JP3105578B2 - 新規なモノクローナル抗体、それを産生する新規なハイブリドーマ株およびその製法 - Google Patents
新規なモノクローナル抗体、それを産生する新規なハイブリドーマ株およびその製法Info
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Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、メタンフェタミン（以下ＭＡと
略称することがある）とＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレン
ジアミン（以下ＤＢＥＤと略称することがある）の両者
に対して、特異的に認識するモノクローナル抗体および
その製造方法に関する。
略称することがある）とＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレン
ジアミン（以下ＤＢＥＤと略称することがある）の両者
に対して、特異的に認識するモノクローナル抗体および
その製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】覚醒剤に関連する事件の増加に伴い、メタ
ンフェタミンの使用者を簡便、迅速かつ正確に認知する
必要性が高まり、簡便、高感度、高選択的にメタンフェ
タミンを測定する方法が望まれている。特開平１−９６
１９８号公報には、動物に免疫して得られた細胞株を培
養することによって、覚醒剤であるメタンフェタミン
（ＭＡ）に対して非常に高い特異的な反応性を示すモノ
クローナル抗体を得ることが提案されている。そして、
現在国外ではＭＡだけを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を用いた測定システムには、ＥＬＩＳＡ法を基本
にした競合法によるものが商品化されている。しかし、
この測定システム法では製品の中にＭＡそのものを使用
する必要があり、日本の覚醒剤取締り法により、これら
の製品は製造、販売、使用が認められていないのが実情
である。
ンフェタミンの使用者を簡便、迅速かつ正確に認知する
必要性が高まり、簡便、高感度、高選択的にメタンフェ
タミンを測定する方法が望まれている。特開平１−９６
１９８号公報には、動物に免疫して得られた細胞株を培
養することによって、覚醒剤であるメタンフェタミン
（ＭＡ）に対して非常に高い特異的な反応性を示すモノ
クローナル抗体を得ることが提案されている。そして、
現在国外ではＭＡだけを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を用いた測定システムには、ＥＬＩＳＡ法を基本
にした競合法によるものが商品化されている。しかし、
この測定システム法では製品の中にＭＡそのものを使用
する必要があり、日本の覚醒剤取締り法により、これら
の製品は製造、販売、使用が認められていないのが実情
である。
【０００３】
【目的】本発明の目的は、ＭＡに対するモノクローナル
抗体を誘導する時にＭＡ以外に日本の法律に抵触しない
特定物質を選択特異的に認識するモノクローナル抗体を
作り、測定キットにはこの抗体と前記特定物質とを用い
ることにより、上記問題点を解決するＭＡの検出用モノ
クローナル抗体とその製造方法を提供する点にある。
抗体を誘導する時にＭＡ以外に日本の法律に抵触しない
特定物質を選択特異的に認識するモノクローナル抗体を
作り、測定キットにはこの抗体と前記特定物質とを用い
ることにより、上記問題点を解決するＭＡの検出用モノ
クローナル抗体とその製造方法を提供する点にある。
【０００４】
【構成】本発明の第１は、メタンフェタミンおよびＮ，
Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンの両者に対してのみ
特異的な免疫反応を示すことを特徴とするメタンフェタ
ミン覚醒剤検出用モノクローナル抗体に関する。本発明
の第２は、前記モノクローナル抗体を産生する能力を有
することを特徴とするハイブリドーマ株に関する。本発
明の第３は、前記ハイブリドーマ株を培養することを特
徴とするモノクローナル抗体の製法に関する。本発明の
第４は、メタンフェタミンの免疫用抗原を哺乳動物（人
を除く）に接種し、抗メタンフェタミン抗体産生能力を
もつリンパ細胞を得、このリンパ細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合させ、得られた融合細胞を培養し、そのな
かからメタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジベンジルエ
チレンジアミンの両者に対して特異的な免疫反応を示す
モノクローナル抗体を産生する能力をもつ請求項２記載
のハイブリドーマ株を選び出すことを特徴とする請求項
２記載のハイブリドーマ株の製法に関する。
Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンの両者に対してのみ
特異的な免疫反応を示すことを特徴とするメタンフェタ
ミン覚醒剤検出用モノクローナル抗体に関する。本発明
の第２は、前記モノクローナル抗体を産生する能力を有
することを特徴とするハイブリドーマ株に関する。本発
明の第３は、前記ハイブリドーマ株を培養することを特
徴とするモノクローナル抗体の製法に関する。本発明の
第４は、メタンフェタミンの免疫用抗原を哺乳動物（人
を除く）に接種し、抗メタンフェタミン抗体産生能力を
もつリンパ細胞を得、このリンパ細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合させ、得られた融合細胞を培養し、そのな
かからメタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジベンジルエ
チレンジアミンの両者に対して特異的な免疫反応を示す
モノクローナル抗体を産生する能力をもつ請求項２記載
のハイブリドーマ株を選び出すことを特徴とする請求項
２記載のハイブリドーマ株の製法に関する。
【０００５】〔モノクローナル抗体の製造プロセス〕 Ａ．免疫用抗原の調製 メタンフェタミン（ＭＡ）をアミノブチル化またはカル
ボキシメチル化してアミノブチル化またはカルボキシメ
チル化メタンフェタミンをつくり、これに任意の支持タ
ンパク質を結合させて複合体を得、これを免疫用抗原と
した。前記支持タンパク質としては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、陣笠貝ヘモシアニン、サイログロ
ブリン、γ−グロブリン等を挙げることができる。ま
た、アミノブチル化もしくはカルボキシメチル化メタン
フェタミンと支持タンパク質を結合させる架橋剤として
は、グルタールアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジメチルホル
ムアミド、マレイミドベンゾイルオキシサクシンイミド
等が用いられる。 Ｂ．リンパ細胞の調製 前記免疫用抗原を哺乳動物（例えば、マウス、ラット
等）に１週間おきに３〜５回投与し、抗原に対する抗体
が充分生成しているのを確認後、その動物の血液リンパ
節、脾臓等からリンパ細胞を得る。この時、免疫賦活剤
としてアジュバンド（ミョウバン、結核死菌、核酸等を
含む）を抗原物質と共にエマルジョンとして動物に投与
することが好ましい。抗体の生成を確認する手段として
は、免疫した動物から静脈血を採取し、後述するII.
