CN1018649B - 免疫球蛋白结合物的制备方法 - Google Patents

免疫球蛋白结合物的制备方法

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Abstract

本发明涉及免疫球蛋白结合物的制备方法，该方法是经过一种烷类二元酸连接基团，使二氟核苷与一种免疫球蛋白反应而形成免疫球蛋白结合物，该结合物可用于肿瘤治疗。

Description

本发明涉及可用于肿瘤治疗的新药物，这些药物是二氟核苷和免疫球蛋白的结合物;这些药物的制备方法以及为制备这些药物所需的中间体的制备方法;应用这些药物的方法和组合物。
欧洲专利说明书第184，365号叙述了将某些二氟核苷用于治疗哺乳动物的肿瘤。一些同样的这类核苷在抗病毒方面的应用以及它们的制备方法已在美国专利4，526，988和英国专利申请书GB2172287号中被公开。已发现这类化合物具有对抗小鼠多种肿瘤体系的有用的活性。
本发明提供某些二氟核苷的免疫球蛋白结合物。虽然把药物结合到抗体上的一般概念通常是已知的，如欧洲专利说明书NO.88695，但是文献清楚地表明，要得到具有有用的生物学性质的结合物，对于用来完成结合作用的方式和方法是关键性的。例如，当一种化合物或药物具有多于一种反应官能团时，通过其中一种官能团结合所提供的结合物与通过另一个不同的官能团结合所提供的结合物相比，可以具有大得多或小得多的生物活性。在一些情况下，通过共价键将化合物与抗体直接结合会有较好的生物活性，而在另一些情况下，两部份之间的一种特定的连结基团会给出较优的活性。所以在大多数情形下，无法预言那一种特定的结合方法将会提供一种有用的结合物。
本发明提供具有通式为（Q）n-Im的免疫球蛋白结合物，其中Im是一种免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段，n值约为1-10，Q代表具有下述通式的一种酰基化的二氟核苷：
Figure 87108348_IMG4
中-R-NH-部份是
R1是氢、C1-C4烷基、-COR3或-COXCO-;R2是氢或-COXCO-;R4是氢、C1-C4烷基、氨基、溴、氟、氯或碘;R3是氢或C1-C4烷基;X是一个键、C1-C10直链亚烷基、C2-C10支链亚烷基、C2-C10亚烯基、C3-C6亚炔基、C3-C8亚环烷基、亚苯基或羟基取代的C1-C10亚烷基;A是N或C-R4;但以R1和R2当中的一个，并仅仅一个是-COXCO-为条件。
本发明也提供具有通式Q-OH的中间体，即具有下式（Ⅲ）的化合物：
Figure 87108348_IMG6
其中R6是氢、C1-C4烷基、-COR3或-COXCOOH;R7是氢或-COXCOOH;但以R6和R7当中的一个，并且仅仅一个 是-COXCOOH为条件。
式Ⅲ的化合物可用作本发明的结合物的中间体，并且也具有有用的抗肿瘤活性。
本发明也提供含有式Ⅰ的一种结合物作为活性组份，并与一种或多种药用载体或赋形剂相结合的药物配方。
本发明还进一步提供一种制备式Ⅰ结合体的方法，该方法包括将具有下式（Ⅶ）的化合物与免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段进行反应：
Figure 87108348_IMG7
其中R8是氢、C1-C4烷基、-COR3或-COXCOZ;R9是氢或-COXCOZ;但以R8和R9当中的一个，并且仅仅一个是-COXCOZ为条件;Z是一个活化基团。
本发明提供的结合物是通过把一种具有式（Ⅲ）的酸的活化形式（Ⅶ），与免疫球蛋白分子中的一个或多个氨基，例如由赖氨酸残基衍生的氨基进行反应而形成的。
较好结合物是那些R1是氢和-R-NH-是4-氨基-2-氧代-1-嘧啶基的结合物，较好的X基团是亚烷基部份，特别含有2-4个碳原子的亚烷基。更好的结合物是那些R2是氢和R1是-COXCO-，以及那些n值约4-8的结合物。
较好的中间体是那些式Ⅲ中R6是-COXOOH的化合物。
已经知道，具有式Ⅰ和式Ⅲ的二氟核糖核苷能以α-β形式存在。本发明提供的结合物带有的核糖核苷是它的外消旋体，或者分别是它的α型或最好是β型。
具有通式Ⅲ的酸是用标准的技术，由具有通式Ⅳ的核苷制备的：
Figure 87108348_IMG8
