的加热温度可在10至50℃,最好是20至40℃。如果加热温度取上述范围的低值时,最好延长保温时间(如30至50℃时加热2至4小时就足够了,但在10至29℃时则需要4至10天;如果加热时间长,最好加入叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠等蛋白质防腐剂)。
也可在低温(如2至10℃)及悬浮状态下保存如此制得的“抗体载体”,但最好也加入必要量的叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠等蛋白质防腐剂或牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质稳定物质。
可使去甲吗啡与分子量为10,000或10,000以上的大分子蛋白质化学结合,并使所得结合产物携带于载体上,以制得本发明中使用的“去甲吗啡载体”。
作为用于制备“去甲吗啡载体”的分子量10,000或10,000以上的大分子蛋白质,包括BSA、OVA、KLH、r-球蛋白等生物大分子以及PLZ等多聚氨基酸。
在制备“去甲吗啡载体”时,可通过使用碳二亚胺和EDPC、CMEC等(如上所述)将去甲吗啡转化成N-(4-溴丁基)衍生物,再将所得产物(使用N-(4-溴丁基)苯邻二甲酰亚胺)结合到上述大分子蛋白质上实现去甲吗啡与大分子蛋白质之间的结合。
可使如此制得的去甲吗啡与大分子蛋白质的结合产物,或在使用Sephadex、Sephacryl(产品名)等对其进行凝胶过滤纯化后,按照静止或振荡一段时间的方法与载体发生接触反应,使抗体载于载体上从而制得“去甲吗啡载体”。接触期间的加热温度一般为10至50℃,最好为20至40℃。另外,此时的加热时间可根据加热温度而异,如加热温度较低则可延长加热时间(例如在30-50℃时只要加热2至4小时,而在10至29℃时则需要4至10天;如果加热时间长,可加入叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠等蛋白质防腐剂)。
也可在悬浮状态下低温(如2至10℃)保存如此制得的“去甲吗啡载体”,但最好再加入适当量的叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠等蛋白质防腐剂或BSA等蛋白质稳定物质。
作为用于本发明吗啡检测法中的检测样品,可使用人尿、血液、血清等液体。进行检测时这些检测样品可以稀释,也可以不稀释。
用于本发明吗啡检测中的检测板,可包括玻璃板、塑料板、包有防水材料的平板(如木或纸质的),但最好使用包有塑料的纸质平板。对反应板的颜色无特殊限制,只要能够清晰地辨认由“去甲吗啡载体”与“抗体载体”之间相互反应所形成的聚集物质即可,但在聚集物质为白色时,则最好将其制成黑色的。
本发明吗啡检测法中用于搅拌反应混合物的搅拌棒可以是任防水材料制成的棒,但最好使用塑料制成的或包有塑料的棒。对棒的大小无特殊限制,只要能实现本发明的目的即可,但其长度可为3至10cm,直径可为0.1至5mm。
有了按上述方法制得的反应板、反应混合物的搅拌棒、试验样品和“标准吗啡溶液”,即可使用吗啡检测药盒中的作为试剂的“抗体载体”、“去甲吗啡载体”,通过下述步骤(ⅰ)至(ⅱ)来检测样品中的吗啡(可按检测吗啡的同样操作方法检测去甲吗啡,不同的是使用去甲吗啡检测样品及已知量的去甲吗啡溶液)。
(ⅰ)滴加一定量的“抗体载体”、“去甲吗啡载体”和待检样品或“标准吗啡溶液”:
将各有一定量(如5至50μl)的“抗体载体”、“去甲吗啡载体”、待检样品或“标准吗啡溶液”滴加在反应板上,这一组物质彼此相互间隔分开,以便能易于搅拌。加在反应板上时最好将[“抗体载体”、“去甲吗啡载体”和待检样品]作为一组,将[“抗体载体”、“去甲吗啡载体”和“标准吗啡溶液”]作为一组。并在同一反应板上彼此间隔开一定距离。
(ⅱ)搅拌步骤(ⅰ)中加于反应板上的各组溶液,使之彼此发生反应:
用搅拌棒快速搅拌各溶液,并在一定温度(如室温)下前后、左右移动反应板使之反应一定时间(如1至2分钟),然后观察各组反应物内“抗体载体”与去甲吗啡载体”之间反应所发生的聚集作用。此时可比较使用“标准吗啡溶液”一组和使用待检样品一组的凝集现象,从而即可知道待检样品中的吗啡含量。
在吗啡检测操作过程中,通过搅拌反应板上各组试剂使之分别反应时,即发生“去甲吗啡载体”中的去甲吗啡或“标准吗啡”溶液中的吗啡与“抗体载体”上携带之抗吗啡抗体之间的竞争性反应,并且在“抗体载体”和“去甲吗啡载体”之间发生凝聚反应,从而可通过比较使用“标准吗啡溶液”一组和使用试验样品一组所出现的聚集现象,迅速而高度敏感地测出样品中的吗啡含量。