（３）のハイブリドーマの選択の項にあるＥＬＩＳＡ法
を用いることにより判定する手段があげられる。 Ｃ．細胞融合とハイブリドーマ株の選択 細胞融合に用いたミエローマ細胞としては、例えばマウ
ス由来のＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）、Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４．１（ＮＳ−１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＭＰ
Ｃ−１１、ラット由来の２１０、ＲＣＹ３、ＡＧ１−２
−３（Ｙ３）、ヒト由来のＳＫＯ−００７、ＧＨ１５０
０６ＴＧ−Ａ１２などを挙げることができる。細胞融合
は、前述したような免疫された動物のリンパ球とミエロ
ーマ細胞を約２〜１０：１になるように混合し、これを
遠心分離してリンパ球とミエローマ細胞の混合沈殿物を
得、これにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセ
ンダイウィルス（ＨＶＪ）を含む細胞培養用培地（ＲＰ
ＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等）を加え、懸濁する
ことにより行うことができるが、操作上の点から、３０
％〜６０％のＰＥＧ（分子量１０００〜８０００）を用
いることが好ましい。ハイブリドーマ株の選択は、融合
後の細胞懸濁液を遠心して上清を除き、これにヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）と１０％
〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培
地に再懸濁して、この懸濁液を培養用プレートに分注す
ることにより行うことができる。この操作により選択さ
れたハイブリドーマ細胞をさらにヒポキサンチン、チミ
ジン（ＨＴ）と１０％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含む細胞培養用培地で培養し、最終的には１０％
〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培
地で培養する。この間、増殖したハイブリドーマ細胞は
培地上清中に抗体を産生するため、ＥＬＩＳＡ（酵素免
疫測定）法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープ免疫測定）
法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いて目的の抗体
の有無を調べることができるが、ＥＬＩＳＡ法を用いる
ことが望ましい。このＥＬＩＳＡ法は以下のようにして
行なうことができる。Ａ．で調製した免疫用抗原をＥＬ
ＩＳＡプレートの各ウェルに固定化して、次にブロッキ
ング剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アル
ブミン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免
疫グロブリン等の生体高分子タンパク質を各ウェルに固
定化する。これは次の操作中、ハイブリドーマ細胞の産
生した抗体がウェルに非特異的に吸着するのを防ぐため
である。一定時間静置した後、上清液を捨て洗浄液（リ
ン酸緩衝液と生理食塩水溶液の混合液、界面活性剤を含
む場合もある）で各ウェルを洗浄する。これに、ハイブ
リドーマ細胞培養上清液を添加し一定時間静置する。同
様に洗浄液で各ウェルを洗浄し、次に酵素標識抗体、例
えばマウスを用いた場合には抗マウスＩｇＧ抗体にアル
カリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ、
βガラクトシダーゼ等の酵素が結合したものを各ウェル
に添加し、一定時間静置する。洗浄液で各ウェルを洗浄
し、次に、用いた酵素に各々対応した基質溶液を添加し
反応させる。培養上清液中に目的とする抗体が存在して
いた場合、酵素反応により生じた基質の色の変化を、肉
眼かもしくはプレートリーダーにより確認することがで
きる。このようにして、抗体を産生しているハイブリド
ーマ細胞を得ることができる。 Ｄ．ハイブリドーマ細胞のクローニング Ｃ．で確認されたウェル中には、遺伝的に異なるハイブ
リドーマ細胞が混在している可能性があるため、クロー
ニング操作により単一な遺伝子からなるハイブリドーマ
細胞群を得る必要がある。この方法には限界希釈法、シ
ングルセルマニュピュレーション法、軟寒天上のコロニ
ーを一つずつ拾い上げる方法、ＦＡＣＳ法（Fluorecent
Activated Cell Sorter)が挙げられるが、特別な装置
を使わない点で、限界希釈法を用いることが望ましい。
この限界希釈法は以下のようにして行なうことができ
る。上記ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように０〜２０％ＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）で調製し、各々の調製液を９６ウェルプレート
上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌずつ分注する。
このプレートをＣＯ2インキュベータ中で培養し、一つ
のコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由来であること
が確認されるようなウェルを選択する。これらのウェル
の上清液中に存在するモノクローナル抗体がＭＡを認識
するかどうかを、Ｃ．のＥＬＩＳＡ法により再検討す
る。このようにして、単一な遺伝子からなるハイブリド
ーマ細胞群が得られ、この細胞から産生された抗体はモ
ノクローナル抗体であるといえる。 Ｅ．モノクローナル抗体の調製 ＭＡに対するモノクローナル抗体の調製には、Ｄ．で得
たハイブリドーマ細胞をフラスコ内、もしくは腹腔内で
培養することにより行なうことができる。ハイブリドー
マ細胞のフラスコ内での培養は、０〜２０％のＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）を用いて行なう。この時、ハイブリドーマ細胞
を最大限増殖させ、その後遠心分離を行えば、分泌され
たモノクローナル抗体が上清中に得られる。ハイブリド
ーマ細胞の腹腔内での培養は、１〜１０×１０6個の細
胞を、プリスタン等の鉱物油を投与した動物の腹腔内に
注入する。この時用いる動物種は、ハイブリドーマ細胞
の作成に用いたミエローマ細胞が増殖し易いように、由
来となっているミエローマ細胞と同種、同系の動物を用
いることが望ましい。例えばマウスを用いた場合、この
操作により１〜２週間後から腹腔内にハイブリドーマ細
胞の増殖が認められ、それにともない腹腔内に腹水が蓄
積する。目的のモノクローナル抗体は腹水中に存在して
いるため腹腔より腹水を回収し、さらに、塩析、透析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等の操作によりモノクローナル抗体を分離精
製することができる。
ボキシメチル化してアミノブチル化またはカルボキシメ
チル化メタンフェタミンをつくり、これに任意の支持タ
ンパク質を結合させて複合体を得、これを免疫用抗原と
した。前記支持タンパク質としては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、陣笠貝ヘモシアニン、サイログロ
ブリン、γ−グロブリン等を挙げることができる。ま
た、アミノブチル化もしくはカルボキシメチル化メタン
フェタミンと支持タンパク質を結合させる架橋剤として
は、グルタールアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジメチルホル
ムアミド、マレイミドベンゾイルオキシサクシンイミド
等が用いられる。 Ｂ．リンパ細胞の調製 前記免疫用抗原を哺乳動物（例えば、マウス、ラット
等）に１週間おきに３〜５回投与し、抗原に対する抗体
が充分生成しているのを確認後、その動物の血液リンパ
節、脾臓等からリンパ細胞を得る。この時、免疫賦活剤
としてアジュバンド（ミョウバン、結核死菌、核酸等を
含む）を抗原物質と共にエマルジョンとして動物に投与
することが好ましい。抗体の生成を確認する手段として
は、免疫した動物から静脈血を採取し、後述するII.
