CN1621413A - 一种c－型凝集素及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种C型凝集素及其编码基因。本发明所提供的C型凝集素，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。C型凝集素编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的C型凝集素将最终为艾滋病、结核病、慢性肝炎等疾病的治疗开辟新的途径。

Description

一种C-型凝集素及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种人源C型凝集素及其编码基因。

背景技术

蛋白和蛋白质糖链的相互作用在天然免疫和继发免疫中发挥重要作用，涉及病原微生物的识别和免疫细胞之间的相互作用，参与这种作用的分子为凝集素(lectins)，其中依赖钙离子的C-型(C-type)凝集素家族(lectin family)为其主要成员。这一家族含有一个相似的功能结构域-糖基识别结构域(carbohydrate-recognitiondomains，CRDs)，它们在进化上可能起源于一个共同的祖先，选择性识别不同的糖基。在这个大家族中大家所熟悉的，如血清甘露糖结合蛋白为可溶性蛋白，它结合病原微生物外壳蛋白甘露糖残基，激活补体，从而清除病原微生物，在天然免疫中起重要作用；选择素(selectins)介导白细胞穿过内皮细胞到达炎症部位，在继发性免疫中起重要作用。而最近引起人们极大兴趣的是在NK细胞、DC细胞、巨噬细胞和特殊部位的内皮细胞上表达的II型膜蛋白受体，它们属于II型C型凝集素，具有相似的结构，N端含有一个胞内较短的胞内结构域，一个穿膜结构域和胞外一个不同长短的颈部，一个C末端CTLD(C-type lectin-like domains)结构域；CTLD与CRD具有相似的空间结构，不同之处在于CTLD不一定识别糖基和依赖钙离子，可与蛋白质相互作用。家族成员的基因主要成簇聚集于人类染色体12p12.3-p13.2和19 p13.3两个区域，前一个区域包括LY49L，NKG2家族、CD94、CLEC-1、CLEC-2、OLR1、KLRF1、AICL、CD69、LLT1、NKRP1A、MAFA-L、M6PR、DCIR和DLEC。LY49L，NKG2家族主要与NK细胞识别异己、激活和抑制功能相关。OLR1表达于内皮细胞膜上，是氧化性低密度脂蛋白受体，与动脉粥样硬化密切相关。其中大部分成员的功能研究均还在进行中。后一个区域包括CD23、DC-SIGN和DC-SIGNR，均为II型膜蛋白受体，家族成员的基因紧密成簇存在于人类染色体19p13.3区。DC-SIGN与DC-SIGNR在碱基水平上有77％同源性，CD23与DC-SIGN、DC-SIGNR在氨基酸水平上分别为33％、32％同源性。CD23，即IgE低亲和力受体，在多种造血细胞上表达，如B细胞、T细胞、FDC细胞(follicular dendritic cells)、单核细胞、郎汗氏细胞(langerhans cells)、嗜酸性粒细胞和NK细胞。其配体为IgE、CD21和CD11b/CD18、CD11c/CD18，CD23的CTLD与IgE的结合不需糖基参与，但依赖于钙离子，而与后两者结合需糖基参与，1-磷酸岩藻糖可抑制其结合。CD23参与多种生物活动，如介导细胞之间的黏附，促进B细胞的生长，影响B细胞在生发中心的存活，参与B-T细胞之间抗原递呈，调节IgE的生成和调理IgE-IC复合物的吞噬。在多种慢性炎症中，如类风性关节炎、红斑狼疮和慢性活动性肝炎等表达显著增高，特别是在EBV病毒感染的B细胞上表达急剧增高，与EBV病毒的长期潜伏性有关。

DC-SIGN(dendritic cell-specific intercellular adhesionmolecule(ICAM-3)-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)是DC(树突状细胞)细胞上特异的II型膜蛋白受体，其配体为ICAM-3(胞内黏附分子-3)、ICAM-2(胞内黏附分子-2)；DC细胞通过DC-SIGN与静止T细胞上的ICAM-3结合，启动免疫反应，参与DC-T细胞之间的抗原递呈；与内皮细胞上ICAM-2结合，协助DC细胞穿过血管内皮。DC-SIGN是HIV gp120的高亲和力受体，生殖黏膜下的未成熟的DC细胞表达DC-SIGN，能够结合HIV病毒的gp120蛋白，迅速把HIV病毒颗粒内吞至晚期溶酶体，但HIV保持增殖能力和毒力，DC细胞激活后，迁移到淋巴结CD₄ ⁺细胞居住区，提呈抗原给CD₄ ⁺细胞；同时DC反式把HIV传染给CD₄ ⁺细胞。DC-SIGN都是通过其CRD结构域与gp120和ICAM-3、ICAM-2结合，但结合部位不重叠，并且与gp120和ICAM-3、ICAM-2的结合是CRD识别gp120、ICAM-3、ICAM-2的高甘露醇式糖链。

