CN1319105A - 制备针对环孢菌素及其代谢物特异性区域的抗体的方法 - Google Patents
制备针对环孢菌素及其代谢物特异性区域的抗体的方法Info
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Abstract
本发明涉及抗环孢菌素(CSA)和/或环孢菌素代谢物/衍生物的特异性部位的多克隆和单克隆抗体的制备。这些多克隆和单克隆抗体的反应性使得它们特别适用于治疗药物监测(TDM)的免疫检测。这些免疫检测或TDM试剂盒可以包括针对环孢菌素和/或其代谢物的特异性部位的多克隆或单克隆抗体。这些试剂盒也可以包括多克隆抗体、多克隆和单克隆抗体或一组单克隆抗体的不同组合物。制备环孢菌素和环孢菌素代谢物的缀合物免疫原免疫宿主动物以产生直接针对环孢菌素或环孢菌素代谢物分子的特异性区域的抗体。通过测定特定抗体的特异性结合区域,开发了能够区分原分子、活性代谢物、无活性代谢物和其它结构类似的免疫抑制化合物的免疫检测方法。并描述了使用二乙烯砜做为连接臂分子形成环孢菌素和环孢菌素代谢物蛋白缀合免疫原。
Description
发明领域
本发明涉及制备抗环孢菌素(Cyclosporine)和/或环孢菌素代谢物、衍生物和类似物的特异性部位的多克隆和单克隆抗体的方法。这些多克隆和单克隆抗体的反应性使得它们特别适用于治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)的免疫检测。这些免疫检测或TDM试剂盒可以包括针对环孢菌素(CSA)和/或其代谢物、衍生物及类似物的特异性部位的多克隆或单克隆抗体。这些试剂盒也可以包括多克隆抗体、多克隆和单克隆抗体或一组单克隆抗体的不同组合。
发明背景
环孢菌素是一种真菌来源(从Tolypocladium Inflatum真菌分离)的11-氨基酸环肽,它含有两个稀有氨基酸:(4R)-4-((E)-2丁烯基)-4,N-二-甲基-1-苏氨酸(Bmt)和I-α-氨基丁酸(Abu),以及几个肽键N-甲基化的残基(残基1、3、4、6、9、10和11)。环孢菌素的结构如图1所示。
目前,最常用于预防移植患者的器官排斥的两种免疫抑制药物是环孢菌素(CSA)和他克莫司(FK-506或FK)。雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)是另一种已知的免疫抑制剂。环孢菌素的主要靶点似乎是辅助性T淋巴细胞。环孢菌素作用于T细胞激活过程的早期,它对正常时由T细胞产生的因子激活的其它细胞类型有继发效应。环孢菌素抑制辅助性T细胞产生白细胞介素2(IL-2),由此阻断T细胞激活和增殖(免疫反应的放大)。它在预防和治疗急性进行性排斥均有效。目前的CSA作用机制模式提示,在T细胞的胞浆内,CSA与被称为亲免蛋白的特异性结合蛋白结合。该CSA-亲免蛋白复合物再结合并阻断被称为钙调神经磷酸酶的磷酸酶。后者是激活因子(NF-ATc)从胞浆到胞核转位所必需的,通常这种激活因子在胞核内结合并激活某些基因的增强子/启动子。在有CSA存在时,胞浆的激活因子不能到达细胞核,IL-2(和其它早期激活因子)的转录被强烈抑制。这种抑制的结果,T细胞不能增生,γ-干扰素的分泌被抑制,不能诱导MHCⅡ型抗原,也就不能进一步激活巨噬细胞。
环孢菌素治疗有不同的副作用,包括中毒性肾损伤、高血压、高血钾症、低镁血症、高尿酸血症。已证明神经或肾中毒性损伤与某些环孢菌素代谢物相关。环孢菌素药物监测分析的必要条件是测定原环孢菌素药物和有免疫抑制及毒性活性的代谢物的水平。需要有改良的方法来监测CSA和/或CSA代谢物及衍生物的水平。
发明概述
本发明是描述制备能诱导产生抗环孢菌素相关化合物特异性抗体的免疫原性缀合物的方法。为了这种应用目的,术语环孢菌素相关化合物意指包括任何或所有的环孢菌素分子自身和/或不同的环孢菌素代谢物及衍生物。制备环孢菌素和环孢菌素代谢物缀合免疫原并用其免疫宿主动物,以产生直接针对环孢菌素或代谢物分子的特异性区域的抗体。通过测定特定抗体的特异性结合区域,开发了能够区分原分子(parent molecule)、活性代谢物、无活性代谢物和其它环孢菌素衍生物/类似物的免疫检测方法。描述了使用二乙烯砜(DVS)做为连接臂分子形成环孢菌素/代谢物-蛋白缀合物免疫原。
首先,本发明提供能与环孢菌素相关化合物结合的抗体。优选这些能识别所述环孢菌素相关化合物或CSA代谢物AM1或AM9的特异性区域的抗体。单克隆抗体(mcAb)最佳。还提供了制备能识别环孢菌素相关化合物的特异性区域的抗体的方法,所述的方法包括:a)给予动物包含环孢菌素相关化合物、连接臂分子和蛋白载体的免疫原,使其产生针对该环孢菌素相关化合物的特异性免疫原性反应;b)从所述动物收集针对所述环孢菌素相关化合物的抗体;和c)通过比较第一种和第二种环孢菌素相关化合物的抗体反应性鉴定抗体结合部位。这些方法中所述连接臂分子优选为二乙烯砜,并最好环孢菌素相关化合物于氨基酸残基1或9连接到载体上。所述蛋白载体可优选匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)或人血清白蛋白。也提供了使用杂交瘤细胞完成上述方法。
另一方面,本发明提供测量哺乳动物体内环孢菌素相关化合物水平的免疫检测方法,包括a)将所述哺乳动物的生物标本与能与环孢菌素相关化合物结合的抗体一起孵育;和b)测定环孢菌素相关化合物与所述抗体的结合。在这些检测中优选使用识别所述环孢菌素相关化合物或CSA代谢物AM1和AM9的特异性区域的抗体。最优选使用单克隆抗体。也提供测定生物标本中环孢菌素相关化合物水平的免疫检测试剂盒,该试剂盒含有如上所述的一种抗体。还提供测定标本中特定的环孢菌素相关化合物的量的检测方法,包括:a)将所述标本与根据权力要求1的第一抗体接触;b)将所述标本与根据权力要求1的第二抗体接触;和c)测定结合到所述第二抗体的所述特定环孢菌素相关化合物的量。
附图简述
图1描述环孢菌素A(CSA)的结构。
图2描述CSA的主要代谢物及其代谢途径。
图3显示单克隆抗体AM19-9-5A6对CSA代谢物AM1的选择性。
图4显示单克隆抗体对AM9代谢物的选择性。
图5显示单克隆抗体AM19-1-7E12对AM1和AM1c部分的选择性。
图6显示单克隆抗体(MoAbs)对AM1和AM9代谢物的选择性的实施例。
图7显示单克隆抗体AM9-9-4F5对CSA和AM9的选择性。
图8显示单克隆抗体对AM1、AM1c、AM9和AM19代谢物的选择性较对原CSA分子的更大。
图9显示MLR检测步骤。
发明详述
下列实施例描述实施本发明的最佳模式。这些实施例描述CSA代谢物的分离、半抗原的制备、免疫动物诱导抗体应答,抗体反应性鉴定、针对CSA及CSA代谢物或衍生物的多克隆及单克隆抗体的生产和选择及应用本发明提供的抗体的检测方法。
下述实施例并不试图以任何方式限制本发明的范围。实施例1-环孢菌素代谢物的分离和鉴定
环孢菌素在肝脏、小肠和肾脏代谢。文献中用高压液相色谱(HPLC)和质谱法已经鉴定了Ⅰ期和Ⅱ期不同代谢物的结构。CSA主要代谢物如图2所示。代谢反应包括在氨基酸#1的氧化和环化以及在不同氨基酸部位的羟化和去甲基化。
低速离10分钟。将内容物倒入分液漏斗;去除底层的水层,将上层的乙醚层蒸发至干。
2.代谢物分离:
将1.0ml的HPLC级的甲醇加入已干燥的提取物中,涡旋30秒并以2800rpm离心2分钟。将上清液移入自动加样器小瓶,并用下述色谱分析条件注入尿液标本:
柱子 Spherisorb S5 C8 10×250mm
保护柱 Spherisorb S5 C8 4.6×10mm
波长 214nm
过柱时间 90分钟
柱温 60℃
W600梯度表
时间(min) | 流量(ml) | H2O(%) | ACN(%) | MeOH(%) |
0.00 | 4.00 | 41.0 | 39.0 | 20.0 |
55.00 | 4.00 | 41.0 | 39.0 | 20.0 |
55.01 | 4.00 | 30.0 | 50.0 | 20.0 |
65.00 | 4.00 | 30.0 | 50.0 | 20.0 |
65.01 | 4.50 | 5.0 | 0 | 95.0 |
85.00 | 4.50 | 5.0 | 0 | 95.0 |
85.01 | 4.50 | 41.0 | 39.0 | 20.0 |
89.80 | 4.50 | 41.0 | 39.0 | 20.0 |
89.90 | 4.00 | 41.0 | 39.0 | 20.0 |
根据以下典型保留时间收集各代谢物:
保留时间(min) | 修饰 | 代谢物种类 |
14.090 | 在氨基酸1和9位羟基化 | AM19 |
16.118 | 在氨基酸1和9位羟基化,在氨基酸1位侧链环化 | AM1c9 |
22.065 | 在氨基酸4位去甲基化,在氨基酸9位羟基化 | AM4n9 |
32.252 | 在氨基酸1位羟基化 | AM1 |
33.852 | 在氨基酸9位羟基化 | AM9 |
35.929 | 在氨基酸1位羟基化,在氨基酸1位侧链环化 | AM1c |
62.630 | 在氨基酸4位去甲基化 | AM4n |
67.584 | NA | CSA |
以下是从20L尿液批次中回收的不同代谢物量的实例。
代谢物 | 批号P(从20L尿液) | 批号N(从19L尿液) | 批号O(从20L尿液) | |||
量(μg) | 总 量 的% | 量(μg) | 总 量 的% | 量(μg) | 总 量 的% | |
AM19 | 849 | 5.0 | 1053 | 7.7 | 719 | 3.9 |
AM1c9 | 401 | 2.4 | 489 | 3.6 | 230 | 0.12 |
AM4n9 | 1323 | 7.8 | 1071 | 7.8 | 786 | 4.2 |
AM1 | 5640 | 33.2 | 4998 | 36.5 | 6600 | 35.5 |
AM9 | 3624 | 21.3 | 2350 | 17.1 | 3852 | 20.7 |
AM1c | 3814 | 22.5 | 2352 | 17.2 | 4766 | 25.6 |
AM4n | 1332 | 7.8 | 1395 | 10.2 | 1643 | 8.8 |
总量 | 16,983 | 13,708 | 18,596 |
3.代谢物的定量分析:
重新将分离的代谢物溶入1ml MeOH中。取25μl该混合液并加入25μl CSG(20,000ng/ml)和300μl的流动相,涡旋并将100μl注入到下述条件的HPLC:
柱子 Spherisorb S5 C8 4.6×250mm
温度 60℃
流速 1.0ml/min
波长 214nm
流动相 33%H2O/47%ACN/20%MeOH4.代谢物浓度:
(代谢物峰面积÷内标峰面积)×0.5μg×(1/0.025)x稀释因子=代谢物量(μg)
百分纯度:
(代谢物峰浓度μg/ml÷所有峰浓度μg/ml)×1005.CSA代谢物的最终纯化:
第一轮用HPLC纯化分离的代谢物通常纯度都低于97%。因此需要用不同的HPLC柱子和流动相做第二次纯化。
将复制的代谢物注入采用下述条件的HPLC:柱子 SymmetryPrep C187μm 7.8×300mm保护柱子 Spherisorb S5 C8 4.6×10mm波长 214nm柱温 60℃
使用由水和甲醇组成的两个溶剂梯度纯化该代谢物。分离的关键是在流动相的甲醇部分加入甲基叔丁基醚(MTBE)(每500ml甲醇用70ml MTBE)。使用的确切梯度根据纯化的代谢物而不同。实施例2-CSA-二乙烯砜的合成以及与蛋白载体的缀合1.CSA-DVS半抗原的制备:
将环孢菌素(30mg,25μmol,U.S.Pharmacopeia,Rockville,MD,Cat#15850-4 USP参照标准),乙烯砜(147mg,1.3mmol)和苯甲基三乙基氯化铵(11.4mg,50μmol)加入到6ml的二氯甲烷中搅拌,然后加入0.4ml的40%氢氧化钾水溶液。将该混合物快速搅拌1.5小时,再用2M的盐酸酸化并用二氯甲烷稀释。分离有机相,用水洗涤,经硫酸镁干燥,使溶剂蒸发。2.CSA-DVS半抗原的分析:
