JPH01112996A - メチルエフェドリンに対するモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、鎮咳薬であるメチルエフェドリン（以下、Ｍ
Ｅと称す）に対するモノクローナル抗体およびそのモノ
クローナル抗体の製法に関する。

〔従来の技術〕

メチルエフェドリン（ＭＥ）は鎮咳薬として風邪薬など
の中に含まれている物質である。

ＭＥの薬理効果の基礎研究としては、その生体内代謝や
血中濃度の測定などが行われる。その際、迅速で正確、
かつ高感度にＭＥを測定できるか否かが非常に重要とな
って（る。

そのような測定方法としては、ＭＥに対して非常に高い
特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を試薬として
用いた免疫学的測定方法が優れた方法であると考えられ
ている。

しかし、これまでに、そのような測定方法に用いること
ができるＭＥに対するモノクローナル抗体の作製に関す
る報告は認められていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、鎮咳薬であるＭＥに対して非常に高い
特異的な反応性を示すモノクローナル抗体およびそのモ
ノクローナル抗体の製法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、哺乳動物に免疫して得られた細胞株を培養す
ることによって、鎮咳薬であるＭＥに対して非常に高い
特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を得ることが
できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、哺乳動物に免疫して得られた細胞株が
産生したＭＥに対するモノクローナル抗体に関するもの
である。

さらに、本発明は、ＭＥに対するモノクローナル抗体を
産生ずる細胞株を培養することを特徴とするＭＥに対す
るモノクローナル抗体の製法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫した哺乳動物から
得られた細胞株が産生ずるものであり、鎮咳薬であるＭ
Ｅに対して非常に高い特異的な反応性を有するものであ
る。

本発明で哺乳動物の免疫に用いる免疫原としては、ＭＥ
に対して非常に高い特異的な反応性を有するモノクロー
ナル抗体を得ることができるものであれば特に制限され
ないが、例えば、ＭＥ、ＭＥの塩類、ＭＥを分子量１万
以上の担体に結合させたもの、ＭＡ、ＭＡの塩類および
ＭＡを分子量１万以上の担体に結合させたものを挙げる
ことができる。この時用いる分子量１万以上の担体とし
ては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、陣笠貝ヘ
モシアニン、免疫グロブリンなどのような生体高分子を
挙げることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、前記のようにして免疫
された哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど
）から得られたリンパ球をウィルス、変異原性物質など
を用いて形質転換する方法によって作製された細胞株を
培養しても得られるが、免疫された動物から得られたリ
ンパ球に細胞増殖能を有する遺伝子を導入して形質転換
する方法（例えば、リン酸カルシウム沈殿物とした遺伝
子の導入、同種または異種動物の細胞融合による遺伝子
の導入など）によって作製された細胞株を培養して得る
ことが好ましく、例えば、本発明者らが、免疫マウスか
ら得られたリンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合
して得たハイブリドーマのＭＡ−１株、ＭＡ−３株、（
微工研条寄第１４９３号）、ＭＡ−９株から得られる。

このようなハイブリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｈｏｌｅｒの方法［Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５　（１９７６）］に準じて行
うことができる。そのようなハイブリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクローナル　　・　ハイブリドーマ　の　１１（ｉ
）免疫原および分析用抗原の調製 免疫原は、ＭＡ、ＭＡの塩類などの化合物を用いた場合
には、例えば、これらの化合物をＮ−（４−ブロモブチ
ル）フタルイミドを用いてＮ−（４−アミノブチル）化
した後、また、ＭＥ、ＭＥの塩類などの化合物を用いた
場合には、例えば、側鎖のＯＨ基を利用してヘミサクシ
ネートとした後、１−シクロへキシル−３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−）ルエンスル
ホン酸塩（以下、ＣＭＥＣと略す）、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（以下、ＥＤＰＣと略す）などのカルボジイミドなどを
用いて分子量１万以上の担体〔例えば、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリンなどのような生
体高分子が好ましい〕と結合することによって作製する
ことができる。

一方、分析用抗原としては、免疫原の調製において用い
た担体とは異なったものを用いて、免疫原の調製法と同
様にして調製したものを用いる。

（ｉｉ）免疫動物リンパ球の調製 哺乳動物（例えば、マウス、ラットなど）の免疫方法は
、ＰＢＳ　（中性のリン酸緩衝液）に溶解した前記（ｉ
）の免疫原（１０〜４００μｇ）を動物に１回または敗
退間隔で数回投与することで行うことができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死菌
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物の充分な抗体価を確認後、最
終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから得
ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｉｉ　）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　　（ＳＰ　２１０　）など、
およびラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３
　（Ｙ３）などのミエローマ細胞を用いることができる
が、６５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０など
の細胞外に抗体、を産生分泌しないミエローマ細胞を用
いた方が好ましい。

