CN107228939B - 检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒，其包括包被有吗啡偶联抗原的酶标板、吗啡单克隆抗体、酶标记抗抗体、吗啡标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测吗啡及可待因的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测火锅底料及辣椒酱中吗啡及可待因的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒，其特别适于火锅底料及辣椒酱中吗啡及可待因残留量的检测。

背景技术

罂粟壳俗称大烟壳，为罂粟科植物罂粟割取浆汁后的干燥成熟果壳，内含20多种生物碱，其中含量最多的生物碱分别为吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀。罂粟壳中生物碱虽然含量较少，但如果长期食用含有这类毒品的食物，会出现发冷、出虚汗、乏力、面黄肌瘦、犯困等症状，严重时可能对神经系统、消化系统造成损害，甚至出现内分泌失调等症状。在我国，罂粟壳作为非食用物质，是不允许在食品及调味品中添加使用的。但近年来少数食品生产经营者为了招揽顾客、牟取暴利，在火锅及其调味料中添加罂粟壳及其水浸物等违禁原料，使食物味道鲜美，严重危害消费者的健康。

检测罂粟壳中生物碱的方法主要有紫外分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法以及液相色谱-串联质谱法等。这些方法各有特点，现以高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法为主流，这两种方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于吗啡及可待因检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有吗啡偶联抗原的酶标板、吗啡单克隆抗体、酶标记抗抗体、吗啡标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述吗啡偶联抗原是由吗啡半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原；所述吗啡半抗原是由3-氟-4-硝基苯胺与亚硝酸钠反应得到重氮盐，再与吗啡反应得到的，其分子结构式为：

所述吗啡单克隆抗体是以吗啡偶联抗原作为免疫原制备获得。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样品筛查，所述试剂盒还包括吗啡标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述吗啡标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH为7.6，含有0.8％～1.2％吐温-20和0.01‰～0.02‰叠氮化钠的0.2～0.4mol/L磷酸盐缓冲液。

所述复溶液优选为pH为7.6，含有9％～12％卵清蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封闭液，37℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

在微孔条上预包被吗啡偶联抗原，加入样品溶液或标准品溶液后，再加入吗啡单克隆抗体溶液，样品中的吗啡及可待因与酶标板上包被的吗啡偶联抗原竞争吗啡单克隆抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样品吸光度值与吗啡及可待因的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样品中吗啡及可待因的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中吗啡及可待因残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测吗啡及可待因的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法定性或定量检测样品中吗啡及可待因的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

附图说明

图1：吗啡半抗原合成路线图

图2：吗啡半抗原核磁共振氢谱图

图3：试剂盒标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1 试剂盒组分的制备

1、吗啡半抗原的合成(合成路线见附图1)及鉴定

取3-氟-4硝基苯胺20mg，加稀硫酸20μL，加水，搅拌溶解，5℃，加入亚硝酸钠18mg，搅拌1h，得到重氮盐溶液；取吗啡15mg，加氢氧化钠乙醇溶液溶解，加入到重氮盐中，反应2h，停止反应，离心分离，得到红色固体化合物，加乙醇旋蒸，蒸干除去水分，加二氯甲烷:石油醚＝1:20洗涤结晶得到半抗原产物。

取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见附图2。¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ：8.40(s,1H,ArH)，7.90(s,1H,ArH)，7.62(s,1H,ArH)，6.82(s,1H,ArH)，5.90(s,1H,-CH-)，5.59(s,1H,-CH-)，5.35(s,1H,-OH)，4.30(d,1H,CH)，3.04(s,1H,CH)，2.76(s,1H,-CH-)，1.88(d,2H,-CH₂-)。图谱中化学位移δ＝8.40、7.90、7.62为间隔臂苯环上氢的共振吸收峰，这些峰的存在，证明间隔臂连接成功，吗啡半抗原结构正确。

2、吗啡偶联抗原的合成及鉴定

免疫原制备——吗啡半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。

取11mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；称取50mg BSA，使之充分溶解在3.8mL 0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中，将溶解好的半抗原逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

包被原制备——吗啡半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。

取11mg半抗原，溶解于1mL DMF中；称取50mg OVA，使之充分溶解在3.8mL 0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中，将溶解好的半抗原逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