用液相色谱-电子喷射离子化质谱法(LC/MS)鉴定了一个质量符合CSA-DVS的产物(1),用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱(semi-prepcolumn);80%甲醇同溶剂;4ml/min;50℃;214nm)纯化该产物。结果得到3.3mg纯的CSA-DVS,获得600 MHz质子核磁共振谱。3.CSA-DVS-蛋白缀合物的制备:
将CSA-DVS(1.0mg)溶解于350μl的二甲基亚砜中,慢慢加入快速搅拌的溶于1.2ml磷酸盐缓冲液(pH7.6)中的匙孔血蓝蛋白(KLH)(1.6mg)溶液中。将该混合物在室温下搅拌24小时。再用磷酸缓冲盐溶液(PBS)透析该物质过夜。用Lowry蛋白分析法测定蛋白浓度,用凝胶电泳和蛋白质印迹分析证实CSA与蛋白偶接。以同样的方法,用人血清白蛋白(HSA)可制备CSA-DVS-HAS缀合物。也可以应用这些方法,将本领域中已知的其它蛋白载体用于制备CSA-DVS缀合物。实施例3-AM1-二乙烯砜的合成以及与蛋白载体的缀合1.AM1-DVS半抗原的制备:
将AMl(4.0mg,3.3μmol)、碳酸钾(70mg,0.51mmol)和少量18-冠-6晶体溶于4ml的无水丙酮中,将该溶液在室温下搅拌45分钟。然后加入乙烯砜(31.0mg,0.26mmol),并在室温下搅拌反应过夜。然后用乙酸乙酯稀释该混合物,再依次用水、稀释的盐酸水溶液和盐水(饱和氯化铵)洗涤。将有机相经硫酸镁干燥,使溶剂蒸发。在残留物内加入甲醇并保留溶于甲醇的部分用于纯化。将该反应重复几次,直到获得足够的用于纯化和结合反应的产物。2.AM1-DVS半抗原的分析:
用LC/MS鉴定了两个质量符合AM1-DVS的主要产物(2)。用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱;80%甲醇同溶剂;4ml/min;50℃;214nm)纯化该产物。AM1-DVS(种类1)和AM1-DVS(种类2)均得到600MHz质子核磁共振谱。3.AM1-DVS-蛋白缀合物的制备:
将AM1-DVS(种类1,0.2mg)溶解于30μl的二甲基亚砜,慢慢加入快速搅拌的溶于1.0ml磷酸盐缓冲液(pH7.6)的KLH(1.0mg)溶液中。将该混合物在室温下搅拌24小时,再用PBS透析过夜。用Lowry蛋白分析法测定蛋白浓度。将AM1-DVS(种类2)以相同的方法与KLH缀合。也可将人血清白蛋白(HAS)和本领域已知的其它蛋白载体用作载体制备AM1-DVS缀合物。
实施例4-AM19-二乙烯砜的合成以及与蛋白载体的缀合
1.AM19-DVS半抗原的制备:
将AM19(4.5mg,3.6μmol)、碳酸钾(60mg,0.43mmol)和少量18-冠-6晶体一起混合溶于5ml的无水丙酮,并将该溶液在室温下搅拌45分钟。然后加入乙烯砜(43.0mg,0.36mmol),在室温下搅拌反应过夜。通过将氮气流通入反应烧瓶使所述溶剂蒸发。立即用1N的盐酸水溶液和乙酸乙酯的混合物骤冷残留物。然后用乙酸乙酯稀释有机相,依次用水、和盐水洗涤,然后经硫酸镁干燥并使溶剂蒸发。在该残留物内加入甲醇并将溶于甲醇的部分用于LC/MS纯化。将该反应重复几次,直到获得足够的用于纯化和缀合反应的产物。2.AM19-DVS半抗原的分析:
用LC/MS鉴定了三个质量符合AM19-DVS(1375-Na加合物m/z)的产物。分别将这些产物称为AM19-DVS(1)、AM19-DVS(2)和AM19-DVS(3)以进行鉴定。
ⅰ)AM19-DVS(1)半抗原的鉴定、纯化和特征:
按以下步骤用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱)纯化AM19-DVS(1):将从粗收集物中旋转蒸发所得的AM19-DVS(1)溶解于77%甲醇中,注入HPLC并应用以下条件过柱:77%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nm。将收集的物质再层析直至纯化。用质谱和HPLC评估AM19-DVS(1)的纯度。纯化的AM19-DVS(1)的电喷雾碎裂分布型(electrospray fragmentation profile)与通过氨基酸1的仲羟基的DVS修饰一致。在本应用中,将该半抗原称为AM19-1-DVS(1)。
ⅱ)AM19-DVS(2)半抗原的鉴定、纯化和特征:
按以下两步用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱)纯化AM19-DVS(2)。第一步:将从粗收集物中旋转蒸发的AM19-DVS(2)溶解于80%甲醇中,注入HPLC并用以下条件过柱:80%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nm。第二步:冻干第一步收集的物质,将其溶解于64%甲醇中,注入HPLC并用以下条件过柱:64%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nm。用质谱和HPLC评估AM19-DVS(2)的纯度。纯化的AM19-DVS(2)的电喷雾碎裂分布型与通过氨基酸1的仲羟基的DVS修饰一致。在本应用中,将该半抗原称为AM19-1-DVS(2)。
ⅲ)AM19-DVS(3)半抗原的鉴定、纯化和特征:
按以下两步用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱)纯化AM19-DVS(3)。第一步:将从粗收集物中旋转蒸发的AM19-DVS(3)溶解于60%甲醇中,注入HPLC并用以下条件过柱:76%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nm。用质谱和HPLC评估AM19-DVS(3)的纯度。纯化的AM19-DVS(2)的电喷雾碎裂分布型与通过氨基酸9的羟基团的DVS修饰一致。在本应用中,将该半抗原称为AM19-9-DVS。3.AM19-DVS-蛋白缀合物的制备:
将0.4mg AM19-1-DVS(1)溶解于250μl的二甲基亚砜,慢慢加入快速搅拌的溶于1.0ml磷酸盐缓冲液(pH7.6)中的KLH(1.0mg)溶液中。将该混合物在室温下搅拌24小时,再用PBS透析过夜。用Lowry蛋白分析法测定蛋白浓度。用相同的方法制备AM19-1-DVS(2)0.8mg/KLH,6.0mg;AM19-9-DVS,0.3mg/KLH,1.0mg缀合物和相应的HAS缀合物。也可将本领域中已知的其它蛋白载体用作载体制备AM19-DVS缀合物。实施例5-AM9-二乙烯砜的合成及与蛋白载体的缀金1.AM9-DVS半抗原的制备:
将AM9(11.1mg,9.1μmol)、碳酸钾(80mg,0.58mmol)和少量的18-冠-6晶体一起混合于5ml的无水丙酮中,将该溶液在室温下搅拌45分钟。然后加入乙烯砜(107.5mg,0.911mmol)并在室温下搅拌反应过夜。通过将氮气流通入反应烧瓶蒸发溶剂。立即用1N的盐酸水溶液和乙酸乙酯的混合物骤冷该残留物。然后用乙酸乙酯稀释有机相,依次用水和盐水洗涤,再后经硫酸镁干燥并溶剂蒸发。在残留物内加入甲醇并将溶于甲醇的部分进行LC/MS纯化。将该反应重复几次,直到获得足够的用于纯化和缀合反应的产物。2.AM9-DVS半抗原的分析:
用LC/MS鉴定了两个质量符合AM9-DVS(1375-Na加合物m/z)的产物(1)。分别将这些产物定为AM9-DVS(1)和AM9-DVS(2)。
ⅰ)AM9-DVS(1)半抗原的鉴定、纯化和特征:
按以下步骤用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱)纯化AM9-DVS(1):将从粗收集物中旋转蒸发所得的AM9-DVS(1)溶解于70%甲醇中,注入HPLC并用以下条件过柱:70%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nn。用质谱和HPLC评估AM9-DVS(1)的纯度。纯化的AM9-DVS(1)的电喷雾碎裂分布型与通过氨基酸9的羟基基团的DVS修饰一致。在本应用中,将该半抗原称为AM9-9-DVS。
ⅱ)AM9-DVS(2)半抗原的鉴定、纯化和特征:
按以下步骤用HPLC(Spherisorb C-8半制备柱)纯化AM9-DVS(2):将从粗收集物中旋转蒸发所得的AM9-DVS(2)溶解于70%甲醇中,注入HPLC并用以下条件过柱:70%甲醇同溶剂;4ml/min;35℃;214nm。用质谱和HPLC评估AM9-DVS(2)的纯度。纯化的AM9-DVS(2)的电喷雾碎裂分布型与通过氨基酸1的仲羟基基团的DVS修饰一致。在本应用中,将该半抗原称为AM9-1-DVS。3.AM9-DVS-蛋白缀合物的制备:
将AM9-9-DVS(0.4mg)溶解于300μl的二甲基亚砜中,慢慢加入快速搅拌的溶于1.0ml磷酸盐缓冲液(pH7.6)中的KLH(1.0mg)溶液中。将该混合物在室温下搅拌24小时,再用PBS透析过夜。用Lowry蛋白分析法测定蛋白浓度。用相同的方法制备AM9-1-DVS-KLH和相应的HAS缀合物。也可将本领域中已知的其它蛋白载体用作载体制备AM9-DVS缀合物。
实施例6-免疫接种诱导CSA和/或CSA代谢物/衍生物的特异性抗体应答
基础免疫步骤如下:通常根据蛋白含量以5、10、1 5或20μg的剂量在0天(1°-初级免疫)、第7天(2°-第二次免疫)和第28天(3°-第三次免疫)经皮下或腹腔内注射CSA/CSA代谢物缀合免疫原免疫小鼠。在2°和3°免疫接种后的7-10天小鼠取血收集用于测定抗体应答的血清。各种其它免疫方案也同样有效,包括0天(1°),第7天(2°)和第14,21或30天(3°);0天(1°),第14天(2°)和第28或44天(3°);以及0天(1°),第30天(2°)和第60天(3°)。在第三次免疫接种后第30天,可进行一次加强注射。以后每月可加强免疫接种1次。
在融合步骤前3-5天,对免疫小鼠经静脉内(I.V.)或腹腔内(I.P.)注射溶解于PBS的免疫原进行最后一次加强免疫。这样可增加脾脏(或淋巴结组织)内免疫原特异性B-淋巴细胞的敏感性和数目。在前次注射后2-3周,让循环中的抗体水平降低后给予最后一次加强免疫。
这种免疫程序对于用CSA/CSA代谢物免疫原缀合物免疫小鼠,诱导产生特异性多克隆抗血清和制备特异性单克隆抗体很有用。所述免疫原组合物对于免疫任何能够诱导产生CSA和/或CSA代谢物或衍生物的特异性抗体的动物均有用,例如牛、绵羊、山羊、马、野兔、猪、犬、猫、鸟和猿类。家禽和野生动物均可免疫。所述给予途径可以是任何常规途径,并可以根据免疫动物和本领域技术人员已知的其它因素等而不同。优选非肠道免疫,如皮下、肌肉内、腹腔内或静脉内免疫。也可以用口服或鼻腔给予免疫,包括肠溶包衣口服剂型。
所述组合物的确切制剂取决于免疫动物种类和给予途径。可用溶液如0.9%NaCl(w/v)、PBS或组织培养基或不同佐剂的制剂注射本发明的免疫原。这样在佐剂可包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、二甲基双十八烷基溴化铵、Adjuvax(Alpha-Beta Technology)、Imject Alum(Pierce)、单磷酸脂质A(Ribi Immunochem Research)、Titermax(CytRx)、毒素、类毒素、糖蛋白、脂质、糖脂、细菌细胞壁、亚单位(细菌的或病毒亚单位)、碳水化合物部分(单-、双-、三-、四-、寡和多糖)、硫酸葡聚糖、各种脂质体制剂或皂角苷。可以用不同佐剂与本发明的免疫原缀合物的组合物来制备药用组合物。
可将本发明的缀合物用作免疫原以诱导生成CSA和/或CSA代谢物/衍生物的特异性多克隆抗体,并用以刺激B细胞产生特异性单克隆抗体。也可将它们用作开发和/或研究的工具;免疫检测试剂盒开发中的诊断试剂;预防药物,例如封闭细胞受体的药物;以及作为免疫调节剂的治疗和药物传递组合物。实施例7-测定抗体对CSA和/或CSA代谢物免疫原的反应性的方法