（ｉｖ）細胞融合 細胞融合は、前記の−ようにして免疫された動物のリン
パ球とミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰＭ１１６４０などの培
地成分）溶液、等張緩樹液などを用いて良（混合し、遠
心分離した後のペレット（細胞塊）に、ＨＶＪ　（セン
ダイウィルス）またはＰＥＧ　（ポリエチレングリコー
ル）溶液を添加することによって行うことができるが、
好ましくはＰＥ、Ｇ溶液を用いるのがよく、さらに好ま
しくは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜６０重
量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよい。この時、細胞融合
を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシド
、ポリーＬ−アルギニンなどを添加することもできる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
動物と異種の動物由来のものを使用することもできるが
、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の
抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された動
物とは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さらに
好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｖ）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞数を入
れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質また
はそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ節
由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に応
じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞数に達す
るまで、ＨＴ培地（ヒボキサンチン、チミジン、ウシ胎
児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に用
いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができる
）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるウシ胎
児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（ｖｉ）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（Ｖ）で得
られたハイブリドーマが、目的とする抗体を産生してい
るか否かの検定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測
定法）、プラーク形成法、凝集反応法、ＲＩＡ（ラジオ
アイソトープを用いた方法）などで行うことができるが
、ＥＬＩＳＡ法でおこなうことが好ましい。

このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

（ｉ）で調製した分析用抗原を固定化したＥＬＩＳＡプ
レートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培
養上清を加えて一定時間静置する。

そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動物
由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識抗
体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。

標識される抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体
だけと反応して結合することができる限り特に限定され
ず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得
られた血清、またはマウス細胞などを用いて作製された
ハイブリドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げ
ることができる。

）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置する。次
に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応し
た基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、酵素
活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウェル
中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドーマが存在し
ていたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
しているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリ１’−７ハ、Ｉ
ＩＩＪ’ｌ釈法、シングル・セル・マニプＬ／−ジョン
法（倒立顕微鏡下、ｌウェルに１個のハイブリドーマを
入れる方法）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方
法、ＦＡＣ３（Ｆｌｕ。

ｒｅｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌＳＯ
ｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすることが
できる。この時、前記のいずれかのクローニング方法に
よって（ｖｉ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培
養し、その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、
（ｖｉ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬ
ＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

このようにして、ＭＥに対して特異性が高く、かつ抗体
価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
株を選択することができる。

モノクローナル　　の１１法 ＭＥに対して特異性が高く、かつ抗体価が高いモノクロ
ーナル抗体の生産は、前記（ｖｉ）で得たハイブリドー
マ株をフラスコ内で培養したり、または動物の腹腔内で
培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含むゞ−一般的用いられるリンパ球培
養用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、Ｒ
ＰＭＩ　１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃
度が上限に達するまで培養することによって行うことが
できる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で
得た培養上滑中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株の動物脂腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。

このような方法によるＭＥに対して特異性が高く、かつ
抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産は、マウス、
ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹腔内にこの動
物の免疫能を低下させる物質、例えば、プリスタンなど
の鉱物油を投与し、数週間後に１０ｈ〜１０７個の前記
（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株細胞を投与し、その腹
腔内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖させることに
よって行うことができる。この時、該モノクローナル抗
体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれている。そし
て、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得た時の培養上
清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛋白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、ＭＥに
対して非常に高い特異的な反応性を有するものである。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ 〔免疫原および分析用抗原の調製〕 ベンゼン１２ｍｆに、０．５　ｍ　ｇのメタンフェタミ
ン（ＭＡ）を溶解し、これに１．１６　ｇのＮ−（４−
ブロモブチル）フタルイミドおよび０．５４ｇの炭酸ナ
トリウムを加えて８０℃下３２時間還流し、無機物を除
去後１２ｍｌのＩＮ塩酸を入れ、水層をベンゼンで洗浄
した。この水層にクロロホルムを入れて得られたクロロ
ホルム層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
脱水し、クロロホルムを減圧留去した。この残留物を１
２ｍ／！のエタノールに溶解し、これに６０μ２の９０
％抱水ヒドラジンを加えて７８．５°Ｃ下２時間還流し
た後にエタノールを留去した。この残留物を１２ｍ２の
ＩＮ塩酸で溶解し、クロロホルムで洗浄した。これを水
酸化ナトリウムを用いてｐＨ１０に調整し、クロロホル
ムを入れて得られたクロロホルム層を飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、クロロホルムを減圧
留去した。このようにして、０．２ｇのＮ−（４−アミ
ノブチル）メタンフェタミン（以下、ＡＢＭＡと略す）
を得た。