（３）のハイブリドーマの選択の項にあるＥＬＩＳＡ法
を用いることにより判定する手段があげられる。 Ｃ．細胞融合とハイブリドーマ株の選択 細胞融合に用いたミエローマ細胞としては、例えばマウ
ス由来のＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）、Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４．１（ＮＳ−１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＭＰ
Ｃ−１１、ラット由来の２１０、ＲＣＹ３、ＡＧ１−２
−３（Ｙ３）、ヒト由来のＳＫＯ−００７、ＧＨ１５０
０６ＴＧ−Ａ１２などを挙げることができる。細胞融合
は、前述したような免疫された動物のリンパ球とミエロ
ーマ細胞を約２〜１０：１になるように混合し、これを
遠心分離してリンパ球とミエローマ細胞の混合沈殿物を
得、これにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセ
ンダイウィルス（ＨＶＪ）を含む細胞培養用培地（ＲＰ
ＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等）を加え、懸濁する
ことにより行うことができるが、操作上の点から、３０
％〜６０％のＰＥＧ（分子量１０００〜８０００）を用
いることが好ましい。ハイブリドーマ株の選択は、融合
後の細胞懸濁液を遠心して上清を除き、これにヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）と１０％
〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培
地に再懸濁して、この懸濁液を培養用プレートに分注す
ることにより行うことができる。この操作により選択さ
れたハイブリドーマ細胞をさらにヒポキサンチン、チミ
ジン（ＨＴ）と１０％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含む細胞培養用培地で培養し、最終的には１０％
〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培
地で培養する。この間、増殖したハイブリドーマ細胞は
培地上清中に抗体を産生するため、ＥＬＩＳＡ（酵素免
疫測定）法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープ免疫測定）
法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いて目的の抗体
の有無を調べることができるが、ＥＬＩＳＡ法を用いる
ことが望ましい。このＥＬＩＳＡ法は以下のようにして
行なうことができる。Ａ．で調製した免疫用抗原をＥＬ
ＩＳＡプレートの各ウェルに固定化して、次にブロッキ
ング剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アル
ブミン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免
疫グロブリン等の生体高分子タンパク質を各ウェルに固
定化する。これは次の操作中、ハイブリドーマ細胞の産
生した抗体がウェルに非特異的に吸着するのを防ぐため
である。一定時間静置した後、上清液を捨て洗浄液（リ
ン酸緩衝液と生理食塩水溶液の混合液、界面活性剤を含
む場合もある）で各ウェルを洗浄する。これに、ハイブ
リドーマ細胞培養上清液を添加し一定時間静置する。同
様に洗浄液で各ウェルを洗浄し、次に酵素標識抗体、例
えばマウスを用いた場合には抗マウスＩｇＧ抗体にアル
カリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ、
βガラクトシダーゼ等の酵素が結合したものを各ウェル
に添加し、一定時間静置する。洗浄液で各ウェルを洗浄
し、次に、用いた酵素に各々対応した基質溶液を添加し
反応させる。培養上清液中に目的とする抗体が存在して
いた場合、酵素反応により生じた基質の色の変化を、肉
眼かもしくはプレートリーダーにより確認することがで
きる。このようにして、抗体を産生しているハイブリド
ーマ細胞を得ることができる。 Ｄ．ハイブリドーマ細胞のクローニング Ｃ．で確認されたウェル中には、遺伝的に異なるハイブ
リドーマ細胞が混在している可能性があるため、クロー
ニング操作により単一な遺伝子からなるハイブリドーマ
細胞群を得る必要がある。この方法には限界希釈法、シ
ングルセルマニュピュレーション法、軟寒天上のコロニ
ーを一つずつ拾い上げる方法、ＦＡＣＳ法（Fluorecent
Activated Cell Sorter)が挙げられるが、特別な装置
を使わない点で、限界希釈法を用いることが望ましい。
この限界希釈法は以下のようにして行なうことができ
る。上記ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように０〜２０％ＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）で調製し、各々の調製液を９６ウェルプレート
上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌずつ分注する。
このプレートをＣＯ2インキュベータ中で培養し、一つ
のコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由来であること
が確認されるようなウェルを選択する。これらのウェル
の上清液中に存在するモノクローナル抗体がＭＡを認識
するかどうかを、Ｃ．のＥＬＩＳＡ法により再検討す
る。このようにして、単一な遺伝子からなるハイブリド
ーマ細胞群が得られ、この細胞から産生された抗体はモ
ノクローナル抗体であるといえる。 Ｅ．モノクローナル抗体の調製 ＭＡに対するモノクローナル抗体の調製には、Ｄ．で得
たハイブリドーマ細胞をフラスコ内、もしくは腹腔内で
培養することにより行なうことができる。ハイブリドー
マ細胞のフラスコ内での培養は、０〜２０％のＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）を用いて行なう。この時、ハイブリドーマ細胞
を最大限増殖させ、その後遠心分離を行えば、分泌され
たモノクローナル抗体が上清中に得られる。ハイブリド
ーマ細胞の腹腔内での培養は、１〜１０×１０6個の細
胞を、プリスタン等の鉱物油を投与した動物の腹腔内に
注入する。この時用いる動物種は、ハイブリドーマ細胞
の作成に用いたミエローマ細胞が増殖し易いように、由
来となっているミエローマ細胞と同種、同系の動物を用
いることが望ましい。例えばマウスを用いた場合、この
操作により１〜２週間後から腹腔内にハイブリドーマ細
胞の増殖が認められ、それにともない腹腔内に腹水が蓄
積する。目的のモノクローナル抗体は腹水中に存在して
いるため腹腔より腹水を回収し、さらに、塩析、透析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等の操作によりモノクローナル抗体を分離精