本发明检测吗啡(以下简称为“MO”)方法中所使用的吗啡检测盒主要包括去甲吗啡结合大分子蛋白(以下简称为“NM结合蛋白”)及一种试剂,其中含有对酶标记的MO具有高度特异性免疫反应活性的单克隆抗体(以下简称为“酶标记抗体”)。对于MO的检测,除以上试剂外,还需要固相支持物,冲洗液,封阻液,用于绘制MO校正曲线的MO或与MO具有同样的MO抗体抑制活性的MO替代物,酶的底物溶液等,这些试剂可以预先装备在MO检测盒中,或在检测前配制。
制备本发明MO检测盒中的“NM结合蛋白”需要让通过一种大分子蛋白固定到固相支持物上的NM与一种试剂反应,该试剂含有与酶标记的MO具有高度特异免疫反应性的单克隆抗体。用于这种制备的大分子蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔 血蓝蛋白(KLH)及γ-球蛋白等。
在制备本发明的“吗啡支持物”时,首先利用N-(4-溴丁基)-邻苯二甲酰亚胺将去甲吗啡转化为N-(4-溴丁基)衍生物,然后向所得产物中加入水化氯醛以完成去邻苯二甲胺反应,产生所需的N-(4-氨基丁基)去甲吗啡(以下简称为“ABNM”)。然后,将这一ABNM与一种碳二亚胺(如EDPC,CMEC等)反应,以与上述大分子蛋白结合。
尽管如此获得的去甲吗啡和大分子蛋白的结合物可直接使用,但最好还是在使用前利用Sephadex、Sephacryl通过凝胶过滤将其纯化。
通过这种凝胶过滤所获得的“NM结合蛋白”部分也可以直接使用(当蛋白质浓度过低时,可通过超滤膜将其浓缩至所需浓度,当该蛋白质浓度过高时,可将其稀释至所需浓度),但最好还是用一种其pH调节至中性左右的缓冲液(如磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液)对其透析,在冻干或通过无菌过滤器过滤后保存,再用作“NM结合蛋白”溶液,根据需要,其浓度为0.1-100μg/ml,优选的为1-20μg/ml。
另外,根据需要,也可以向“NM结合蛋白”中加入蛋白质防腐剂(如叠氮化钠)。
在制备本发明MO检测盒中的“酶标记抗体”时,用于标记抗体的酶可包括至少一种选自氧化还原酶(如过氧化物酶,过氧化氢酶,葡萄糖氧化酶,乳酸氧化酶,乙醇氧化酶,单胺氧化酶,β-半乳糖苷酶等)及磷酸水解酶(碱性磷酸酶)的酶。
用上述酶标记的抗体可包括由菌株MO-2(FERM-PNo.1910)、MO-3(FERM-P N.1911)、MO-4、MO-5(FERM-P N.1912)、MO-6等产生的单克隆抗体。如上所述,这些菌株均为杂交瘤。
本发明的“酶标记抗体”可采用利用戊二醛的一步法[Immunochemistry,6,43,(1969)]、两步法Immunochemistry,8,1175,(1971)]、高碘酸氧化法[Method in Enzymology,37,133(1975)]或马来酰亚胺法[Journal of the Biochemistry,78,235(1975)],通过将至少一种上述单克隆抗体与至少一种上述酶进行结合而制备,其中后两种方法较好。
它可直接用于MO检测,但为了增强MO的检测灵敏度,最好使用经过Sephadex、Sephacryl凝胶过滤而纯化的“酶标记抗体”作为MO的检测试剂。
尽管通过这种凝胶过滤所获得的“酶标记抗体”可直接加以使用,但优选的还是用一种pH值调至中性的缓冲液(例如Tris-HCl缓冲液的磷酸盐缓冲液)对其进行透析,在经过冻干或经过无菌过滤器过滤后将其保存,然后用作“酶标记抗体”溶液,根据需要,其蛋白浓度为0.01-100μg/ml,优选的是0.1-10μg/ml。
本发明中用于检测MO的固相支持物是用于将MO检测盒中的“NM结合蛋白”固定的支持物。
用于固定NM结合大分子蛋白的固相支持物的形状可包括,例如,板状,管状,珠状,膜状等。对于免疫检测,其材料可包括,例如,聚乙烯,聚苯乙烯,聚丙烯,硝基纤维素,玻璃等。
用于本发明的MO检测中的冲洗液是用来将一定量的“NM结合蛋白”固定化后未固定在固相支持物上的“NM结合蛋白”冲洗掉,或者是将在待检样品中的MO及用“酶标记抗体”固定在固相支持物上的“NM结合蛋白的完全反应后未反应的物质冲洗掉。冲洗液也可用作待检样品的稀释剂或制备封阻液的溶剂。
用于以上目的的冲洗液包括,例如,水,调至反应pH值的缓冲液(如磷酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液等),上述缓冲液含0-3%(体积)的表面活性剂,如Tween 20及Tween 60,优选的是含0.005-0.8%(体积)的上述表面活性剂且调至反应pH的缓冲液。
本发明MO检测法中所用的封阻液是用来防止“酶标记抗体”与其上未固定有“NM结合蛋白”的固相支持物之间的非特异性结合。
通过将大分子蛋白,如BSA、OVA、KLH、γ-球蛋白等溶解在已调至反应pH的一种冲洗液中可制备用于以上目的的封阻液,这些大分子蛋白的浓度为0.1-10%(重量/体积),优选的是0.1-2%(重量/体积),当优选各种动物的血清时,使用上述冲洗液将其浓度调至1-50%(体积/体积),优选10-20%(体积/体积)。