免疫原は、前記のＡＢＭＡを用いて以下のようにして調
製した。

０、４　ｍ　ｌのジメチルホルムアミドに２０ｍｇのＡ
ＢＭＡと生体高分子である２　０ｍｇの免疫グロブリン
（ヒ）ＩｇＧ）とを溶解後、１０％の１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（以下、ＥＤＰＣと略す）を１２ｍｊ！入れ、室温下３
時間攪拌した後にＰＢＳ（ｐＨ７，４のリン酸緩衝液）
に対して透析し、非透析画分を凍結乾燥して、免疫原で
あるメタンフェタミン（ＭＡ）とヒトＩｇＧとの結合物
（以下、ＭＡ−ＩｇＧと略す）を４ｍｇ得た。

分析用抗原は、以下のようにして調製した。

前記の免疫原の調製方法でＥＤＰＣのかわりに１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥＣ）を用
い、ヒトＩｇＧのかわりに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いる以外は同様にして、分析用抗原であるＭＡとＢ
ＳＡとの結合物（以下、ＭＡ−ＢＳＡと略す）を３ｍｇ
得た。

実施例２ （ＭＥに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株の作製〕 （ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製実施例１で
調製した免疫原である４００μｇのＭＡ−ＩｇＧを溶解
した１ｍｆのＰＢＳ　（リン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４）
と１ｍｊ！のフロイントの完全アジュバントとを充分に
混合して得られたエマルジョンの０．５　ｍ　ｌをＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウス（♀、７適齢）の腹腔内に投
与した。

この初回免疫から２週間後、および４週間後に前記と同
様にして調製したエマルジョンの０．５ｍｌを前記マウ
スの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記の抗原１０
０μｇを溶解したＰＢＳの０．２　ｍ　ｌを前記マウス
の尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日目に摘出した肺臓を、氷冷下に、ＲＰＭ１１６４０液
（リンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解したもの）を
入れたシャーレ中で洗い、新たに用意したＲＰＭ１１６
４０液の中に移して、ピンセットでほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＲＰＭＩ１６４０
液に懸濁して、遠心分離しく回転数；１１０００ｒｐ、
時間：５分間）、ＲＰＭ１１６４０液に再懸濁し、細胞
融合に使用するマウス肺臓リンパ球とした。

（ｂ）細胞融合 ４．５Ｘ１０’個の対数増殖期にある８−アザグアニン
耐性のマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ、６５３；
６５３）と前記のマウスの肺臓リンパ球２．７Ｘ１０”
個とを５０ｍ１容プラスチツク製コニカル遠心管に入れ
、混合し、次いで、上清を遠心分離した後に（回転数；
１４００ｒｐｍ。

時間；６分間）、同遠心管を軽くたたいてペレットをほ
ぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥＧ４０００溶液（３７°Ｃ）を１分間かけて１ｍ
２入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながらＲＰＭＩＩ６４０液
（３７°Ｃ）を徐々に加え、最終的には１０ｍｆとし、
室温で遠心分離（回転数；８００μｌｍ＋時間；６分間
）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、１６０ｍ！
のＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１
０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−ｓＭチミジン
及び２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培
地）に懸濁して、９６ウエルの培養プレート１９枚の各
培養ウェルに１００μｌづつ分注して、ＣＯ２インキュ
ベーターを用いて培養した（５％Ｃｏ、、９５％空気、
３７°Ｃ１湿度１００％）。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択 前述（ｂ）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上滑中に、
ＭＡに対する抗体が含まれているか否かを、次に示すＥ
ＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＵ底ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析
ウェルに、実施例１で調製した分析用抗原であるＭＡ−
ＢＳＡ溶液（２ｔｔ　ｇ／ｍｌ、ｐ　Ｈ９，８の０．０
５　Ｍ炭酸緩衝液に溶解）を５０μλづつ分注し、４°
Ｃで１晩静置した（このような処理によって、ＭＡ−Ｂ
ＳＡが各分析ウェルの表面に吸着する。）。