其中R1′的定义与R1相同，但不能是-COXCO-。当然，如果连接基团被安置在5′-甲醇位置上，那么R′1必定是氢。
一般，连接基团是连接在可使具有式Ⅳ的胺与具有通式ZCOXCOOH（Ⅴ）的单活化二元酸反应的位置上。Z部分是一个羧基活化基团，如那些在化学技术中所熟知的、特别是在多肽化学中所应用的。这类基团在M.Bodanszky等人所著的“多肽合成”第二版（1976年），Jonn Wley&Sons公司出版，主要在第85-136页已经讨论过。因此，Z的涵义是，包括叠氮基（-N3）、卤素如溴，特别是氯，具有通式R5COO的酰氧基，其中R5是一个脂肪或芳香基团例如C1-C4烷基，烷氧基，最好是C1-C3烷氯基或芳氧基、甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基或苯磺酰氧基、咪唑基或一个N-酰基羟胺衍生物的基，例如Z是丁二酰亚胺氧基、邻苯二甲酰亚胺氧基或苯并三唑氧基。另外，具有下式Ⅵ的环状酸酐也可以用来代替Ⅴ：
Figure 87108348_IMG9
这种化学都是技术熟知的，例如，酰化分子中的醇部份可看，例如，美国专利NO.4，596，676号和英国专利申请书2，137，210。一般，化合物Ⅳ和Ⅴ（或Ⅵ）最好在一种非反应性的溶剂中反应，这类溶剂有醚类，如四氢呋喃、乙醚、二氧杂环己烷等;酮类，如丙酮、甲乙酮等;烃类，如己烷、环己烷、甲苯等;或氯化烃类，如二氯甲烷。另外，除上述溶剂外，该反应也可以在一种非反应性的酸净化剂如吡啶、三乙胺等之中，或在这些净化剂的存在下进行反应。应用大为过量的具有通式Ⅴ或Ⅵ的试剂是合适的，尤其是当所需的产物具有在5′甲醇位置上的连结基团。试剂过量的范围为2倍至6倍之间，特别是4倍左右时是合适的。
具有通式Ⅳ的核苷与酰化剂反应得到一些产物的混合物。氨基是最容易被酰化的，但5′位甲醇基上的氧和3′-羟基的氧也是有反应活性的，因此，不仅形成单酰基化的产物，也形成二和三酰基化的产物。这些不同的产物可用色谱技术分离，这在后面的实例中有详细的说明。
可以相信，在三种可以酰化的位置中，在5′-甲醇基上的连接基团是最稳定的，按此，通式Ⅲ的中间体，其中R
Figure 87108348_IMG10
是-COXCOOH的，可以相当纯净的形式被分离，即通过将产物水溶液简单的暴露于热之中，就可使任何不需要的酰基从氨基的氨上和3′位羟基的氧上解裂下来。这样的分离方法在后面的实例中也有说明。
这样形成的化合物Ⅲ即可与选定的免疫球蛋白 进行反应，结合过程是按前述的方法首先通过用Z官能团把化合物Ⅲ中的酸基活化来完成的。这类制备酰卤、叠氮化物、活化酯、混合酸酐等等的方法也是技术上所熟知的。其中丁二酰亚胺氧和酰卤、特别是酰氯衍生物，是特别重要的活化基团。这些活化的酸可按在技术上熟知的标准技术来制备，然后用来和免疫球蛋白偶联。免疫球蛋白和活化的化合物Ⅲ的反应，最好是在水性介质中，在约5-25℃、pH值约7-10时进行。反应过程导致一个或多个经修饰的二氟核苷通过酸基与免疫球蛋白分子中游离的氨基形成酰胺的共价键结合。结合的残基数目取决于反应物的浓度、反应时间、特定的免疫球蛋白，但平均数目通常约在1-10之间。
在进行经活化的式Ⅲ的化合物与免疫球蛋白的结合反应时，适当的溶剂如二甲基甲酰胺可用作一种媒介物以便将活化的酸引入免疫球蛋白的缓冲溶液，例如pH8.6的0.34M的硼酸缓冲液中。结合物可用pH7.4的磷酸盐缓冲的盐水作溶剂，通过凝胶过滤分离。另外，结合物可储存于4℃的冰箱中或者例如，在-20℃冰冻。
具有通式Ⅳ的核苷在技术上是已知的，试剂Ⅴ和Ⅵ或者是可以买到的商品，是在文献中已知的，或者可通过技术上已知的方法来制备。
新结合物的另一组份是一种免疫球蛋白，在这类物质中，最好是用单克隆抗体（MoAb），它是一种诸如1g或1M的丙种球蛋白。优选的这类免疫球蛋白是那些对无用的细胞表面上的抗原有反应活性的、即能够识别抗原的免疫球蛋白;即它具有抗原识别的性质。
由免疫动物的血清中，或通过培养杂种瘤所分泌的单克隆产物以生产这类免疫球蛋白的技术是众所周知的。用于本发明的优选的抗体类型是一种丙种球蛋白的免疫球蛋白。特别优选的是IgG、IgA和IgM亚类。一些有代表性的免疫球蛋白是下列各种抗原的单克隆或多克隆抗体：
（ⅰ）与人类或牲畜的肿瘤结合的抗原;
