JPH0664065B2 - 菌体外膜保有菌の免疫学的測定法 - Google Patents
菌体外膜保有菌の免疫学的測定法Info
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- JPH0664065B2 JPH0664065B2 JP60289799A JP28979985A JPH0664065B2 JP H0664065 B2 JPH0664065 B2 JP H0664065B2 JP 60289799 A JP60289799 A JP 60289799A JP 28979985 A JP28979985 A JP 28979985A JP H0664065 B2 JPH0664065 B2 JP H0664065B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- outer membrane
- haemophilus influenzae
- membrane protein
- antibody
- immunological assay
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は菌体外膜保有菌の免疫学的測定法、更に詳細に
は、ヘモフイルス・インフルエンザ（Haemophilus infl
uenzae）菌の外膜蛋白を抗原として得られるポリクロー
ナル抗体を使用して免疫学的にヘモフイルス・インフル
エンザ菌を測定する方法に関する。
は、ヘモフイルス・インフルエンザ（Haemophilus infl
uenzae）菌の外膜蛋白を抗原として得られるポリクロー
ナル抗体を使用して免疫学的にヘモフイルス・インフル
エンザ菌を測定する方法に関する。
従来、ヘモフイルス・インフルエンザ菌（以下、インフ
ルエンザ菌と称する）を測定する方法としては、当該菌
をホルマリン等で死菌化したものを家兎に免疫して得ら
れる抗血清を用いる免疫学的測定法が行われている。
ルエンザ菌と称する）を測定する方法としては、当該菌
をホルマリン等で死菌化したものを家兎に免疫して得ら
れる抗血清を用いる免疫学的測定法が行われている。
しかしながら、インフルエンザ菌は莢膜血清型別とし
て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆの６型に分類され、更に
実際の患者の呼吸器から分離されるインフルエンザ菌の
８０〜９０％は上記ａ〜ｆ型の何れにも属さないノン−
タイプブルなものである。従って、従来の抗血清を使用
する測定法ではインフルエンザ菌の全てを測定できない
ものであり、全てのインフルエンザ菌を測定しようとす
ると、上記ａ〜ｆ型の各菌を抗原として得られる抗血清
を混合して使用しなければならないが、このようにする
と個々の抗血清が希釈されてしまい検出感度が低下して
しまうと共に、斯くしてもなおもノン−タイプブルなイ
ンフルエンザ菌は検出できないという欠点があった。
て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆの６型に分類され、更に
実際の患者の呼吸器から分離されるインフルエンザ菌の
８０〜９０％は上記ａ〜ｆ型の何れにも属さないノン−
タイプブルなものである。従って、従来の抗血清を使用
する測定法ではインフルエンザ菌の全てを測定できない
ものであり、全てのインフルエンザ菌を測定しようとす
ると、上記ａ〜ｆ型の各菌を抗原として得られる抗血清
を混合して使用しなければならないが、このようにする
と個々の抗血清が希釈されてしまい検出感度が低下して
しまうと共に、斯くしてもなおもノン−タイプブルなイ
ンフルエンザ菌は検出できないという欠点があった。
従って、全タイプのインフルエンザ菌をもれないく、し
かも感度よく測定する方法が望まれていた。
かも感度よく測定する方法が望まれていた。
斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結
果、インフルエンザ菌の１株のｂタイプの外膜蛋白を抗
原として得られるポリクローナル抗体がインフルエンザ
菌に対する特異性が高く、しかも使用したインフルエン
ザ菌の型以外の型でも又ノン−タイパブルのものでも、
全タイプのインフルエンザ菌をもれなく測定できること
を見出し、本発明を完成した。
果、インフルエンザ菌の１株のｂタイプの外膜蛋白を抗
