JPS61229899A - 抗ｔ−２トキシンモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるｔ−２トキシン類の測定方法 - Google Patents
抗ｔ−２トキシンモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるｔ−２トキシン類の測定方法Info
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- JPS61229899A JPS61229899A JP60069170A JP6917085A JPS61229899A JP S61229899 A JPS61229899 A JP S61229899A JP 60069170 A JP60069170 A JP 60069170A JP 6917085 A JP6917085 A JP 6917085A JP S61229899 A JPS61229899 A JP S61229899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の属する技術分野］
本発明は、 〒−２トキシンに対して特異性の高いモノ
クローナル抗体及びそれを産生ずるハイブリドーマ及び
それらの製造方法並びにその抗Ｔ−２トキシンモノクロ
ーナル抗体を用いる〒−２トキシンの測定方法に関する
ものである。
クローナル抗体及びそれを産生ずるハイブリドーマ及び
それらの製造方法並びにその抗Ｔ−２トキシンモノクロ
ーナル抗体を用いる〒−２トキシンの測定方法に関する
ものである。
［従来の技術とその問題点］
Ｔ−２トキシン類は、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）
属のある種のものにより生産される有毒二次代謝産物で
ある。 Ｔ−２）キシンはマイコトキシンの中でも毒
性の強いものの一つであり、現在では穀物、飼料や食肉
などの汚染が問題となっている。
属のある種のものにより生産される有毒二次代謝産物で
ある。 Ｔ−２）キシンはマイコトキシンの中でも毒
性の強いものの一つであり、現在では穀物、飼料や食肉
などの汚染が問題となっている。
Ｔ−２トキシンを穀物あるいはその加工製品から検出す
る方法としては、 ＴＬＩＣやＧＥ、Ｃ等が用いられて
おり、最近では免疫測定法も試みられている。
る方法としては、 ＴＬＩＣやＧＥ、Ｃ等が用いられて
おり、最近では免疫測定法も試みられている。
さて免疫測定法で特異的に〒−２トキシンを測定するた
めには特異性の高い抗体が必要であることは論するまで
もない。
めには特異性の高い抗体が必要であることは論するまで
もない。
Ｔ−２トキシンのような低分子化合物に対する抗体を作
製する場合は、それ自身が免疫原性を持たないので、蛋
白質などの高分子キャリアーと結合させてハブテン抗原
となし動物に免疫するのが通常の方法である。又、τ−
２トキシンなどのトリコテセン系化合物の場合、その中
の一種の化合物にのみ特異的な抗体を作製することは困
難であり、通常得られる抗体はその化合物が属する群の
その他の多くの化合物と交叉反応する場合が多い。
製する場合は、それ自身が免疫原性を持たないので、蛋
白質などの高分子キャリアーと結合させてハブテン抗原
となし動物に免疫するのが通常の方法である。又、τ−
２トキシンなどのトリコテセン系化合物の場合、その中
の一種の化合物にのみ特異的な抗体を作製することは困
難であり、通常得られる抗体はその化合物が属する群の
その他の多くの化合物と交叉反応する場合が多い。
Ｔ−２トキシンに対する抗体の特性は、従来？−２トキ
シンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させたハブ
テン抗原でウサギを免疫して行ってきたが、得られた抗
体の特異性は十分ではなく、？−２トキシン類全般に交
叉反応を示した。このように特異性の高いＴ−２トキシ
ンに対する抗体としては、これまでの多くの研究者の努
力にもかかわらず未だ充分なものが得られていない、こ
のため、穀類中のＴ−２トキシンの特異的な測定法の開
発が要求されている折から、特異抗体の作製が強く待ち
望まれている。
シンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させたハブ
テン抗原でウサギを免疫して行ってきたが、得られた抗
体の特異性は十分ではなく、？−２トキシン類全般に交
叉反応を示した。このように特異性の高いＴ−２トキシ
ンに対する抗体としては、これまでの多くの研究者の努
力にもかかわらず未だ充分なものが得られていない、こ
のため、穀類中のＴ−２トキシンの特異的な測定法の開
発が要求されている折から、特異抗体の作製が強く待ち
望まれている。
又、動物を免疫する都度に新たにハブテン抗原を作製す
る従来の抗血清の製造方法では、一般にハブテン抗原の
作り方や動物の固体差、免疫の仕方によってその都度力
価、特異性、抗体サブクラスの異なった抗体が得られる
ため、測定試薬に応用した場合、測定結果に微妙な影響
が生じる。
る従来の抗血清の製造方法では、一般にハブテン抗原の
作り方や動物の固体差、免疫の仕方によってその都度力
価、特異性、抗体サブクラスの異なった抗体が得られる
ため、測定試薬に応用した場合、測定結果に微妙な影響
が生じる。
［発明の目的］
本発明の目的は、Ｔ−２トキシンに対し特異性の高いモ
ノクローナル抗体を提供するとともに、該モノクローナ
ル抗体を用いてＴ−２トキシン類を精度良く測定し得る
方法を提供することにある。
ノクローナル抗体を提供するとともに、該モノクローナ
ル抗体を用いてＴ−２トキシン類を精度良く測定し得る
方法を提供することにある。
［発明の概要］
本発明者らは、ハブテン抗原を用いて免疫すれば、動物
の免疫担当臓器、主に膵臓における多数の抗体産生クロ
ーンの中から目的の抗原に特異的な抗体を産生するクロ
ーンが出現するとの着想を得、クローニングによりその