次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した
後、０．５％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解）を各分析ウ
ェルに１００μλづつ分注して室温で２時間静置し、こ
れらの各分析ウェルを洗浄液で洗浄し、前記培養プレー
トの各培養ウェルの培養上清を、これらの各分析ウェル
に５０ｐｌづつ分注して室温で２時間静置した（陰性対
照には、融合前のマウス肺臓リンパ球とマウスミエロー
マ細胞との混合物を同様に培養して得た上清を用いた。

一方、陽性対照には、本発明での細胞融合に用いたマウ
スの血清を洗浄液で１００倍に希釈したものを用いた。

）。

次に、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄し
、マウス免疫グロブリンに対するアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗体溶液を、５０μ！づつ、各分析ウェルに分
注し、室温で１時間静置した。

そして、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄
後、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・６Ｈ２０溶
液（１ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を１００μｊ２づつ各分
析ウェルに分注し、室温で３０分反応後、マイクロプレ
ート用の吸光度測定装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍ
における吸光度を測定した。

このような検討の結果、培養プレート中の１４１１個の
培養ウェルの中の３４個で、ＭＡに対する抗体の産生が
認められた。

これらの抗体を産生した３４個の培養ウェルについて、
ＭＥを用いた阻害試験（前記のＥＬＩＳＡで培養ウェル
の上清のかわりに、その上清に１０μｇのＭＥを含む溶
液を入れる以外は同様な操作を行う。）を行った。

その結果、ＭＥで阻害される抗体を含有している培養ウ
ェルは、３４個の中の３個で認められた。

即ち、この３個の培養ウェルには、ＭＥと反応する抗体
を産生ずるハイブリドーマが存在することが確認された
。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された１９
個の培養ウェルのうちの３個の培養ウェルについてシン
グル・セル・マニプレーション法（倒立顕微鏡下、１ウ
エルに１個のハイブリドーマを入れる方法）でハイブリ
ドーマをクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０７個／　ｍ　ｉ　）を使用して、（ハイブリドーマ
１個）／（胸腺細胞懸濁液１００μｆ）／ウェルで培養
した。

前記の培養において、１０日目頃から単一コロニーとし
て観察される培養ウェルの上清を採取して、ＭＡ−ＢＳ
Ａを用いたＥＬＩＳＡ法（前述の（Ｃ）工程と同様の方
法）で抗体産生ウェルのスクリーニングを行ない、ハイ
ブリドーマ株を３株得、これらを再クローニングした。

このようにして得られた株をＭＡ−１株、ＭＡ−３株（
微工研条寄第　１４９３号）、ＭＡ−９株と称し、これ
らの株が産生したモノクローナル抗体を、それぞれＭＡ
−１、ＭＡ−３およびＭＡ＝９と称す。

これら３株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体
のクラス・サブクラス、ＬｔＪｆの型を次の測定試験Ｉ
で決定し、各種化合物に対する反応性を測定試験■で検
討した。

剖１」い１上 （ＭＡに対するモノクローナル抗体のクラス・サブクラ
スの決定） ＭＡ−１株、ＭＡ−３株およびＭＡ−９株が産生した免
疫グロブリンのクラス・サブクラスの決定は、マウス抗
体の各クラス・サブクラスに特異的なペルオキシダーゼ
標識抗体溶液（ＩｇＧ＋、ＩｇＧ、ａ　、ＩｇＧ、ｂ　
、ＩｇＣｙ、、ＩｇＭ、ＩｇＡ、に型り鎖またはλ型り
鎖などに対する西洋ワサビペルオキシダーゼで標識され
た抗体）を用いた前述の（Ｃ）工程と同様のＥＬＩＳＡ
法、およびマウス抗体の各クラス・サブクラスに特異的
な抗体溶液（ＩｇＧ＋　、ＩｇＧｚ　ａ　、Ｉ　ｇＧｚ
　ｂ　、ＩｇＧ、　、ＩｇＭ、ＩｇＡ、に型り鎖または
λ型り鎖などに対する抗体）を用いたオフタロニー法で
行った。

その結果、ＭＡ−１株、ＭＡ−３株、ＭＡ−９株が産生
したモノクローナル抗体（ＭＡ−１、ＭＡ−３、ＭＡ−
９＞は、いずれもに型のし鎖を有するＩｇＧ、に属する
抗体であることがわかった。

