JPH0286794A

JPH0286794A - モルヒネに対するモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法

Info

Publication number: JPH0286794A
Application number: JP63234826A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Yukimasa Ito; 伊藤　幸勝; Takashi Usagawa; 宇佐川　崇
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1988-09-21
Publication date: 1990-03-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、鎮痛薬の一種であるモルヒネに対して非常に
高い特異的な反応性を有するモノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体の製法およびそのモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株に〔従来の技術〕近年、末期癌患者の加療法の一つとして、モルヒネを投
与することによって痛みを軽減する方法が採用されてい
る。このような方法では、モルヒネの投与量が少ないと
鎮痛効果がなく、その量が多すぎると副作用が大きくな
りすぎる。従って、常にそれを適切な濃度に維持するた
めにその投与量を決めるためには、その血中濃度を簡単
、かつ迅速にモニタリングできる方法を用いる必要があ
る。

そのような方法としては、従来、ポリクローナル抗体〔
クリニカル・ケミストリイ（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）２０．２４３〜２４８．１９７４）ま
たはモノクローナル抗体（日本薬学会第１０８年会；沢
田ら、１９８８年４月）を用いた酵素免疫測定法を用い
た簡便な測定法が知られている。

しかし、これらの測定で用いられたポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体はいずれもコデイン（咳止剤
）と交差反応性を有するので、コデインが血中に存在し
ていても血中のモルヒネ濃度を正確に測定できるような
モルヒネに高い特異的な反応性を示すがコデインには反
応性を示さない抗体は、これまでに知られていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、鎮痛薬であるモルヒネに対して非常に
高い特異的な反応性を有するモノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体の製法およびそのモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞とを
融合して得られたハイブリドーマ株を培養することによ
って、鎮痛薬であるモルヒネに対して非常に高い特異的
な反応性を示すモノクローナル抗体を得ることができる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞との細胞融合に
よって得られたハイブリドーマ株が産生じた、コデイン
とは実質的に反応しないが、モルヒネに対しては非常に
高い特異的な反応性を有することを特徴とするモルヒネ
に対するモノクローナル抗体に関するものである。

さらに、本発明は、前記のハイブリドーマ株を培養する
ことを特徴とするモルヒネに対するモノクローナル抗体
の製法に関するものである。

また、さらに、本発明は、前記のハイブリドーマ株に関
するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、マウスリンパ球とマウ
スミエローマ細胞との細胞融合によって得られたハイブ
リドーマ株が産生ずるものであり、モルヒネに対して非
常に高い特異的な反応性を有するものである。

本発明で用いるマウスリンパ球としては、マウスミエロ
ーマ細胞との細胞融合によって、モルヒネに対して非常
に高い特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を産
生ずることができるハイブリドーマ株を得ることができ
る限り特に制限されないが、好ましくは適当な免疫原で
免疫して得られたリンパ球を使用するのが良い。

本発明でマウスの免疫に用いる適当な免疫原としては、
モルヒネに対して非常に高い特異的な反応性を有するモ
ノクローナル抗体を得ることができるものであれば特に
制限されず、例えば、モルヒネ、モルヒネの塩類、モル
ヒネを分子量１万以上の高分子担体に結合させたもの、
ノルモルヒネ、ノルモルヒネを分子！１万以上の高分子
担体に結合させたものなどを挙げることができるが、好
ましくはノルモルヒネを分子量１万以上の高分子担体に
結合させたものを用いるのが良い。そして、この時用い
る分子量１万以上の高分子担体としては、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、卵白アルプミ：／　（ＯＶＡ）　、
陣笠具ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリンなどの
ような生体高分子やポリＬ−リジン（ＰＬＬ）などのよ
うなポリアミノ酸を挙げることができる。

本発明のモルヒネに対して非常に高い特異的な反応性を
有するモノクローナル抗体は、モルヒネに対して高い特
異性な反応性を有するが、コカイン、コデイン、ジヒド
ロコデイン、エチルモルヒネ、フエンタニール、メサト
ン、Ｍ−３−Ｇ　（モルヒネ−３−グルクロナイド）な
どとは実質的に反応性が認められないものである。その
ような特異性を有するモノクローナル抗体は、例えば、
ノルモルヒネを生体高分子である免疫グロブリンに結合
させたものを免疫原に用いた免疫マウスから得たリンパ
球とマウスのミエローマ細胞とを融合して得たハイブリ
ドーマ株のＭＯ−２株（微工研条寄第１９１０号）、Ｍ
Ｏ−３株（微工研条寄第１９１１号）、ＭＯ−４株、Ｍ
Ｏ−５株（微工研条寄第１９１２号）、ＭＯ−６株など
を一般的なリンパ球培養培地を用いたフラスコでの静置
培養、またはマウス腹腔内での培養によって得ることが
できるが、さらに、Ｍ−６−Ｇ（モルヒネ−６−グルク
ロナイド）と実質的に反応性が認められないモノクロー
ナル抗体を必要とする場合には、Ｍ０−３株、ＭＯ−４
株、ＭＯ−５株またはＭＯ−６株を培養することによっ
て、さらに高い特異性を有するモノクローナル抗体を得
ることができる。