本实施例中应用基本的直接ELISA法(抗原组ELISA)来测定抗体对CSA和/或CSA代谢物的反应性,如下所述:直接ELISA操作程序:
1.使用Falcon的预结合(pro-bind)免疫板。
2.用碳酸盐-重碳酸盐缓冲液将包被抗原(Ag)稀释成1.0μg/ml。使用玻璃试管。
3.在免疫板各孔中加入100μl。4℃保存过夜。
4.倒出孔中液体,每孔用200μl的PBS/0.05%Tween(v/v)洗涤3遍。
5.每孔加入封闭缓冲液(blocking buffer)200μl(PBS/2%BSA(w/v))。在37℃孵育60分钟。
6.同第四步洗涤3次。
7.在每孔中加入100μl在PBS/0.1%Tween(v/v)中适当稀释的测试抗体。在37℃孵育60分钟。
8.同第四步洗涤3次。
9.用PBS/0.1%Tween(v/v)稀释缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG(Pjerce cat#31322)至1∶2000的浓度。每孔加100μl并在37℃孵育60分钟。
10.同第四步洗涤3次。
11.使用Sigma#104碱性磷酸酶底物片(1mg/ml,溶于10%二乙醇胺底物缓冲液)配制酶底物。每孔加入100μl,并在室温下避光孵育。大约间隔15分钟在405nm处可读出吸光度。
应用以下基本步骤测量CSA或CSA代谢物免疫原诱导产生的同种型抗体水平(IgM,IgG和IgA同种型)。同种型抗体ELISA操作程序:
1.使用Falcon预结合免疫板。
2.将包被抗原(Ag)在碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中稀释成1μg/ml每孔中加入100μl。4℃孵育过夜。
3.倒出孔中液体,每孔用200μl的PBS/0.05%Tween(v/v)洗涤3遍。
4.在每孔中加入封闭缓冲液200μl(PBS/2%BSA(w/v))。室温孵育60分钟。
5.同第三步洗涤。
6.每孔中加入100μl未经稀释的组织培养上清液或用PBS/0.1%Tween(v/v)稀释到1/100的小鼠血清。37℃孵育60分钟。
7.同第三步洗涤。
8.用稀释缓冲液(PBS/0.1%Tween(v/v))配备1∶2稀释的EIA级的鼠型抗体(兔抗鼠IgM,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3和IgA,Bio-Rad)。每孔中加入100μl,37℃孵育60分钟。
9.同第三步洗涤。
10.用PBS/0.1%Tween(v/v)稀释缀合碱性磷酸酶的抗兔IgG(Tago Cat#4620)至1∶2000的浓度。每孔中加入100μl,37℃孵育60分钟。
11.同第三步洗涤。
12.使用Sigma#104碱性磷酸酶底物片(1mg/ml,溶于10%(v/v)二乙醇胺底物缓冲液)配制酶底物。每孔中加入100μl,室温避光孵育。间隔大约15分钟在405nm处可读出吸光度。
13.利用兔抗小鼠同种型抗体对不同浓度的鼠型和鼠亚型特异性免疫球蛋白(Zymed Labs.Inc)的ELISA反应产生的剂量-反应曲线,可将吸光度读数转变成每毫升血清中的抗体微克数。
应用以下步骤测定抗体与CSA或CSA代谢物/衍生物的特异部位的结合,并对抗体与FK-506、雷帕霉素和KLH或HSA蛋白的交叉反应进行定量。抑制性ELISA操作程序:
1.使用Falcon预结合免疫板。
2.将包被抗原(Ag)在碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中稀释成1μg/ml。每孔中加入100μl。4℃孵育过夜。
3.同天准备抑制抗原管。将抗体等份分装到玻璃试管内。在乙醇中配制适当浓度的抗原,并以每250μl抗体加10μl乙醇溶液的量将抗原加入分装的抗体中。涡旋试管,4℃孵育过夜。
4.倒出孔中液体,每孔用200μl的PBS/0.05%Tween(v/v)洗涤3遍。
5.每孔中加入封闭缓冲液200μl(PBS/2%BSA(w/v))。室温孵育60分钟。
6.同第四步洗涤。
7.将抑制管的内容物转到抗原包被板内,每孔中加入100μl,37℃孵育60分钟。
8.同第四步洗涤。
9.用PBS/0.1%Tween(v/v)稀释缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG(Pierce cat#31322)至1∶5000的浓度。每孔中加入100μl,37℃孵育60分钟。
10.同第四步洗涤。
11.使用Sigma#104碱性磷酸酶底物片(1mg/ml,溶于10%(v/v)二乙醇胺底物缓中液)配制酶底物。每孔中加入100μl,室温避光孵育。大约间隔15分钟在405nm处可读出吸光度。
在直接、同种型和抑制性ELISA实验中使用的缓冲液是:
包被缓冲液(碳酸钠/重碳酸钠0.05M.rH9.6)
碳酸钠(Fisher,cat#S-233-500) 2.93g
重碳酸钠(Fisher,cat#S-263-500) 1.59g
用1M HCl或1M NaOH调pH至9.6,4℃保存。
10×PBS缓冲液
磷酸二氢钾(Fisher,cat#P-284B-500) 8.00g
磷酸氢二钾(Fisher,cat#S-373-1) 46.00g
氯化钠(Fisher,cat#S-671-3) 320.00g
氯化钾(Fisher,cat P-217-500) 8.00g
溶解在4升的蒸馏水中,室温保存。
稀释缓冲液(1×PBS/0.1%Tween)
10×PBS 50.0ml
蒸馏水 450ml
Tween-20(聚氧乙烯-山梨醇月桂酸酯Sigma,cat#P-1379)0.5ml
调节pH至7.2,室温保存。
洗涤缓冲液(1×PBS/0.05%Tween)
10×PBS 200ml
蒸馏水 1800ml
Tween-20 1.0ml
调节pH至7.2,室温保存。
封闭缓冲液(1×PBS/2%BSA)
1×PBS 100ml
牛血清蛋白BSA(Sigma,cat#A-7030) 2.0g
4℃保存。
底物缓冲液(10%二乙醇胺)
二乙醇胺(Fisher,cat#D-45-500) 97.0ml
氯化镁(Fisher cat#M-33-500) 100.0mg
调节pH至9.8,4℃避光保存。
这里描述了用直接ELISA、同种型和抑制性ELISA步骤来检测鼠抗体(多克隆抗体和单克隆抗体),然而这些步骤经修改也可用于其它动物种类,包括但不限于兔、豚鼠、绵羊或山羊的抗体。实施例8-多克隆抗体对CSA-DVS-KLH免疫原的反应性
用实施例2所述CSA-DVS-KLH免疫原在小鼠体内制备多克隆抗血清,免疫方案如实施例6所述。用直接ELISA法(如实施例7所述)检测第二次和三次免疫接种后10天收集的单个小鼠血清的抗体滴度,用CSA、CSA缀合物或KLH抑制剂通过抑制性ELISA进一步筛选。表1所示是具有良好抗CSA反应性的小鼠多克隆血清的实例。CSA和CSA-DVS-HSA以剂量依赖的形式抑制抗体结合到CSA-DVS-HSA包被的ILISA板上。KLH或FK-DVS-KLH缀合物不抑制抗体结合。
用抗原组ELISA检测法进一步确定这些小鼠血清的特点,结果如表2所示。这些结果证明,免疫小鼠血清对CSA-DVS、AM19-1-DVS(1)、AM19-1-DVS(2)和AM9-1-DVS HAS缀合物有良好的反应性。这些血清对AM19-9-DVS-HAS缀合物的反应性低。该结果表明,这些抗血清识别CSA/CSA代谢物分子的表位,而且当DVS结合到9位氨基酸残基时可显著减低抗体反应性(即DVS与9位氨基酸残基的连接封闭表位的识别位点)。这些血清对CSA抗原有特异性并且不与FK、雷帕霉素或HSA抗原反应。用KLH包被的ELISA板观察到对CSA-DVS-KLH缀合物的KLH载体分子的显著反应。
为进一步确定这个多克隆抗体反应的特性,进行了对CSA-DVS-HAS缀合物的抑制性ELISA实验。结果如表3所示。CSA和所有CSA代谢物均抑制该多克隆血清(观察到与CSA代谢物结合的某些变异)。这些血清不能结合FK、雷帕霉素、KLH或HSA分子上的表位。这些结果显示所述CSA-DVS-KLH免疫原诱导产生针对CSA和CSA代谢物的多克隆抗血清。
表1:显示小鼠多克隆血清的CSA特异性的抑制性ELISA
(CSA-DVS-KLH免疫原)
抑制抗原浓度(μg/100μl) | 小鼠1 | 小鼠2 | ||||||
CSA | CSA-DVS-HSA | KLH | FK-DVS-KLH | CSA | CSA-DVS-HSA | KLH | FK-DVS-KLH | |
10 | 82.9 | 85.4 | 0 | 0 | 86.8 | 83.3 | 0 | 0 |
5 | 80.4 | 83.2 | 0 | 0 | 85.9 | 70.7 | 0 | 0 |
2.5 | 75.9 | 80.3 | 0 | 0 | 73.3 | 54.4 | 0 | 0 |
1.25 | 72.1 | 68.3 | 0 | 0 | 66.8 | 47.4 | 0 | 0 |
0.625 | 56.5 | 62.0 | 0 | 0 | 48.8 | 28.4 | 0 | 0 |
0.313 | 43.4 | 43.3 | 0 | 0 | 19.6 | 10.1 | 0 | 0 |
0.156 | 23.0 | 30.3 | 0 | 0 | 6.9 | 2.2 | 0 | 0 |
(结果按抑制百分率表示)
表2:小鼠多克隆抗体(CSA-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 鼠1 | 鼠2 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 0.991 | 100 | 0.977 | 100 |
AM9-1-DVS-HSA | 1.304 | >100 | 1.218 | >100 |
AM19-9-DVS-HSA | 0.290 | 29.3 | 0.453 | 46.4 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 1.099 | >100 | 1.462 | >100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 1.212 | >100 | 1.128 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0.005 | 0 | 0.010 | 1.0 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
*反应百分率=测试抗原OD/CSA-DVS-HSA的OD×100
表3:用CSA/CSA代谢物、雷帕霉素、FK、KLH、和HSA抗原对小鼠血清(CSA-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠血清 |
CSA | 65.1 |
AM1 | 96.2 |
AM1c | 98.O |
AM4n | 59.5 |
AM1c9 | 60.5 |
AM19 | 57.2 |
AM9 | 70.7 |
FK | 31.9 |
雷帕霉素 | 28.2 |
KLH | 30.2 |
HSA | 24.9 |
实施例9-多克隆抗体对AM1-DVS-KLH免疫原的反应性
用实施例2描述的AM1免疫原在小鼠体内制备多克隆抗血清,免疫方案如实施例6所述。用直接ELISA法检测第二次和三次免疫10天后收集的单个小鼠血清的抗体滴度。检测具有高抗-CSA滴度的小鼠血清对抗原组的反应的特异性。结果如表4所示。