DC-SIGNR(DC-SIGN相关蛋白，DC-SIGN related protein)主要表达在LSEC(肝窦状内皮细胞)、淋巴结窦状内皮细胞和胎盘绒毛膜部分毛细血管内皮细胞上，由于与DC-SIGN有很高的同源性，因而具有相似的功能，也能与T细胞上的ICAM-3黏附分子结合，参与抗原递呈和细胞的迁移，证实能识别HIV gp120的高甘露糖糖蛋白，并以反式方式传染给CD₄ ⁺细胞，可能与HIV血源性传播和垂直传播密切相关。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种C型凝集素及其编码基因。

本发明所提供的C型凝集素，名称为CD23L，来源于人，是具有序列表中SEQ ID№：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2是由293个氨基酸残基组成的蛋白质。

一种C型凝集素编码基因CD23L，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID №：1是由1141个碱基组成的cDNA，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第70位-951位碱基。

含有C型凝集素编码基因CD23L的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和细胞系。

本发明基于胎肝cDNA大规模测序的完成，为寻找新的黏附分子，选中DC-SIGN，DC-SIGNR和CD23的氨基酸序列为模板，tBlastn搜索人胎肝cDNA数据库，找到一条具有较高同源性的EST：D1210，862bp。然后搜索NCBI的核酸库和EST库，发现其为一未知基因。采用RACE技术获得了其全长cDNA：1411bp，编码293个氨基酸的蛋白。全长氨基酸序列与DC-SIGNR、DC-SIGN和CD23有较高的同源性，分别为32％，31％和31％，命名为CD23L(CD23-like protein，CD23L)。

生物信息学分析显示，CD23L为一新的C-type lectin-like基因，定位于19p13.3区，与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR紧密成簇共定位于19p13.3区105kb大小区域，从中心粒起依次为DC-SINR、DC-SIGN、CD23L、CD23，它们具有相似的基因组结构，具有典型的由3′端三个外显子编码CTLD功能域的特性，只是编码颈部的外显子数目和大小不同。CD23L氨基酸Blastp分析也显示其为一新的C-typelectin，全长氨基酸与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR具有较高的同源性，约有32％左右的相同氨基酸，相似性约为46％，但在CRD结构域它们的同源性相对较高，相同的氨基酸约38％。CD23L的功能结构域预测显示，CD23L由N端较短的胞内区、穿膜区、膜外coiled-coil结构的颈部和C端的CTLD结构域组成，其中胞内区含非典型内吞motif：YSKW，CTLD结构域含有六个保守的C，可形成链内三对二硫键，构成CTLD的空间结构的基础，大部分CTLD保守氨基酸都保守，含典型的钙离子2结合位点，钙离子1结合位点氨基酸部分保守，含识别甘露糖，N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖的motif：EPN；膜外coiled-coil结构的颈部可能使CD23L形成多聚体。以上生物信息学分析提示，CD23L与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR具有相似的功能结构域和相似的空间结构排列，较高的同源性，相似的基因结构和基因紧密成簇排列，这些均说明它们可能来源于同一祖先，可能具有相似的功能，而进化树分析也证实这一推测，CD23L与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR确实属于同一C-type lectin亚家族。

Northern Blot显示CD23L在15种人组织中，只在胎肝、肝脏和淋巴结表达，而在心脏、大脑、肺、肾脏、骨骼肌、骨髓、脾脏、外周血白细胞、结肠、胸腺、小肠、胎盘组织未见表达。RT-PCR检测各种血细胞系、DC细胞、肝癌细胞株HepG2和BEL-7402、脐静脉内皮细胞、外周血单个核细胞和刺激的单个核细胞均未检测到CD23L的表达。为了原位检测CD23L的表达，制备了CD23L的多抗，通过WesternBlot，间接免疫荧光和流式细胞计数仪检测稳定表达CD23L的CHO细胞(CHO-CD23L)证实抗体的特异性，并且证实CD23L为II型膜蛋白，分子量为40kDa，以四聚体形式存在。免疫组织化学检测正常肝脏和淋巴结组织切片，发现CD23L主要在肝脏和淋巴结的窦状内皮细胞表达，并与DC-SIGNR共表达于同一细胞上。