根据需要,封阻液也可含有必需量的蛋白质防腐剂,如叠氮化钠,乙基汞硫代水杨酸钠等。
可用作本发明MO检测法的样品包括人体液,如人尿,血液,血清等。
在MO检测中,是通过用上述冲洗液将这些样品稀释至MO可被检测的范围而对MO进行检测。
作为用于本发明MO检测法的底物溶液(以下简称为“底物液”)的缓冲液含有H2O2底物(它与在“酶标记抗体”中用于抗体标记的酶反应),以及一种显色物质[它被酶促反应形成的产物显色,如邻苯二胺,2,2′-氨基-二(3-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)等]。
如上所述,制备固相支持物,冲洗液,封阻液,用于制备MO校正曲线的MO溶液以及“底物液”,再利用“NM结合蛋白”,“酶标抗体”(它为MO检测盒),通过下面所示各个步骤,就可检测样品中的MO。
(1)将一定量的“NM结合蛋白”固定在固相支持物上的步骤:
将一定体积的“NM结合蛋白”溶液与固相支持物接触一定时间,对接触时的温度没有具体限制,只要“NM结合蛋白”不会冻结或沸腾就行,但优选2-40℃。
(2)除去未固定在固相支持物上的“NM结合蛋白”的步骤:
将“NM结合蛋白”与固相支持物接触一段时间后除去“NM结合蛋白”溶液,再用冲洗液冲洗数次,以除去剩余的未固定在固相支持物上的“NM结合蛋白”。
(3)防止“酶标抗体”非特异性地结合至其上不含固定化的“NM结合蛋白”的固相支持物表面的步骤:
将一定体积的封阻液与其上固定有“NM结合蛋白”的上述固相支持物接触一段时间,对接触时的温度没有具体限制,只要封阻液不冻结或沸腾就行,但优选2-40℃。
(4)使待检样品中的MO及固定在固相支持物上的“NM结合蛋白”与“酶标记抗体”完全反应的步骤:
如上所述,将等体积待检样品和“酶标记抗体”溶液与固定在固相支持物上的“NM结合蛋白”接触和反应,待检样品和“酶标记抗体”溶液可以在混合后与“NM结合蛋白立即进行接触反应,或者在依次与“NM结合蛋白”接触后立即通过搅拌而进行反应。
(5)未通过“NM结合蛋白”固定在固相支持物上的“酶标记抗体”的除去步骤:
除去上述待检样品与“酶标记抗体”溶液的混合物,并用冲洗液数次冲洗以除去未通过“NM结合蛋白”与固相支持物结合的剩余混合液。
(6)将通过“NM结合蛋白”固定在固相支持物上的“酶标记抗体”与“底物液”反应的步骤:
作为在此所用的“底物液”,加入相应于用于标记“酶标记抗体”的酶(包括酶促反应发生时用于显色的物质)。
将一定体积的“底物液”与按上述方法通过“NM结合蛋白”固定在固相支持物上的“酶标记抗体”反应一定时间,并且最好使用酸(如H2SO4)、碱(如NaOH)或酶抑制剂终止反应。在所用酶的选择温度范围内反应温度不会有问题,但优选20-35℃。
(7)在上述酶促反应后检测反应混合物吸收值的步骤:
在上述酶反应显示最大吸收后,当反应混合物显色时检测反应的吸收值。
按上述方法用已知量的MO代替待检样品所获得的结果制取校正曲线,从该曲线就可知道待检样品中的MO含量。
在MO检测操作方法的步骤(4)中,随着“酶标记抗体”溶液及待检样品的加入,固定在固相支持物的“NM结合蛋白”的MO以及待检样品中的MO与“酶标记抗体”发生完全反应,从而可以迅速及灵敏地检测出样品中的MO含量。
实施例
下面将详细描述本发明的实施例。这些实施例绝不是限定本发明的范围。
实施例1
检测用免疫原和抗原的制备
在20ml二氧六环中溶解271mg去甲吗啡(下文简称NM),并向该溶液内加入5ml溶有340mgN-(4-溴丁基)苯邻二甲酰亚胺的乙醇溶液及600mg碳酸钠,然后在回流条件下加热20小时。过滤除去反应混合物中的无机物沉淀后,于低压下蒸发滤液。所得残余物溶解于极小量乙酸乙酯中并将溶液过硅胶柱[20mm直径×300mm长;Kieselgel 60(商品名)(70至200目ASTM)]。用60ml乙酸乙酯/甲醇(9∶1)随后用乙酸乙酯/甲醇(5∶1)洗柱并以20ml分部收集。用TLC法(Kieselgel 60(商品名);展开剂为乙酸乙酯/甲醇/浓氨水=85∶10∶5)分析各部分,收集只含所需产物的部分并于低压下除去溶剂。将所得残留物溶解于20ml乙醇中,然后加入100μl 90%水合肼。回流2小时除去乙醇。将所得残留物溶解于15ml 1%盐酸中,用氯仿/异丙醇(5∶1)洗两次。用浓氨水调至pH8后用氯仿/异丙醇(5∶1)提取溶液并经无水硫酸钠过滤脱水提取物。然后于低压下除去滤液得到130mgN-(4-氨丁基)去甲吗啡(下文简称ABNM)。
可按下述方法使用ABNM制备小鼠的免疫原。