这些结果显示,用缀合到KLH载体上的AM1-DVS抗原免疫的小鼠显示对CSA抗原有良好的抗体反应性,并与AM19-1-DVS(1)、AM19-1-DVS(2)和AM9-1-DVS抗原具有交叉反应性。这些血清对AM19-9-DVS抗原反应性较低。与前一个实施例一样,该结果表明,DVS与第一位氨基酸残基连接时,这些抗血清识别CSA/CSA代谢物缀合物的表位,但当DVS结合到第九位氨基酸残基时可显著减低抗体反应性(即掩盖了抗体的表位识别位点)。这些血清对CSA/CSA代谢物的表位有特异性且不与FK、雷帕霉素或HSA抗原反应。这些小鼠对免疫原缀合物的KLH载体有显著反应。
为进一步确定这些多克隆抗体反应的特性,按实施例7所述进行了对CSA-DVS-HAS缀合物的抑制性ELISA实验。结果如表5所示。CSA和CSA代谢物可抑制这些多克隆血清。然而根据抑制分子不同,抑制率在39-100%之间变化。这些多克隆抗血清对CSA/CSA代谢物是特异性的,因为没有观察到对FK、雷帕霉素、HSA或KLH抗原的抑制作用。
表4:小鼠多克隆抗体(AM1-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 鼠1 | 鼠2 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 0.780 | 100 | 0.622 | 100 |
AM9-1-DVS-HSA | 1.037 | >100 | 0.966 | >100 |
AM19-9-DVS-HSA | 0.483 | 61.9 | 0.583 | 93.7 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 1.075 | >100 | 1.244 | >100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 0.982 | >100 | 1.187 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
*反应百分率=测试抗原OD/CSA-DVS-HSA的OD×100
表5:用CSA/CSA代谢物、雷帕霉素、FK、KLH、和HSA抗原对小鼠多克隆血清(AM1-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠1 | 小鼠2 |
CSA | 96.6 | 56.2 |
AM1 | 100 | 96.7 |
AM1c | 96.9 | 99.5 |
AM4n | 86.8 | 72.6 |
AM1c9 | 75.6 | 92.7 |
AM19 | 39.2 | 84.7 |
AM9 | 87.9 | 88.6 |
FK | 3.5 | 13.0 |
雷帕霉素 | 0 | 12.4 |
KLH | 8.9 | 5.8 |
HSA | 1.8 | 14.9 |
实施例10-多克隆抗体对AM19-DVS-KLH免疫原的反应性
用AM19-1-DVS(1)、AM19-1-DVS(2)或AM19-9-DVS KLH缀合物(如实施例4所述)第二次和第三次免疫接种动物(如实施例6所述)后的第10天收集血清样本。用直接ELISA法检测这些血清样本对特异性半抗原的抗体滴度。将显示对AM19有高抗体反应性的血清进一步用抗原组ELISA测定进行特征鉴定(表6)。
小鼠1和小鼠2(AM19-1-DVS(1)半抗原)的血清对CSA/CSA代谢物表位具有良好反应性,而与雷帕霉素、FK或HSA表位无交叉反应。小鼠3和小鼠4(AM19-1-DVS(2)半抗原)的血清还与CSA/CSA代谢物表位反应。氨基酸#9的修饰(DVS与氨基酸#9结合)减少抗体的结合。这些血清与雷帕霉素、FK或HAS分子的表位无交叉反应。所有小鼠对KLH载体蛋白均有显著的抗体滴度。
抑制性ELISA结果(表7)证实了对所述CSA代谢物的多克隆抗体的不同反应性,而对CSA原分子几乎没有或没有抑制作用。
表6:小鼠多克隆抗体(AM19-1-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 小鼠1* | 小鼠2* | 小鼠3** | 小鼠4** | ||||
OD | %*** | OD | % | OD | % | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 2.135 | 65.1 | 2.741 | 90.5 | 0.994 | 70.4 | 1.534 | 59.6 |
AM9-1-DVS-HSA | 2.683 | 81.8 | 2.920 | 96.4 | 1.372 | 97.2 | 2.134 | 82.9 |
AM19-9-DVS-HSA | 3.17 | 96.6 | 2.409 | 79.6 | 0.646 | 45.8 | 1.091 | 42.4 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 3.281 | 100 | 3.028 | 100 | 1.181 | 83.7 | 2.351 | 91.4 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 3.020 | 92.0 | 3.188 | >100 | 1.411 | 100 | 2.573 | 100 |
FK-DVS-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0.036 | 1.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
*AM19-1-DVS(1)-KLH免疫原
**AM19-1-DVS(2)-KLH免疫原
***反应百分率=测试抗原OD/AM19-1-DVS(1)或(2)的OD×100
表7:用CSA/CSA代谢物对小鼠多克隆血清(AM19-1-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠1* | 小鼠2* | 小鼠3** | 小鼠4** |
CSA | 4.9 | 23.4 | 0.2 | 4.7 |
AM1 | 35.3 | 53.6 | 58.3 | 64.7 |
AM1c | 76.6 | 87.2 | 76.8 | 82.7 |
AM4n | 26.3 | 50.1 | 44.1 | 47.3 |
AM1c9 | 75.0 | 88.2 | 61.5 | 69.0 |
AM19 | 68.5 | 85.6 | 42.3 | 60.8 |
AM9 | 57.9 | 75.9 | 46.1 | 50.3 |
FK | 0 | 0 | 0 | 0 |
雷帕霉素 | 0 | 0 | 0 | 0 |
KLH | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
*AM19-1-DVS(1)HSA包被板
**AM19-1-DVS(2)HSA包被板
还用AM19-1-DVS(1)缀合物免疫兔。表8抑制性ELISA(AM19-1-DVS(1)HSA包被板)结果显示该多克隆血清的反应性。正如在鼠血清中观察到的一样,该兔血清不识别CSA分子,对CSA代谢物有不同的反应性,并且很强地结合于AM1c、AM1c9、AM19和AM9代谢物。与雷帕霉素、FK、KLH或HSA抗原无交叉反应。表8:用CSA/CSA代谢物对兔多克隆血清(AM19-1-DVS-KLH(1)免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 兔血清 |
CSA | 0 |
AM1 | 55.2 |
AM1c | 89.5 |
AM4n | 55.2 |
AM1c9 | 97.2 |
AM19 | 97.2 |
AM9 | 94.7 |
FK | 0 |
雷帕霉素 | 0 |
KLH | 0 |
HSA | 0 |
用抗原组ELISA法(表9)对用AM19-9-DVS免疫原免疫的小鼠血清进一步进行特征鉴定,它表现为对AM19-9-DVS半抗原有高反应性。观察到对KLH载体的显著的抗体滴度。
来源于小鼠5和小鼠6(AM19-9-DVS半抗原)的血清识别AM19-9-DVS半抗原上的表位。氨基酸#1的修饰(CSA-DVS,AM9-1-DVS或AM19-1(2))抑制抗体结合。认为所述抗体识别部位是在氨基酸1上或是在氨基酸1分子面附近。
当用AM19-9-DVS-HSA包被板进行抑制性ELISA检测时,多克隆血清显示了不同的结果。证明小鼠5的血清识别CSA和CSA代谢物表位。因为这是多克隆血清,所述免疫原可诱导产生既针对原CSA分子的表位也针对代谢物的修饰的表位的抗体。对于小鼠6,该免疫原似乎只诱导产生针对代谢物的修饰表位的抗体,没有产生针对CSA表位的抗体。这两种血清与雷帕霉素、FK、KLH或HSA抗原均无交叉反应。结果如表10所示。
表9:小鼠多克隆抗体(AM19-9-DVS-KLH免疫原)与CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 小鼠5 | 小鼠6 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 0.002 | 0 | 0.017 | 0 |
AM9-1-DVS-HSA | 0.232 | 7.2 | 0.457 | 14.0 |
AM19-9-DVS-HSA | 3.231 | 100 | 3.267 | 100 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 3.411 | >100 | 3.022 | 92.5 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 0.167 | 5.2 | 0.968 | 29.6 |
FK-DVS-HSA | 0.033 | 1.0 | 0.032 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0.020 | 0 | 0.033 | 0 |
HSA | 0.012 | 0 | 0.007 | 0 |
*反应百分率=测试抗原OD/AM19-9-DVS-HSA的OD×100
表10:CSA/CSA代谢物对小鼠多克隆血清(AM19-9-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠5 | 小鼠6 |
CSA | 87.9 | 19.9 |
AM1 | 96.2 | 67.6 |
AM1c | 92.5 | 58.7 |
AM4n | 77.9 | 36.3 |
AM1c9 | 91.0 | 30.2 |
AM19 | 97.8 | 55.4 |
AM9 | 95.1 | 52.5 |
FK | 0 | 0 |
雷帕霉素 | 0 | 0 |
KLH | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 |
实施例11-多克隆抗体对AM9-DVS-KLH免疫原的反应性
用实施例5所述的AM9-1-DVS或AM9-9-DVS缀合物和实施例6所述的免疫接种方案在小鼠体内制备多克隆抗血清。在第二次和第三次免疫后的第10天收集各血清样本,并用直接ELISA法检测这些血清样本对相应的半抗原的抗体滴度。用直接ELISA法也对KLH载体分子的滴度进行了定量。
用抗原组ELISA法对显示对特异性半抗原具有高抗体(Ab)反应性的用AM9-1-DVS缀合物免疫的小鼠血清进一步进行特征鉴定(表11)。这些小鼠的血清识别CSA半抗原、AM9-1、AM19-1(1)和(2)半抗原缀合物(即AM9-1-DVS半抗原可提供所述分子的修饰的(羟化的)氨基酸#9表面作为免疫识别点)。没有观察到对雷帕霉素、FK、KLH或HSA表位的反应。认为抗体与AM19-9半抗原的结合减少是由于掩盖了表位识别位点,(即:用DVS连接臂封闭修饰的氨基酸#9残基可以由此阻断抗体/抗原相互作用)。抑制性ELISA法的结果(表12,AM9-1-DVS-HSA包被板)证明,所述多克隆抗血清不能很强地识别CSA原分子上的表位,并显示出对所述CSA代谢物有不同的反应性。可用AM9-1-DVS免疫原制备和分离针对不同的CSA代谢物的单克隆抗体。也能够成功地筛选特异性抗AM9的单克隆抗体。