（ⅱ）人类B-和T-细胞抗原;
（ⅲ）人类Ia抗原;
（ⅳ）病毒、真菌和细菌抗原;以及
（ⅴ）涉及人类的炎性或过敏性反应的细胞。
在这些对于与人类或牲畜肿瘤结合的抗原的优选的抗体中，可以提及的有：
（ⅰ）来自用癌胚抗原免疫的山羊或绵羊的Ig;
（ⅱ）来自兔子抗急性成淋巴细胞的白血病血清中的Ig;
（ⅲ）来自下列各种疾病所引起的各种灵长类抗血清中的Ig：急性成淋巴细胞的白血病、急性原始粒细胞性白血病、慢性成淋巴细胞的白血病和慢性粒性白细胞的白血病;
（ⅳ）来自用肺癌细胞或其细胞碎片免疫的山羊或绵羊的Ig;
（ⅴ）来自能分泌抗人类结肠直肠肿瘤抗体的小鼠杂种瘤中的单克隆Ig;
（ⅵ）来自能分泌抗人类黑素瘤抗体的小鼠杂种瘤中的单克隆Ig;
（ⅶ）来自能分泌出与人类白血病细胞反应的抗体的小鼠杂种瘤中的单克隆Ig;
（ⅷ）来自能分泌出与人类的成神经细胞瘤细胞反应的抗体的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅸ）来自能分泌出与人类乳腺癌抗原反应的抗体的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅹ）来自能分泌出与人类卵巢癌细胞反应的抗体的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅹⅰ）来自能分泌出与人类骨肉瘤细胞、与人类胰腺癌细胞、与人类前列腺癌细胞等反应的抗体的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅹⅱ）来自能分泌抗体至包括肺、肾、乳腺和胰的腺癌的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅹⅲ）来自能分泌出与人类鳞状癌细胞反应的抗体的小鼠杂种瘤的单克隆Ig;
（ⅹⅳ）来自人类杂种瘤的单克隆Ig（这种杂种瘤能分泌抗体至与人类肿瘤的相关的抗原，这些抗体包括、但不限于上述那些单克隆Ig）;
（ⅹⅴ）在它的轻的或重的侧链上含有碳水化合物分子的任何一种抗体或它的片段;
（ⅹⅵ）一种来自大鼠、仓鼠或其它上面未专门提及的哺乳类动物，来自能分泌抗体至与人类肿瘤相关的抗原的杂种瘤的单克隆Ig。这些抗体包括、但并不限于上述那些单克隆Ig;
如前所述，结合物也能用免疫球蛋白的片段Ig，还有有关的如Fab，F（ab′），F（ab′）2，和衍生自一种抗体的1gM单体，通过，例如，蛋白水解酶消化或还原的烷基化作用而得到。有用的结合物也可用嵌合的单克隆抗体和双功能抗体制得。这类物质和它 们的制备方法是熟知的，并可以指出，优选的蛋白水解酶是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。一般可参看Parham在J.Jmmunology，131卷2895页（1983年）;Lamoyi等人在J.Immunological    Methods，56卷第235页（1983年）;Parham，在同一杂志第53卷，第133页（1982）以及Matthew等人在同一杂志第50卷第239页（1982年）。
存在着对于抗多种肿瘤有活性的特定单克隆抗体;这种免疫球蛋白能识别肿瘤细胞表面上的抗原，或者能和肿瘤细胞结合，下面的表Ⅰ包括（但并不限于）这些抗体种。
表Ⅰ
肿瘤    单克隆抗体    参考文献
肺癌    KSI/4    N.m.Varki等人
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小细胞肺癌    TFS-2    OKabe等人，癌症研究
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结肠癌    11.285.14    G.Rowland等人，
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NS-3a-22，NS-10    Z.Steplewskl等人
NS-19-9，NS-33a    癌症研究
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肉瘤    791T/36    P.181