このようなハイブリドーマ株の作製は、従来公知の方法
、例えば、ミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）とケー
ラー（Ｋｈｏｌｅｒ）の方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２５６．４９５　（１９７６））に準じて行うこ
とができる。

そのようなハイブリドーマ株の好ましい作製方法につい
て、概略を以下順次説明する。

モノクロ−ル　　　　バイブｉドーマ　の（ｉ）免疫原
および分析用抗原の作製マウスに用いる免疫原は、例えば、ノルモルヒネ、ノル
モルヒネの塩類などの化合物をＮ−（４−ブロモブチル
）フタルイミドを用いてＮ−（４−ブロモブチル）化し
た後、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩
（以下、ＣＭＥＣと略記する。）、１−エチル−３−（
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−塩酸塩（以
下、ＥＤＰＣと略記する。）などのカルボジイミドを用
いて、分子１１万以上の高分子担体（例えば、ＢＳＡ、
ＯＶＡ、ＫＬＨ，免疫グロブリンなどのような生体高分
子、およびＰＬＬなどのようなポリアミノ酸などを好ま
しい例として挙げることができる。）と結合することに
よって作製することができる。

一方、分析用抗原としては、免疫原の作製において用い
た高分子担体およびカルボジイミドとは異なった高分子
担体およびカルボジイミドを用いて、前記の免疫原の作
製法と同様にして作製したものを用いる。

（ｉｉ　）免疫マウスリンパ球の調製マウスの免疫方法は、ＰＢＳ　（リン酸緩衝食塩水）に
溶解した前記（ｉ）の免疫原（１０〜４００μｇ）をマ
ウスに１回または敗退間隔で数回投与することで行うこ
とができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死菌
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫マウスの充分な抗体価を確認後、
最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから
得ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｉｉ　）ミエローマ細胞の準備細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−４１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、および
ラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　（Ｙ
３）などのミエローマ細胞を用いることができるが、６
５３、Ｐ３Ｕ１、ＭＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０などの細胞
外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が
好ましい。

（ｉｖ）ＩＩＩ胞融合細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球と前記ミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：
１の割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液
、例えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（
ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙＳＲＰＭ１１６４０など
の培地成分）溶液、等張緩衝液などを用いて良く混合し
、遠心分離した後のペレット（細胞塊）に、ＨＶＪ　（
センダイウィルス）またはＰＥＧ　（ポリエチレングリ
コール）溶液を添加することによって行うことができる
が、好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのがよく、さらに好
ましくは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜６０
重量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよい。この時、細胞融
合を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシ
ド、ポリーＬ−アルギニンなどを適当量添加することも
できる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
マウスと異種の動物由来のものを使用することもできる
が、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
の抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された
マウスとは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さ
らに好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｖ）ハイブリドーマの選択バイプリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含有した培地。この培地成
分としては一般に用いられるリンパ球培養用培地成分を
用いることができる）で培養して行うことができる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたバイプリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、Ｆｅ
２を含有した培地、この培地成分としては一般に用いら
れるリンパ球培養用培地成分を用いることができる）で
数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるＦｅ２を含
有するリンパ球培養用培地で培養する。

（ｖｉ）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（ｖ）で得
られたハイブリドーマが、目的とする抗体を産生じてい
るか否かの検定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測
定法）、プラーク形成法、凝集反応法、ＲＩＡ（ラジオ
アイソトープを用いた方法）、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ
）などで行うことができるが、検定数が非常に多い場合
には、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で行うことが好ましい。

このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

（ｉ）で調製した分析用抗原を固定化したＥＬＩＳＡプ
レートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培
養上清を加えて一定時間静置する。

そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動物
由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識抗
体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。

標識される抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体
だけと反応して結合することができる限り特に限定され
ず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得
られた血清、またはマウス細胞などを用いて作製された
ハイブリドーマ株が産生じたモノクローナル抗体を挙げ
ることができる。