製することができる。
【０００６】
【実施例】以下に、本発明の実施例を具体的に説明す
る。尚、これらの実施例は本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例１ Ｉ．免疫用抗原の調製 １．アミノブチル化メタンフェタミンの調製 メタンフェタミン（ＭＡ）を適当なタンパク質に結合さ
せるために、例えばChengらの方法〔FEBS LETTERS 36,3
39（1973）〕に準じ、ＭＡにアミノ基の導入を行なっ
た。４００ｍｇのメタンフェタミン（ＭＡ）を４０ｍｌ
の脱水したエタノールに溶解し、２．２７２ｇのＮ−
（４−ブロモブチル）フタルイミドと８５２ｍｇの炭酸
ナトリウムを添加して４日間還流した。次に０．５ｍｌ
の８５％含水ヒドラジンを添加して２日間撹拌した。反
応液に１Ｎの塩酸を添加し酸性にした後、生じた沈殿物
を濾過により除いた。濾液を５０ｍｌのクロロホルムを
用いて３回抽出し、さらに水層を１Ｎの水酸化ナトリウ
ムを用いてｐＨを１０に調製後、５０ｍｌのクロロホル
ムを用いて４回抽出した。クロロホルム層をあわせ、硫
酸マグネシウムで脱水し、クロロホルムを減圧留去し
た。このようにして、１．２７ｇのＮ−（４−アミノブ
チル）メタンフェタミンを得た。
る。尚、これらの実施例は本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例１ Ｉ．免疫用抗原の調製 １．アミノブチル化メタンフェタミンの調製 メタンフェタミン（ＭＡ）を適当なタンパク質に結合さ
せるために、例えばChengらの方法〔FEBS LETTERS 36,3
39（1973）〕に準じ、ＭＡにアミノ基の導入を行なっ
た。４００ｍｇのメタンフェタミン（ＭＡ）を４０ｍｌ
の脱水したエタノールに溶解し、２．２７２ｇのＮ−
（４−ブロモブチル）フタルイミドと８５２ｍｇの炭酸
ナトリウムを添加して４日間還流した。次に０．５ｍｌ
の８５％含水ヒドラジンを添加して２日間撹拌した。反
応液に１Ｎの塩酸を添加し酸性にした後、生じた沈殿物
を濾過により除いた。濾液を５０ｍｌのクロロホルムを
用いて３回抽出し、さらに水層を１Ｎの水酸化ナトリウ
ムを用いてｐＨを１０に調製後、５０ｍｌのクロロホル
ムを用いて４回抽出した。クロロホルム層をあわせ、硫
酸マグネシウムで脱水し、クロロホルムを減圧留去し
た。このようにして、１．２７ｇのＮ−（４−アミノブ
チル）メタンフェタミンを得た。
【化１】 ２．カルボキシメチル化メタンフェタミンの調製 ＭＡを適当なタンパク質に結合させるために、例えばIn
ayamaらの方法〔Chem.Pharm. Bull 28,2779(1980)〕に
準じ、ＭＡにカルボキシル基の導入を行なった。以下の
反応は全て室温で行なった。６００ｍｇのメタンフェタ
ミン、８５２ｍｇの炭酸ナトリウム、１．５ｍｌのエチ
ルブロモ酢酸を４０ｍｌのエタノール中に溶解し、窒素
ガス充填下で５日間還流した。反応終了後、濾過により
沈殿物を除き、濾液を減圧濃縮した。次に、３０ｍｌの
５％の水酸化カリウム−メタノール溶液を添加し、窒素
ガス充填下で２日間撹拌した。反応終了後、反応液を２
Ｎの塩酸で酸性にし、約１ｍｌにまで減圧濃縮した。こ
れに５ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、２５
ｍｌのクロロホルムで５回抽出した。このクロロホルム
層を硫酸マグネシウムで脱水し、減圧濃縮した。このよ
うにして６９１．１ｍｇのＮ−カルボキシメチルメタン
フェタミンを得た。
ayamaらの方法〔Chem.Pharm. Bull 28,2779(1980)〕に
準じ、ＭＡにカルボキシル基の導入を行なった。以下の
反応は全て室温で行なった。６００ｍｇのメタンフェタ
ミン、８５２ｍｇの炭酸ナトリウム、１．５ｍｌのエチ
ルブロモ酢酸を４０ｍｌのエタノール中に溶解し、窒素
ガス充填下で５日間還流した。反応終了後、濾過により
沈殿物を除き、濾液を減圧濃縮した。次に、３０ｍｌの
５％の水酸化カリウム−メタノール溶液を添加し、窒素
ガス充填下で２日間撹拌した。反応終了後、反応液を２
Ｎの塩酸で酸性にし、約１ｍｌにまで減圧濃縮した。こ
れに５ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、２５
ｍｌのクロロホルムで５回抽出した。このクロロホルム
層を硫酸マグネシウムで脱水し、減圧濃縮した。このよ
うにして６９１．１ｍｇのＮ−カルボキシメチルメタン
フェタミンを得た。
【化２】 ３．免疫用抗原もしくは酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳ
Ａと略）に用いた抗原の調製は、上記のアミノブチル
化、もしくはカルボキシメチル化メタンフェタミンを用
いて行った。 ２５ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン
を１ｍｌのＰＢＳ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液、１５０ｍ
Ｍ−塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解後、１Ｎの塩
酸を用いてｐＨを６．５〜７．０に調製した。一方、５
０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解後、撹拌しなが
ら上記溶液に滴下した。これに、２〜５μｌの２５％グ
ルタールアルデビトＰＢＳ溶液を添加し、室温で９０分
間撹拌した。次に全溶液を４℃、２４時間、ＰＢＳに対
して透析した。これにより７０ｍｇのＮ−（４−アミノ
ブチル）メタンフェタミン−ウシ血清アルブミン−グル
タールアルデヒド複合体（ＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡ）
が得られた。または、２５ｍｇのＫＬＨを１ｍｌの蒸留
水に溶解し、０．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶か
した１５ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタ
ミンを滴下し、撹拌した。これに１ｍｌの蒸留水に溶か
した５００ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、室温
で６時間撹拌した。全反応液を４℃、２日間、蒸留水に
対して透析してＥＤＣを除き、３４ｍｇのＮ−（４−ア
ミノブチル）メタンフェタミン−陣笠貝ヘモシアニン
（ＭＡ−ＡＢ−ＫＬＨ−ＥＤＣ）を得た。また、同様の
操作で、ＫＬＨの代わりに卵白アルブミン（ＯＶＡ）や
ＢＳＡを用いてＭＡ−ＡＢ−ＯＶＡ−ＥＤＣ、ＭＡ−Ａ
Ｂ−ＢＳＡ−ＥＤＣをそれぞれ得た。更に、Ｎ−（４−
アミノブチル）メタンフェタミンの代わりにＮ−カルボ
キシメチルメタンフェタミンとＢＳＡ、ＫＬＨを用い
て、ＭＡ−ＣＭ−ＢＳＡ−ＥＤＣ、ＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ
−ＥＤＣをそれぞれ得た。 II．ＭＡに対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ株の作製 （１）マウスへの抗原の投与と脾臓細胞の調製 Ｉ．で調製したメタンフェタミンと支持タンパク質との
複合体を、４匹のマウスに投与した。例えば、０．１ｍ
ｇのＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ−ＧＡを０．１ｍｌのＰＢＳに
溶かし０．１ｍｌのフロイント完全アジュバンドとよく
混合し、この乳化混合液０．２ｍｌをＢＡＬＢ／ｃ系、
♀、７週齢のマウス腹腔内に投与した。投与後の各々の
マウスから無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０組
織培養用培地中で洗浄し、余分な脂肪組織を除いた。次
に、新しいＲＰＭＩ１６４０培地に移してハサミで細断
後、ゴム栓を用いて脾臓内のリンパ細胞を押しだした。
浮遊しているリンパ細胞を遠心し（１，０００ｒｐｍ、
５分間、室温）集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁
し、次の細胞融合に用いた。この操作により、マウス一
匹から約１×１０8株のリンパ細胞が得られた。 （２）細胞融合 約４×１０7個の対数増殖期にあるミエローマ細胞（６
５３株）と（１）で得られた約１×１０8個リンパ細胞
をＲＰＭＩ１６４０培地中で混合し、遠心後（１，００
０ｒｐｍ、５分間、室温）上清液を除いた。沈降したミ
エローマ細胞とリンパ細胞に、１ｍｌの５０％ポリエチ
レングリコール（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ社）−ＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌ容ピペットを用
いて、３０秒間徐々に加えながら激しく振とうし混合し
た。次に、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１分間かけ
て添加しながら激しく振とうし、更に、８ｍｌのＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を３分間かけて添加し、遠心後、上清液
を除いた。３０ｍｌのＨＡＴ選択培地（１×１０-4Ｍヒ
ポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．６×
１０-5Ｍチミジン、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地）を添加し、細胞をよく懸濁した後、９６
ウェルの培養プレート３枚に分注した。すなわち、１ウ
ェルあたり約４．７×１０5個の細胞を分注し、ＣＯ2イ
ンキュベータ（５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃、湿度
１００％）を用いて培養した。 （３）ハイブリドーマの選択 各ウェルに細胞が増殖しているかどうかを肉眼にて確認
し、更に、このウェルの上清液中にメタンフェタミンを
認識する抗体が存在しているかどうかを、次に示すＥＬ
ＩＳＡ法を用いて検討した。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用
プレート（ポリスチレン製、Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ社）に、（Ｉ）で調製した０．１ｍｇのＭＡ−
ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸緩衡液
（ｐＨ９．６）に溶解させ、各ウェルに０．１ｍｌずつ
分注し、４℃で一晩静置した。すなわち、１ウェルあた
り１μｇのＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡが存在しているこ
とになり、この操作によりウェルの内壁に吸着する。次
に、このプレートの各ウェルを洗浄用ＰＢＳ（ｐＨ７．
２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を用いて４回洗
浄し、未吸着のＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを除いた。更
に、各ウェルに０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを０．１ｍ
ｌずつ分注し、３７℃で１時間静置した。各ウェルを洗
浄用ＰＢＳで４回洗浄し、細胞の増殖が確認されたウェ
ルの上清液を０．１ｍｌ添加した。３７℃、２時間静置
した後、各ウェルを洗浄用ＰＢＳで４回洗浄し、マウス
免疫グロブリンに対する抗体溶液（アルカリフォスファ
ターゼ結合、Ｓｉｇｍａ社、０．５％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓに１／５００になるように希釈した）を０．１ｍｌ添
加し、３７℃、１時間静置した。各ウェルを洗浄用ＰＢ
Ｓで４回洗浄し、Ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム
・６Ｈ2Ｏを１ｍｇ／ｍｌに調製した基質溶液を０．１
ｍｌずつ添加後、室温で３０分間静置した。陽性ウェル
はアルカリフォスファターゼの酵素活性により、Ｐ−ニ
トロフェニルリン酸ナトリウムが分解され、黄色発色を
呈する。各ウェルに５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加し
て反応を停止し、マイクロプレート用吸光度測定器を用
いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。次に、陽性ウェル
の上清液を、ＭＡを用いた競合阻害試験（先述の各ウェ
ルの上清と共に、１μｇ／ｍｌになるようにＭＡを添加
した）を行った。これらのＥＬＩＳＡ法により、抗体を
産生している５１個の陽性ウェルが得られた。 （４）ハイブリドーマのクローニング （３）で得られた５１個の陽性ウェル中のハイブリドー
マ細胞を、限界希釈法を用いてモノクローン化した。す
なわち、ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、各々の希釈液を９６ウ
ェルプレート上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌず
つ分注した。このプレートをＣＯ2インキュベータ中で
培養し、一つのコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由
来であることが確認されるようなウェルを選択した。こ
れらのウェルの上清液中に存在する抗体（モノクローナ
ル抗体）がＭＡを認識するかどうかを、先述のＥＬＩＳ
Ａ法により再検討した。この操作により、ＭＡに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、
２４株得られた。III．２４種のハイブリドーマ細胞の
産生する抗ＭＡモノクローナル抗体が、ＭＡの構造類似
化合物に対してどの様な反応性を有するかについて、