表11:小鼠多克隆抗体(AM9-1-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 小鼠1 | 小鼠2 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 1.486 | 76.6 | 1.702 | 69.7 |
AM9-1-DVS-HSA | 1.941 | 100 | 2.443 | 100 |
AM19-9-DVS-HSA | 1.119 | 57.7 | 1.644 | 67.3 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 2.683 | >100 | 2.750 | >100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 2.171 | >100 | 2.859 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
*反应百分率=测试抗原OD/AM9-1-DVS-HSA的OD×100
表12:用CSA/CSA代谢物对小鼠多克隆血清(AM9-1-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠1 | 小鼠2 |
CSA | 3.2 | 17.8 |
AM1 | 61.5 | 41.6 |
AM1c | 94.3 | 75.4 |
AM4n | 25.1 | 43.8 |
AM1c9 | 70.7 | 80.8 |
AM19 | 57.9 | 74.2 |
AM9 | 47.7 | 74.6 |
用抗原组ELISA法对AM9-9-DVS免疫原免疫的对AM19-9-DVS半抗原具有强反应的小鼠血清进一步23进行特征鉴定(表13)。这些小鼠的血清识别AM19-9-DVS-HSA分子上的表位。然而与用CSA、AM9-1、AM19-1(1)和AM19-1(2)-HAS缀合物观察到的一样。DVS与氨基酸#1的结合似乎消除了或显著减低了抗体的结合性,抗体与经氨基酸#1残基连接的抗原组的结合减少被认为是由于掩盖了抗体表位识别位点。由于AM9-9-DVS免疫原可提供分子的氨基酸#1表面作为免疫识别部位,用DVS连接臂封闭氨基酸#1残基可以阻断抗体/抗原相互作用。小鼠血清不与雷帕霉素、FK或HSA抗原发生交叉反应,但观察到对KLH载体蛋白的显著的抗体滴度。
抑制性ELISA法结果(表14,AM19-9-DVS-HSA包被板)证明,这些多克隆血清识别CSA原分子和其代谢物上的表位。可用AM9-9-DVS半抗原制备和分离针对CSA原分子和不同的CSA代谢物的单克隆抗体。
表13:小鼠多克隆抗体(AM9-9-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | 小鼠1 | 小鼠2 | 小鼠3 | |||
OD | %* | OD | % | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 0.032 | 1.0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
AM9-1-DVS-HSA | 0.252 | 8.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
AM19-9-DVS-HSA | 3.077 | 100 | 0.618 | 100 | 1.802 | 100 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 0.018 | 0 | 0 | 0 | 0.777 | 43.1 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 0.015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
FK-DVS-HSA | 0.016 | 0 | 0 | 0 | 0.046 | 2.6 |
Rapa-suc-HSA | 0.048 | 1.6 | 0 | 20.2 | 0 | 0 |
HSA | 0.001 | 0 | 0.060 | 9.7 | 0 | 0 |
*反应百分率=测试抗原OD/AM19-9-DVS-HSA的OD×100
表14:用CSA/CSA代谢物对小鼠多克隆血清(AM9-9-DVS-KLH免疫原)的抑制百分率
抑制抗原 | 小鼠1 | 小鼠2 |
CSA | 65.4 | 83.9 |
AM1 | 66.2 | 83.9 |
AM1c | 71.9 | 78.9 |
AM4n | 51.9 | 57.7 |
AM1c9 | 60.8 | 65.9 |
AM19 | 32.7 | 69.0 |
AM9 | 82.3 | 88.1 |
FK | 24.2 | 34.5 |
雷帕霉素 | 16.9 | 24.1 |
KLH | 12.3 | 35.8 |
HSA | 24.6 | 26.8 |
实施例12-单克隆抗体(MoAb)的制备方法:
单克隆抗体制备的步骤简述如下:
用原药物或代谢物的缀合物免疫小鼠(1,2,3和加强免疫)
↓
从小鼠脾回收分泌抗体的B细胞
+
骨髓瘤细胞系(NS-1、SP-2、和P3X63-Ag8.653)
↓
杂交(用PEG)
↓
增殖
↓
筛选(免疫印迹、ELISA、自动化检测)
↓
克隆(3X)
↓
筛选
↓
增殖
↓
特征鉴定(代谢物交叉反应)
↓
组织培养的单克隆抗体制备
↓
腹水单克隆抗体制备
虽然有很多合适的试剂供应商,我们发现为了获得高融合物产率,分离到稳定的克隆和制备单克隆抗体,最优选以下的试剂供应商。
Dulbecco's Modified Eagles Medium:(DMEM)获自JRHBIOSCIENCES公司,Cat#56499-10L+3.7g/L NaHCO3.
HAT补充成分:(100×-10mM次黄嘌呤钠,40mM氨喋呤,1.6mM胸苷腺嘧啶))获自CANADIAN LIFE TECHNOLOGIES,Cat#31062-037。
HT贮藏液:(100x-10mM次黄嘌呤钠,1.0mM胸苷)获自CANADIAN LIFE TECHNOLOGIWA,Cat#11067-030。
FCS:CPSR-3 Hybrid-MAX获自Sigma,Cat#C-9155。聚乙二醇(PEG):使用PEG4000,SERVA#33136。高压灭菌PEG,稍冷却,用无血清的DMEM稀释至50%(w/v)。融合前一天新鲜配制PEG,放在37℃培养箱内。
融合步骤:
进行融合前一周,解冻骨髓瘤细胞系,并扩大培养,在融合前一天将细胞分瓶。不要将骨髓瘤细胞系保持在持续培养状态。以预防细胞被支原体感染,也预防细胞由于反复传代而发生变化。
例如:
可将SP2/0分成1×104细胞/ml,冻存时至少5×106细胞/每管。
可将NS-1分成1×104细胞/ml,冻存时至少5×106细胞/每管。
可将P3X63-Ag8.653分成1×104细胞/ml,冻存时至少5×106细胞/每管。
培养骨髓瘤细胞系,使在融合当天至少有0.5×107细胞(处于对数生长期)。融合前3-5天,加强免疫小鼠。该小鼠必须与骨髓瘤细胞系的基因型匹配。应该证实骨髓瘤细胞的药物敏感性
应该测试血清支持母代骨髓瘤细胞系生长的能力。为了测试各批血清,用10%、5%、2.5%和1%FCS中克隆母代骨髓瘤细胞(见克隆项下简述)。不需要饲养层细胞。每天检查细胞生长和活细胞率,连续5天。
融合当天:
1.将用于融合的新鲜培养基和FCS放在水浴中。
2.收集骨髓瘤细胞,用无血清的培养基(可用DMEM,RPMI或其它商品化的组织培养基)洗涤3次。
3.从免疫的小鼠取出脾脏(也可用淋巴结细胞);即切开皮肤、腹部肌肉和取出脾脏每步之间,用重新消毒的器械或使用新的无菌器械。
4.将脾脏转入含无菌培养基的塑料培养皿中洗涤脾脏外部3次;每步间用无菌镊子。
5.将脾脏放入装有无血清培养基的塑料培养皿中,切成4块,用无菌的玻璃活塞轻轻挤压,通过筛目获得单细胞悬液。
6.用50-ml的圆锥形的离心管以300×g(用消声器1200rpm)离心脾细胞10分钟。
7.将细胞重新悬浮在10ml的培养基中。取一小份,稀释100倍并计数细胞。
8.离心剩余的脾细胞,再悬浮,再离心。同时洗涤骨髓瘤细胞。最优选NS-1,SP2/0和P3X63Ag8骨髓瘤细胞系,然而也可以使用本领域中已知的其它骨髓瘤细胞系。这些细胞系包括但不限于小鼠细胞系:X63Ag8.653、FO、NS0/l、FOX-NY;大鼠细胞系:Y3-Ag1.2.3、YB2/0和IR983F及不同的兔和人细胞系。
9.用过量的脾细胞按5∶1或10∶1的比例将骨髓瘤和脾细胞加在一起。
10.再离心:现在已将脾细胞和骨髓瘤洗涤3次。11.轻轻地弹击细胞团,将其放入培养箱15分钟使达到37℃。
融合步骤:
1.将试管放置于37℃水浴中(装有温水的烧杯),搅拌下在一分钟内(以0.25ml/15秒的速度加入)1ml的50%PEG(w/v)。PEG融合骨髓瘤细胞膜与抗体分泌(B)细胞。
2.在37℃水浴中搅拌一分钟,溶液将呈块状。
3.在37℃水浴中搅拌下在1分钟内加入1ml的培养基。
4.在一分钟内,搅拌下再加入1ml的培养基。
5.在两分钟内,搅拌下加入8ml的培养基。
6.以300×g(1200rpm,消声器)离心10分钟并吸去上清液。
7.在试管的细胞内加入10ml的培养基+20%FCS(v/v),将细胞倒入塑料陪替氏培养皿中。
8.将细胞放入5%CO2,37℃培养箱中1-3小时,可加强融合产物的稳定性。
9.以每孔100μl培养基含2×105的细胞浓度,将细胞接种于培养板内。
10.第二天,在100μl含有2×HAT的培养基中培养细胞。
-这时,不需要饲养层细胞。
-第三天,在100μl培养基+HAT选择性添加物中培养融合物。通过加入可阻断核苷酸从头合成途径的药物氨喋呤选择杂交瘤细胞(骨髓瘤:脾细胞杂交细胞)。骨髓瘤:脾细胞杂交细胞能够经利用补救途径存活。未融合的骨髓瘤细胞和补救途径酶有缺陷的骨髓瘤:骨髓瘤融合物均死亡。免疫小鼠的未融合脾细胞在组织培养中不能生长。也可使用本领域中已知的其它药物选择骨髓瘤:脾细胞杂交细胞,如氨甲喋呤或重氮丝氨酸。
-如果需要,在第五天在100μl培养基+HAT+脾/胸腺饲养层细胞中培养融合物(1×105细胞/孔)。也可以用成纤维细胞、红细胞或其它细胞种类作为饲养层细胞。
-继续在培养基+HAT中培养融合物一周,融合后第七天,将培养液换成培养基+HT。融合10-14天后,应该出现克隆。
注意:
1.用无血清的培养基洗涤脾细胞、骨髓瘤细胞和进行融合流程的1-6步。
2.胸腺细胞大约在三天后死亡,未融合的脾细胞大约在六天后死亡。
3.杂交细胞相当大,并且几乎总是圆的而且有反光(iridescent)。4.也可能会生长T细胞和粒细胞集落。它们是较小的细胞。
克隆杂交细胞:
1.用无菌的Eppendorf微量吸管头将孔内细胞重新悬浮于200μl,并将其转入5ml无菌小试管中。
2.在原孔中加入200μl培养基(20%FCS v/v)。这是克隆过程的一个安全预防措施。也可将母代细胞转入24孔板作为一种预防。
3.从第一步的杂交细胞悬液中取出20μl,加入20μl的伊红或台盼蓝溶液。在40×放大倍数下,杂交细胞似乎与骨髓瘤细胞系的大小和形态一样。
4.用有限稀释法克隆活细胞:
融合培养基中用20%FCS(v/v)
1×HT
每毫升1×106胸腺细胞每次克隆1400个细胞。
稀释克隆步骤:
用含20%FCS(v/v)的DMEM配制10ml的胸腺细胞克隆悬液。取1400个杂交细胞并稀释至2.8ml。
第一排:平板接种8孔(200μl孔)→100细胞/孔