）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置する。次
に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応し
た基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、酵素
活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウェル
中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドーマが存在し
ていたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
しているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）バイプリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マニプレーション法（倒立顕
微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡＣ
３（Ｆ　ｌｕ。

ｒｅｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌＳｏ
ｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすることが
できる。この時、前記のいずれかのクローニング方法に
よって（ｖｉ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培
養し、その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、
（ｖｉ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬ
ＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

このようにして、モルヒネに対して特異性が高く、かつ
抗体価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマ株を選択して得ることができる。

モノクローナル　　の１法モルヒネに対して特異性が高（、かつ抗体価が高いモノ
クローナル抗体の生産は、前記（ｖｉ）で得たハイブリ
ドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物の腹腔
内で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養
用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰ
Ｍ１１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃度が
上限に達するまで培養することによって行うことができ
る。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で得た
培養上清中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株の動物脂腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。

このような方法によるモルヒネに対して特異性が高く、
かつ抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産は、マウ
ス、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹腔内にこ
の動物の免疫能を低下させる物質、例えば、ブリスタン
などの鉱物油を投与し、数週間後に１０６〜１０７個の
前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株細胞を投与し、そ
の腹腔内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖させるこ
とによって行うことができる。この時、該モノクローナ
ル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれている。

そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得た時の培
養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛋白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、モルヒ
ネに対して非常に高い特異的な反応性を有するものであ
る。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１〔免疫原および分析用抗原の作製〕２０ｍ１のジオキサンに、２７１ｍｇのノルモルヒネ（
以下、ＮＭと略す。）を溶解し、これに５ｍｉ！、のエ
タノールに３４０ｍｇのＮ−（４−ブロモブチル）フタ
ルイミドを溶解したものと６００ｍｇの炭酸ナトリウム
とを追加し、引き続き２０時間加熱還流した。反応液か
ら無機物を濾別後、濾液を減圧乾固した。得られた残渣
を極少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカラム（２
０ｍｍΦＸ３００ｍｍＬ；Ｋｉｅｓｅ１ｇｅｌ　　６０
（７０〜２００　　ｍｅｓｈ　　ＡＳＴＭ））にかけた
。これを６０ｍ１の酢酸エチル／メタノール（９：１）
で溶出後、続けて酢酸エチル／メタノール（５：１）で
溶出させ、２０ｍρづつ分画した。ＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅ
ｌｇｅｌ　　６０；展開溶媒は、酢酸エチル／メタノー
ル／濃アンモニア水＝８５：１０：５）で分析し、目的
物のみを含む百分を集め、溶媒を減圧留去した。得られ
た残渣を２０ｍｊ！のエタノールに溶解後１００μｌの
９０％泡水ヒドラジンを加えて２時間還流後、エタノー
ルを留去した。得られた残渣を１５ｍ１の１％塩酸に溶
解後、クロロホルム／イソプロパツール（５：１）で２
回洗浄した。、濃アンモニア水でｐＨ８に調整した後、
クロロホルム／イソプロパツール（５：１）で抽出後、
無水硫酸ナトリウムで脱水して濾別した後、濾液を減圧
留去して、１３０ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）ノル
モルヒネ（以下、ＡＢＮＭと略す。）を得た。

マウスへの免疫原は、前記のＡＢＮＭを用いて以下のよ
うにして作製した。

０、３　ｍ　ｌのジメチルホルムアミドに１５ｍｇのＡ
ＢＮＭを溶解したものと、１．５　ｍ　ｌの純水に高分
子担体である１０ｍｇのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）
を溶解したものとを混合後、１０％の１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モル承りノエチル）カルボジイミド−メ
ト−ｐ−）ルエンスルホン酸塩（ＣＭＥＣ）水溶液を０
．５　ｍ　ｌ加え、ｐＨを５．５に調整し、室温で１６
時間攪拌した後、純水に対して２回透析し、非透析画分
を凍結乾燥して、免疫原として用いるＮＭとＩｇＧとの
結合物（以下、ＮＭ−ＩｇＧと略す。）を１０ｍｇ得た
。

分析用抗原は、以下のようにして作製した。

前記の免疫原の作製方法でＩｇＧのかわりにウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を用い、ＣＭＥＣのかわりにｌ−エ
チル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
−塩酸塩（ＥＤＰＣ）を用いる以外は同様にして、分析
用抗原であるＮＭとＢＳＡとの結合物（以下、ＮＭ−Ｂ
ＳＡと略す。

