JPH0196198A

JPH0196198A - メタンフェタミンに対するモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法

Info

Publication number: JPH0196198A
Application number: JP62253781A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Yukimasa Ito; 伊藤　幸勝; Takashi Usagawa; 宇佐川　崇; Minoru Nishimura; 西村　実
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1989-04-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、覚醒剤の一種であるメタンフェタミンに対す
るモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の
製法に関する。

〔従来の技術〕

覚醒剤事犯の増加に伴い、メタンフェタミン（以下、Ｍ
Ａと略す。）などの覚醒剤の乱用者を簡単で迅速に、か
つ正確に把握する必要性が高まってきている。

このような問題点を解決する方法としては、ＭＡなどに
対して非常に高い特異的な反応性を示すモノクローナル
抗体を試薬として用いた免疫学的測定方法が優れた方法
であると考えられているが、これまでに、〜ＩＡに対す
るモノクローナル抗体の作製に関する報告は認められて
いない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、覚醒剤であるＭＡに対して非常に高い
特異的な反応性を示すモノクローナル抗体およびそのモ
ノクローナル抗体の製法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、動物に免疫して得られた細胞株を培養するこ
とによって、覚醒剤であるメタンフェタミン（ＭＡ）に
対して非常に高い特異的な反応性を示すモノクローナル
抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

即ち、本発明は、動物に免疫して得られた細胞株が産生
したＭＡに対するモノクローナル抗体に関するものであ
る。

さらに、本発明は、ＭＡに対するモノクローナル抗体を
産生ずる細胞株を培養することを特徴とするＭＡに対す
るモノクローナル抗体の製法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫した動物から得ら
れた細胞株が産生ずるものであり、覚醒剤であるＭＡに
対して非常に高い特異的な反応性を有するものである。

本発明で動物の免疫に用いる免疫原としては、ＭＡに対
して非常に高い特異的な反応性を有するモノクローナル
抗体を得ることができるものであれば特に制限されない
が、例えば、ＭＡ、ＭＡの塩類およびＭＡを分子量１万
以上の担体に結合させたものを挙げることができるが、
好ましくはＭＡを分子量１万以上の担体に結合させたも
のを用いるのが良い。この時用いる分子量１万以上の担
体としては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、陣
笠貝ヘモシアニン、免疫グロブリンなどのような生体高
分子を挙げることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、前記のようにして免疫
された動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなどの哺
乳動物）から得られたリンパ球をウィルス、変異原性物
質などを用いて形質転換する方法によって作製された細
胞株を培養しても得られるが、免疫された動物から得ら
れたリンパ球に細胞増殖能を有する遺伝子を導入して形
質転換する方法（例えば、リン酸カルシウム沈澱物とし
た遺伝子の導入、同種または異種動物の細胞融合による
遺伝子の導入など）によって作製された細胞株を培養し
て得ることが好ましく、例えば、本発明者らが、免疫マ
ウスから得られたリンパ球とマウスのミエローマ細胞と
を融合して得たバイプリドーマのＭＡ−７株（微工研条
寄第　１４９４号）、ＭＡ−１３株・（微工研条寄第　
１４９５′号）またはＭＡ−１５株（微工研条寄第　１
４９６号）などから得られる。

このようなハイブリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｈｏｌｅｒの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５　（１９７６）］に準じて行
うことができる。そのようなハイブリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクローナル抗体　産　ハイブリドーマ株の　凹（ｉ
）免疫原および分析用抗原の調製免疫原は、例えば、ＭＡ、ＭＡの塩類などの化合物をＮ
−（４−ブロモブチル）フタルイミドを用いてＮ−（４
−アミノブチル）化した後、１−シクロへキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−ト
ルエンスルホン酸塩（以下、ＣＭＥＣと略す）、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（以下、ＥＤＰＣと略す）などのカルボジイ
ミドなどを用いて分子量１万以上の担体〔例えば、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯｖＡ）
、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリンなど
のような生体高分子が好ましい〕と結合することによっ
て作製することができる。　一方、分析用抗原としては
、免疫原の調製において用いた担体とは異なったものを
用いて、免疫原の調製法と同様にして調製したものを用
いる。

（ｉｉ　）免疫動物リンパ球の調製動物（例えば、マウス、ラットなど）の免疫方法は、Ｐ
ＢＳ　（中性のリン酸緩衝液）に溶解した前記（ｉ）の
免疫原（１０〜４００μｇ）を動物に１回または数週間
層で数回投与することで行うことができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死菌
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物の充分な抗体価を確認後、最
終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから得
ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｊ）ミエローマ細胞の準備細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−−Ｕｌ　（Ｐ３．Ｕｌ）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−
１）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、お
よびラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　
（Ｙ３）などのミエローマ細胞を用いることができるが
、６５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０などの
細胞外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた
方が好ましい。