目的のクローンを選び出して単クローンとすることによ
り特異性の高い抗体の製法が確立出来ると考えて研究を
進め、本発明を完成するに至った。
の免疫担当臓器、主に膵臓における多数の抗体産生クロ
ーンの中から目的の抗原に特異的な抗体を産生するクロ
ーンが出現するとの着想を得、クローニングによりその
目的のクローンを選び出して単クローンとすることによ
り特異性の高い抗体の製法が確立出来ると考えて研究を
進め、本発明を完成するに至った。
マウスのミニローマドＴ−２トキシンをハブテンとした
抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリンパ球との
細胞融合により形成されたハイブリドーマから産生され
る抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体。
抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリンパ球との
細胞融合により形成されたハイブリドーマから産生され
る抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の目的を達成するための第一段階は、抗体を産生
ずる新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。
ずる新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。
１、免疫
２、細胞融合
３、ハイブリドーマの選択と単りローン化免葺
本発明において、 Ｔ−２トキシンとしては１例えば
フサリウム・スポロトリチオイデス（ＦｕＳａｒｉｕｍ
ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）の培養液より分離
・精製したものを使用することができる。
フサリウム・スポロトリチオイデス（ＦｕＳａｒｉｕｍ
ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）の培養液より分離
・精製したものを使用することができる。
↑−２トキシンは単独では抗原になり得ないため、〒−
２トキシンを蛋白質と結合して免疫抗原とする。蛋白質
としては、一般に入手できるものであれば特に選択の必
要はないが、通常入手し易いウシ血清アルブミン（８Ｓ
Ａ）などが用いられる。この他に、卵白アルブミン（Ｏ
ＶＡ） 、陣笠具ヘモジアニリン（ＫＬＨ）などを使用
してもよい、 Ｔ−２）キシンと蛋白質との結合には
、自体公知の方法が有効に利用できる。
２トキシンを蛋白質と結合して免疫抗原とする。蛋白質
としては、一般に入手できるものであれば特に選択の必
要はないが、通常入手し易いウシ血清アルブミン（８Ｓ
Ａ）などが用いられる。この他に、卵白アルブミン（Ｏ
ＶＡ） 、陣笠具ヘモジアニリン（ＫＬＨ）などを使用
してもよい、 Ｔ−２）キシンと蛋白質との結合には
、自体公知の方法が有効に利用できる。
蛋白質との結合方法としては、 ？−２）キシンの水
酸基に無水コハク酸を反応させて得られる Ｔ−２ヘミ
サクシネー） （Ｔ−２−Ｈ５）のカルボキシル基を利
用し、カルボジイミドで脱水縮合させるカルボジイミド
法、酸無水物を利用する酸無水物法などがある。
酸基に無水コハク酸を反応させて得られる Ｔ−２ヘミ
サクシネー） （Ｔ−２−Ｈ５）のカルボキシル基を利
用し、カルボジイミドで脱水縮合させるカルボジイミド
法、酸無水物を利用する酸無水物法などがある。
免疫抗原が作製できたならば１次に免疫動物を選ぶ必要
があるが、その選択は細胞融合に使用する腫瘍細胞株に
よって決められる。一般にはラット、マウスが多く用い
られる。マウスの中でも免疫グロブリンを産生しない腫
瘍細胞株の確立されていいるＢａ１ｂ／Ｃがよく用いら
れる拳ハブテン抗原は、等張緩樹液或は生理食塩水など
に溶解して使用するが、マウス−匹あたり １回にｔｏ
ｐｇから３００ ＄４ ｇを投与するのが好ましい。
があるが、その選択は細胞融合に使用する腫瘍細胞株に
よって決められる。一般にはラット、マウスが多く用い
られる。マウスの中でも免疫グロブリンを産生しない腫
瘍細胞株の確立されていいるＢａ１ｂ／Ｃがよく用いら
れる拳ハブテン抗原は、等張緩樹液或は生理食塩水など
に溶解して使用するが、マウス−匹あたり １回にｔｏ
ｐｇから３００ ＄４ ｇを投与するのが好ましい。
免疫は数回に分けて行うが９、初回免疫はアジュバント
と共に投与することが多い、アジュバントとしては、ミ
ョウバン、結核死菌、核酸、フロインドアジュバントな
どが使用される。免疫は２〜４週間隔で行い、最終免疫
はアジュバントを使用せず生理食塩水等に溶解し腹腔内
或は静脈内に投与する。
と共に投与することが多い、アジュバントとしては、ミ
ョウバン、結核死菌、核酸、フロインドアジュバントな
どが使用される。免疫は２〜４週間隔で行い、最終免疫
はアジュバントを使用せず生理食塩水等に溶解し腹腔内
或は静脈内に投与する。
１１亙渣
最終免疫後２〜４日後にリンパ節或いは牌臓を摘出し、
得られるリンパ球を細胞融合に供する。
得られるリンパ球を細胞融合に供する。
一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては、初期
にはＮＰＣ−１１，Ｐ３−Ｘ８３−Ａｇ８等があったが
これらは自身免疫グロブリンを産生ずるので、近来テ（
ｔＰ３−Ｘ８３−Ａｇ８−［１、Ｐ３−ＭＳ−１及びＳ
Ｐ２１０−Ａｇ目（ＳＰ２１０）等が汎用されている。
にはＮＰＣ−１１，Ｐ３−Ｘ８３−Ａｇ８等があったが
これらは自身免疫グロブリンを産生ずるので、近来テ（
ｔＰ３−Ｘ８３−Ａｇ８−［１、Ｐ３−ＭＳ−１及びＳ
Ｐ２１０−Ａｇ目（ＳＰ２１０）等が汎用されている。
細胞融合時は、腫瘍細胞に比ベリンパ球を５〜２０倍量
多く用いる。 ｎｘＥｉ培地、 ＭｃＣｏ！倍地、Ｒ借
地 １１６４０借地又は等張緩樹液等で洗浄した。腫瘍