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优选的结合物是那些由单克隆抗体，特别是那些能识别出下述人类肿瘤细胞的单克隆抗体所制得 的结合物。这些人类肿瘤细胞包括腺癌、鳞状细胞癌、转移细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、小细胞癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤。
下面的实例是以本发明的中间体对结合物加以说明。这些实例仅作为说明之用，并不是要以任何方式限制本发明。
实例1
5′-0-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷。
把干燥的2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷（311，毫克）加入无水乙醇中，加热使之回流。半小时内分几部份加入丁二酸酐（2.5克），并将反应混合物再回流半小时。将反应混合物减压浓缩，得到的粗产品放置于硅胶柱上，以5%、20%和50%的甲醇在二氯甲烷中的溶液进行分段梯度洗脱。将所需产物从50%甲醇在二氯甲烷中的洗脱液中分离出来，得148毫克产物。把这产物和由相似的实验所得的产物合并，共得253毫克物质。将它溶于8毫升0.01M的醋酸铵溶液中。用氢氧化铵调节pH值到8.6，然后将这溶液加到新装填好的单-Q阴离子交换柱上（新泽西08854    Piscata-way，Centennial大街800，Pharmacia公司的产品），将所需的液份合并后冷冻，并冷冻干燥。将残留物溶解于蒸馏水中，冷冻并冷冻干燥数次，然后溶于少量甲醇和苯中，冷冻并冷冻干燥，得到60毫克所需的标题化合物，其质子NMR谱与所需产物的结构一致;
δ7.68，双重峰，IH（C6，＝CH-N）;δ6.24，三重峰，IH（C1′，O-CRH-）;δ6.13，双重峰;IH（C5，C＝CH-）;δ4.78，单峰，4个可交换的质子（-OH，-NH）;δ4.2-4.7，多重峰，4个质子（在糖分子C3′，C4′，C5′上的质子）;δ2.60和2.73，三重峰的双峰，4个质子（丁二酸酯质子-CH2-CH2-）。
实例2
5′-0-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷与007B的结合。
把25毫克实例1中得到的产物溶于小量苯和甲醇中，冷冻并冷冻干燥总共三次。残余物溶于1毫升干燥的二甲基甲酰胺和4毫升新蒸馏的四氢呋喃中。混合物冷至4℃后加入N-甲基-吗啉（151微升）在四氢呋喃中的溶液。10分钟后，加入177微升氯甲酸异丁酯在四氢呋喃中的溶液。在4℃搅拌20分钟后，加入248微升N-羟基丁二酰亚胺，在4℃继续搅拌20分钟，再在室温搅拌3小时。溶液减压浓缩并在真空中放置过夜。
上面一艺中制备的活化酯（31.7毫克）溶解于4.18毫升干燥的二甲基甲酰胺中。抗体007B是通过建立次克隆细胞系产生公布的抗体KSI/4，并选择只产生有关的KSI/4的IgGa单克隆体KSI/4，并选择只产生有关的KSI/4的IgG2a单克隆抗体、而不产生无关的IgGI蛋白的变异的杂种瘤克隆而制备的。用通常的方法在细胞培养基中使这类克隆生长以产生007B。将500毫克007B在pH为8.6的硼酸缓冲液中的溶液放在圆底烧瓶中，在10分钟内加入上述活化酯的溶液，反应物在暗处搅拌3小时，用1N盐酸把pH调到7.4，以每分钟2，000转离心10分钟，将上层清液分成两半，各部分放在Bio-gelP-6柱上（加利福尼亚洲94804，Richmond，32nd和Grittin大街的Bio-Rad实验室的产品），用pH7.4的磷酸缓冲的盐水（PBS）洗脱，将每部分的结合物的峰收集在三个液份中，合并两次制备中相似的洗脱液份，其中将合并的第二个馏份浓缩至3毫升并用PBS稀释，即得到总体积共13.29毫升、浓度为25.44毫升/毫升的溶液。回收的蛋白质为338毫克，核苷对蛋白质的摩尔比为4∶1。该产物经消毒灭菌后用于后面的体内实验中。
实例3
5′-0-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷
将600毫克干燥的2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷盐酸盐加到6毫升无水的吡啶中，加入804毫克丁二酸酐。反应混合物在室温搅拌1.5小时。然后把混合物在减压下浓缩成为油状物，并在冲箱中放置过夜。然后在室温放置4小时并在500毫升Q-琼脂糖柱（pharmacia公司产品）进行色谱法即将上述油溶于6毫升0.1M醋酸铵缓冲液中，通过柱子，用由0.1M改变到1.0M醋酸铵的梯度缓冲液洗胶，在整个过程中pH值都保持在8.0。在小型单-Q柱上对混合物进行分析型的色谱法，表明产品中除单酰化的产物外，还存在二酰化和三酰化的产物以及小量未酰化的原料。含有产物的洗脱液份计约200毫升，在37℃的浴中放置68小时，在这段时间过后，三酰化的产物即已分解，单酰化和双酰化的产物则仍然存在。
在单-Q柱上进行制备型的色谱法以分离该产物的混合物，用上面所说的同一种梯度缓冲液洗脱，收集含有单酰化产物的液份，合并后冷冻干燥两次，得到500毫克所需的中间体产物，产物经核磁共振分析 鉴定，（用重水作溶剂，在300兆周仪器上）其共振谱特征峰为：δ6.15，双峰，1H（C5）：6.25，三重峰，1H（C1′）：7.7，双峰，1H（C6）。
实例4
5′-0-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷N-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷
将200毫克2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷盐酸盐溶于2毫升吡啶中，然后加入134毫克丁二酸酐。将混合物在室温搅拌1.25小时后，减压浓缩。残余物溶于二氯甲烷/甲醇中，然后被吸附于1.5克硅胶上，将它在二氯甲烷中搅成浆状物之后，装到4克硅胶柱上，用梯度溶剂洗脱，先用二氯甲烷，最后用甲醇。合并含有产物的洗脱液份并冷冻干燥过夜，得到255毫克产物的混合物。把它溶解于3毫升0.01M醋酸铵溶液中，在22毫升单-Q填装的快速流动柱（pharmacia公司的产品）上进行色谱分离，用前面提到过的醋酸铵梯度缓冲液洗脱。蒸发含有产品的洗脱液份，得到81毫克标题所指的单酰化产物的混合物。
用实例3中所说的分析方法，观测到两种产物的下述核磁共振特征：
N-酰化产物    O-酰化产物
三重峰，IH（C1）    δ6.25    δ6.25
二重峰，IH（C5）    δ7.4    δ6.15
二重峰，IH（C6）    δ8.2    δ7.7
实例5
5′-O-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷的活化
称量23.2毫克实例1制得的中间化合物，把它放入一个50毫升的烧瓶内，并溶于小量甲醇中。加入数毫升苯，将溶液减压蒸发。上述溶解和蒸发操作重复一次，以保证化合物干燥。然后将其溶于1.2毫升二甲基甲酰胺中，所用的二甲基甲酰胺在分子筛存在下储存使其干燥。加入14.7毫克N-羟基丁二酰亚胺，再加入14.5毫克二环己基羰二亚胺。然后将反应混合物在室温搅拌过夜，即得到5′-0-（3-羧基-1-氧代丙基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷的丁二酰亚胺氧酯。
实例6
与抗体9.2.27的结合
把624微升由实例5中制得的活化酯溶液加到一只管形瓶中，并往其中加入100毫克分离的抗体9.2.27。反应混合物在室温搅拌数小时后，在冰箱内放置两天。反应混合物在G-50型排阻色谱柱（pharmacia公司产品）上色谱分离，用PBS洗脱。含有产品的洗脱液份用紫外分析检测，观察在280λ处最大吸收和在251λ处最大吸收。药物对抗体的比率是每摩尔抗体有3.7摩尔的药物。
实例7
与抗体007B的结合
按实例5所说的方法制备活化酯的溶液，但使它的浓度加倍。把1.4毫升这种溶液加到500毫克分离的抗体007B中，反应混合物在室温搅拌4小时，然后离心分离，把固体小团按照上面实例6中所说的方法，装在G-50上并进行色谱分离。得到两份含产物的液份，按实例6中所说的方法用紫外分析，结果表明它们分别是每摩尔抗体结合有8.9摩尔和10.2摩尔的药物。