按合成吗啡偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。偶联物吗啡半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与吗啡半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明吗啡半抗原-载体蛋白的合成是成功的。经计算，半抗原与BSA的结合比为14:1，与OVA的结合比为10:1。

3、吗啡单克隆抗体的制备

(1)杂交瘤细胞的获得

1)首次免疫：将吗啡半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；

2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌吗啡单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

(2)单克隆抗体的制备

1)细胞复苏：取出吗啡单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到吗啡单克隆抗体溶液(-20℃保存)。

(3)单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(100000～500000)。

间接竞争ELISA方法：用吗啡半抗原-OVA偶联物包被酶标板，加入吗啡标准品溶液、吗啡单克隆抗体溶液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

(4)单克隆抗体特异性的测定

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将吗啡、可待因、蒂巴因、那可汀、罂粟碱做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：吗啡100％、可待因150％、蒂巴因40％、那可汀＜1％、罂粟碱＜1％。本发明抗体对蒂巴因、那可汀、罂粟碱等其他药物无交叉反应，只针对吗啡及可待因有特异性结合。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

(2)降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原(吗啡半抗原-OVA偶联物)稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2 检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被吗啡偶联抗原的酶标板；

(2)吗啡标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L；

(3)吗啡单克隆抗体工作液；

(4)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)洗涤液为pH为7.6，含有0.8％～1.2％吐温-20和0.01‰～0.02‰叠氮化钠的0.2～0.4mol/L磷酸盐缓冲液；

(8)复溶液为pH为7.6，含有9％～12％卵清蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

实施例3 火锅底料及辣椒酱样品中吗啡及可待因的检测

1、样品前处理

称取1.0g±0.05g均质后的样品至50mL聚苯乙烯离心管中，分别加入10mL乙醇，用涡旋仪涡动5min，3000g室温(20～25℃)离心5min；移取1mL上层有机相(若上层有悬浮物应避开)至10mL洁净干燥玻璃管中，于50～60℃水浴氮吹至干；加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动2min至油脂溶解，再加入1mL复溶液，继续涡动3min至均匀；将混匀后的液体移入2mL离心管中，4500g室温(20～25℃)离心2min；去除上层油脂层及乳化层，取下层50μL用于分析。

2、用试剂盒检测

向包被有吗啡偶联抗原的酶标板微孔中加入吗啡标准品溶液或经前处理的样品溶液50μL/孔，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体50μL/孔，再加入吗啡单克隆抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min；倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μL，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以吗啡标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的吗啡及可待因含量则可从标准曲线上读出。

实施例4 吗啡及可待因酶联免疫试剂盒技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为0.3μg/L，标准曲线的范围为0.3～24.3μg/L，IC₅₀(50％抑制浓度)浮动范围为0.8～1.2μg/L；对空白火锅底料、辣椒酱样品各20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样品浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对火锅底料、辣椒酱样品的检测限为5μg/kg。

2、样品精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD％＝SD/X×100％，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg三个浓度吗啡及可待因对火锅底料、辣椒酱样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1 精密度及准确度试验

以5、10、20μg/kg三个浓度吗啡及可待因对火锅底料、辣椒酱样品进行添加，平均回收率在80％～120％之间；批内、批间相对标准偏差均小于15％。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、吗啡及可待因添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

Claims (7)

1.一种检测吗啡及可待因的酶联免疫试剂盒，包括包被有吗啡偶联抗原的酶标板、吗啡单克隆抗体、酶标记抗抗体、吗啡标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，其特征在于：所述吗啡偶联抗原是由吗啡半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原；所述吗啡半抗原是由3-氟-4-硝基苯胺与亚硝酸钠反应得到重氮盐，再与吗啡反应得到的，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述吗啡单克隆抗体是以吗啡偶联抗原作为免疫原制备获得。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸溶液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为pH为7.6，含有0.8％～1.2％吐温-20和0.01‰～0.02‰叠氮化钠的0.2～0.4mol/L磷酸盐缓冲液；所述复溶液为pH为7.6，含有9％～12％卵清蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述吗啡标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L。

7.一种检测样品中吗啡及可待因含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1～6任一项所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。