細胞とリンパ球とを混合後遠心分離し、ペレットとする
。ペレットをほぐした後、ＨＶＪ（センダイウィルス）
又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で細胞を融合
させるが、一般には取扱いが便利な平均分子量 １．０
００〜８．０００のＰＥ０４０〜８０％溶液を０．５〜
２膳交使用する。融合を促進するためにコルヒチン、ジ
メチルスルホキシド、ポリーＬ−フルギニン等を添加す
ることもあるが必須ではない。
多く用いる。 ｎｘＥｉ培地、 ＭｃＣｏ！倍地、Ｒ借
地 １１６４０借地又は等張緩樹液等で洗浄した。腫瘍
細胞とリンパ球とを混合後遠心分離し、ペレットとする
。ペレットをほぐした後、ＨＶＪ（センダイウィルス）
又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で細胞を融合
させるが、一般には取扱いが便利な平均分子量 １．０
００〜８．０００のＰＥ０４０〜８０％溶液を０．５〜
２膳交使用する。融合を促進するためにコルヒチン、ジ
メチルスルホキシド、ポリーＬ−フルギニン等を添加す
ることもあるが必須ではない。
ＰＥＧ溶液で融合反応を１〜ｌＯ分間程度行なった後、
ＤＩＥ誠倍地借地ＲＰＮ１１８４Ｇ倍地等をｌＯ〜借
地−徐々に加え融合反応を停止させる。停止後遠心し上
清を除去する。ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を５〜２０％含
むＯＭＥＮ倍地或いはＲＰＮ１１８４０倍地を加え、２
借地の培養プレートにリンパ球が１穴あたり ｌＸｌ０
’〜 ５×１０＠個となるよう ｌ−毎分性する。或い
は９８穴培養プレートにリンパ球が１穴当り １〜２Ｘ
１０６個となるよう ０．１−毎分性する０両方共に
フィーダー細胞は添加した方が好ましい、フィーダー細
胞としてはラットの胸腺細胞、牌細胞、マウスの胸腺細
胞、牌細胞等が用いられ、その濃度が０．５〜２×１０
・ｌ■交となるように添加する０次に、ヒポキサンチン
ＩＸ １０４ Ｍ 、アミノプテリン４×１０−’Ｎ、
チミジン １−８Ｘ １０４ＩＩＩを含むＲｐＨｌ１１
Ｂ４０倍地（或いはＤＮＥ借地地）借地ちＨＡτ倍地借
地えて行＜、ＨＡ丁倍借地換の方法は一般には翌日培養
プレートに融合時に分注した容量と等容量加え、更に翌
日その半量をＨＡＴ倍地借地換する。その後２〜３日毎
ＨＡＴ倍地で半量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目
に７ミノブテリンを除いたＨＡＴ倍地借地ち１７借地に
半量交換し、更にその １〜３日後より１〜３日毎に借
地の半量をＨＡ丁を含まない通常の借地に交換する。
ＤＩＥ誠倍地借地ＲＰＮ１１８４Ｇ倍地等をｌＯ〜借
地−徐々に加え融合反応を停止させる。停止後遠心し上
清を除去する。ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を５〜２０％含
むＯＭＥＮ倍地或いはＲＰＮ１１８４０倍地を加え、２
借地の培養プレートにリンパ球が１穴あたり ｌＸｌ０
’〜 ５×１０＠個となるよう ｌ−毎分性する。或い
は９８穴培養プレートにリンパ球が１穴当り １〜２Ｘ
１０６個となるよう ０．１−毎分性する０両方共に
フィーダー細胞は添加した方が好ましい、フィーダー細
胞としてはラットの胸腺細胞、牌細胞、マウスの胸腺細
胞、牌細胞等が用いられ、その濃度が０．５〜２×１０
・ｌ■交となるように添加する０次に、ヒポキサンチン
ＩＸ １０４ Ｍ 、アミノプテリン４×１０−’Ｎ、
チミジン １−８Ｘ １０４ＩＩＩを含むＲｐＨｌ１１
Ｂ４０倍地（或いはＤＮＥ借地地）借地ちＨＡτ倍地借
地えて行＜、ＨＡ丁倍借地換の方法は一般には翌日培養
プレートに融合時に分注した容量と等容量加え、更に翌
日その半量をＨＡＴ倍地借地換する。その後２〜３日毎
ＨＡＴ倍地で半量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目
に７ミノブテリンを除いたＨＡＴ倍地借地ち１７借地に
半量交換し、更にその １〜３日後より１〜３日毎に借
地の半量をＨＡ丁を含まない通常の借地に交換する。
ハイブリドーマ クローン
ハイブリドーマの増殖の盛んな穴の細胞培養上清を種々
の分析法（例えばＲＩＡ 、プラーク法、凝集反応、Ｅ
ＬＩＳＡなど）で目的の抗体産生ハイブリドーマを選択
する。ハイブリドーマを得たならクローニングを行う、
クローニングの方法としてはＦＡＣ９（Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅ
ｒ）を用いたり、 ５ｏｆｔ Ａｇａｒを用いてコロニ
ーを拾い上げる方法の他に、一般によく用いられる限界
希釈法などがある。クローニングはコロニーが一つのハ
イブリドーマから形成されるような細胞濃度で行なう、
限界希釈法では９Ｂ穴プレートの１穴あたり細胞が０．
８個以下になるように行う、どの方法を用いてもクロー
ニングは２回繰返し行ない、単一クローンとする。
の分析法（例えばＲＩＡ 、プラーク法、凝集反応、Ｅ
ＬＩＳＡなど）で目的の抗体産生ハイブリドーマを選択
する。ハイブリドーマを得たならクローニングを行う、
クローニングの方法としてはＦＡＣ９（Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅ
ｒ）を用いたり、 ５ｏｆｔ Ａｇａｒを用いてコロニ
ーを拾い上げる方法の他に、一般によく用いられる限界
希釈法などがある。クローニングはコロニーが一つのハ
イブリドーマから形成されるような細胞濃度で行なう、
限界希釈法では９Ｂ穴プレートの１穴あたり細胞が０．
８個以下になるように行う、どの方法を用いてもクロー
ニングは２回繰返し行ない、単一クローンとする。
Ｔ−２トキシンモノクローナル の
クローンを確立したなら抗体は大量にｉｎ ｖｉｔｒ。
で培養するか、或いはｉｎ ｖｉｖｏで培養するかによ