再加1.2ml培养基到剩余的1.2ml内。
第二排:平板接种8孔(200μl孔)→50细胞/孔
再加2.0ml培养基到剩余物内。
第三排:平板接种8孔(200μl/孔)→10细胞/孔
再加1.2ml培养基到剩余物内。
第四排:平板接种8孔(200μl/孔)→5细胞/孔
再加2.8ml培养基到剩余物内。第五和六排:平板接种16孔(200μl孔)→1细胞/孔。
克隆并筛选阳性孔后,再克隆生长较快、反应较强的克隆。为保证杂交瘤稳定而且产单细胞克隆,将这种克隆法重复3次直到每个测试孔均为阳性。然后可将细胞扩大培养,收集组织培养上清液用于单克隆抗体。也可以使用本技术领域中已知的其它的有限稀释克隆方法、挑取单细胞的单细胞克隆方法以及利用在软琼脂中生长的单细胞克隆法。
单克隆抗体的生产:
很容易从组织培养上清液中回收单克隆抗体。可以用加有FCS的组织培养基或本技术领域中已知的无血清培养基培养杂交细胞。用中空纤维或生物反应器技术能够生产大规模量的单克隆抗体。当用腹水生产单克隆抗体时,特异性单克隆抗体的浓度、亲合力和活性(avidity)都能增加。
腹水的产生:
1.至少在注射杂交细胞5天前,给合格小鼠注射(I.P.)0.5ml的姥鲛烷(pristane)(2,6,10,14-四甲基十五烷)。小鼠的基因型应该与所注射的细胞相配,即NS-1或SP2/0融合物应该用Balb/c小鼠。如果在注射细胞前照射射线,也可使用基因型不相配的小鼠。然而最好使用姥鲛烷处理的Balb/c小鼠。
2.注射(I.P.)106(或更多)用PBS悬浮的杂交细胞,注射前将细胞洗涤3次以去除FCS。
3.大约7-14天后,已可以对小鼠进行腹腔穿刺抽取腹水。用18-1/2G针头收集腹水细胞和腹水。
4.将这些小鼠的至少106腹水细胞接种到多只姥鲛烷处理的小鼠。
5.可将腹水细胞冻存在10%DMSO(v/v),20%FCS(v/v)的DMEM培养基内。每管大约冻存5×106细胞。
可以用本技术领域中已知的方法纯化从组织培养或从腹水中制备的单克隆抗体。实施例13-针对CSA和/成CSA代谢物/衍丝物特异位点的单克隆抗体的分离和特征鉴定
分离单克隆抗体和特征鉴定其与CSA和/或CSA代谢物特异位点的反应性的步骤概括如下:
鉴定针对CSA和/成CSA代谢物特异位点的单克隆抗体的步骤
免疫接种方案(收集多克隆血清)
↓
直接ELISA(针对CSA或CSA代谢物的抗体)
↓
抗原组ELISA
↓
抑制性ELISA(对CSA或CSA代谢物/衍生物表位的特异性,对FK、雷帕霉素、
KLH或HSA抑制剂的交叉反应性)
↓直接ELISA(对CSA代谢物、FK、雷帕霉素或HAS的交叉反应性)
↓
融合步骤
↓
筛选原代融合物
免疫印迹
直接ELISA
抑制性ELISA
抗体同种型
↓
克隆和筛选(3次)
↓
特征鉴定组织培养上清液中抗体
直接ELISA(只用于IgG同种型)抗原组ELISA(对CSA代谢物、FK、雷帕霉素或HAS的交叉反应性)
抑制性ELISA(雷帕霉素、FK、CSA和CSA代谢物抑制剂)
↓
腹水产生
直接ELISA(抗体滴度和同种型)
抑制性ELISA(雷帕霉素、FK、CSA和CSA代谢物抑制剂)
↓
抗体纯化
特征鉴定抗体反应性免疫斑点测定:
1.将5-10μl抗体点到硝酸纤维素纸上,该纸上已划有格子供参考。
2.空气干燥,将硝酸纤维素纸浸入PBS/0.1%Tween(v/v)/5%牛奶(w/v)以封闭非特异性结合位点。室温下摇动孵育60分钟。
3.用PBS/0.05%Tween(v/v)洗涤两次,每次摇动10分钟。
4.用PBS/0.1%Tween(v/v)稀释缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG(Tago cat#AMI 4405)至1:2000。将硝酸纤维素膜放在石蜡膜或Saran包装膜上,加入稀释缀合抗体直到覆盖硝酸纤维素膜。放入37°孵育60分钟。在各步骤间不能让硝酸纤维素膜变干。
5.按第三步方法洗涤。
6.用BCIP/NBT(Canadian Life Technologies,cat#18280-016;88μl NBT和66μl BCIP的20ml底物缓冲液:100mM Tris,5mMMgCl2,100mM NaCl)配制酶底物。将硝酸纤维素膜放入底物溶液中,室温下摇动10-30分钟,观察颜色形成。
7.用水洗涤硝酸纤维素膜来终止反应。
分泌抗体的原代融合物一经鉴定,进一步按实施例7所述的方法用直接、同种型和抑制性ELISA检测来确定组织培养上清液对CSA/CSA代谢物的反应特征。然后进一步特征鉴定CSA/CSA代谢物阳性原代融合物的克隆(3x)的组织培养上清液:用同种型ELISA分离IgG生成克隆、用直接ELISA法确定抗体滴度、用抗原组ELISA确定CSA/CSA代谢物的反应性和确定FK和HAS的交叉反应以及应用雷帕霉素、CSA、FK和CSA代谢物的抑制性ELISA进一步证实特异性和测定CSA位点反应性。
利用免疫斑点测定和直接ELISA检测,鉴定了许多原代融合物,它们对CSA和其代谢物抗原具有很强的反应性。我们已经用直接、抗原组、抑制和同种型ELISA法分离了许多对CSA和其代谢物抗原反应的IgM和IgG分泌克隆。实施例14-诱导生成针对CSA-DVS免疫原的单克隆抗体
用CSA-DVS缀合物免疫小鼠的脾细胞制备分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆。已经分离了抗CSA的IgM和IgG分泌克隆。表15描述了其中的两个抗CSA单克隆抗体(CSA-1H6和CSA-2G9)的组织培养上清液(TCS)的反应性。
这两种单克隆抗体显示出对CSA-DVS,AM9-1-DVS,AM19-1-DVS(1)和AM19-1-DVS(2)抗原组(即半抗原与#1氨基酸残基连接)有良好的反应性(高OD值)。单克隆抗体与AM19-9-DVS半抗原结合的减少表明通过#9氨基酸残基连接DVS减少了抗体/表位间的结合(即CSA分子的这个区域很重要或者是表位识别位点的组成部分)。CSA-1H6和CSA-2G9对CSA表位具有特异性,并与FK、雷帕霉素、KLH或HSA分子上的表位无交叉反应。
为进一步特征鉴定CSA-1H6和CSA-2G9单克隆抗体的特异性,进行了CSA-DVS-HAS缀合物的抑制性ELISA检测。表16显示原CSA分子和AM1及AM1c代谢物抑制CSA-1H6和CSA-2G9的TCS(更强抑制CSA-2G9)。用AM4n、AM1c9、AM19和AM9代谢物的抑制作用是显著的。CSA-1H6和CSA-2G9单克隆抗体克隆的TCS对CSA/CSA代谢物表位具有特异性,且与雷帕霉素、FK、KLH和HAS无交叉反应。可将CSA-1H6和CSA-2G9用于TDM检测来测定CSA原分子和CSA代谢物水平。
表15:小鼠单克隆抗体(CSA-1H6,CSA-2G9)对CSA、CSA代谢物、
FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | CSA-1H6 | CSA-2G9 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 1.515 | 100 | 2.752 | 100 |
AM9-1-DVS-HSA | 1.904 | >100 | 2.978 | >100 |
AM19-9-DVS-HSA | 0.511 | 33.7 | 0.323 | 11.7 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 1.390 | 91.7 | 2.731 | >100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 1.870 | >100 | 3.219 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0 | 0 | 0.029 | 1.1 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0.006 | 0 |
HSA | 0.006 | 0 | 0 | 0 |
KLH | 0 | 0 | 0.026 | 0 |
(CSA-1H6和CSA-2G9均为同种型IgG1抗体)
*反应百分率=测试抗原的OD/CSA-DVS-HSA的OD×100
表16:CSA/CSA代谢物、雷帕霉素、FK、KLH和HSA抗原对CSA-1H6和CSA-2G9单克隆抗体克隆的TCS的抑制百分率
抑制抗原 | CSA-1H6 | CSA-2G9 |
CSA | 62.5 | 92.6 |
AM1 | 98.0 | 98.2 |
AM1c | 99.1 | 98.8 |
AM4n | 98.8 | 64.3 |
AM1c9 | 72.7 | 79.4 |
AM19 | 62.4 | 76.4 |
AM9 | 78.3 | 71.4 |
雷帕霉素 | 0 | 10.4 |
FK | 0 | 10.8 |
HSA | 0 | 1.5 |
KLH | 0 | 4.8 |
实施例15-诱导生成针对AM1-DVS免疫原的单克隆抗体
用AM1-DVS缀合物免疫小鼠的脾细胞制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。已经用针对CSA-DVS-HAS缀合物的直接ELISA法分离了抗CSA的IgM和IgG单克隆抗体。表17描述了其中两个单克隆抗体克隆(AM1-2E10和AM1-7F5)的TCS反应性。
如同CSA-DVS半抗原诱导生成单克隆抗体一样,所述诱导的针对AM1-DVS半抗原的单克隆抗体对CSA-DVS、AM9-1-DVS、AM19-1-DVS(1)和AM19-1-DVS(2)抗原组(即通过#1氨基酸残基与DVS连接臂连接的半抗原)有良好的亲合力。同样,单克隆抗体与AM19-9-DVS半抗原结合的减少证明,通过#9氨基酸残基连接DVS减少了抗体/表位间的结合。这些结果表明,AM1-2E10和AM1-7F5对CSA和CSA代谢物表位具有特异性,它们不识别FK、雷帕霉素、KLH或HSA分子上的表位。
通过CSA-DVS-HAS缀合物的抑制性ELISA检测,进一步特征鉴定AM1-2E10和AM1-7F5单克隆抗体克隆的TCS的特异性。表18证明,原CSA分子和所有的CSA代谢物均抑制AM1-2E10。该单克隆抗体与雷帕霉素、FK、KLH和HAS分子的任何表位均无交叉反应。在TDM检测中可用AM1-2E10测定CSA原分子和所有CSA代谢物水平。
AM1-7F5、AM1及AM1c代谢物强烈地抑制单克隆抗体与CSA-DVS-HSA包被板的结合。还发现CSA原分子和AM4n、AM1c9、AM19和AM9代谢物较弱但明显的抑制作用。雷帕霉素、FK、KLH或HSA无明显抑制作用。这些结果表明,在TDM检测中可用AM1-7F5测定CSA和CSA代谢物水平。在一定的TDM检测条件下(即单克隆抗体稀释),也可将AM1-7F5用于选择性地测量AM1和AM1c代谢物的水平。
表17:小鼠单克隆抗体(AM1-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代
谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | AM1-2E10 | AM1-7F5 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 1.546 | 100 | 1.971 | 100 |
AM9-1-DVS-HSA | 1.750 | >100 | 2.465 | >100 |