用标准技术，可测定对雌性裸鼠的P3-UCLA腺癌的抑制作用。即在第0天对小鼠接种，在第2、第4和第8天静脉注射受试化合物，在第14或第21天对试验结果进行评价。用仅接受赋形剂注射的对照组来定出抑制肿瘤生长的百分率。每次试验和对照组均用5只小鼠。结合物的剂量用计算出所用母体核苷的毫克/公斤表示。这些试验的结果总结在表Ⅱ中。
表Ⅱ
对裸鼠P3-UCLA腺癌的抑制作用
实例化合物    剂量    抑制百分率
（毫克/公斤）    14天时    21天时
1    5.0    25%    37%
2    5.0    86%    84%
2.5    63%    62%
0.5    31%    27%
在第2，第4和第8天通过静脉注射的剂量。细胞的接种在第0天;在第14或第21天评价;实例2化合物的剂量是按毫克/公斤的母体核苷计算的。
还进行了同一类型的另外一些试验，即在接种后的第14、第21和第28天观测动物。所用的实例2结合物是具有平均结合比为7.8的合并组。
实例化合物    剂量    抑制百分率
（毫克/公斤）    14天时    21天时    28天时
1    10    41    36    28
2.5    28    18    2
0.5    25    7    23
1    10    97    99    95
5    97    98    94
2.5    96    92    85
1    48    38    32
0.5    48    16    4
服用最高剂量的实例1化合物的五只小鼠中有一只死亡，同样，服用最高剂量的实例2化合物的五只小鼠中有三只死亡。
上面的试验的结果证实了把核苷结合到定向抗体上的价值。由该数据可以明显看出，结合的药物即使用较低的、非致毒的剂量，它对肿瘤的抑制作用也比母体核苷的药效大两倍以上。
体外试验是在ELISA体系内进行的，用以测定结合的药物的抗体部份对于有未结合的抗体相连接的抗原的亲合力。试验结果用存在于连接抗原的样品中的抗体的分数表示：
抗体007B
结合比    ELISA结果
8.9    0.43
6.6    0.42
2.5    0.55
抗体9.2.27
结合比    ELISA结果
16.5    0.15
4.9    0.26
0    0.65
本发明的新结合物可用于癌的治疗，为此最好把它制备成适用于注射的配方。因此本发明包括一种药物配方，例如一种可注射的制剂，它包括本发明的一种结合物以及一种药用载体或稀释剂，这些是本专业中众所周知的，配方最好做成单位剂量的形式，每份剂量含有，例如，0.1至10毫克活性组份（指核苷药物部份）。
新的结合物在很广的剂量范围内都是有效的，并且，例如对于患有癌症的成年病人的治疗，每周的剂量将一般在0.01至10毫克/公斤的范围内（指核苷药物部份），更常用的剂量范围是0.03至9毫克/公斤。但是应当了解，结合物的实际使用剂量将由医生来决定，即根据有关的情况，包括治疗的症状和选用的给药途径等。

Claims (4)

1、一种制备通式为(Q)n-Im的结合物的方法，其中Im是抗体007B或9.2.27，n值约为4-10，Q是具有下式的酰基化的二氟核苷：
Figure 87108348_IMG1
其中-R-NH-部份是
Figure 87108348_IMG2
R1是-COXCO-；R2是氢；X是C1-C10直链的亚烷基、C2-C10支链的亚烷基；A是C-R4；R4是氢，该方法包括在一种缓冲水溶液中，在pH值为7到10和温度为5至25℃时把具有下式(Ⅶ)的化合物与抗体进行反应：
Figure 87108348_IMG3
式(Ⅶ)中的R8是-COXCOZ-；R9是氢；Z是一种活性基团。
2、根据权利要求1的制备结合物的方法，其中的Im是具有识别抗原性质的免疫球蛋白。
3、根据权利要求1的制备结合物的方法，其中的免疫球蛋白是一种单克隆的抗体。
4、根据权利要求1的制备结合物的方法，其中的Q是5′-O-（1，4-二氧代丁基）-2′-去氧-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷基。
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