って産生される。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された抗体
は他の抗体の混入はないが抗体価は低い、 Ｉｎ ｖｉ
ｖ。
って産生される。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された抗体
は他の抗体の混入はないが抗体価は低い、 Ｉｎ ｖｉ
ｖ。
で産生された抗体は宿主が若干混じるが、抗体価はｉｎ
ｖｉｔｒｏに比し非常に高い、どちらの方法で抗体を
産生させるかは目的による。
ｖｉｔｒｏに比し非常に高い、どちらの方法で抗体を
産生させるかは目的による。
上記方法により、抗〒−２トキシンモノクローナル抗体
Ｔ２．１． Ｔ２．２、Ｔ２．３． ？２．４、Ｔ２．
５ 及びＴ２．６が得られる。これら１０種のモノク
ローナル抗体はいずれモＴ−２）キシンに対して高い特
異性を有する。
Ｔ２．１． Ｔ２．２、Ｔ２．３． ？２．４、Ｔ２．
５ 及びＴ２．６が得られる。これら１０種のモノク
ローナル抗体はいずれモＴ−２）キシンに対して高い特
異性を有する。
〒−２トキシン の゛
抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体を用いて特異的に
Ｔ−２トキシンを測定するためには、通常ＲＩＡ又は
ＫＬ ＩＳＡ等によッテ行われる。 ＥＬＩＳＡ ニ使
用する時は標準酵素としてβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ等を用いるこ
とができる。
Ｔ−２トキシンを測定するためには、通常ＲＩＡ又は
ＫＬ ＩＳＡ等によッテ行われる。 ＥＬＩＳＡ ニ使
用する時は標準酵素としてβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ等を用いるこ
とができる。
以下に実施例を挙げて更に詳細に説明するが。
以下の実施例が発明の範囲を拘束するものではない。
［発明の実施例］
実施例１
抗〒−２トキシンモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ及び抗体の作製 １） Ｔ−２ヘミサクシネー） （’ｒ−２−Ｈ！９
）の作製Ｔ−２トキシン５０Ｂを無水ピリジン２−に加
え、溶解後さらにその溶液に無水コハク酸８００■ｇを
加え、８０℃で２時間へミサクシニル化を行った。この
操作により Ｔ−２トキシンはＴ−２−ヘミサクシネー
） （Ｔ−２−）１ｓ）に誘導された０次に、この反応
液に２−の蒸留水を加えて過剰の無水コハク酸を分解し
た後、等量のクロロホルムを加え、 ？−２−ＨＳ誘導
体を抽出した。副反応物及び残存ピリジンを完全に除去
する目的でこのクロロホルム溶液を蒸留水で１０回洗浄
し、クロロホルム溶液を減圧乾固し。
リドーマ及び抗体の作製 １） Ｔ−２ヘミサクシネー） （’ｒ−２−Ｈ！９
）の作製Ｔ−２トキシン５０Ｂを無水ピリジン２−に加
え、溶解後さらにその溶液に無水コハク酸８００■ｇを
加え、８０℃で２時間へミサクシニル化を行った。この
操作により Ｔ−２トキシンはＴ−２−ヘミサクシネー
） （Ｔ−２−）１ｓ）に誘導された０次に、この反応
液に２−の蒸留水を加えて過剰の無水コハク酸を分解し
た後、等量のクロロホルムを加え、 ？−２−ＨＳ誘導
体を抽出した。副反応物及び残存ピリジンを完全に除去
する目的でこのクロロホルム溶液を蒸留水で１０回洗浄
し、クロロホルム溶液を減圧乾固し。
Ｔ−２−Ｈ５を得た。
２）免疫抗原１分析用抗原の作製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ４１）ｅｇｌ Ｏ，Ｏ
ＩＮリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７，０） ４−に
溶解し、！−エチルー３−（ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（ＥＤＰＣ） ８（１ｍｇを加えた。こ
の溶液に、Ｔ−２−Ｈ３５腸ｇをジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）Ｏ，１ｗＪに溶解したものを室温攪拌下、滴
下した。
ＩＮリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７，０） ４−に
溶解し、！−エチルー３−（ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（ＥＤＰＣ） ８（１ｍｇを加えた。こ
の溶液に、Ｔ−２−Ｈ３５腸ｇをジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）Ｏ，１ｗＪに溶解したものを室温攪拌下、滴
下した。
さらに、１２時間室温攪拌を行った後１反応液を生理食
塩水に対して透析し、非透析画分を２００Ｏｒ、ｐ、■
、で１０分間遠心し、若干の不純物を沈澱させ、上清を
↑−２−Ｈ９−ＢＳＡの生理食塩水液とした。
塩水に対して透析し、非透析画分を２００Ｏｒ、ｐ、■
、で１０分間遠心し、若干の不純物を沈澱させ、上清を
↑−２−Ｈ９−ＢＳＡの生理食塩水液とした。
またＢｊＡの代わりに卵白アルブミン（ＯＶＡ） 、陣
笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、上記と同様の藝 操作でｔ−２−ｎｓ−ｏｊａ、 ？−２−）１ｓ−Ｋｌ
、Ｈを作製した。
笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、上記と同様の藝 操作でｔ−２−ｎｓ−ｏｊａ、 ？−２−）１ｓ−Ｋｌ
、Ｈを作製した。
さらに、？−２−Ｈ９のかわりにオクラトキシンＡ（Ｏ
ＴＡ） ヲ用い、同様の操作−１？０ＴＡ−ＢＳＡ 、
０ｎ−ＯｖＡ。
ＴＡ） ヲ用い、同様の操作−１？０ＴＡ−ＢＳＡ 、
０ｎ−ＯｖＡ。
０ＴＡ−ＫＬ）Ｉを作製した。
３）免疫
Ｔ−２−ＭＳ−ＢＳＡ ２１ｇを溶解した生理食塩水
１ｊとフロイントの完全アジュバント１１ｍ１を混合し