原として得られるポリクローナル抗体がインフルエンザ
菌に対する特異性が高く、しかも使用したインフルエン
ザ菌の型以外の型でも又ノン−タイパブルのものでも、
全タイプのインフルエンザ菌をもれなく測定できること
を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、インフルエンザタイプｂの外膜蛋
白を抗原として動物に免疫して得られる抗体を、被検体
と免疫反応せしめることを特徴とする全タイプのインフ
ルエンザ菌の測定法を提供するものである。
白を抗原として動物に免疫して得られる抗体を、被検体
と免疫反応せしめることを特徴とする全タイプのインフ
ルエンザ菌の測定法を提供するものである。
インフルエンザ菌の外膜蛋白はすでに公知のものであ
り、例えば、インフエクシヨン・アンド・イムニテイー
（Infection and Immunity）Vol.36，No.1，80〜88頁，
1982年に記載の方法によって単離される。外膜蛋白とし
ては、完全に精製されていない多少の不純物を含む粗外
膜蛋白を使用することができる。
り、例えば、インフエクシヨン・アンド・イムニテイー
（Infection and Immunity）Vol.36，No.1，80〜88頁，
1982年に記載の方法によって単離される。外膜蛋白とし
ては、完全に精製されていない多少の不純物を含む粗外
膜蛋白を使用することができる。
外膜蛋白を動物に免疫して抗体を調製する方法として
は、自体公知の方法が採用される。動物としては家兎、
山羊、緬羊、ろ馬、馬等の哺乳動物が使用される。外膜
蛋白の一定量を上記動物の皮内、皮下、筋肉内、腹腔
内、整脈内又は足蹠に数回接種することによって抗血清
を得る。
は、自体公知の方法が採用される。動物としては家兎、
山羊、緬羊、ろ馬、馬等の哺乳動物が使用される。外膜
蛋白の一定量を上記動物の皮内、皮下、筋肉内、腹腔
内、整脈内又は足蹠に数回接種することによって抗血清
を得る。
このようにして調製した抗血清（抗体）を使用して、被
検体中のインフルエンザ菌を測定するには、斯かる場合
に一般に行われている免疫反応を行えばよく、例えばエ
ンザイムイムノアツセイ、ラジオイムノアツセイ、直接
螢光抗体法、間接螢光抗体法、逆受身血球凝集法、逆受
身ラテツクス凝集法、コアグルチィネーション法が使用
される。
検体中のインフルエンザ菌を測定するには、斯かる場合
に一般に行われている免疫反応を行えばよく、例えばエ
ンザイムイムノアツセイ、ラジオイムノアツセイ、直接
螢光抗体法、間接螢光抗体法、逆受身血球凝集法、逆受
身ラテツクス凝集法、コアグルチィネーション法が使用
される。
本発明は外膜蛋白より得られる抗体を使用するため、型
別に関係なく全タイプのインフルエンザ菌をもれなく測
定できると共に、インフルエンザ菌に特異的であり、し
かも検出度が高いという利点を有する。
別に関係なく全タイプのインフルエンザ菌をもれなく測
定できると共に、インフルエンザ菌に特異的であり、し
かも検出度が高いという利点を有する。
次に実施例を挙げて説明する。
(1) 菌体外膜蛋白抽出法 インフルエンザタイプｂの１株を、イースト抽出物５mg
／ｍ、ヘミン１０μｇ／ｍ、NAD１００μｇ／ｍ
を加えたブレインハートインフユージヨン液体培地で、
３７℃にて１８〜２０時間培養した菌を連続遠心にて菌
体を回収し、１５０ｍの生理食塩水にて２回遠心洗浄
後、２００ｍの塩化リチウム抽出緩衝液（２００mM塩
化リチウム、１００mM酢酸リチウム、pH 6.0）に再浮遊
させ、直径６mmのガラスビーズを約１００個加えたロー
タリー攪拌機により、４５℃にて３時間激しく攪拌し、
12,000×ｇ１５分間遠心し、さらに25,000×ｇ２０分間
遠心した上清を精製水に対して透析したものを外膜蛋白
とした。
／ｍ、ヘミン１０μｇ／ｍ、NAD１００μｇ／ｍ
を加えたブレインハートインフユージヨン液体培地で、
３７℃にて１８〜２０時間培養した菌を連続遠心にて菌
体を回収し、１５０ｍの生理食塩水にて２回遠心洗浄
後、２００ｍの塩化リチウム抽出緩衝液（２００mM塩
化リチウム、１００mM酢酸リチウム、pH 6.0）に再浮遊
させ、直径６mmのガラスビーズを約１００個加えたロー
タリー攪拌機により、４５℃にて３時間激しく攪拌し、
12,000×ｇ１５分間遠心し、さらに25,000×ｇ２０分間
遠心した上清を精製水に対して透析したものを外膜蛋白
とした。
(2) 外膜蛋白抗血清作製と精製 上記(1)項で得られた外膜蛋白２mg（蛋白濃度）を１回