（II）の（３）の工程で用いたＥＬＩＳＡ法により検討
した。すなわち、各ハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル抗体を添加するときに、多段階に希釈した類似化
合物を添加し、プレート上のＭＡとモノクローナル抗体
の抗原抗体反応に対して、この類似化合物がどの程度、
競合的に阻害反応を起すかを調べたものである。その結
果、２４種のハイブリドーマ株から得られるモノクロー
ナル抗体のうちＭＡとＤＢＥＤのみに反応する４Ｂ２株
または２Ｈ３株で表わされるモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ株を選別した。表１にＭＡに対する
反応性を１００として、他の類似化合物に対する反応性
について各々示した。表中 ＭＡは、メタンフェタミン ＤＢＥＤは、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン Ａは、アンフェタミン ＭＰＡは、メトキシフェナミン ＮＯＲ−ＥＰ（＋）は、ノルエフェドリン（＋） ＯＨ−ＭＡは、Ｐ−ヒドロキシメタンフェタミン ＯＨ−ＮＯＲＥＰは、Ｐ−ヒドロキシノルエフェドリン ＯＨ−ＥＰは、Ｐ−ヒドロキシエフェドリン ＯＨ−Ａは、Ｐ−ヒドロキシアンフェタミン ＭＥは、メチルエフェドリン ＮＯＲ−ＥＰ（−）は、ノルエフェドリン（−） ＥＰは、エフェドリン ＰＨＥは、フェンテルミン ＭＥＳは、メスカリン である。
Ａと略）に用いた抗原の調製は、上記のアミノブチル
化、もしくはカルボキシメチル化メタンフェタミンを用
いて行った。 ２５ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン
を１ｍｌのＰＢＳ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液、１５０ｍ
Ｍ−塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解後、１Ｎの塩
酸を用いてｐＨを６．５〜７．０に調製した。一方、５
０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解後、撹拌しなが
ら上記溶液に滴下した。これに、２〜５μｌの２５％グ
ルタールアルデビトＰＢＳ溶液を添加し、室温で９０分
間撹拌した。次に全溶液を４℃、２４時間、ＰＢＳに対
して透析した。これにより７０ｍｇのＮ−（４−アミノ
ブチル）メタンフェタミン−ウシ血清アルブミン−グル
タールアルデヒド複合体（ＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡ）
が得られた。または、２５ｍｇのＫＬＨを１ｍｌの蒸留
水に溶解し、０．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶か
した１５ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタ
ミンを滴下し、撹拌した。これに１ｍｌの蒸留水に溶か
した５００ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、室温
で６時間撹拌した。全反応液を４℃、２日間、蒸留水に
対して透析してＥＤＣを除き、３４ｍｇのＮ−（４−ア
ミノブチル）メタンフェタミン−陣笠貝ヘモシアニン
（ＭＡ−ＡＢ−ＫＬＨ−ＥＤＣ）を得た。また、同様の
操作で、ＫＬＨの代わりに卵白アルブミン（ＯＶＡ）や
ＢＳＡを用いてＭＡ−ＡＢ−ＯＶＡ−ＥＤＣ、ＭＡ−Ａ
Ｂ−ＢＳＡ−ＥＤＣをそれぞれ得た。更に、Ｎ−（４−
アミノブチル）メタンフェタミンの代わりにＮ−カルボ
キシメチルメタンフェタミンとＢＳＡ、ＫＬＨを用い
て、ＭＡ−ＣＭ−ＢＳＡ−ＥＤＣ、ＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ
−ＥＤＣをそれぞれ得た。 II．ＭＡに対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ株の作製 （１）マウスへの抗原の投与と脾臓細胞の調製 Ｉ．で調製したメタンフェタミンと支持タンパク質との
複合体を、４匹のマウスに投与した。例えば、０．１ｍ
ｇのＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ−ＧＡを０．１ｍｌのＰＢＳに
溶かし０．１ｍｌのフロイント完全アジュバンドとよく
混合し、この乳化混合液０．２ｍｌをＢＡＬＢ／ｃ系、
♀、７週齢のマウス腹腔内に投与した。投与後の各々の
マウスから無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０組
織培養用培地中で洗浄し、余分な脂肪組織を除いた。次
に、新しいＲＰＭＩ１６４０培地に移してハサミで細断
後、ゴム栓を用いて脾臓内のリンパ細胞を押しだした。
浮遊しているリンパ細胞を遠心し（１，０００ｒｐｍ、
５分間、室温）集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁
し、次の細胞融合に用いた。この操作により、マウス一
匹から約１×１０8株のリンパ細胞が得られた。 （２）細胞融合 約４×１０7個の対数増殖期にあるミエローマ細胞（６
５３株）と（１）で得られた約１×１０8個リンパ細胞
をＲＰＭＩ１６４０培地中で混合し、遠心後（１，００
０ｒｐｍ、５分間、室温）上清液を除いた。沈降したミ
エローマ細胞とリンパ細胞に、１ｍｌの５０％ポリエチ
レングリコール（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ社）−ＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌ容ピペットを用
いて、３０秒間徐々に加えながら激しく振とうし混合し
た。次に、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１分間かけ
て添加しながら激しく振とうし、更に、８ｍｌのＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を３分間かけて添加し、遠心後、上清液
を除いた。３０ｍｌのＨＡＴ選択培地（１×１０-4Ｍヒ
ポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．６×
１０-5Ｍチミジン、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地）を添加し、細胞をよく懸濁した後、９６
ウェルの培養プレート３枚に分注した。すなわち、１ウ
ェルあたり約４．７×１０5個の細胞を分注し、ＣＯ2イ
ンキュベータ（５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃、湿度
１００％）を用いて培養した。 （３）ハイブリドーマの選択 各ウェルに細胞が増殖しているかどうかを肉眼にて確認
し、更に、このウェルの上清液中にメタンフェタミンを
認識する抗体が存在しているかどうかを、次に示すＥＬ