）を１１ｍｇ得た。

実施例２〔モルヒネに対するモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株の作製〕 ■マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製実施例１で作製
した免疫原である４００μｇのＮＭ−ＩｇＧを溶解した
０、　４　ｍ　ｌのＰＢＳ　（リン酸緩衝生理食塩水、
ｐ　Ｈ７，４）と０．４　ｍ　ｌのフロイントの完全ア
ジュバントとを充分に混合して得られたエマルジョンの
０．２　ｍ　ｌをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　■マウス（♀、
８週齢）の腹部皮下に投与した。

この初回免疫から２周間後、前記と同様にして調製した
エマルジョンの０．２　ｍ　ｌを前記マウスの腹部皮下
に投与した。

さらに、２週間後に、前記の抗原４００μｇを溶解した
１ｍｌのＰＢＳと、１ｍ！！、のフロイントの不完全ア
ジュバントとを充分に混合して得られたエマルジョンの
０．５　ｍ　ｌを前記マウスの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記の抗原１０
０μｇを溶解した０、　２　ｍ　ｌのＰＢＳを前記マウ
スの尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日目に摘出した肺臓を、ＭＥＭ　（リンパ球培養用培地
粉末を蒸溜水に溶解したもの、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを
含む）を入れたシャーレ中で洗い、１０ｍｊｌ！のＭＥ
Ｍを入れた別のシャーレ中に移して、滅菌したスライド
グラスのフロスト部分を用いてほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＭＥＭ（３７°Ｃ
）に懸濁して、遠心分離（回転数；１゜４０Ｏｒｐｍ、
時間；６分間）して洗浄した。この操作をさらに２回反
復した後、ＭＥＭ（３７℃）に再懸濁し、細胞融合に供
するマウス肺臓リンパ球とした。

■細胞融合対数増殖期にある８−アザグアニン耐性のマウスミエロ
ーマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ、６５３；６５３）を回収し、
その培養液から遠心分離（回転数；１．４０Ｏｒｐｍ、
時間：６分間）して得られた細胞をＭＥＭ（３７°Ｃ）
に懸濁して遠心分離（回転数；１，４０Ｏｒｐｍ、時間
；６分間）することによって洗浄した。この操作をさら
に１回反復した後、ＭＥＭ（３７°Ｃ）に再懸濁し、細
胞融合に供するマウスミエローマ細胞とした。

４．７０Ｘ１０’個の前記マウスミエローマ細胞と２．
３５Ｘ１０”個の前記のマウスの肺臓リンパ球とを５０
ｍ！容プラスチック製コニカル遠心管に入れ、混合し、
次いで、上清を遠心分離（回転数：１，４０Ｏｒｐｍ、
時間；６分間）した後に、同遠心管を軽くたたいてペレ
ットをほぐした。

同遠心管を回転させつつ、１ｍｌの４０％ＰＥＧ１５０
０溶液（３７°Ｃ）を１分間かけて加え、回転させなが
らさらに１分間反応させた。

次に、回転させながらＭＥＭ（３７°Ｃ）を徐々に加え
、最終的には１０ｍｊ！とじ、遠心分離（回転数；８０
０ｒｐｍ、時間；６分間）して上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、１４０ｍ１
のＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１
０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジン
、ウシインシュリン０．２Ｕ／ｍｆおよび２０％ウシ胎
児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地、３７°Ｃに保
温）に再懸濁して、９６ウエルの培養プレート１８枚の
各培養ウェルに１００μ！づつ分注して、ＣＯ□インキ
ュベーターを用いて培養した（５％Ｃｏ、、９５％空気
、３７°Ｃ１湿度１００％）。

■ハイブリドーマの選択前述■の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖が認
められた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、モル
ヒネに対する抗体が含まれているか否かを、次に示すＥ
ＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＵ底ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート（以下、
ＥＬＩＳＡプレート略す。）の各分析ウェルに、実施例
１で作製した分析用抗原であるＮＭ−ＢＳＡ溶液（２ｔ
ｔ　ｇ／ｍｌ！、ｐ　Ｈ９，８の０．０５　Ｍ炭酸緩衝
液に溶解）を５０μ！づつ分注し、４　’Ｃで１晩静置
した（このような処理によって、ＮＭ−ＢＳＡが各分析
ウェルの接触面に非特異的に吸着する。）。

次いで、その各分析ウェルを洗浄液（０，０５％の’ｌ
’ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎと略記する。）で洗浄した後、０．５％のＢＳＡ溶液
（ＰＢＳに溶解）を各分析ウェルに１００μｌづつ分注
して室温で３０分間静置した。