の接種量とし、家兎の静脈内に１週間に１回４週連続接
種した後、さらに４週の間隔をおいて１週間に１回、３
週連続接種して免疫を行なう。最終免疫の１週間後に血
液を採取し常法によって抗血清を得た。この抗血清を硫
安塩析、イオン交換してＩｇＧ分画を調製し、抗外膜蛋
白抗体とした。
の接種量とし、家兎の静脈内に１週間に１回４週連続接
種した後、さらに４週の間隔をおいて１週間に１回、３
週連続接種して免疫を行なう。最終免疫の１週間後に血
液を採取し常法によって抗血清を得た。この抗血清を硫
安塩析、イオン交換してＩｇＧ分画を調製し、抗外膜蛋
白抗体とした。
(3) 抗外膜蛋白抗体を利用したELISA法 1) 固相化抗体の調製 上記(2)項による抗外膜蛋白抗体（ＩｇＧ分画）を0.05
Ｍ炭酸緩衝液（pH 9.6）で希釈して５０μｇ／ｍの抗
体溶液となし、これをＥＩＡ用マイクロプレートの各ウ
エルに２００μ宛分注した。このマイクロプレートを
４〜１０℃で２４時間放置した後にウエル内容物を蒸留
水で洗浄した。次いで、各ウエル内に２％牛アルブミン
含有燐酸緩衝食塩水（pH 7.2）を２００μ宛分注し、
４〜１０℃で更に２４時間放置して固相化抗体とした。
Ｍ炭酸緩衝液（pH 9.6）で希釈して５０μｇ／ｍの抗
体溶液となし、これをＥＩＡ用マイクロプレートの各ウ
エルに２００μ宛分注した。このマイクロプレートを
４〜１０℃で２４時間放置した後にウエル内容物を蒸留
水で洗浄した。次いで、各ウエル内に２％牛アルブミン
含有燐酸緩衝食塩水（pH 7.2）を２００μ宛分注し、
４〜１０℃で更に２４時間放置して固相化抗体とした。
尚、この固相化抗体は使用に先立ち蒸留水で洗浄され
る。
る。
2) 標識抗体の調製 アルカリホスフアターゼ（仔牛小腸起源、ベーリンガー
社製）３mgを１mM塩化マグネシウム含有0.1Ｍ，Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液（pH
8.5）１ｍに添加して溶解させ、次いで過沃素酸カリ
ウム２０mgを添加し３７℃で２時間放置した。その後に
８００回転で５分間遠心して不溶物を除去し、上清を１
mM塩化マグネシウム含有0.1Ｍ炭酸緩衝液（pH 9.5）で
一晩透析した。次いで上記(2)項による抗外膜蛋白抗体
（ＩｇＧ分画）1.5mgを添加し、４〜１０℃で１４日間
放置し、２％牛アルブミン含有燐酸緩衝食塩水で２０倍
に希釈した後に凍結保存した。
社製）３mgを１mM塩化マグネシウム含有0.1Ｍ，Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液（pH
8.5）１ｍに添加して溶解させ、次いで過沃素酸カリ
ウム２０mgを添加し３７℃で２時間放置した。その後に
８００回転で５分間遠心して不溶物を除去し、上清を１
mM塩化マグネシウム含有0.1Ｍ炭酸緩衝液（pH 9.5）で
一晩透析した。次いで上記(2)項による抗外膜蛋白抗体
（ＩｇＧ分画）1.5mgを添加し、４〜１０℃で１４日間
放置し、２％牛アルブミン含有燐酸緩衝食塩水で２０倍
に希釈した後に凍結保存した。
尚、使用時には２％牛アルブミン含有燐酸緩衝食塩水で
所要希釈率のものとなす。
所要希釈率のものとなす。
3) 測定法 上記(3)−1)で準備された抗外膜蛋白抗体（ＩｇＧ分
画）が固相化されたマイクロプレートを蒸留水にて洗浄
した後、上記(1)項でえられた外膜蛋白そのもの又は上
記(1)項で使用した液体培地で培養された菌体を含む培
養液を２００μ宛分注した。このマイクロプレートを
室温で２時間反応後、蒸留水にて洗浄した後、上記(3)
−2)で調製された標識抗体の希釈液２００μを添加
し、室温で１時間反応させた後に内容物を蒸留水で洗浄
する。次いでアルカリホスフアターゼ活性測定用基質液
（４５mMフエニル燐酸２ナトリウム及び２mM４−アミノ
アンチピリン含有0.025Ｍ炭酸緩衝液、pH 10.2）を２０
０μ添加し、室温で２０分間反応させる。その後に発
色液（0.8％過沃素酸ナトリウム）１００μを添加し
て酵素反応を停止させると共に発色を生じさせ、抗原抗
体反応に関与したアルカリホスフアターゼの活性を、EL
ISAアナライザーにより、波長５００nmで吸光度測定を
行う。
画）が固相化されたマイクロプレートを蒸留水にて洗浄
した後、上記(1)項でえられた外膜蛋白そのもの又は上
記(1)項で使用した液体培地で培養された菌体を含む培