为了证实CD23L的糖基结合能力，用CD23L-Fc融合蛋白和CD23L的CH0稳定表达株(CHO-CD23L)细胞裂解液通过亲和层析的方法，发现CD23L能结合甘露糖，N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖，并依赖钙离子。因此，CD23L的生理功能可能是一种识别糖基的受体。此外，用复性的原核表达的CD23L膜外部分和真核表达的CD23L膜外部分与Fc的融合蛋白，应用流式的方法，筛选各种血细胞，发现CD23L能黏附T细胞，尤其是激活的T细胞；其黏附能被EDTA和甘露聚糖所抑制，说明CD23L黏附激活T细胞依赖钙离子，并需甘露糖一类的糖基参与，进一步证实CD23L是识别糖基的受体，其配体在激活T细胞上表达。其可能作为一个新的黏附分子在抗原递呈和细胞-细胞的黏附中发挥作用，为临床上治疗慢性炎症和其他免疫系统疾病提供新的治疗途径。

CD23L的发现和其功能研究为肝和淋巴结窦内皮细胞的黏附功能和吞噬功能的分子机制打开了一扇认识的大门，也将为它们与其它内皮细胞具有不同的特性尤其是具有独特的免疫功能提供一些分子基础。

CD23L可能在病原微生物的慢性感染和免疫逃避中发挥着重要作用。艾滋病、结核病、慢性肝炎等疾病现还没有很好的治疗方法，因此研究CD23L在这些慢性疾病发病中的作用具有前瞻意义，为下一步应用CD23L的抗体和糖拮抗剂来治疗这些疾病打下了坚实的理论基础，最终为艾滋病、结核病、慢性肝炎等疾病的治疗开辟新的途径。

附图说明

图1为DC-SIGN和DC-SIGNR tBlastn搜索人胎肝EST库的结果

图2为D1210搜索人类EST库结果

图3为RACE扩增的D1210全长cDNA序列

图4为CD23L在BL21中的表达

图5为Ni-NTA亲和纯化HIS-sCD23L蛋白

图6为ELISA法测定CD23L多抗的效价

图7为自制CD23L多抗的特异性

图8为间接免疫荧光确定CD23L为II型膜蛋白

图9为流式细胞分析CHO-CD23L的表达

图10为CD23L在胎肝细胞膜成分的Western Blot检测

图11为CD23L的多聚体

图12为Western Blot检测培养基中分泌型sCD3L-Fc融合蛋白的表达

图13为Western Blot检测sCD23L-Fc的糖基结合能力

图14为Western Blot检测稳定表达CD23L的CHO细胞株的糖基结合能力

图15为SDS-PAGE检测原核表达的sCD23L分子大小和纯度

图16为原核表达的sCD23L与K562和HL-60细胞的黏附

图17为原核表达的sCD23L与THP-1和U937细胞的黏附

图18为原核表达的sCD23L与Jurkat，Molt-4和Hut-78的黏附

图19为原核表达的sCD23L与Daudi、Raji和Namalwa细胞的黏附

图20为sCD23L-Fc与HL-60和K562细胞的黏附

图21为sCD23L-Fc与U937和THP-1细胞的黏附

图22为sCD23L-Fc与Jurkat、Hut-78和Molt-4细胞的黏附

图23为sCD23L-Fc与Raji、Daudi和Namalwa细胞的黏附

图24为EDTA(15mM)抑制sCD23L-Fc与激活的Jurkat细胞的黏附

图25为Mann(20μg/ml)抑制sCD23L与激活的Jurkat细胞的黏附

图26为EDTA和Mann对sCD23L-Fc与激活Jurkat细胞黏附的抑制作用

图27为CD23L多抗部分抑制sCD23L-Fc与激活的Jurkat细胞的黏附

图28为激活的Jurkat和Molt-4与sCD23L-Fc的黏附

具体实施方式

实施例1、CD23L的克隆

试剂

SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒购自CLONTECH公司；LA Taq酶购自宝生物(大连)公司；胎肝总RNA购自CLONTECH公司；寡核苷酸合成和DNA序列测定在上海博亚公司完成，其中5’-RACE的特异引物为GSP1：5’-GGAACAGCTCAGTGCGGACGTCCTCAC-3’，巢式引物为GSP2：5’-CTCTCCTGCTCCATCAGCTTCGC-3’；3’-RACE的特异引物序列为UX1：5’-CCTGCGGGAACTGCGTGAGCGCGTGAC-3’，巢式引物序列为UX2：5’-GTGAGGACGTCCGCACTGAGCTGTTCC-3’；pGEM-T载体(购自PROMEGA公司)。