（ｉｖ）細胞融合細胞融合は、前記のようにして免疫された動物のリンパ
球とミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：１の割
合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例え
ば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（Ｍ　Ｅ
　Ｍ、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、　Ｍ　ｃ　Ｃｏｙ、ＲＰＭＩ
　１６４０などの培地成分）溶液、等張緩衝液などを用
いて良く混合し、遠心分離した後のペレット（細胞塊）
に、ＨＶＪ　（センダイウィルス）またはＰＥＧ　（ポ
リエチレングリコール）溶液を添加することによって行
うことができるが、好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのが
よく、さらに好ましくは平均分子量が１０００〜８００
０で３０〜６０重量％のＰ　Ｅ　Ｇ　溶？Ｆｉを用いる
のがよい。この時、細胞融合を促進するために、コルヒ
チン、ジメチルスルホキシド、ポリーＬ−アルギニンな
どを添加することもできる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
動物と異種の動物由来のものを使用することもできるが
、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の
抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された動
物とは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さらに
好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｖ）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血゛清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検嬌に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、ウシ
胎児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に
用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるウシ
胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（ｖｉ）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（Ｖ）で得
られたハイブリドーマが、目的とする抗体を産生じてい
るか否かの検定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測
定法）、プラーク形成法、凝集反応法、ＲＩＡ（ラジオ
アイソ）　−プを用いた方法）などで行うことができる
が、ＥＬＩＳＡ法でおこなうことが好ましい。

このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

（ｉ）で調製した分析用抗原を固定化したＥＬＩＳＡプ
レートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培
養上清を加えて一定時間静置する。

そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動物
由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識抗
体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。

標識される抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体
だけと反応して結合することができる限り特に限定され
ず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得
られた血清、またはマウス細胞などを用いて作製された
ハイブリドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げ
ることができる。

）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置する。次
に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応し
た基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、酵素
活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウェル
中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドーマが存在し
ていたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
じているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マニプレーション法（倒立顕
微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡＣ
３（Ｆｌｕ。

ｒｅｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌＳｏ
ｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすることが
できる。この時、前記のいずれかのクローニング方法に
よって（ｖｉ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培
養し、その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、
（ｖｉ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬ
ＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

このようにして、ＭＡに対して特異性が高く、かつ抗体
価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
株を選択することができる。

モノクローナル−〇′！１ｉ法〜ＩＡに対して特異性が高（、かつ抗体価が高いモノク
ローナル抗体の生産は、前記（ｖｉｉ）で得たハイブリ
ドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物の腹腔
内で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培
養での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２
０％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培
養用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏ　ｙ、
ＲＰＭＩ　１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞
濃度が上限に達するまで培養することによって行うこと
ができる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作
で得た培養上清中に含まれている。

一方、前記（ｖｉｉ）で得たハイブリドーマ株の動物脂
腔内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合
に用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行
うこともできるが、同種の動物を用いて行った方が好ま
しく、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方が
よい。

このような方法乙こよるＭＡに対して特異性が高く、か
つ抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産は、マウス
、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹腔内にこの
動物の免疫能を低下させる物質、例えば、ブリスタンな
どの鉱物油を投与し、数週間後に１０６〜１０’個の前
記（ｖｉｉ）で得たハイブリドーマ株細胞を投与し、そ
の腹腔内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖させるこ
とによって行うことができる。この時、８亥モノクロー
ナル抗体は、遠心操作で得た腹水上滑中に含まれている
。そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得た時の
培養上清の抗体濃度の１０−１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛍白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、ｉ！？、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを行うことによって精製され、高純度のモノクロー
ナル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、ＭＡに
対して非常に高い特異的な反応性を有するものである。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１〔免疫原および分析用抗原の調製〕ベンゼン１２ｍｊ！に、０．５　ｍ　ｇのメタンフェタ
ミン（ＭＡ）を溶解し、これに１．１６　ｇのＮ−（４
−ブロモブチル）フタルイミドおよび０．５４ｇの炭酸
ナトリウムを加えて８０°Ｃ０°Ｃ下３還流し、無機物
を除去後１２、ｍｉのＩＮ塩酸を入れ、水層をベンゼン
で洗浄した。この水層にクロロホルムを入れて得られた
クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで脱水し、クロロホルムを減圧留去した。この残留
物を１２ｍ２のエタノールに溶解し、これに６０μ２の
９０％抱水ヒドラジンを加えて７日、５°Ｃ下２時間還
流した後にエタノールを留去した。この残留物を１２ｍ
１のＩＮ塩酸で溶解し、クロロホルムで洗浄した。これ
を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１０に調整し、クロロ
ホルムを入れて得られたクロロホルム層を飽和食塩水で
洗浄し、無水硫酸す）　ＩＪウムで脱水し、クロロホル
ムを減圧留去した。このようにして、０．２ｇのＮ−（
４−アミノブチル）メタンフェタミン（以下、Ａ　Ｂ　
Ｍ　Ａと略す）を得た。