てエマルジョンとし、その０．１−をＢａ１ｂ／ｃマウ
ス （雌性、４週齢）の背部皮肉に投与した。１０日後
及び２０日後、〒−２−Ｈ！３−ＢＪＡ １００ ＩＬ
ｇの生理食塩水溶液を腹腔内投与あるいは尾静脈に注射
することにより追加免疫を行った。
１ｊとフロイントの完全アジュバント１１ｍ１を混合し
てエマルジョンとし、その０．１−をＢａ１ｂ／ｃマウ
ス （雌性、４週齢）の背部皮肉に投与した。１０日後
及び２０日後、〒−２−Ｈ！３−ＢＪＡ １００ ＩＬ
ｇの生理食塩水溶液を腹腔内投与あるいは尾静脈に注射
することにより追加免疫を行った。
０ 細胞融合
最終免疫より ３日後、マウスの膵臓を抽出し、１０−
のＨＥＭ倍地借地れたプラスチックシャーレ中で牌リン
パ球をほぐした。牌リンパ球は、遠心操作（１０００回
転、１０分間）を繰返し、 ＭＥＮ培地で３回洗浄した
。牌リンパ球ｔ、ａｘ ｔｏａ個とト７ザグアニン耐性
ミエローマＳＰ２１０−Ａｇ１４（ＳＦ３）２Ｘ １０
’個を混合し、 １０００回転、１０分遠心してペレッ
トとした。上清のＭＥＮ倍地借地引除去し、ペレットを
ほぐした。５０％ＰＥ０ ４０００１−を １分間かけ
て加え、用いたピペットで攪拌しながら３７℃で１分間
反応させた。続いて１ｄのＤＭＩ！Ｍ培地１−を３７℃
のもと、 １分間かけて加えた。同様の操作をもう１度
行なった後、３７℃に温めておいたＤＩＩＩＥＮ培地７
ｄを２〜３分間で加えた。直ちに、８００回転で８分間
室温にて遠心し、上清を除去した０次いで、３７℃に温
めていた２０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２） −ＤＭＦＭ培
地３０−を加え、ペレットを懸濁させた。さらに３０−
の２０％ＦＧＳ−ＤＮＩ’Ｍ培地を加えて良く懸濁させ
た後、９Ｂ穴培養プレート ７枚にこの懸濁液を １穴
あたり ０．１−分注し、ＣＯ２インキュベーター内で
培養した。以下、細胞融合を行なった日を第０日として
記述する。
のＨＥＭ倍地借地れたプラスチックシャーレ中で牌リン
パ球をほぐした。牌リンパ球は、遠心操作（１０００回
転、１０分間）を繰返し、 ＭＥＮ培地で３回洗浄した
。牌リンパ球ｔ、ａｘ ｔｏａ個とト７ザグアニン耐性
ミエローマＳＰ２１０−Ａｇ１４（ＳＦ３）２Ｘ １０
’個を混合し、 １０００回転、１０分遠心してペレッ
トとした。上清のＭＥＮ倍地借地引除去し、ペレットを
ほぐした。５０％ＰＥ０ ４０００１−を １分間かけ
て加え、用いたピペットで攪拌しながら３７℃で１分間
反応させた。続いて１ｄのＤＭＩ！Ｍ培地１−を３７℃
のもと、 １分間かけて加えた。同様の操作をもう１度
行なった後、３７℃に温めておいたＤＩＩＩＥＮ培地７
ｄを２〜３分間で加えた。直ちに、８００回転で８分間
室温にて遠心し、上清を除去した０次いで、３７℃に温
めていた２０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２） −ＤＭＦＭ培
地３０−を加え、ペレットを懸濁させた。さらに３０−
の２０％ＦＧＳ−ＤＮＩ’Ｍ培地を加えて良く懸濁させ
た後、９Ｂ穴培養プレート ７枚にこの懸濁液を １穴
あたり ０．１−分注し、ＣＯ２インキュベーター内で
培養した。以下、細胞融合を行なった日を第０日として
記述する。
５） ＨＡＴ選択
第１日に、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチンＩＸ １０”舅
、アミノプテリン４Ｘ ｔｏ−７Ｍ 、チミジン１．８
×１（１’ Ｍを含む２０％ＦＯＳ−［ＩＮＥＩＩＩ培
地）を １穴アタ４ＪＯ，１−加えた。第２，３，５．
８及び１１日目に培地の半分を吸引除去し、）ＩＡ丁培
地ｏ、 １ｍｇを加えた・以降３，４日毎にＨＴ培地（
アミノプテリンを除いたＨＡ丁培地）を同様の操作で交
換した。ハイブリドーマは金穴に増殖してきた。
、アミノプテリン４Ｘ ｔｏ−７Ｍ 、チミジン１．８
×１（１’ Ｍを含む２０％ＦＯＳ−［ＩＮＥＩＩＩ培
地）を １穴アタ４ＪＯ，１−加えた。第２，３，５．
８及び１１日目に培地の半分を吸引除去し、）ＩＡ丁培
地ｏ、 １ｍｇを加えた・以降３，４日毎にＨＴ培地（
アミノプテリンを除いたＨＡ丁培地）を同様の操作で交
換した。ハイブリドーマは金穴に増殖してきた。
８）ハイブリドーマの選択
融合して２週間から３週間後までの間、３．４日毎に培
養上清を各穴ごとに集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。
養上清を各穴ごとに集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。
先ず、ＥＬＩＳ＾プレートに丁−２−ＨＳ４［、Ｈ（２
ＩＬｇ／ １０Ｇ川交）を分注し、２５℃で２時間整地
して抗原をプレートに固定化した。 丁ｗｅｅｎ ２０
を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、培養上清中
の蛋白質の非特異的吸着を避けるため、卵白アルブミン
０ＶＡ５００ ＩＬｇ／ １００終ｉ）を分注し、２５
℃で１時間静置した０次に同上緩衝液で３回洗浄後、上
記の各細胞培養上清を １００ ｈ ｌに分注し、２５
℃で１時間静置した。一方、陰性対照としして２０％Ｆ
Ｃ９−ＯＮＥＮ培地１００１Ｌｉを分注した。更に同上
緩衝液で４回洗浄後、抗マウス免疫グロブリン抗体−ア
ルカリフォスファターゼ複合体溶液１００＃Ｌｕをプレ
ートに分注し、室温にて２時間静地した。同上緩衝液で
４回洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸 ２ナトリウ
ム・８Ｈ２０（１ｍｇ／ ｙｄ ）溶液を １００鉢文
ずつ分注し、室温で３０分間反応後、 Ｏ，Ｄ、 ４０
５ｎ−を測定して、アルカリフォスファターゼ活性を定
量した。
ＩＬｇ／ １０Ｇ川交）を分注し、２５℃で２時間整地
して抗原をプレートに固定化した。 丁ｗｅｅｎ ２０