AM19-9-DVS-HSA | 0.270 | 17.5 | 0.790 | 40.1 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 1.546 | 100 | 2.283 | >100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 1.793 | >100 | 3.372 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0.015 | 0 | 0 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0.015 | 0 | 0.008 | 0 |
KLH | 0.061 | 3.9 | 0 | 0 |
HSA | 0.006 | 0 | 0 | 0 |
(AM1-2E10是同种型IgG2b抗体,而AM1-7F5是同种型IgG1抗体)
*(反应百分率=测试抗原的OD/CSA-DVS-HSA的OD×100
表18:用CSA/CSA代谢物、雷帕霉素、FK、KLH和HSA抗原对AM1-2E10和AM1-7F5单克隆抗体克隆的TCS的抑制百分率
抑制抗原 | AM1-2E10 | AM1-7F5 |
CSA | 81.9 | 53.8 |
AM1 | 100 | 99.5 |
AM1c | 100 | 100 |
AM4n | 85.7 | 57.5 |
AM1c9 | 100 | 56.2 |
AM19 | 100 | 60.0 |
AM9 | 100 | 62.3 |
雷帕霉素 | 0 | 25.4 |
FK | 0 | 26.0 |
KLH | 0 | 22.5 |
HSA | 0 | 16.1 |
实施例16-诱导生成针对AM19-DVS免疫原的单克隆抗体
用AM19-1-DVS(1)缀合物免疫小鼠的脾细胞制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。已经分离了抗AM19-1-DVS(1)ELISA反应性IgM和IgG同种型单克隆抗体。表19描述了其中两个抗AM19-1-DVS单克隆抗体克隆(AM19-1-7E12-1和AM19-1-7E12-2)的TCS的反应性。
这两种单克隆抗体TCS对CSA-DVS、AM9-1-DVS、AM19-9-DVS、AM19-1-DVS(1)和AM19-1-DVS(2)抗原组具有高反应性。这些单克隆抗体与雷帕霉素、FK、KLH或HSA抗原不发生交叉反应。用更特异的AM19-1-DVS(1)包被的ELISA板的抑制性ELISA检测,所述CSA原分子不抑制抗体的结合,而AM1c代谢物强烈抑制这些单克隆抗体的结合,AM1和AM1c9显著抑制单克隆抗体的结合,AM4n,AM19和AM9中等程度地抑制结合,而雷帕霉素、FK、KLH和HSA对单克隆抗体结合无抑制作用(表20)。
在特定的TDM检测条件下(即单克隆抗体稀释),可定量AM1c代谢物的水平,也可以通过改变检测参数选择性地测定所有CSA代谢物的水平而不与CSA原分子反应。
表19:小鼠单克隆抗体(AM19-DVS-KLH免疫原)对CSA、CSA代
谢物、FK、雷帕霉素、KLH或HSA抗原的反应性
抗原组 | AM19-1-7E12-1 | AM19-1-7E12-2 | ||
OD | %* | OD | % | |
CSA-DVS-HSA | 3.229 | 100 | 3.477 | >100 |
AM9-1-DVS-HSA | 3.268 | >100 | 3.167 | 95.5 |
AM19-9-DVS-HSA | 2.883 | 89.4 | 2.132 | 64.3 |
AM19-1-DVS-HSA(1) | 3.226 | 100 | 3.316 | 100 |
AM19-1-DVS-HSA(2) | 3.405 | >100 | 3.504 | >100 |
FK-DVS-HSA | 0.029 | 0 | 0 | 0 |
Rapa-suc-HSA | 0 | 0 | 0 | 0 |
HSA | 0.009 | 0 | 0 | 0 |
KLH | 0.023 | 0 | 0 | 0 |
(AM19-1-7E12-1和AM19-1-7E12-2均是同种型IgG1抗体)
*反应百分率=测试抗原的OD/AM19-1-DVS(1)-HSA的OD×100
表20:用CSA/CSA代谢物、雷帕霉素、FK、KLH和HSA抗原对
AM19-1-7E12-1和AM19-1-7E12-2单克隆抗体克隆的TCS
的抑制百分率
抗原 | AM19-1-7E12-1 | AM19-1-7E12-2 |
CSA | 0 | 0 |
AM1 | 59.2 | 67.3 |
AM1c | 99.6 | 99.8 |
AM4n | 30.4 | 36.8 |
AM1c9 | 64.6 | 71.6 |
AM19 | 35.2 | 49.5 |
AM9 | 43.0 | 44.3 |
雷帕霉素 | 7.7 | 8.6 |
FK | 6.3 | 3.2 |
KLH | 3.8 | 4.3 |
HSA | 3.5 | 1.5 |
相似地,用AM19-1-DVS(2)和AM19-9-DVS半抗原-蛋白缀合物免疫原制备单克隆抗体。例如,用AM19-1-DVS(2)和AM19-9-DVS缀合物制备针对AM1或AM9代谢物的特异性单克隆抗体。AM19-1和AM19-9免疫原的能力并不限于形成AM1或AM9代谢物残基的单克隆抗体,也可将它们用来制备针对其它CSA代谢物残基和CSA原分子上的表位的单克隆抗体。诱导针对AM19-9半抗原的单克隆抗体的反应性的实例如表21所示。
表21:用CSA/CSA代谢物对AM19-9-1E11和AM19-9-5A6和
AM19-9-2G9单克隆抗体克隆TCS的抑制百分率
抗原 | AM19-9-1E11 | AM19-9-5A6 | AM19-9-2G9 |
CSA | 96 | 72 | 28 |
AM1 | 99 | 95 | 80 |
AM1c | 99 | 68 | 20 |
AM4n | 93 | 58 | 25 |
AM1c9 | 96 | 61 | 47 |
AM19 | 99 | 74 | 82 |
AM9 | 99 | 44 | 85 |
*这些TCS对雷帕霉素、FK、KLH或HSA无交叉反应。实施例17-诱导生成针对AM9-DVS免疫原的单克隆抗体
使用本申请中公开的方法,可用AM9-DVS-KLH缀合物免疫的小鼠的脾细胞制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。可用AM9-1-DVS-KLH和AM9-9-DVS-KLH免疫原诱导产生对AM1、AM1c和AM9代谢物部分的特异性单克隆抗体。用这些免疫原也可以制备针对其它CSA/CSA代谢物抗原的单克隆抗体(表22)。
表22:AM9-1-9H5、AM9-1-2A11、AM9-9-4F5和AM9-9-6C3
对TCS的抑制百分率
抗原 | AM9-1-9H5 | AM9-1-2A11 | AM9-9-4F5 | AM9-9-6C3 |
CSA | 6 | 18 | 36 | 57 |
AM1 | 45 | 53 | 25 | 58 |
AM1c | 94 | 82 | 13 | 52 |
AM4n | 21 | 15 | 22 | 50 |
AM1c9 | 41 | 28 | 6 | 40 |
AM19 | 24 | 19 | 6 | 37 |
AM9 | 21 | 40 | 99 | 99 |
*这些TCS对雷帕霉素、FK、KLH或HSA无交叉反应。
实施例18-纯化的单克隆抗体的选择性
为证实本发明单克隆抗体的反应性和选择性,从组织培养上清液中制备纯化的单克隆抗体。使用以下步骤纯化单克隆抗体:抗体纯化方法:
融化一管冻存的单克隆细胞,使其生长于200ml的DMEM+补充成分(10%CPSR-3,1%青霉素/链霉素,1%L-谷氨酰胺,1%丙酮酸钠)中,直至融合。在37℃,5%CO2培养箱中孵育。
1.通过1200 RPM,4℃,离心10分钟收集浓缩的上清液。平衡浓缩上清液的pH至7。
2.按照说明书准备G蛋白柱(GammaBind Plus Spharose,CodeNo.17-0886-02,Pharmacia Biotech)。
3.在室温下将浓缩的上清液上样到G蛋白柱。
4.用25ml的结合缓冲液(0.01M磷酸钠,0.15M NaCl,0.01MEDTA,pH 7.0)洗涤柱子。
5.用15-20ml的洗脱缓冲液(0.5M醋酸,pH3.0)洗脱柱子。
6.用分级收集器(fraction collector,ISCO,FOXY Jr.)分段收集。
7.用0.5ml中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH9.0)中和洗出部分。
8.在280nm波长处测量洗出部分的光密度值(BECKMANSpectrophotometerDU640i)。
9.将这些部分一起收集在Spectra/Por膜MWCO:6-8000内(SPECTRUM,#132653)。
10.对1×PBS在4℃透析过夜
11.用BSA作为标准品(0,200,400,600,800,1000mg/ml)进行蛋白检测。在280nm波长处读OD值。
也可应用本技术领域中已知的其它抗体纯化方法。应用竞争性抑制性ELISA法,测定了单克隆抗体对一组羟化或去甲基化的CSA代谢物的交叉反应。基于单克隆抗体的选择性,可以将本发明中针对代谢物半抗原缀合物的单克隆抗体至少分成6组。从组织培养上清液中纯化的不同单克隆抗体的选择性如表23所示。
表23:纯化单克隆抗体的选择性
克隆名称 | 纯化单克隆抗体的选择性* |
GpI:第Ⅰ组 AM1-2E10 | AM1 |
AM19-9-5A6 | AM1(图3) |
AM9-1-6D4 | AM1 |
GpⅡ:第Ⅱ组 AM9-1-7D2 | AM9(图4) |
AM9-9-11G9 | AM9 |
AM9-9-6C3 | AM9 |
GpⅢ:第Ⅲ组 AM1-3A6 | AM1,AM1c |
AM19-1-7E12 | AM1,AM1c(图5) |
AM9-1-2A11 | AM1,AM1c |
GpⅣ:第Ⅳ组 AM19-9-1E11 | AM1,AM9 |
AM19-9-1D8 | AM1,AM9 |
AM19-9-2G9 | AM1,AM9(图6) |
GpⅤ:第Ⅴ组 AM9-9-11H11 | CSA,AM1,AM9 |
AM9-9-4F5 | CSA,AM9(图7) |
GpⅥ:第Ⅵ组 AM9-1-4D6 | AM1,AM1c,AM9,AM19(图8) |
*选择性是通过抑制性ELISA实验确定的。
组Ⅰ单克隆抗体对AM1代谢物具有选择性,图3显示单克隆抗体AM19-9-5A6对AM1代谢残基具有选择性。实施例19-抗CSA衍生物的单克隆抗体:
用CSA、CSA衍生物和CSG抑制剂还分析了CSA-1H6,CSA-2G9、AM1-2E10、AM1-7F5和AM19-7E12-1单克隆抗体的特异性(表24)。
如前述所证明的,原CSA分子可抑制这些单克隆抗体。CSA分子的氨基酸#1残基的氘化不影响抗体表位识别。该CSA衍生物抑制它们结合到ELISA板上。单克隆抗体CSA-1H6和CSA-2G9对环孢菌素G(CSG)分子有良好的亲合力。AM1单克隆抗体对CSG显示中等(AM1-2E10=61%抑制率)到低度(AM1-7F5=28.8%抑制率)亲合力。
这些结果表明CSA-1H6、CSA-2G9、AM1-2E10和AM1-7F5对CSA分子和在氨基酸#1残基上修饰的CSA衍生物有良好的亲合力。CSA-1H6和CSA-2G9对CSG分子也有良好的亲合力。这些单克隆抗体与雷帕霉素或FK的衍生物的表位均无交叉反应。
表24:CSA、CSG和CSA衍生物对CSA和AM1单克隆抗体
的抑制百分率
抗原 | CSA-1H6 | CSA-2G9 | AM1-2E10 | AM1-7F5 |
Ⅰ | 100 | 100 | 100 | 100 |
Ⅱ | 0 | 23.1 | 12.7 | 16.6 |
Ⅲ | 5.5 | 21.9 | 17.8 | 16.6 |
HSA | 6.0 | 9.4 | 15.4 | 13.6 |
CSA | 100 | 100 | 90.4 | 77.5 |