免疫原は、前記のＡＢＭＡを用いて以下のようにして調
製した。

０、４　ｍ　ｌのジメチルホルムアミドに２０ｍｇのＡ
ＢＭＡと生体高分子である２　０ｍｇの免疫グロブリン
（ヒトＩｇＣ，）とを溶解後、１０％の１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩（以下、ＥＤＰＣと略す）を１２ｍｊ！入れ、室温下
３時間攪拌した後にＰＢＳ（ｐＨ７，４のリン酸緩衝？
Ｆ１．）に対して透析し、非透析画分を凍結乾燥して、
免疫原である「目的とするモノクローナル抗体に対応す
る抗原ｊであるメタンフェタミン（ＭＡ）とヒト■ｇＧ
との結合物（以下、ＭＡＩｇＧと略す）を４ｍｇ得た。

分析用抗原は、以下のようにして調製した。

前記の免疫原の調製方法でＥＤＰＣのかわりに１−シク
ロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥＣ）を用
い、ヒトＩｇＧのかわりに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いる以外は同様にして、分析用抗原であるＭＡとＢ
ＳＡとの結合物（以下、ＭＡ−ＢＳＡと略す）を３ｍｇ
得た。

実施例２（ＭＡに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株の作製〕（ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製実施例１で
調製した免疫原である４００μｇのＭＡ−ＩｇＧを溶解
した１ｍｌのＰＢＳ　（リン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４）
と１ｍｌのフロイントの完全アジュバントとを充分に混
合して得られたエマルジョンの０．５　ｍ　ＩＬをＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス（♀、７退部）の腹腔内に投
与した。

この初回免疫から２周間後、および４週間後に前記と同
様にして調製したエマルジョンの０．５ｍｌを前記マウ
スの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記の抗原１０
０μｇを溶解したＰＢＳの０．２　ｍ　ｌを前記マウス
の尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日目に摘出した肺臓を、氷冷下に、ＲＰＭ１１６４０液
（リンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解したもの）を
入れたシャーレ中で洗い、新たに用意したＲＰＭ１１６
４０液の中に移して、ピンセットでほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＲＰＭ１１６４０
液に懸濁して、遠心分濯しく回転数；１１０００ｒｐ、
時間；５分間）、ＲＰＭ１１６４０液に再懸濁し、細胞
融合に使用するマウス肺臓リンパ球とした。

（ｂ）細胞融合４．５Ｘ１０’個の対数増殖期にある８−アザグアニン
耐性のマウスミエローマ！胞（Ｘ６３−Ａｇ、６５３；
５５３）と前記のマウスの肺臓リンパ球２．７Ｘ１０’
個とを５０ｍ！２容プラステンク製コニカル遠心管に入
れ、混合し、次いで、上清を遠心分離した後に（回転数
；１４００ｒｐｍ。

時間；６分間）、同遠心管を軽くたたいてペレットをほ
ぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥ（１，４０００溶液（３７°Ｃ）を１分間かけて
１ｍｊ２入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながらＲＰＭＩＩ６４０液
（３７°Ｃ）を徐々に加え、最終的には１０ｍ１とし、
室温で遠心分離（回転数；　８００　ｒｐｍ、時間；６
分間）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、１６０ｍ１
のＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１
０−７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジン
及び２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培
地）に懸濁して、９６ウエルの培養プレート１９枚の各
培養ウェルに１００μｌづつ分注して、Ｃ○２インキュ
ベーターを用いて培養した（５％ＣＯ□、９５％空気、
３７°Ｃ１湿度１００％）。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択前述（ｂ）の培養開始から２〜４ａ間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、
ＭＡに対する抗体が含まれているか否かを、次に示すＥ
ＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＵ底ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェ
ルに、実施例１で調製した分析用抗原であるＭＡ−ＢＳ
Ａ溶液（２ｕ　ｇ／ｍＬ　ｐ　Ｈ９，８の０．０５　Ｍ
炭酸緩衝液に溶解）を５０μｌづつ分注し、４°Ｃで１
晩静置した（このような処理によって、ＭＡ−ＢＳＡが
各分析ウェルの表面に吸着する。）。