養液を２００μ宛分注した。このマイクロプレートを
室温で２時間反応後、蒸留水にて洗浄した後、上記(3)
−2)で調製された標識抗体の希釈液２００μを添加
し、室温で１時間反応させた後に内容物を蒸留水で洗浄
する。次いでアルカリホスフアターゼ活性測定用基質液
（４５mMフエニル燐酸２ナトリウム及び２mM４−アミノ
アンチピリン含有0.025Ｍ炭酸緩衝液、pH 10.2）を２０
０μ添加し、室温で２０分間反応させる。その後に発
色液（0.8％過沃素酸ナトリウム）１００μを添加し
て酵素反応を停止させると共に発色を生じさせ、抗原抗
体反応に関与したアルカリホスフアターゼの活性を、EL
ISAアナライザーにより、波長５００nmで吸光度測定を
行う。
(4) 結果 i) 臨床分離株による検討を行なう前に、インフルエン
ザ菌の莢膜血清型別ａ〜ｆの６株、莢膜型別ａ〜ｆの何
れにも属さないノンタイパブルなインフルエンザ菌８
株、さらに上記(1)項で外膜蛋白を得た菌も含めた莢膜
型別タイプｂ（臨床分離株）４株について、上記(3)−
1)項の「測定法」に記載の操作手順に従い、ELISA法に
よる測定を行ない表−１の成績を得た。即ち、抗外膜蛋
白抗体を利用したELISA法では（ ）内の菌体培養液を
測定した場合も、上記(1)項の記載された方法により１
８株の外膜蛋白そのものを測定した場合も、いずれも陽
性の結果を得た。また対照として、従来の市販莢膜型別
用抗血清と同様の方法でインフルエンザ菌タイプｂの１
株をホルマリン死菌化した菌を家兎に免疫して得られた
抗体を利用したELISA法を行なったところ、市販莢膜型
別用抗血清と同様にタイプｂの菌のみが反応しただけだ
った。このことからも本発明による方法は、全てのイン
フルエンザ菌を測定することに有効であることが判る。
ザ菌の莢膜血清型別ａ〜ｆの６株、莢膜型別ａ〜ｆの何
れにも属さないノンタイパブルなインフルエンザ菌８
株、さらに上記(1)項で外膜蛋白を得た菌も含めた莢膜
型別タイプｂ（臨床分離株）４株について、上記(3)−
1)項の「測定法」に記載の操作手順に従い、ELISA法に
よる測定を行ない表−１の成績を得た。即ち、抗外膜蛋
白抗体を利用したELISA法では（ ）内の菌体培養液を
測定した場合も、上記(1)項の記載された方法により１
８株の外膜蛋白そのものを測定した場合も、いずれも陽
性の結果を得た。また対照として、従来の市販莢膜型別
用抗血清と同様の方法でインフルエンザ菌タイプｂの１
株をホルマリン死菌化した菌を家兎に免疫して得られた
抗体を利用したELISA法を行なったところ、市販莢膜型
別用抗血清と同様にタイプｂの菌のみが反応しただけだ
った。このことからも本発明による方法は、全てのイン
フルエンザ菌を測定することに有効であることが判る。
ii) 生化学的性状によりヘモフイルス・インフルエン
ザ菌と同定された臨床分離株１７９株について、上記
(1)項で使用した液体培地で培養された菌体を含む培養
液について、上記(3)−1)項の「測定法」に記載の操作
手順に従い、表−２の成績を得た。即ち、抗外膜蛋白体
を利用したELISA法では、１７９株中１７２株（９６
％）が陽性の結果を得た。対照として従来の市販莢膜型
別用抗血清と同様の方法で、インフルエンザ菌タイプｂ
の１株をホルマリン死菌化した菌を家兎に免疫して得ら
れた抗体を利用したELISA法を行なったところ、市販の
生菌凝集試験で二社の製品でタイプｂと同定されたもの
だけが陽性となった。またインフルエンザ菌以外の細菌
１１１株についても同様の測定を行なったが全ての株で
陰性の結果を得た。
ザ菌と同定された臨床分離株１７９株について、上記
(1)項で使用した液体培地で培養された菌体を含む培養
液について、上記(3)−1)項の「測定法」に記載の操作
手順に従い、表−２の成績を得た。即ち、抗外膜蛋白体
を利用したELISA法では、１７９株中１７２株（９６
％）が陽性の結果を得た。対照として従来の市販莢膜型
別用抗血清と同様の方法で、インフルエンザ菌タイプｂ
の１株をホルマリン死菌化した菌を家兎に免疫して得ら
れた抗体を利用したELISA法を行なったところ、市販の
生菌凝集試験で二社の製品でタイプｂと同定されたもの
だけが陽性となった。またインフルエンザ菌以外の細菌
１１１株についても同様の測定を行なったが全ての株で
陰性の結果を得た。
このことからも本発明による方法は、インフルエンザ菌
に対する特異性が高く、しかも全てのインフルエンザ菌