節ｍも■ （ＭＡに対するモノクローナル抗体の各種化合物に対す
る反応性の検討〕 ＭＡ−１、ＭＡ−３およびＭＡ−９などのモノクローナ
ル抗体の反応特異性について、ＭＥ（メチルエフェドリ
ン）の他に、ＭＡ（メタンフェタミン）、ＡＰ（アンフ
ェタミン）、ＥＰ（エフェドリン）１、ＭＰＡ（メトキ
シフェナミン）、ＰＴ（フェンテルミン）、ｎｏｒＥＰ
　（ノルエフェドリン）、ＤＢＥＤ　（Ｎ、Ｎ’　−ジ
ベンジルエチレンジアミン）、ＯＨ−ＭＡ（Ｐ−ヒドロ
キシメタンフェタミン）、０Ｈ−ＡＰ（ｐ−ヒドロキシ
アンフェタミン）、０Ｈ−ＥＰ（ｐ−ヒドロキシエフェ
ドリン）、０Ｈ−ｎｏｒＥＰ　（ｐ−ヒドロキシノルエ
フェドリン）、Ｍｅｓ（メスカリン）などの化合物との
反応性を前述の（Ｃ）工程のＭＥを用いた阻害試験と同
様のＥＬＩＳＡ法で検討した（ただし、測定に用いる試
薬は２倍量とし、ハイブリドーマ培養上清のかわりに洗
浄液で多段階に希釈した５０μｌの化合物の溶液と５０
μｌのモノクローナル抗体溶液との混合溶液を用いた。

）。

これらの抗体のＭＥ、ＭＡ、ＡＰ、ＥＰ、ＭＰＡ、ＰＴ
、ｎｏ　ｒＥＰ、ＤＢＥＤ、ＯＨ−ＭＡ。

０Ｈ−ＡＰ、０Ｈ−ＥＰ、０Ｈ−ｎｏ　ｒＥＰ、Ｍｅｓ
との反応性をＭＥとの反応性比で表１に示す。

（以下、余白） 表１ 実施例３ 〔フラスコ培養でのＭＥに対するモノクローナル抗体の
生産〕 １５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養
して得たＭＡ−３株の培養細胞を１０ｍ、ｊ２のＲＰＭ
１１６４０液（ウシ胎児血清を含まない）に移しかえて
、死滅直前まで培養した。

ＭＥに対するモノクローナル抗体（ＭＡ−３）は、培養
液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５分間
）して得られた上清中に３７μｇ／ｍ！（−次元平板免
疫拡散法により測定）含有されていた。

実施例４ 〔マウス腹腔内でのＭＥに対するモノクローナル抗体の
生産〕 ＭＥに対する大量のモノクローナル抗体を得るために、
マウス腹腔内でＭＡ−３株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　７ウス（♀、６週齢、２週間
前にプリスタンを０．５　ｍ　１．腹腔内に投与してお
く）の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させたＭＡ３
株の細胞を２Ｘ１０’個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な工ｉ−加を
示し、２週間目に腹水（８，０ｎ／！／匹）を仁取した
。この腹水を遠心分離（回転数、３００Ｃｒｐｍ、時間
；５分間）して、腹水上清を得た。

ＭＥに対するモノクローナル抗体（ＭＡ−３）は、この
腹水上清中に８．５ｍｇ／ｍｆｆ１　（−次）平板免疫
拡散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明のｒ細胞株の培養によって得られた鎮隻薬である
メチルエフェドリン（ＭＥ）に対してジ常に高い特異的
な反応性を有するモノクロ−ナノ抗体１は、ＭＥの検査
、測定などに利用できる。

特許出願人　　宇部興産株式会社

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物に免疫して得られた細胞株が産生したメ
   チルエフェドリンに対するモノクローナル抗体。
2. （２）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
   囲第１項に記載のメチルエフェドリンに対するモノクロ
   ーナル抗体。
3. （３）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
   されたものである特許請求の範囲第２項に記載のメチル
   エフェドリンに対するモノクローナル抗体。
4. （４）メチルエフェドリンに対するモノクローナル抗体
   を産生する細胞株を培養することを特徴とするメチルエ
   フェドリンに対するモノクローナル抗体の製法。
5. （５）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
   囲第４項に記載のメチルエフェドリンに対するモノクロ
   ーナル抗体の製法。
6. （６）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
   されたものである特許請求の範囲第５項に記載のメチル
   エフェドリンに対するモノクローナル抗体の製法。