ＩＳＡ法を用いて検討した。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用
プレート（ポリスチレン製、Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ社）に、（Ｉ）で調製した０．１ｍｇのＭＡ−
ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸緩衡液
（ｐＨ９．６）に溶解させ、各ウェルに０．１ｍｌずつ
分注し、４℃で一晩静置した。すなわち、１ウェルあた
り１μｇのＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡが存在しているこ
とになり、この操作によりウェルの内壁に吸着する。次
に、このプレートの各ウェルを洗浄用ＰＢＳ（ｐＨ７．
２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を用いて４回洗
浄し、未吸着のＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを除いた。更
に、各ウェルに０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを０．１ｍ
ｌずつ分注し、３７℃で１時間静置した。各ウェルを洗
浄用ＰＢＳで４回洗浄し、細胞の増殖が確認されたウェ
ルの上清液を０．１ｍｌ添加した。３７℃、２時間静置
した後、各ウェルを洗浄用ＰＢＳで４回洗浄し、マウス
免疫グロブリンに対する抗体溶液（アルカリフォスファ
ターゼ結合、Ｓｉｇｍａ社、０．５％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓに１／５００になるように希釈した）を０．１ｍｌ添
加し、３７℃、１時間静置した。各ウェルを洗浄用ＰＢ
Ｓで４回洗浄し、Ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム
・６Ｈ2Ｏを１ｍｇ／ｍｌに調製した基質溶液を０．１
ｍｌずつ添加後、室温で３０分間静置した。陽性ウェル
はアルカリフォスファターゼの酵素活性により、Ｐ−ニ
トロフェニルリン酸ナトリウムが分解され、黄色発色を
呈する。各ウェルに５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加し
て反応を停止し、マイクロプレート用吸光度測定器を用
いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。次に、陽性ウェル
の上清液を、ＭＡを用いた競合阻害試験（先述の各ウェ
ルの上清と共に、１μｇ／ｍｌになるようにＭＡを添加
した）を行った。これらのＥＬＩＳＡ法により、抗体を
産生している５１個の陽性ウェルが得られた。 （４）ハイブリドーマのクローニング （３）で得られた５１個の陽性ウェル中のハイブリドー
マ細胞を、限界希釈法を用いてモノクローン化した。す
なわち、ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、各々の希釈液を９６ウ
ェルプレート上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌず
つ分注した。このプレートをＣＯ2インキュベータ中で
培養し、一つのコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由
来であることが確認されるようなウェルを選択した。こ
れらのウェルの上清液中に存在する抗体（モノクローナ
ル抗体）がＭＡを認識するかどうかを、先述のＥＬＩＳ
Ａ法により再検討した。この操作により、ＭＡに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、
２４株得られた。III．２４種のハイブリドーマ細胞の
産生する抗ＭＡモノクローナル抗体が、ＭＡの構造類似
化合物に対してどの様な反応性を有するかについて、
（II）の（３）の工程で用いたＥＬＩＳＡ法により検討
した。すなわち、各ハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル抗体を添加するときに、多段階に希釈した類似化
合物を添加し、プレート上のＭＡとモノクローナル抗体
の抗原抗体反応に対して、この類似化合物がどの程度、
競合的に阻害反応を起すかを調べたものである。その結
果、２４種のハイブリドーマ株から得られるモノクロー
ナル抗体のうちＭＡとＤＢＥＤのみに反応する４Ｂ２株
または２Ｈ３株で表わされるモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ株を選別した。表１にＭＡに対する
反応性を１００として、他の類似化合物に対する反応性
について各々示した。表中 ＭＡは、メタンフェタミン ＤＢＥＤは、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン Ａは、アンフェタミン ＭＰＡは、メトキシフェナミン ＮＯＲ−ＥＰ（＋）は、ノルエフェドリン（＋） ＯＨ−ＭＡは、Ｐ−ヒドロキシメタンフェタミン ＯＨ−ＮＯＲＥＰは、Ｐ−ヒドロキシノルエフェドリン ＯＨ−ＥＰは、Ｐ−ヒドロキシエフェドリン ＯＨ−Ａは、Ｐ−ヒドロキシアンフェタミン ＭＥは、メチルエフェドリン ＮＯＲ−ＥＰ（−）は、ノルエフェドリン（−） ＥＰは、エフェドリン ＰＨＥは、フェンテルミン ＭＥＳは、メスカリン である。
【表１】
【表２】 IV．前記選別された抗ＭＡ−ＤＥＢＤモノクローナル抗
体（請求項１）のクラス、サブクラスの検討 得られたハイブリドーマ細胞の内、２Ｈ３株の産生する
モノクローナル抗体が、どのクラス、サブクラスに属す
るかを検討するため、アルカリフォスファターゼの結合
した８種類の抗マウスクラス、サブクラス、（Ｉｇ
Ｇ1、ＩｇＧ2ａ，ＩｇＧ2ｂ、ＩｇＧ3、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、κ型Ｌ鎖、λ型Ｌ鎖）抗体を用いて、II．（３）の
ＥＬＩＳＡ法により検討した。この結果、２Ｈ３株の産
生するモノクローナル抗体はκ鎖のＬ鎖を有するＩｇＧ
1に属する抗体するであることがわかった。 Ｖ．マウス腹腔内での請求項２のハイブリドーマ細胞の
培養と請求項１のモノクローナル抗体の精製 一週間前にプリスタン処理をしたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
系、♀、６週齢）に、II．で得られたハイブリドーマ細
胞を腹腔内に１×１０7個注入した。１−２週間後、ハ
イブリドーマ細胞の増殖とともに、マウス腹部の肥大化
が確認され、シリンジを用いて腹腔中より腹水を採取し
た。この操作を１日おきに１−２週間程度行うことによ
り、一匹のマウスから１０−２０ｍｌの腹水が得られ
た。この腹水に飽和硫酸アンモニウム溶液を４０％にな
るように添加し、ＩｇＧを含むタンパク質画分を沈殿さ
せた。この沈殿物を遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、
２０分間）により回収し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し