混合0.3ml溶有15mg ABNM的二甲基甲酰胺和1.5ml溶有10mg人免疫球蛋白(Ig G,其为大分子载体)的水溶液,然后加入0.5ml 10%1-环己基-3-(2-吗啡代乙基)-碳二亚胺-N-甲-对位甲苯磺酸盐(CMEC)的水溶液,将pH调至5.5并于室温下搅拌16小时。将混合物对纯水透析两次并将未透析出去的部分冻干,得到10mg NM和Ig G的结合产物(下文简称NM-Ig G),用作免疫原。
按下述方法制备用于检测分析的抗原:制备抗原方法与上述制备免疫原的方法相同,只是用牛血清蛋白(BSA)代替Ig G,并用1-乙基-3-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDPC)代替CMEC,结果得到11mg用作检测抗原的NM与BSA的结合产物(下文简称为NM-BSA)。
实施例2
产生抗吗啡单克隆抗体之杂交瘤细胞株的制备
(1)免疫小鼠及制备脾淋巴细胞:
将0.4ml含有实施例1中制得之400μg NM-Ig G(作为免疫原)的PBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水,pH7.4)与0.4ml完全弗氏佐剂充分混合,并将0.2ml所得乳化液注射到BALB/C小鼠(雌性,8周龄)皮下。
初次免疫两周后,再将0.2ml如上制得的乳化液注入上述小鼠的皮下。
再过两周后,充分混合1ml含400μg上述抗原的PBS溶液与1ml不完全弗氏佐剂制得乳化液,取0.5ml注入上述小鼠腹腔内。
又两周后作最后一次免疫,即在上述小鼠尾静脉内注入0.2ml含100μg上述抗原的PBS溶液。
在未次免疫后3天自被免疫小鼠体内分离脾脏并在含有MEM(一种用于培养淋巴细胞的培养基粉,溶于含10m M HEPES的蒸馏水中)的实验表皿内,然后移入含10ml I MEM的另一个实验表皿内并用无菌载玻片的磨砂部分挤压使细胞分散。
将如此得到的淋巴细胞悬浮于MEM(37℃)中,离心(转速:1,400rpm,时间:6分钟)洗涤之。重复上述操作两次后,将淋巴细胞重新悬浮于MEM(37℃)中,得到用于细胞融合的小鼠脾淋巴细胞。
(2)细胞融合
收获处于对数生长期的小鼠8-氮鸟嘌呤抗性骨髓瘤细胞(X-63-Ag,653;653),将离心(转速:1,500rpm,时间:6分钟)收集的细胞悬浮于MEM(37℃)中并经离心(1,400rpm,6分钟)洗涤之。重复上述操作,然后将细胞重新悬浮于MEM(37℃)中。得到用于细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞。
将4.70×107个上述小鼠骨髓瘤细胞和2.35×108个上述小鼠脾淋巴细胞置于塑料制成的园锥形离心管(50ml体积)内,混合后离心(1,400rpm,6分钟)除去上清,然后轻叩离心管以使细胞团块分散开。
一边旋转该离心管,一边于1分钟内缓慢加入1ml 40% PEG1500溶液(37℃),并继续旋转离心管使反应继续进行1分钟。
在旋转离心管的同时缓缓加入MEM(37℃)至10ml,借助离心(800rpm,6分钟)过滤上清液。
轻叩该离心管使细胞团块散开,将细胞重新悬浮于140ml HAT培养基(含1×10-4次黄嘌呤、4×10-7氨基喋呤、1.6×10-5胸苷、0.2单位/ml牛胰岛素及20%胎牛血清,37℃预热的RPMI1640培养基)中,在18块96小井培养板的各培养小井内各分配100μl并在CO2培养箱(5%CO2,95%空气,温度100%)中培养。
(3)杂交瘤细胞的筛选
按上述方法培养2至4周后,用下述ELISA方法检测已证实有细胞生长的培养板各小井的培养物上清液内是否含有抗吗啡抗体。
首先向96小井U形底ELISA板(下称ELISA板)各检测小井内加入50μl实施例1中制备的检测用抗原物质,即NM-BSA溶液(20μg/ml,溶于0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.8)中),并于4℃放置过夜(经如此处理后,NM-BSA被非特异地吸附于各小井的接触表面上)。
各检测小井用洗涤溶液[含0.05%Tween20(产品名)的PBS,下文简称为PBS-Tween]洗涤,并向各小井内加入100μl 0.5%BSA溶液(溶于PBS中),然后于室温下放置30分钟。用PBS-Tween洗各检测小井,并将上述培养板各培养小井的培养物上清液各50μl分别加于各检测小井内,然后于室温下放置2小时(使用HAT培养基作为阴性对照;另一方面,用在PBS-Tween中稀释100倍的用于本发明细胞融合的小鼠血清作为阴性对照)。
下一步骤是用PBS-Tween洗上述各检测小井,在各检测小井内各加入50μl碱性磷酸酶标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体溶液,并于室温下放置1小时。用PBS-Tween洗各检测小井,之后向各检测小井分别加入100μl硝基苯磷酸钠·6HO溶液(1mg/ml),室温下保温30分钟,然后通过微量板分光光度计测定各检测小井在405nm的吸光率。