次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した
後、０．５％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解）を各分析ウ
ェルに１００μ尼づつ分注して室温で２時間静置し、こ
れらの各分析ウェルを洗浄液で洗浄し、前記培養プレー
トの各培養ウェルの培養上清を、これらの各分析ウェル
に５０μβづつ分注して室温で２時間静置した（陰性対
照には、融合前のマウス肺臓リンパ球とマウスミエロー
マ細胞との混合物を同様に培養して得た上清を用いた。

一方、陽性対照には、本発明での細胞融合に用いたマウ
スの血清を洗浄液で１００倍に希釈したものを用いた。

）。

次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄し、マ
ウス免疫グロブリンに対するアルカリフォスファターゼ
標識抗体溶液を、５０μｌづつ、各分析ウェルに分注し
、室温で１時間静置した。

そして、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄後、
ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・６Ｈ，Ｏ溶液（
１ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を１００．ｃ／！づつ各分析
ウェルに分注し、室温で３０分反応後、マイクロプレー
ト用の吸光度測定装置を用いて各ウェルの４０５　ｎｍ
における吸光度を測定した。

このような検討の結果、培養プレート中の１４１１個の
培養ウェルの中の３４個で、ＭＡに対する抗体の産生が
認められた。

これらの抗体を産生した３４個の培養ウェルについて、
ＭＡを用いた阻害試験（前記のＥＬＩＳＡで培養ウェル
の上清のかわりに、その上清に１０μｇのＭＡを含む溶
液を入れる以外は同様な操作を行う。）を行った。

その結果、ＭＡで阻害される抗体を含有している培養ウ
ェルは、３４個の中の１９個で認められた。即ち、この
１９個の培養ウェルには、ＭＡと反応する抗体を産生ず
るハイブリドーマが存在することが確認された。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された１９
個の培養ウェルのうちの３個の培ｉウェルについてシン
グル・セル・マニプレーション法（倒立顕微鏡下、１ウ
エルに１個のハイブリドーマを入れる方法）でハイブリ
ドーマをクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０７個／　ｍ　ｊ２　）を使用して、（ハイブリドー
マ１個）／（胸腺細胞懸濁液１００μｉ、）／つエルで
培養した。

前記の培養において、１０日目頃から単一コロニーとし
て観察される培養ウェルの上清を採取して、ＭＡ−ＢＳ
Ａを用いたＥＬＩＳＡ法（前述の（Ｃ）工程と同様の方
法）で抗体産生ウェルのスクリーニングを行ない、ハイ
ブリドーマ株を３株得、これらを再クローニングした。

このようにして得られた株をＭＡ−７株（微工研条寄第
　１４９４号）、ＭＡ−１３株（微工研条寄第　１４９
５号）　、ＭＡ−’１５株（微工研条寄第　１４９６号
）と称し、これらの株が産生したモノクローナル抗体を
、それぞれＭＡ−７、ＭＡ−１３およびＭＡ−１５と称
す。

これら３株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体
のクラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験Ｉで決
定し、各種化合物に対する反応性を測定試験■で検討し
た。

１ヱ拭笠土（Ｍ　Ａに対するモノクローナル抗体のクラス・サブク
ラスの決定〕ＭＡ〜７株、ＭＡ１３株およびＭＡ−１５株が産生した
免疫グロブリンのクラス・サブクラスの決定は、マウス
抗体の各クラス・サブクラスに特異的なペルオキシダー
ゼ標識抗体溶）夜（Ｉ　ｇＧ＋　、ＩｇＧｚａＳ　Ｉｇ
Ｇｚｂ、１ｇＧ２　、ＩｇＭ。

ＩｇＡ、に型り鎖またはλ型り鎖などに対する西洋ワサ
ビペルオキシダーゼで標識された抗体）を用いた前述の
（Ｃ）工程と同様のＥＬＩＳＡ法、およびマウス抗体の
各クラス・サブクラスに特異的な抗体溶液（ＩｇＣ＋　
、ＩｇＧｚ　ａ、■ｇＧ２ｂ、ＩｇＧ：ｒ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＡ、χ型り鎖またはλ型り鎖などに対する抗体）を用
いたオフタロニー法で行った。