た。懸濁液をＰＢＳに対して一晩透析し、硫酸アンモニ
ウムを除いた。この状態で、７−８ｍｇのモノクローナ
ル抗体が得られ、ＭＡの判定、定量に充分使用できる
が、更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換樹
脂、Ｇ−１５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル濾過樹脂等を用
いて精製することもできる。
体（請求項１）のクラス、サブクラスの検討 得られたハイブリドーマ細胞の内、２Ｈ３株の産生する
モノクローナル抗体が、どのクラス、サブクラスに属す
るかを検討するため、アルカリフォスファターゼの結合
した８種類の抗マウスクラス、サブクラス、（Ｉｇ
Ｇ1、ＩｇＧ2ａ，ＩｇＧ2ｂ、ＩｇＧ3、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、κ型Ｌ鎖、λ型Ｌ鎖）抗体を用いて、II．（３）の
ＥＬＩＳＡ法により検討した。この結果、２Ｈ３株の産
生するモノクローナル抗体はκ鎖のＬ鎖を有するＩｇＧ
1に属する抗体するであることがわかった。 Ｖ．マウス腹腔内での請求項２のハイブリドーマ細胞の
培養と請求項１のモノクローナル抗体の精製 一週間前にプリスタン処理をしたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
系、♀、６週齢）に、II．で得られたハイブリドーマ細
胞を腹腔内に１×１０7個注入した。１−２週間後、ハ
イブリドーマ細胞の増殖とともに、マウス腹部の肥大化
が確認され、シリンジを用いて腹腔中より腹水を採取し
た。この操作を１日おきに１−２週間程度行うことによ
り、一匹のマウスから１０−２０ｍｌの腹水が得られ
た。この腹水に飽和硫酸アンモニウム溶液を４０％にな
るように添加し、ＩｇＧを含むタンパク質画分を沈殿さ
せた。この沈殿物を遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、
２０分間）により回収し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し
た。懸濁液をＰＢＳに対して一晩透析し、硫酸アンモニ
ウムを除いた。この状態で、７−８ｍｇのモノクローナ
ル抗体が得られ、ＭＡの判定、定量に充分使用できる
が、更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換樹
脂、Ｇ−１５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル濾過樹脂等を用
いて精製することもできる。
【０００７】
【効果】本発明の新規モノクローナル抗体は、新規なハ
イブリドーマ株より産生されるものであり、メタンフェ
タミンのみでなくＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミ
ンに対しても特異的に反応することができるので、覚醒
剤検出のための測定用キット中に使用するメタンフェタ
ミンの変わりにＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン
を使用することができる。したがって本発明のモノクロ
ーナル抗体を利用した測定用キットは、キット中にＭＡ
を使用していないので、国内法にふれず国内での販売、
使用が可能となり、メタンフェタミンを簡便、かつ高感
度で測定することができる。
イブリドーマ株より産生されるものであり、メタンフェ
タミンのみでなくＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミ
ンに対しても特異的に反応することができるので、覚醒
剤検出のための測定用キット中に使用するメタンフェタ
ミンの変わりにＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン
を使用することができる。したがって本発明のモノクロ
ーナル抗体を利用した測定用キットは、キット中にＭＡ
を使用していないので、国内法にふれず国内での販売、
使用が可能となり、メタンフェタミンを簡便、かつ高感
度で測定することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 メタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジベ
ンジルエチレンジアミンの両者に対してのみ特異的な免
疫反応を示すことを特徴とするメタンフェタミン覚醒剤
検出用モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生する能力を有することを特徴とするハイブリドーマ
株。 - 【請求項３】 請求項２記載のハイブリドーマ株を培養
することを特徴とするモノクローナル抗体の製法。 - 【請求項４】 メタンフェタミンの免疫用抗原を哺乳動
物（人を除く）に接種し、抗メタンフェタミン抗体産生
能力をもつリンパ細胞を得、このリンパ細胞とミエロー
マ細胞とを細胞融合させ、得られた融合細胞を培養し、
そのなかからメタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジベン
ジルエチレンジアミンの両者に対して特異的な免疫反応
を示すモノクローナル抗体を産生する能力をもつ請求項
２記載のハイブリドーマ株を選び出すことを特徴とする
請求項２記載のハイブリドーマ株の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03185189A JP3105578B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 新規なモノクローナル抗体、それを産生する新規なハイブリドーマ株およびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03185189A JP3105578B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 新規なモノクローナル抗体、それを産生する新規なハイブリドーマ株およびその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH057497A JPH057497A (ja) | 1993-01-19 |
| JP3105578B2 true JP3105578B2 (ja) | 2000-11-06 |
Family
ID=16166415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP03185189A Expired - Fee Related JP3105578B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 新規なモノクローナル抗体、それを産生する新規なハイブリドーマ株およびその製法 |
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