上述分析发现在培养板的1013个培养小井中有14个产生了抗吗啡抗体。
对已产生了抗体的14个培养小井使用吗啡作抑制试验[试验操作与上述ELISA法相同,不同的是在同一时间在检测小井内加入25μl培养小井的上清液和25μl含10μg吗啡的PBS-Tween(吗啡溶解于其中)以代替加入50μl培养小井的上清液]。
结果14个含抗体的培养小井中有5个被吗啡所抑制。从而进一步证实这5个培养小井中存在产生抗吗啡抗体的杂交瘤细胞。
(4)杂交瘤细胞的克隆
按照有限稀释法,使用含有20%FCS的RPMI1640培养基克隆在上述步骤(3)中证实有抗体产生的五个培养小井(A、B、C、D和E)中的杂交瘤细胞。
使用96小井培养板并使用BALB/C小鼠的胸腺细胞悬液(107个/ml)作为喂养细胞,以每小井1至5杂交瘤细胞/100μl胸腺细胞进行培养,并在培养开始后第5天各加入100μl含20%FCS的RPMI1640培养基,继续作进一步培养。
在克隆上述A、B、C、D和E5个培养小井中的杂交瘤细胞中,在第10至14天收集观察到有单个群落之培养小井的上清液,并用ELISA法筛选有抗体产生的小井(方法同上述步骤(3)中所述)。这样即可由A、B、C、D和E培养小井中分别得到至少一个或多个杂交瘤细胞株。根据细胞生长情况及抗体产生量,由A、B、C、D和E等培养小井中各收集一个细胞株并进行再克隆。
如此得到的细胞株分别定名为MO-2细胞株(FERM-PNo.1910)、MO-3细胞株(FERM-P No.1911)、MO-4细胞株、MO-5细胞株(FERM-P No.1912)和MO-6细胞株;且由这些细胞产生的单克隆抗体分别称为MO-2、MO-3、MO-4、MO-5和MO-6。
在下述检测试验I检测培养上清液中所含这5个细胞株之单克隆抗体L链的类·亚类和型,并在检测试验Ⅱ中分析与各种化合物的反应活性。
检测试验Ⅰ
确定抗吗啡单克隆抗体的类·亚类
使用对各类·亚类小鼠抗体特异的、过氧化物酶标记的抗体溶液(用辣根过氧化物酶标记的抗Ig G1、Ig G2a、Ig G2b、Ig G3、Ig M、Ig A、K型L链或λ型L链抗体),依照如上述步骤(3)中所述的ELISA法,并使对各类·亚类小鼠抗体特异的特异性抗体溶液(抗Ig G1、Ig G2a、Ig G2b、Ig G3、Ig M、Ig A、K型L链或λ型L链抗体)以ouchterlony方法检测由MO-2、MO-3、MO-4、MO-5和MO-6细胞株产生的免疫球蛋白的类·亚类。
结果发现由MO-2细胞株产生的单克隆抗体(MO-2)是具有K型L链的Ig G1,由MO-3细胞株产生的单克隆抗体(MO-3)属于具有K型L链的Ig G2b,由MO-4细胞株产生的单克隆抗体(MO-4)属于具有K型L链的Ig A,由MO-5细胞株产生的单克隆抗体(MO-5)属于具有λ型L链的Ig G1,由MO-6细胞株产生的单克隆抗体(MO-6)属于具有λ型L链的Ig M。
检测试验Ⅱ
研究抗吗啡单克隆抗体与各种化合物的反应活性
按照上述步骤(3)中所述的ELISA法研究单克隆抗体MO-2、MO-3、MO-4、MO-5和MO-6与活体内吗啡代谢产物[吗啡-3-葡糖酸苷(M-3-G)或吗啡-6-葡糖酸苷(M-6-G)]或其他有类似作用的化合物(可卡因、可待因、二氢可待因、乙基吗啡、芬太尼或美沙酮)的反应活性,以确定它们的反应特异性(但试验中用25μl经PBS-Tween中作多步稀释的化合物溶液和25μl任一种上述单克隆抗体溶液的混合物代替50μl杂交瘤细胞上清液)。
表1中以与吗啡之反应活性比例的形式显示了各单克隆抗体与各化合物的反应活性。
表1
化合物 MO-2 MO-3 MO-4 MO-5 MO-6
吗啡 100 100 100 100 100
可卡因 <1.0 <0.001 <0.001 <0.001 <0.1
可待因 <1.0 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
二氢可待因<1.0 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
乙基吗啡 <1.0 <0.01 <0.01 <0.01 <0.1
芬太尼 <1.0 <0.01 <0.001 <0.001 <0.1
美沙酮 <1.0 <0.001 <0.001 <0.001 <0.1
M-3-G 2.0 0.1 0.2 0.5 0.3
M-6-G 440 0.6 0.9 0.9 1.0
实施例3
经培养瓶培养产生抗吗啡单克隆抗体
将在含有15%FCS的RPMI1640培养基中培养所得到的MO-3细胞株的培养细胞移入10ml不含FCS的RPMI1640培养基中并培养到差不多所有细胞均死亡为止。
在离心(3,000rpm,5分钟)培养液所得上清中,抗吗啡单克隆抗体(MO-3)含量为50μg/ml(用单向平板免疫扩散法测定)。