を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、培養上清中
の蛋白質の非特異的吸着を避けるため、卵白アルブミン
０ＶＡ５００ ＩＬｇ／ １００終ｉ）を分注し、２５
℃で１時間静置した０次に同上緩衝液で３回洗浄後、上
記の各細胞培養上清を １００ ｈ ｌに分注し、２５
℃で１時間静置した。一方、陰性対照としして２０％Ｆ
Ｃ９−ＯＮＥＮ培地１００１Ｌｉを分注した。更に同上
緩衝液で４回洗浄後、抗マウス免疫グロブリン抗体−ア
ルカリフォスファターゼ複合体溶液１００＃Ｌｕをプレ
ートに分注し、室温にて２時間静地した。同上緩衝液で
４回洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸 ２ナトリウ
ム・８Ｈ２０（１ｍｇ／ ｙｄ ）溶液を １００鉢文
ずつ分注し、室温で３０分間反応後、 Ｏ，Ｄ、 ４０
５ｎ−を測定して、アルカリフォスファターゼ活性を定
量した。
同様ニＴ−２−Ｈ３−ＢＳＡ、 ？−２−ＨＳ−ＯＶＡ
、０ＴＡ−ＫＬＨ，Ｏ↑Ａ−−ＢＳＡ、 ０ＴＡ−ＯＶ
Ａをプレートに固定化しテＥＬＩｓＡを行イ、’ｒ−２
−）１ｓ−ＫＬＨ，Ｔ−２−１（Ｓ−ＢＳＡ、 Ｔ−２
−ＨＳ−ＯＶＡニ対して陽性、カッ、０ＴＡ−ＫＬＨ，
０ＴＡ−ＢＳＡ、 ０ＴＡ−ＯＶＡ ニ対して陰性を示
した培養上清で増殖しているハイブリドーマを抗Ｔ−２
トキシン抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
、０ＴＡ−ＫＬＨ，Ｏ↑Ａ−−ＢＳＡ、 ０ＴＡ−ＯＶ
Ａをプレートに固定化しテＥＬＩｓＡを行イ、’ｒ−２
−）１ｓ−ＫＬＨ，Ｔ−２−１（Ｓ−ＢＳＡ、 Ｔ−２
−ＨＳ−ＯＶＡニ対して陽性、カッ、０ＴＡ−ＫＬＨ，
０ＴＡ−ＢＳＡ、 ０ＴＡ−ＯＶＡ ニ対して陰性を示
した培養上清で増殖しているハイブリドーマを抗Ｔ−２
トキシン抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
３８０穴中８０穴に抗Ｔ−２トキシン抗体産生が認めら
れた。
れた。
さらに、真の抗〒−２トキシン抗体産生ハイブリドーマ
を同定するために、遊離型Ｔ−２トキシンによる阻害試
験を行った。すなわち、実施例１．５で述ヘタＥＬｒｓ
Ａ ｔ７）実験系テｏ、！ｉＩＬｇ ｆ） ？−２ト＋
シン存在下での各穴の？−２−１８−ＯＶＡに対する活
性を測定し、Ｔ−２トキシンで活性が阻害されるものを
真の抗〒−２トキシン抗体産生ハイブリドーマと決定し
た。抗Ｔ−２トキシン抗体産生ハイブリドーマは、最終
的に３５穴に認められた。
を同定するために、遊離型Ｔ−２トキシンによる阻害試
験を行った。すなわち、実施例１．５で述ヘタＥＬｒｓ
Ａ ｔ７）実験系テｏ、！ｉＩＬｇ ｆ） ？−２ト＋
シン存在下での各穴の？−２−１８−ＯＶＡに対する活
性を測定し、Ｔ−２トキシンで活性が阻害されるものを
真の抗〒−２トキシン抗体産生ハイブリドーマと決定し
た。抗Ｔ−２トキシン抗体産生ハイブリドーマは、最終
的に３５穴に認められた。
？） １ｓＪへの培養スケールの拡大どの穴で抗Ｔ−
２抗体を産生じているかが判明したら、２４穴培養プレ
ートへ植え換え、 ！−スケールでの培養を行った。こ
の際、 Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胸腺細胞を支持細胞とし
て用いた。
２抗体を産生じているかが判明したら、２４穴培養プレ
ートへ植え換え、 ！−スケールでの培養を行った。こ
の際、 Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胸腺細胞を支持細胞とし
て用いた。
ＨＴ培地０．５４を２４穴培養プレートに分注する。
それぞれの穴に １〜２ＸｌＯ’備の胸腺細胞を加える
。これには４．５週齢のマウスから胸腺を摘出し、少な
くとも ３回洗浄した後、胸腺Ｉ個あたりｌ−の２０％
ＦＣ９−ＯＭＥＮ培地に懸濁する。この懸濁液を５０〜
１００ ＩＬｌずつそれぞれの穴に加えればよい、それ
から、８Ｂ穴培地プレートにおける抗体産生穴の細胞懸
濁液を２４穴培養プレートに移す。
。これには４．５週齢のマウスから胸腺を摘出し、少な
くとも ３回洗浄した後、胸腺Ｉ個あたりｌ−の２０％
ＦＣ９−ＯＭＥＮ培地に懸濁する。この懸濁液を５０〜
１００ ＩＬｌずつそれぞれの穴に加えればよい、それ
から、８Ｂ穴培地プレートにおける抗体産生穴の細胞懸
濁液を２４穴培養プレートに移す。
これを再懸濁し、そのうちの２５０１ＬｆＬを元の９６
穴培養プレートの穴にもどす、これが、複製となり、新
しい細胞株の損失をふせぐことができる。
穴培養プレートの穴にもどす、これが、複製となり、新
しい細胞株の損失をふせぐことができる。
２．３ＥＩ後、２４穴培養プＬ／ −） ニ２ｏ％ＦＣ
Ｓ−ＯＭＥＮ培＃！ ０．５−を加える （ここでは支
持細胞は必要としない）、さらに２日後、上清を除き新
しい培地を加える。細胞が、はぼ全面に広がってきたら
、抗体活性を再テストする。
Ｓ−ＯＭＥＮ培＃！ ０．５−を加える （ここでは支
持細胞は必要としない）、さらに２日後、上清を除き新
しい培地を加える。細胞が、はぼ全面に広がってきたら
、抗体活性を再テストする。
もし引続き抗体を産生しているようであれば即座にクロ
ーニングを行う。
ーニングを行う。
もしも、抗体を産生している穴がそれほど多くなければ
、８Ｂ穴培養プレートで培養している段階から、直接ク
ローニングをしてもよい、しかし、２４穴培養プレート
に植え換えてもなお抗体を産生しているものからクロー
ニングすることにより、より不安定な株をクローニング
するという無駄を省くことができる。
、８Ｂ穴培養プレートで培養している段階から、直接ク
ローニングをしてもよい、しかし、２４穴培養プレート
に植え換えてもなお抗体を産生しているものからクロー
ニングすることにより、より不安定な株をクローニング
するという無駄を省くことができる。
８）モノクローン化