を測定することに有効であることが判る。
に対する特異性が高く、しかも全てのインフルエンザ菌
を測定することに有効であることが判る。
Claims (1)
- 【請求項１】ヘモフイルス・インフルエンザタイプｂの
外膜蛋白を抗原として動物に免疫して得られる抗体を、
被検体と免疫反応せしめることを特徴とする全タイプの
ヘモフイルス・インフルエンザ菌の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60289799A JPH0664065B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 菌体外膜保有菌の免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60289799A JPH0664065B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 菌体外膜保有菌の免疫学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62148859A JPS62148859A (ja) | 1987-07-02 |
| JPH0664065B2 true JPH0664065B2 (ja) | 1994-08-22 |
Family
ID=17747913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60289799A Expired - Lifetime JPH0664065B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 菌体外膜保有菌の免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0664065B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0714649U (ja) * | 1993-08-12 | 1995-03-10 | 東洋電機製造株式会社 | 真空吸着チャック |
| AU2010204066B2 (en) * | 2009-01-07 | 2015-03-19 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for detecting all Haemophilus influenzae |
| WO2012170422A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Proteomics based diagnostic detection method for chronic sinusitis |
| US10921320B2 (en) | 2015-03-30 | 2021-02-16 | Entvantage Diagnostics, Inc. | Devices and methods for diagnosis of sinusitis |
| SI3075862T1 (en) | 2015-03-30 | 2018-02-28 | Entvantage Diagnostics, Inc. | Aids and tests for the diagnosis of sinusitis |
| US11650213B2 (en) | 2015-03-30 | 2023-05-16 | Entvantage Diagnostics, Inc. | Devices and assays for diagnosis of viral and bacterial infections |
-
1985
- 1985-12-23 JP JP60289799A patent/JPH0664065B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＩＮＦＥＣＴＩＭＭＵＮ．３６〔１〕Ｐ．８０−８８（１９８２） |
| ＩＮＦＥＣＴＩＭＭＵＮ．３７〔３〕Ｐ．１０３２−１０３６（１９８２） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62148859A (ja) | 1987-07-02 |
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