实施例4
在小鼠腹腔内产生抗吗啡单克隆抗体
为了大量获得抗吗啡单克隆抗体而在小鼠腹腔内培养MO-3细胞株的细胞。向BALB/C小鼠(雌性,8周龄,腹腔内注射细胞前2周给予0.5ml姥鲛烷)腹腔内给予总量0.5ml其中悬浮有2×106个MO-3细胞的PBS。
约一周后小鼠体重显著增加,并于注射细胞后第7、9和11天用19G注射器收集腹水(总收集量为6ml/小鼠)。离心(3.000rpm,5分钟)腹水以得到腹水上清液。
发现腹水上清中抗吗啡单克隆抗体(MO-3)的含量为10mg/ml(用单向平板免疫扩散法测定)。
参考实施例1
抗体的产生和纯化
可按下述方法由杂交瘤MO-3细胞株(FERM-P No.1911)产生对吗啡和去甲吗啡有高度特异性的单克隆抗体。
将悬浮于磷酸盐缓冲液中的107个上述细胞于腹腔注入BALB/C小鼠(雌性,8周龄,腹腔内注射细胞前2周给予0.5ml姥鲛烷)体内。在注射后1周左右,小鼠体重明显增加,并在1-3周时收集腹水。发现如此得到的单克隆抗体的效价为10至10。
按下述方法由所得腹水中纯化单克隆抗体。
将上述腹水对Tris-HCl缓冲液(pH7.4)透析,并过预先用同一缓冲液平衡的DEAE-纤维素柱。用50%饱和硫酸铵盐析洗出部分,将所得沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.4)中并用同一缓冲液透析。
使用SDS聚丙烯酰胺凝胶,以平板凝胶电泳法检测法对吗啡和去甲吗啡有高度特异反应活性之单克隆抗体的纯度,结果发现其纯度是很高的。
实施例5
“去甲吗啡载体”的制备
向溶于20ml二噁烷的270mg去甲吗啡的溶液内加入溶于5ml乙醇的340mg N-(4-溴丁基)邻苯二酰亚胺的溶液,然后加入600mg碳酸钠,并于回流下将混合物加热20小时。过滤除去反应混合物中的无机物,并在低压下将滤液浓缩至干。将所得残留物溶解于极小量乙酸乙酯中并加于硅凝胶柱[20mmφ×300mmL;Kieselgel60(70-200目ASTM)]上。先用60ml乙酸乙酯/甲醇(9∶1),再用乙酸乙酯/甲醇(5∶1)洗脱,并按每部分20ml收集洗脱液。经用TLC(Kieselgel 60;展开剂:乙酸乙酯/甲醇浓氨水=85∶10∶5),收集只含所需产物的部分,然后于低压下蒸发除去溶剂。将所得残留物溶解于20ml甲醇中,再加入100μl90%水合肼,回流除去乙醇。将所得残留物溶解于15ml 1%盐酸中,并用氯仿/异丙醇(5∶1)洗两次。用浓氨水调至pH8后用氯仿/异丙醇(5∶1)提取混合物,然后通过无水硫酸钠过滤脱水。于低压下蒸发干燥滤液,得到130mg N-(4-氨基丁基)去甲吗啡(下文简称ABNM)。
使用上述ABNM,按下述方法制备去甲吗啡与大分子蛋白质BSA的结合产物(下文简称为去甲吗啡-BSA)。
使溶于0.3ml二甲基甲酰胺的15mg ABNM的溶液与溶于1.5ml纯水的10mg大分子载体BSA的溶液混合,再加入0.5ml10%1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDPC)。调至pH5.5后,将混合物于室温下搅拌16小时,然后对纯水透析两次,冻干未被透析的部分,得到10mg用作免疫原的去甲吗啡-BSA。
在制备“去甲吗啡载体”时,按下述方法使去甲吗啡通过去甲吗啡-BSA中的BSA携带于载体上。
于37℃下将100μl去甲吗啡-BSA溶液(400μg/ml)和100μl聚苯乙烯胶乳(因体成分4%(重量),颗粒大小0.8μm(直径),溶剂为pH7.4的0.1M磷酸钠缓冲液)振荡3小时,使去甲吗啡-BSA物理结合于聚苯乙烯胶乳表面上,从而制得“去甲吗啡载体”悬浮液。
实施例6
“去甲吗啡载体”的制备
于37℃下将一半实施例5的“去甲吗啡载体”继续加热5小时,得到“去甲吗啡载体”悬浮液。
实施例7
“抗体载体”的制备
将100μl参考实施例1的对吗啡和去甲吗啡有很高特异性的单克隆抗体溶液(1mg/ml,溶剂:0.1M磷酸盐缓冲液,pH7.4)与100μl用作载体的聚苯乙烯胶乳(固体成分4.0%(重),颗粒大小0.8μm(直径),溶剂:0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)]混合,并于37℃将混合物振荡3小时,以使单克隆抗体物理结合于聚苯乙烯胶乳表面上,从而制得“抗体载体”。
实施例8
检测用健康人尿稀释的吗啡
将实施例5中制备的“去甲吗啡载体”和实施例7中制备的“抗体载体”各25μl间隔一定距离逐滴加在反应板的两个相邻点上,以使这些试剂彼此不相接触,并以一定距离间隔彼此分开逐滴加入各5μl含浓度为0、0.1、0.2或0.3ppm的用健康人尿稀释的“标准吗啡溶液”(HYLAND DIAGNOSTIC公司制造),使之不与试剂接触。然后立即用搅拌棒搅拌并混合同一反应板上的“去甲吗啡载体”、“抗体载体”和被检样品。连续慢慢移动反应板,用肉眼观察聚苯烯胶乳颗粒聚集现象,当“标准吗啡溶液”的吗啡浓度为0ppm时16秒种聚集,为0.1ppm时22秒钟聚集,为0.2ppm时35秒钟聚集,为0.3ppm时则180秒或更长时间聚集。