クローニング培地は、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胸腺細胞を
１０’個／−含んだ２０％ＦＣ５−ロＭＥＮ培地である
。もし、クローニングを直接９Ｂ穴培養プレートから行
うときは、培地はＨＴ培地を用いる。
１０’個／−含んだ２０％ＦＣ５−ロＭＥＮ培地である
。もし、クローニングを直接９Ｂ穴培養プレートから行
うときは、培地はＨＴ培地を用いる。
抗？−２抗体産生ハイプリドーマを計数し、クローニン
グ培地ｌ−中に１０個の細胞が含まれるように希釈した
。この懸濁液を １００ＩＬｊＬずつ、９Ｂ穴培養プレ
ート中の６０穴に分注する。５日目に １００ｇ１の培
地を加えた。１４４日目、 ！Ｉ、ＩＳＡにより活性を
測定し、活性のあるクローンを２４穴培養プレートで増
殖させた。さらに、同様の方法で再クローニングを行い
、抗Ｔ−２トキシン抗体産生ハイブリドーマのクローン
を得た。
グ培地ｌ−中に１０個の細胞が含まれるように希釈した
。この懸濁液を １００ＩＬｊＬずつ、９Ｂ穴培養プレ
ート中の６０穴に分注する。５日目に １００ｇ１の培
地を加えた。１４４日目、 ！Ｉ、ＩＳＡにより活性を
測定し、活性のあるクローンを２４穴培養プレートで増
殖させた。さらに、同様の方法で再クローニングを行い
、抗Ｔ−２トキシン抗体産生ハイブリドーマのクローン
を得た。
８）モノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体は培養上清中に１０〜５０ｇｇ／−
分泌される。
分泌される。
Ｔ２，１ハイブリドーマを増殖させた後、はとんど全て
のバイプリドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を回
収した。
のバイプリドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を回
収した。
また１丁２，１ハイブリドーマの２Ｘ １Ｇ’個をＤ）
ＩＩ！ＩＩ培地０．５−に浮遊させ、Ｂａ１ｂ／ｃマウ
ス （雌性、８週齢、あらかじめ３〜１０日前にプリス
タン０．５−を腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内に
投与し、腹水を回収した。
ＩＩ！ＩＩ培地０．５−に浮遊させ、Ｂａ１ｂ／ｃマウ
ス （雌性、８週齢、あらかじめ３〜１０日前にプリス
タン０．５−を腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内に
投与し、腹水を回収した。
１０）モノクローナル抗体のクラスの決定それぞれのハ
イブリトーマ−クローンの産生する免疫グロブリンのク
ラスは、各クラスに特異的な抗血清 （抗ＩｇＧ１．
ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ、 ＩｇＭ、 ＩｇＡ）を用
いたオフタロニー法によって決定した。各ハイブリドー
マの産生ずる抗体は、 ？２．１モノクローナル抗体を
はじめとして、その多くがＩｇＧ１に属することが判明
した。
イブリトーマ−クローンの産生する免疫グロブリンのク
ラスは、各クラスに特異的な抗血清 （抗ＩｇＧ１．
ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ、 ＩｇＭ、 ＩｇＡ）を用
いたオフタロニー法によって決定した。各ハイブリドー
マの産生ずる抗体は、 ？２．１モノクローナル抗体を
はじめとして、その多くがＩｇＧ１に属することが判明
した。
実施例２
モノクローナル抗体の特異性
抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体の特異性を調べる
ため、各抗体のＴ−２−１１９−ＯＶＡに対する結合反
応が丁−２トキシン及びその類縁体によってどの程度阻
害されるかを検討した。
ため、各抗体のＴ−２−１１９−ＯＶＡに対する結合反
応が丁−２トキシン及びその類縁体によってどの程度阻
害されるかを検討した。
測定操作は実施例１の６のハイブリドーマの選択で記載
した方法に準じた。
した方法に準じた。
Ｔ２．１の産生ずるＴ２．１モノクロ一ナル抗体は。
Ｔ−２トキシンにより強く阻害されるが、ＩＴ−２では
さほど阻害されない（Ｔ−２トキシンの１／１０） 、
また、ネオソラニオール及びデオキシニバレノールによ
っては全く阻害されない。
さほど阻害されない（Ｔ−２トキシンの１／１０） 、
また、ネオソラニオール及びデオキシニバレノールによ
っては全く阻害されない。
また、この７２．１抗体を用いたＩｉ：ＬＩＳＡによる
？−２トキシンの検出感度はおよそ２５ｐｇ／分析であ
った（図参照）。
？−２トキシンの検出感度はおよそ２５ｐｇ／分析であ
った（図参照）。
他のモノクローナル抗体についても同様の測定結果が得
られた。
られた。
［発明の効果］
本発明により得られる新規なモノクローナル抗体は〒−
２トキシンと特異的に反応し、他のＴ−２トキシン類と
はほとんど反応しない、したがって、本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いれば、 ？−２トキシンを精度良く
高感度で測定することが可能になる。
２トキシンと特異的に反応し、他のＴ−２トキシン類と
はほとんど反応しない、したがって、本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いれば、 ？−２トキシンを精度良く
高感度で測定することが可能になる。
更に、本発明ではバイプリドーマを用いてモノクローナ
ル抗体を産生じているが、ハイブリトーマを培養さえし
ていれば、いつでも必要なときにモノクローナル抗体を
得ることができ、しかも一定の特性を有するものが得ら
れるため、動物を免疫する毎にハブテン抗原を調整する
必要はなく、動物の固体差に影響されることなく常に安
定した品質の抗体を得ることができる。
ル抗体を産生じているが、ハイブリトーマを培養さえし