CSG | 88.6 | 89.8 | 61.2 | 28.8 |
抑制性衍生物
种类鉴定 | 修饰 |
Ⅰ | CSA-#1氨基酸氘化 |
Ⅱ | 雷帕霉素-#7氨基酸氘化和甲基化 |
Ⅲ | FK(#22氨基酸)的肟 |
这个实施例表明,用本发明的CSA或CSA代谢物的缀合物可诱导生成识别CSA原分子、CSG或其它CSA衍生物/类似物上的表位的抗体。
实施例20-用体外混合淋巴细胞反应(MLR)分析测定CSA和CSA代谢物的生物活性:
MLR分析是用于鉴定有生物学活性(免疫抑制)的CSA代谢物以及定量测定相对于原CSA分子的免疫抑制活性的活性。
图9图示用于本目的的混合淋巴细胞增测定法实例,步骤如下:双向混合淋巴细胞反应分析:
1.从两个个体各收集20ml血,用Ficoll-Paque(PharmaciaBiotech)分离淋巴细胞。
2.用2%醋酸(v/v)稀释并计数1∶10稀释的淋巴细胞。
3.用DMED/20%FCS(v/v)将各淋巴细胞群(A+B)配制10ml的浓度为1×106细胞/ml细胞悬液。
4.设立96孔无菌组织培养板,平底(Sarstedt,cat#83.1835)。在各孔中加入:
5.各孔中加等份的100μl淋巴细胞A群
6.各孔中加等份的100μl淋巴细胞B群
7.各孔中加等份的用无补充物DMEM配制的浓度为0、2.5、5、10、25、50和100μg/L的20μl药物(CSA和CSA代谢物),每个浓度3孔。
8.为测定药物对增殖的影响,将培养板在37℃,5%CO2培养箱中培养5天。
9.第六天,用无补充物DMEM配制3.2ml 1∶50稀释度的甲基-3H-胸腺嘧啶(Amersham Life Science,cat#TRK 120)。各孔中加30μl,将培养板在37℃,5%CO2环境中孵育18小时。
10.第七天,用细胞收集器(Skatron,cat#11019)将细胞收获到玻璃微纤维滤膜GF/A(Whatman,cat#1820024)上。用1ml的无菌蒸馏水洗涤细胞3次。
注意:所有的步骤均在生物通风柜中按无菌操作技术进行。
11.将滤膜放入闪烁计数管中,加入1.5ml SciniSafe+50%闪烁液(Fisher,cat# SX-25-5)。
12.用β计数器(Micromedic System Inc.,TAURUS自动液体闪烁计数器)测定掺入淋巴细胞的放射活性量一分钟。
增殖率(%)=100-抑制率(%)。
也可以用本领域中已知的其它混合淋巴细胞反应分析。
可用该MLR分析选择本发明中的可结合具有生物学活性CSA代谢物和/或原CSA分子的抗体。也可以选择对无生物学活性代谢物部分反应的抗体。表25所示是表现出这种反应性/选择性的单克隆抗体的实例。
表25:抗CSA代谢物的单克隆抗体对CSA抑制MLR
的封闭能力
纯化的单克隆抗体 | 对MLR的抑制百分率(%) |
培养基对照(无CSA,无单克隆抗体) | 0 |
CSA 100μl/L(无单克隆抗体) | 49.1 |
AM1-3A6 | 3.6 |
AM1-7F5 | 0 |
AM9-1-7D2 | 5 |
AM9-1-2A11 | 46.7 |
AM9-9-6C3 | 0 |
AM9-9-11G9 | 0 |
AM19-1-7E12 | 0 |
AM19-1-4E8 | 0 |
AM19-9-1D8 | 0 |
AM19-9-5A6 | 41.5 |
AM19-9-1E11 | 0 |
AM19-9-2G9 | 42.5 |
如表25所示,CSA在100μg/L浓度时对MLR的抑制为49.1%(IC50值),培养基单独不引起MLR的抑制。有几个单克隆抗体封闭了CSA对MLR的抑制,表明单克隆抗体与所述CSA分子的表位结合(或交叉反应)。为确定非特异性抑制作用,在本MLR分析中(没有CSA药物),所有单克隆抗体均设有对照测试。单克隆抗体显示对MLR无任何抑制作用。三种单克隆抗体(AM9-1-2A11;AM19-9-5A6和AM19-9-2G9)显示无封闭CSA对MLR的抑制作用的能力。该结果确证了抑制性ELISA法结果,它证实了对代谢物部分的选择性。AM9-1-2A11对AM1和AM1c具有选择性;AM19-9-5A6对AM1而AM19-9-2G9对AM1和AM9具有选择性。这些单克隆抗体不与CSA分子的表位结合或发生交叉反应。实施例21-应用针对环孢菌素特异性部位的多克隆或单克隆抗体的免疫检测试剂盒:
可用本发明的针对CSA特异性部位的多克隆或单克隆抗体开发免疫检测或TDM试剂盒。这种检测可以包括但不限于直接、抑制、竞争或夹层免疫检测(ELISA或其它检测系统)、RIA、固相或液相检测或自动检测系统。
在自动检测形式中,CSA-2G9单克隆抗体能显著抑制CSA-酶缀合物(27.6%;本检测形式下最高的抑制率为30%)。用游离的CSA可调节(阻断)这种抑制作用。应用本发明的缀合物诱导生成、最适用于自动TDM检测中CSA定量测定的其它单克隆抗体,包括(但不限于)CSA-1H6;AM1-7F5;AM1-3B1;AM1-2E10;AM1-3C1;AM19-1-5D2;AM19-1-4E8;AM19-1-5B2;AM9-9-11H11和AM9-94F5。
本发明的另一方面是利用代谢物选择性单克隆抗体来清除或封闭病人标本中的代谢物,因此减少抗CSA代谢物的交叉反应。这样能够更加准确地测定标本中原CSA分子的水平。最适用于该用途的本发明的单克隆抗体包括,但不限于,AM1-2E10、AM19-9-5A6、AM9-1-6D4、AM9-1-7D2、AM9-9-11G9、AM9-9-6C3、AM1-3A6、AM19-1-7E12、AM9-1-2A11、AM19-9-1E11、AM19-9-1D8、AM19-9-2G9和AM9-1-4D6等单克隆抗体。
本发明的另一方面是用CSA或代谢物半抗原缀合物来制备针对氨基酸#1区域外的CSA表位的抗体。也可以制备针对氨基酸#9区域外的CSA表位的其它抗体。利用两种不同种抗体,开发了TDM的三明治检测法。例如,用AM9-9-DVS半抗原缀合物制备的小鼠多克隆或单克隆抗体(AbA)能够结合CSA,用CSA-DVS或AM1-DVS半抗原制备的兔多克隆或单克隆抗体(AbB)能与CSA分子的其它面的表位结合,这样就形成了三明治检测。本发明也提供制备针对不同CSA代谢物的表位的多克隆或单克隆抗体的方法。应用本技术领域中已知的方法可开发用这些单克隆抗体建立封闭、结合或去除特异性代谢物的方法。
利用单克隆抗体的组合物也能够设计TDM分析以测定CSA原分子的水平和某些生物学活性和/或毒性代谢物的水平。例如,可以用一种单克隆抗体(原CSA分子特异性)和另一种单克隆抗体(AM1和AM1c代谢物特异性)以及另外一种单克隆抗体(AM9代谢物特异性)的组合物来测量CSA、AM1、AM1c和AM9代谢物的水平。还可以单独使用这些单克隆抗体来定量测定CSA或特异的CSA代谢物的水平。
本申请中公开的实施例表明,制备的多克隆和单克隆抗体可用于TDM分析中测定原CSA/CSA衍生物水平、或原CSA/CSA衍生物和所有的CSA代谢物水平、或原CSA/CSA衍生物和特异的代谢物水平(即:AM1和/或AM1c和/或AM9);或用于开发TDM分析来测定特异的CSA代谢物水平。本发明并不限于用实施例2-5所述免疫原生产单克隆抗体,因为它们只是为证明本发明原理提供证据。本发明也包含用CSA衍生物或任何CSA代谢物制备免疫原,以及生产针对所有CSA代谢物(即:Ⅰ、Ⅱ期等代谢物)的多克隆和单克隆抗体。
阅读了本说明书,对本发明进行的改良对于本领域中的技术人员将是显而易见的。本说明书、实施例以及附后的权力要求书包括这类改良实施方案。
Claims (28)
1.能够与环孢菌素相关化合物结合的抗体。
2.权利要求1的抗体,该抗体识别所述环孢菌素相关化合物的特异性区域。
3.权利要求1或2的抗体,其中所述环孢菌素相关化合物选自环孢菌素A(CSA)、环孢菌素G(CSG)、同位素标记修饰的环孢菌素以及环孢菌素代谢物。
4.权利要求1-3中任一项的抗体,该抗体对环孢菌素的亲合力比环孢菌素代谢物高。
5.权利要求1-3中任一项的抗体,该抗体对环孢菌素代谢物的亲合力比未代谢的环孢菌素高。
6.权利要求1-5中任一项的抗体,它是一种多克隆抗体或单克隆抗体。
7.权利要求1-6中任一项的抗体,它对AM1或AM9具有选择性。
8.权利要求1-7中任一项的抗体,所述抗体选自CSA-2G9、CSA-1H6、AM1-7F5、AM1-3B1、AM1-2E10、AM1-3C1、AM19-1-5D2、AM19-1-4E8、AM19-1-5B2、AM1-2E10、AM19-9-5A6、AM9-1-6D4、AM9-1-7D2、AM9-9-11G9、AM9-9-6C3、AM1-3A6、AM19-1-7E12、AM9-1-2A11、AM19-9-1E11、AM19-9-1D8、AM19-9-2G9、AM9-9-11H11、AM9-9-4F5和AM9-1-4D6。
9.一种杂交瘤细胞系,它产生权利要求1-8中任一项的抗体。
10.一种免疫原,它用于针对环孢菌素相关化合物诱发产生特异性免疫原性应答,所述免疫原包含环孢菌素相关化合物、连接臂分子和蛋白载体。
11.权利要求10的免疫原,其中所述连接臂分子是二乙烯砜。
12.权利要求10或11的免疫原,其中所述蛋白载体选自匙孔血蓝蛋白和人血清白蛋白。
13.权利要求10-12中任一项的免疫原,其中所述环孢菌素相关化合物是通过氨基酸残基1或9与所述载体连接。
14.产生能够识别环孢菌素相关化合物的特异性区域的抗体的方法,该方法包括:a)将权利要求10-13中任一项的免疫原给予动物,使其诱导产生针对环孢菌素相关化合物的特异性免疫原性应答;b)从所述动物回收针对所述环孢菌素相关化合物的抗体;和c)通过测定所述抗体与至少一种环孢菌素相关化合物的反应性鉴定所述抗体的结合区域。
15.权利要求14的方法,其中所述鉴定是通过比较所述抗体对第一种环孢菌素相关化合物的反应性和第二种环孢菌素相关化合物的反应性完成的。
16.权利要求14-15中任一项的方法,其中回收所述抗体的所述步骤包括从所述动物回收至少一种抗体生成细胞,使所述抗体生成细胞永生化,以及任选从所述永生化抗体生成细胞分离单克隆抗体。
17.权利要求14-16中任一项的方法,其中所述动物是小鼠、大鼠、兔、鸡、豚鼠、驴、猪、山羊、绵羊、母牛、马、狗、猫或猴。
18.一种抗体,它是用权利要求14-17中任一项的方法生产的抗体。
19.测量样品中环孢菌素相关化合物水平的免疫检测方法,包括:a)将样品与根据权利要求1-8或18中任一项的抗体一起孵育;以及b)测定所述环孢菌素相关化合物与所述抗体的结合。
20.权利要求19的免疫检测方法,其中环孢菌素相关化合物选自环孢菌素A(CSA)、环孢菌素G(CSG)、同位素标记修饰的环孢菌素以及环孢菌素代谢物。
21.权利要求19或20的免疫检测方法,其中所述样品是生物样品。
22.用于测定样品中环孢菌素相关化合物水平的免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1-8或18中任一项的抗体。
23.权利要求22的试剂盒,其中环孢菌素相关化合物选自环孢菌素A(CSA)、环孢菌素G(CSG)、同位素标记修饰的环孢菌素以及环孢菌素代谢物。
24.权利要求22或23的试剂盒,其中所述样品是生物样品。
25.测定样品中特定环孢菌素相关化合物的量的方法,包括:a)将所述样品与根据权利要求1-8或18中任一项的第一抗体接触;b)再将所述样品与根据权利要求1-8或18中任一项的第二抗体接触;和c)测定所述特定环孢菌素相关化合物与所述第二抗体的结合量。
26.权利要求25的方法,其中所述特定环孢菌素相关化合物是CSA,所述第一抗体对CSA代谢物具有选择性,而所述第二抗体对CSA具有选择性。
27.权利要求25的方法,其中所述特定环孢菌素相关化合物是CSA代谢物,所述第一抗体对CSA具有选择性,而所述第二抗体对CSA代谢物具有选择性。
28.权利要求25-27中任一项的方法,其中所述样品是生物样品。
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