实施例9
检测用健康人尿稀释的吗啡
将实施例6中制备的“去甲吗啡载体”和实施例7中制备的“抗体载体”各25μl隔开一定距离逐滴加在反应板的两个相邻点上,使这些试剂彼此不相接触,并以一定间隔彼此分开逐滴加入各5μl含浓度为0、0.1、0.2或0.3ppm用健康人尿稀释之吗啡的“标准吗啡溶液”(HYLAND DIAGNOSTIC公司制造),使之不与试剂接触,然后立即用搅拌棒搅拌并混合同一反应板上的“去甲吗啡载体”、“抗体载体”和被检样品。持续慢慢移动反应板,用肉眼观察聚苯烯胶乳颗粒聚集现象,可见“标准吗啡溶液”的吗啡浓度为0ppm时13秒聚集,0.1ppm时19秒聚集,0.2ppm时30秒聚集,0.3ppm时150秒或更长时间聚集。
比较实施例1
检测可卡因
检测方法同实施例8所述,不同的是用可卡因代替实施例8中的吗啡制备标准溶液。
结果用肉眼观察到当可卡因浓度为0ppm时聚苯烯胶乳颗粒在16秒钟聚集,浓度为0.3ppm时也在16秒钟聚集。
比较实施例2
检测乙基吗啡
检测方法同实施例8所述,不同的是用乙基吗啡代替实施例8中的吗啡制备标准溶液。
结果用肉眼观察到当乙基吗啡浓度为0ppm时聚苯烯胶乳颗粒于16秒钟聚集,浓度为0.3ppm时也于16秒钟聚集。
比较实施例3
检测可卡因
检测方法同实施例9所述,不同的是用可卡因代替实施例9中的吗啡制备标准溶液。
结果用肉眼观察到当可卡因浓度为0ppm时聚苯烯胶乳颗粒在13秒钟聚集,浓度为0.3ppm时也在13秒钟聚集。
比较实施例4
检测乙基吗啡
检测方法同实施例9所述,不同的是用乙基吗啡代替实施例9中的吗啡制备标准溶液。
结果用肉眼观察到当乙基吗啡浓度为0ppm时聚苯烯胶乳颗粒在13秒钟聚集,浓度为0.3ppm时也在13秒钟聚集。
可以期望利用“培养本发明的杂交瘤细胞株制得的与吗啡(作为一种镇痛剂)有高度特异反应活性性的单克隆抗体”检测吗啡。
根据本发明,使用主要包含“去甲吗啡载体”和“抗体载体”的吗啡检测药盒,可以高度特异、迅速、高度敏感而又简便地检测吗啡。
实施例10
制备“NM结合蛋白”
按类似实例1的方法,得到130mg ABNM。
利用上述ABNM按下述方法制备去甲吗啡和BSA的结合产物(以下简称为“去甲吗啡-BSA”)。
将0.3ml二甲基甲酰胺与15mgABNM和溶解在1.5ml水中的10mg牛血清白蛋白(BSA)的水溶液混合后,加入0.5ml 10%EDPC,调节pH至5.5,在室温下搅拌20小时,用纯水透析混合物两次,然后将未透析部分冻干,得11mg用作免疫原的去甲吗啡-BSA。
实施例11
生产和纯化抗体
按日本专利申请号234826/1988所述的方法由杂交瘤MO-3菌株(FERM 1911)生产对吗啡和去甲吗啡具有高度特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体的生产按下述方法进行:
将107悬浮于PBS的菌株细胞向BALB/C小鼠(雄性,8周龄,2周前通过腹膜注射0.5ml姥鲛烷(pristan)]腹膜内注射。大约一周后发现小鼠体重明显增加,约1-3周后适当取出腹水,如此获得的单克隆抗体的效价为106-108。
按以下方式从所获腹水中纯化单克隆抗体。
将上述腹水对Tris-HCl(pH7.4)透析,且流过用同样缓冲液平衡的DEAE-纤维素柱。通过的部分用50%饱和硫酸铵盐析,将产生的沉淀溶于PBS,并向同样的缓冲液透析,发现如此获得的抗MO单克隆抗体的纯度高于按SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法所获得的任何抗体的纯度。
按照使用如上所述制得的纯化抗MO单克隆抗体的MO检测法就可能进行对MO的高灵敏和快速检测。
实施例12
制备用于MO检测盒的“NM结合蛋白”和“酶标记抗体”
按下述方法制备检测盒用的“NM结合蛋白”和“酶标记抗体”。
将按实施例10的方法制备的“NM结合蛋白”于4℃向PBS透析过夜,然后按每个0.5ml分装至各瓶中,冻干后保存(100-3000μg/瓶),以提供本发明检测盒的“NM结合蛋白”。在检测MO时,向瓶中加入0.5ml蒸馏水以充分溶解冻干的粉末,且在使用前用PBS稀释至所需浓度。
按参考实例2所示方法利用MO-3菌株(FERM-P1911)获得作为纯化单克隆抗体的“酶标记抗体”中的抗体。
使用单克隆抗体,按下面所述的已知方法用酶标记抗体,制备本发明检测盒的“酶标记抗体”。