これらの各分析ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、
前記培養プレートの各培養ウェルの培養上清を、これら
の各分析ウェルに５０μ２づつ分注して室温で２時間静
置した（陰性対照には、）ＩＡＴ培地を用いた。一方、
陽性対照には、本発明での細胞融合に用いたマウスの血
清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１００倍に希釈したものを用
いた。）。

次に、前記の各分析ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄
し、マウス免疫グロブリンに対するアルカリフォスファ
ターゼ標識抗体溶液を、５０μβづつ、各分析ウェルに
分注し、室温で１時間静置した。そして、その各分析ウ
ェルをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸ナトリウム・６Ｈ！０溶液（１ｍｇ／ｍｉ
、）を１００μｌづつ各分析ウェルに分注し、室温で３
０分間反応後、この分析プレート用の吸光度測定装置を
用いて各分析ウェルの４０５　ｎｍにおける吸光度を測
定した。

このような検討の結果、培養プレート中の１０１３個の
培養ウェルの中の１４個で、モルヒネに対する抗体の産
生が認められた。

これらの抗体を産生じた１４個の培養ウェルについて、
モルヒネを用いた阻害試験（前記のＥＬＩＳＡで培養ウ
ェルの上清５０ｕｌのかわりに、その培養ウェルの上清
２５μｌとモルヒネ１０μｇを熔解したＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ２５μｊ！とを同時に分析ウェルに入れる以外は同
様の操作を行う）を行った。

その結果、モルヒネで阻害される抗体を含有している培
養ウェルは、１４個の中の５個で認められた。即ち、こ
の５個の培養ウェルには、モルヒネに対する抗体を産生
ずるハイブリドーマが存在することが確認された。

■ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ＦＣ３
を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述の■工程に
おいて示した抗体産生が確認された５個の培養ウェル（
Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ）中のハイブリドーマについて限界
希釈法でクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０７個／ｍｌ）を使用して、（ハイブリドーマ１〜５
個）／（胸腺細胞懸濁液１００μり／ウェルで培養し、
培養開始から５日目に２０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６
４０培地を各培養ウェルに１ｏｏｕＪ２づつ追加してさ
らに培養を続けた。

前記Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅの５個の培養ウェル中のハイブ
リドーマのクローニングにおいて、１０〜１４日目に単
一コロニーとして観察される培養ウェルの上清を採取し
て、ＥＬＩＳＡ法（前述の■工程と同様の方法）で抗体
産生ウェルのスクリーニングを行なった。このようにし
て、Ａ、Ｂ。

Ｃ，Ｄ、Ｈの各培養ウェルからハイブリドーマ株をそれ
ぞれ少な（とも１株づつ以上得た。そして、それらのう
ちで細胞増殖と抗体産生量を考慮してＡ、Ｂ、ＣＳＤ、
Ｅ培養ウェル由来のハイブリドーマ株を各々１株づつ選
んで再クローニングした。

このようにして得られた株をＭＯ−２株（徽工研条寄第
１９１０号）、ＭＯ−３株（微工研条寄第１９１１号）
、ＭＯ−４株、ＭＯ−５株（微工研条寄第１９１２号）
、ＭＯ−６株と称し、これらの株が産生じたモノクロー
ナル抗体を、それぞれＭＯ−２、ＭＯ−３、ＭＯ−４、
ＭＯ−５、ＭＯ−６と称す。

これら５株の培養上滑中に含まれるモノクローナル抗体
のクラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験■で決
定し、各種化合物に対する反応性を測定試験■−で検討
した。

貫足跋脹土〔モルヒネに対するモノクローナル抗体のクラス・サブ
クラスの決定〕ＭＯ−２株、ＭＯ−３株、ＭＯ−４株、ＭＯ−５株およ
びＭＯ−６株が産生じた免疫グロブリンのクラス・サブ
クラスの決定は、マウス抗体の各クラス・サブクラスに
特異的なペルオキシダーゼ標識抗体溶液（ＩｇＧ＋　、
ＩｇＧｚａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ｒｇＭ、ＩｇＡ、
に型り鎖またはλ型り鎖などに対する西洋ワサビペルオ
キシダーゼで標識された抗体）を用いた前述の■工程と
同様のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法、およびマウス抗体の各クラス
・サブクラスに特異的な抗体溶液（ＩｇＧ＋、Ｔｇ　Ｇ
　ｚ　ａ　ＳＩ　ｇ　Ｇ　ｍ　ｂ　−、Ｉ　ｇ　Ｇ　ｓ
、ＩｇＭ、ＩｇＡ、に型り鎖またはλ型り鎖などに対す
る抗体）を用いたオフタロニー法で行った。