その結果、ＭＡ−７株およびＭＡ−１３株が産生したモ
ノクローナル抗体（ＭＡ−７およびＭＡ−１３）は、い
ずれもλ型のＬ鎖を有するｊ　ｇ　Ｇ、に属する抗体で
あり、ＭＡ−１５株が産生したモノクローナル抗体（Ｍ
Ａ−１５）は、に型のし鎖を有するＩｇＧ、ｂに属する
抗体であることがわかった。

遺ｍ先■ （ＭＡに対するモノクローナル抗体の各種化合物に対す
る反応性の検討〕ＭＡ−７、ＭＡ−１３およびＭＡ−１５などのモノクロ
ーナル抗体の反応特異性について、ＡＰ（アンフェタミ
ン）、ＥＰ（エフェドリン）、ＭＥ（メチルエフェドリ
ン）、ＭＰＡ（メトキシフェナミン）、ＰＴ（フェンテ
ルミン）、ｎｏｒＥＰ（ノルエフェドリン）、ＤＢＥＤ
　（Ｎ、Ｎ’　　−ジベンジルエチレンジアミン）　、
ＯＨ−ＭＡ　（Ｐ−ヒドロキシメタンフェタミン）、○
Ｈ−ＡＰ（ｐ−ヒドロキシアンフェタミン）、０Ｈ−Ｅ
Ｐ（ｐ−ヒドロキシエフェドリン）、０Ｈ−ｎｏｒＥＰ
　（ｐ−ヒドロキシノルエフェドリン）、ＭｅＳ（メス
カリン）などのＭＡとは異なる化合物との反応性を前述
の（Ｃ）工程と同様のＥＬＩＳＡ法で検討した（ただし
、測定に用いる試薬は２倍量とし、ハイブリドーマ培養
上清のかわりに洗浄液で多段階に希釈した５０μ！の化
合物の溶液と５０μ２のモノクローナル抗体溶液との混
合溶液を用いた。）。

これらの抗体のＭＡ、ＡＰ、ＥＰ、ＭＥ、ＭＰＡＳＰＴ
、、ｎｏｒＥＰ、ＤＢＥＤ、ＯＨ−ＭＡ、０Ｈ−ＡＰ、
０Ｈ−ＥＰ、０Ｈ−ｎｏ　ｒＥＰ、Ｍｅｓとの反応性を
ＭＡとの反応性比で表１に示す。

（以下、余白）表　　　１実施例３〔フラスコ培養でのＭＡに対するモノクローナル抗体の
生産〕１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養
して得たＭＡ−１５株の培養細胞を１０ｍｊ２のＲＰＭ
１１６４０液（ウシ胎児血清を含まない）に移しかえて
、死滅直前まで培養した。

ＭＡに対するモノクローナル抗体（ＭＡ　　１５）は、
培養液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５
分間）して得られた上清中に４０μｇ／ｍｌ　（−次元
平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

実施例４〔マウス腹腔内でのＭＡに対するモノクローナル抗体の
生産〕ＭＡに対する大量のモノクローナル抗体を得るために、
マウス腹腔内でＭＡ−１５株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　マウス（♀、６周齢、２週間
前にプリスタンを０．５　ｍ　ｌ　ｌｉ腔内に投与して
おく）の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させたＭＡ
−１５株の細胞を２×１０ｈ個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、２週間目に腹水（１０ｍｊ！／匹）を採取した。この
腹水を遠心分離（回転数、３０００ｒｐｍ、時間；５分
間）して、腹水上清を得た。

ＭＡに対するモノクローナル抗体（ＭＡ　　１５）は、
この腹水上清中に８．３ｍｇ／ｍｌ　（−次元平板免疫
拡散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明の「細胞株の培養によって得られた覚醒剤である
メタンフェタミン（Ｍ　Ａ　）に対して非常に高い特異
的な反応性を有するモノクローナル抗体ｊは、ＭＡの検
査、測定などに利用できる。

特許出願人　　宇部興産株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）動物に免疫して得られた細胞株が産生したメタン
フェタミンに対するモノクローナル抗体。
（２）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
囲第１項に記載のメタンフェタミンに対するモノクロー
ナル抗体。
（３）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
されたものである特許請求の範囲第２項に記載のメタン
フェタミンに対するモノクローナル抗体。
（４）メタンフェタミンに対するモノクローナル抗体を
産生する細胞株を培養することを特徴とするメタンフェ
タミンに対するモノクローナル抗体の製法。
（５）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
囲第４項に記載のメタンフェタミンに対するモノクロー
ナル抗体の製法。
（６）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
されたものである特許請求の範囲第５項に記載のメタン
フェタミンに対するモノクローナル抗体の製法。