ていれば、いつでも必要なときにモノクローナル抗体を
得ることができ、しかも一定の特性を有するものが得ら
れるため、動物を免疫する毎にハブテン抗原を調整する
必要はなく、動物の固体差に影響されることなく常に安
定した品質の抗体を得ることができる。
図は、〒２，１モノクローナル抗体の〒−２トキシン、
ＨＴ−２及びネオソラニオールに対する交叉反応性を調
べた結果を示したものである。
ＨＴ−２及びネオソラニオールに対する交叉反応性を調
べた結果を示したものである。
Claims (3)
- （１）マウスのミエローマとＴ−２トキシンをハブテン
とした抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリンパ
球との細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
生される抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体。 - （２）Ｔ−２トキシン及びその類縁化合物に対する相対
的な反応性が第１図に示されているような特性である特
許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - （３）マウスのミエローマとＴ−２トキシンをハブテン
とした抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリンパ
球との細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
生される抗Ｔ−２トキシンモノクローナル抗体を用いる
Ｔ−２トキシン類の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069170A JPS61229899A (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | 抗ｔ−２トキシンモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるｔ−２トキシン類の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069170A JPS61229899A (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | 抗ｔ−２トキシンモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるｔ−２トキシン類の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61229899A true JPS61229899A (ja) | 1986-10-14 |
| JPH0543358B2 JPH0543358B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=13394969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60069170A Granted JPS61229899A (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | 抗ｔ−２トキシンモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるｔ−２トキシン類の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61229899A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2601781A1 (fr) * | 1986-07-18 | 1988-01-22 | Ube Industries | Reactif de dosage de mycotoxine et methode l'utilisant pour doser une mycotoxine |
| CN103330937A (zh) * | 2013-06-15 | 2013-10-02 | 济南环肽医药科技有限公司 | 单克隆抗体抗原结合片段-t-2毒素偶联物 |
| CN105067811A (zh) * | 2015-07-22 | 2015-11-18 | 中国农业大学 | 基于荧光微球免疫层析法检测t-2毒素的产品及其制备方法 |
-
1985
- 1985-04-03 JP JP60069170A patent/JPS61229899A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| APPL.ENVIRON MICROBIOL=1979 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2601781A1 (fr) * | 1986-07-18 | 1988-01-22 | Ube Industries | Reactif de dosage de mycotoxine et methode l'utilisant pour doser une mycotoxine |
| CN103330937A (zh) * | 2013-06-15 | 2013-10-02 | 济南环肽医药科技有限公司 | 单克隆抗体抗原结合片段-t-2毒素偶联物 |
| CN105067811A (zh) * | 2015-07-22 | 2015-11-18 | 中国农业大学 | 基于荧光微球免疫层析法检测t-2毒素的产品及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0543358B2 (ja) | 1993-07-01 |
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