その結果、ＭＯ−２株が産生じたモノクーナル抗体（Ｍ
Ｏ−２）はに型り鎖を有するＩｇＧ、に属する抗体であ
り、ＭＯ−３株が産生じたモノクローナル抗体（ＭＯ−
３）はに型り鎖を有する■ｇＧ、ｂに属する抗体であり
、ＭＯ−４株が産生したモノクローナル抗体（ＭＯ−４
）はに型Ｉ、１ｍを有するｒｇＡに属する抗体であり、
ＭＯ−５株が産生したモノクローナル抗体（ＭＯ−５）
はλ型り鎖を有するＩｇＧ、に属する抗体であり、ＭＯ
−６株が産生じたモノクローナル抗体（ＭＯ−６）は、
λ型り鎖を有するＩｇＭに属する抗体であった。

皿足拭籏工〔モルヒネに対するモノクローナル抗体の各種化合物に
対する反応性の検討〕ＭＯ−２、ＭＯ−３、ＭＯ−４、ＭＯ−５およびＭＯ−
６などのモノクローナル抗体の反応特異性について、モ
ルヒネ、モルヒネの生体内代謝産物〔モルヒネ−３−グ
ルクロナイド（Ｍ−３−Ｇ）またはモルヒネ−６−グル
クロナイド（Ｍ−６−Ｇ））、またはその他の鎮痛効果
を有する化合物〔コカイン、コデイン、ジヒドロコデイ
ン、エチルモルヒネ、フェンタニールまたはメサトン〕
との反応性を前述の■工程と同様のＥＬＩＳＡ法で検討
した（ただし、ハイブリドーマ培養上清５０ｔｔ１．の
かわりに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで多段階に希釈した化合
物溶液２５μ！と前記のいずれかのモノクローナル抗体
溶液２５μｌとの混合液を用いた。）。

各モノクローナル抗体と各化合物との反応性の結果を、
モルヒネとの反応性比で第１表に示す。

第　　１　　表（以下、余白）（以下、余白）実施例３〔フラスコ培養でのモルヒネに対するモノクローナル抗
体の生産〕１５％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養して得
たＭＯ−３株の培養細胞を１０ｍｆのＲＰＭ１１６４０
培地（Ｆｅ２を含まない）に移しかえて、殆ど全ての細
胞が死滅する直前まで培養した。

モルヒネに対するモノクローナル抗体（ＭＯ−３）は、
培養液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５
分間）して得られた上清中に５０μｇ／ｍｌ　（−次元
平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

実施例４〔マウス腹腔内でのモルヒネに対するモノクローナル抗
体の生産〕モルヒネに対する大量のモノクローナル抗体を得るため
に、マウス腹腔内でＭＯ−３株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、８周齢、２週間前
にプリスタンを０．５　ｍ　ｉ　ｐ腔内に投与しておく
）の腹腔内に、ＭＯ−３株の細胞を２Ｘ１０’個浮遊さ
せた０、　５　ｍ　ｌのＰＢＳを全景投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、細胞投与から７．９および１１日ロー１９　Ｇの注射
針を用いて腹水を採取した（全採取量；　６　ｍ　ｌ　
７匹）。そして、この腹水を遠心分離（回転数；３．Ｏ
ＯＯｒｐｍ、時間；５分間）して、腹水上清を得た。

モルヒネに対するモノクローナル抗体（ＭＯ−３）は、
この腹水上清中にＬｏｍｇ／ｍｆ（−次元平板免疫拡散
法により測定）含有されていた。

〔発明の効果］本発明のｒハイブリドーマ株の培養によって得られた鎮
痛薬であるモルヒネに対して非常に高い特異的な反応性
を有するモノクローナル抗体ｊは、モルヒネの検査、測
定などへの利用を期待できるものである。

特許出願人　　宇部興産株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞との細胞
融合によって得られたハイブリドーマ株が産生した、コ
デインとは実質的に反応しないが、モルヒネに対しては
非常に高い特異的な反応性を有することを特徴とするモ
ルヒネに対するモノクローナル抗体。
（２）請求項１に記載のハイブリドーマ株を培養するこ
とを特徴とするモルヒネに対するモノクローナル抗体の
製法。
（３）請求項１に記載のハイブリドーマ株。