首先,将7.32g辣根过氧化物酶溶于1ml蒸馏水中,并加入200μl过氧化钠,于室温下放置30分钟。然后将酶溶液于4℃向1mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)过夜透析,再加入100μl0.2M碳酸钠缓冲液(pH9.5)以调节pH至9.5。另外,将溶解于PBS的8.78mg单克隆抗体(MO-3)于4℃向0.01M碳酸钠缓冲液(pH9.5)过夜透析。将如此得到的过氧化物酶和单克隆抗体混合后放置于室温放置2.5小时,再向反应混合物中加入200μl 0.4%氢硼化钠溶液,于4℃放置2小时。将如此获得的过氧化物酶标记的单克隆抗体于4℃向PBS过夜透析,再用0.1M PBS(pH7.4)稀释至100倍,将其按每个0.2ml分装至各瓶中,冻干保存,提供MO检测盒的“酶标记抗体”(10μg/瓶),当检测MO时,将0.2ml蒸馏水加至瓶中,以充分溶解冻干粉末,并在使用前用0.1M PBS(pH7.4)适当稀释该溶液。
实施例13
利用“酶标记抗体”绘制MO的校正曲线
将每份100μl的NM-BSA“NM结合蛋白”(去甲吗啡与BSA的结合产物,2μg/ml)分加至用于免疫检测的96井平底平板中,该平板为固相支持物(由Nunc公司用苯乙烯制造的一种微量平板),将平板于4℃放置过夜,以将NM-BSA固定于每井中。然后,为了防止“酶标记抗体”非特异性地吸附于平板,加入含10%胎儿血清(pH7.4的磷酸盐缓冲液,含0.05%Tween20),于室温下放置30分钟。在用同样冲洗液冲洗后同时向每井中加入用同样冲洗液稀释至10倍的库存健康人血清制备的50μl标准MO溶液[(0-30)ng/ml](Nescol X,商品名,由The Chemo-and Sero-Therapeutci Research Institute研究所制造)以及50μl按实施例10制得的“酶标记抗体”,混合后于室温放置30分钟。再在用同样冲洗液冲洗后按每份100μl向各井中加入“底物液”(10mg邻苯二胺和10μl 35%H2O2溶解于25ml 50m M柠檬酸缓冲液中,pH5.0),于避光处室温下放置5分钟。最后,向每井中加入50μl 2N硫酸以终止酶促反应,利用微量平板光度计于492nm处测定溶液的吸收值,结果使用“酶标记抗体”的MO检测法能够利用其上固定有“NM结合蛋白”的96井平底平板(Nunc公司的由聚苯乙烯制造的微量平板)高度灵敏地在40分钟内测定MO。结果示于表1。
实施例14
MO的收回试验
按实施例13的方法检测MO,不同的是分别按3ppb、10ppb及30ppb MO的量向实施例13的“Nescol X”中加入MO盐酸。结果发现所加MO的量与检测出的MO量基本相同,结果见表2。
表2
加入MO后血清中MO浓度 测定结果 回收率
(ng/ml) (%)
观测值(读数) 计算值
0 0.051 0.51 -
3 0.33 3.3 96
10 1.1 11 105
30 3.1 31 102
实施例15
用ELISA法和HPLC法测定血液中吗啡值的比较
将酶联免疫吸附法(ELISA检测法)和常规高效液相层析(HPLC法)所测得的在吗啡止痛治疗中药物控制实际患者(91人)的结果彼此进行了比较。发现结果实际相同,见表2。
Claims (7)
1、一种由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞株产生的抗吗啡单克隆抗体,特征在于其基本上不与可待因反应,但与吗啡有高度特异的反应活性。
2、一种制备抗吗啡单克隆抗体的方法,该方法包括培养由小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合而得到的杂交瘤细胞株,特征在于该抗体基本上不与可待因反应,但与吗啡有高度特异反应活性。
3、由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合而得到的杂交瘤细胞株,特征在于其基本上不与可待因反应,但与吗啡有高度特异的反应活性。
4、一种吗啡检测药盒,其主要包含:
(a)一种携带对吗啡和去甲吗啡有高度特异免疫反应活性之抗体的载体,及
(b)一种携带去甲吗啡的载体。
5、一种检测去甲吗啡的方法,其包括使用主要包含:
(a)一种携带与吗啡和去甲吗啡有高度特异免疫反应活性之抗体的载体,及
(b)一种携带去甲吗啡的载体。
的吗啡检测药盒,使被检样品中的吗啡和携带于载体上的去甲吗啡竞争性地与携带于载体上的抗体反应。
6、一种吗啡检测法,它包括将固定在一种固相支持物上的去甲吗啡结合大分子蛋白以及待检样品中的吗啡与含单克隆抗体的试剂完全反应,该单克隆抗体对酶标记的吗啡具有高度特异的免疫活性。
7、一种用于检测吗啡的检测药盒,它主要包括:
(a)去甲吗啡结合大分子蛋白,及
(b)含有一种单克隆抗体的试剂,该抗体对酶标记的吗啡具有高度特异的免疫反应活性。
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