用DC-SIGN和DC-SIGNR蛋白tBlastn搜索22周龄的人胎肝EST库，结果如序列表中SEQ ID №：3和图1所示，表明获得一条EST：D1210，长862bp，与DC-SIGNR具有35％的相同氨基酸，49％的相似性；与DC-SIGN具有33％的相同氨基酸，49％的相似性。为获得其全长cDNA和正确的编码区，采用5’-RACE和3’-RACE来获得其全长。

(1)5-RACE和3-RACE的cDNA模板的制备

采用SuperScript^TMfirst-strand synthesis system来制备RACE用cDNA。3μg胎肝来源的总RNA用于反转录反应，整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。

(2)5’-RACE和3’-RACE及ORF分析

5’-RACE首先由GSP1与UPM(为试剂盒内成分)配合进行Touchdown PCR扩增，反应条件为94℃，5秒；72℃，3分钟；5循环。94℃，5秒；70℃，10秒；72℃，3分钟；5循环。94℃，5秒；68℃，10秒，72℃，3分钟；20循环。然后取PCR产物1μl按1∶20稀释，由NUP(为试剂盒内成分)与GSP2配合巢式扩增30循环，反应条件为94℃，45秒；58℃，1分钟；72℃，3分钟。此轮PCR产物重组到pGEM-T载体中测序鉴定。同样地对于3’-RACE，先由UX1与UPM进行TouchdownPCR扩增后，再用NUP与UX2巢式扩增，PCR产物重组到pGEM-T载体中测序鉴定，得到pGEM-T-CD23L质粒。测序结果表明5’-RACE通过巢式PCR扩增后，获得一条504bp的片断，3’-RACE通过巢式PCR扩增后，获得一条904bp的片断。根据5’-RACE和3’-RACE的测序结果，通过Blast2连接成全长cDNA，再通过ORF finder找到其编码区。结果表明5’-RACE在D1210的5’端延长318bp，3’-RACE在D1210的3’端延长了241bp，其全长cDNA为1411bp(SEQ ID №：1)，命名为CD23L。通过ORF分析，其CDS为882bp，编码293个氨基酸(SEQ ID №：2)。5’-RACE和3’-RACE及ORF分析结果如图3所示，表明其起始密码子ATG的周围序列CCACC ATGA，符合Kozak一致序列规则，起始密码子ATG的上游同相位存在两个终止密码子TAG和TGA，并且在-35处存在典型的启动子序列TATA，这些都说明此ATG为起始密码子。在起始密码子ATG同相位3’端下游949bp处为终止密码子TGA，1333bp处AATAAA为加尾信号，1357bp处为polyA信号。说明通过RACE成功地获得了D1210的全长cDNA序列。图3中，ATG为启始密码子；TGA为终止密码子；TATA为启动子；AATAAA为加A信号；星号为终止密码子；加方框的碱基为启始密码子同相位终止密码子；字母倾斜序列为非编码区。

实施例2、CD23L的特性

试剂

pfu酶(MBI)，T₄ DNA连接酶(TaKaRa)；pET-28a质粒(novagen)，pcDNA3.1A载体(invitrogen)；BamHI、EcoRI限制性内切酶(TaKaRa)；Ni-NAT琼脂糖(QIAGEN)；完全佐剂和非完全佐剂(Sigma)；FITC-anti Rab IgG(中山)；rProteinA-FF(Amersham Pharmacia Biotech AB)；PCR Preps DNA Purification Resin(PROMEGA)；LipofectAMINE(GIBCO)；寡核苷酸合成和DNA序列测定在上海博亚生物技术有限公司完成。

1、pET-28a-sCD23L表达载体的构建设计：CD23L膜外部分的特异性引物，F1：5′-CGG  GGA TCCAAG GCC TCC ACG GAG CGC-3′，(画线为BamHI位点)，R1：5′-ACGC  GTC GAC TCA GCA GTT GTG CCT TTT CTC-3′(画线为SalI位点)。以pGEM-T-CD23L(构建方法见实施例1的步骤2)质粒为模板，用pfu酶PCR扩增CD23L膜外部分，PCR条件：94℃，5min；94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min；30次循环；72℃，10min。产物用PCR纯化试剂盒纯化，用BamHI和SalI双酶切，37℃，过夜。同时，pET-28a质粒也用BamHI和SalI双酶切。酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶在16℃连接过夜，转化BL21感受态细胞，挑选菌落，摇菌，提取质粒，BamHI和SalI双酶切鉴定重组子，并测序验证。

2、CD23L膜外部分在BL21细胞的原核表达：测序验证正确的菌株，划线于LB氨苄抗生素平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，于1L LB培养基37℃摇菌，在OD＝0.6时，加入终浓度为1mM IPTG诱导，37℃摇菌4小时，收获细菌，PBS洗三次。于液氮冻溶三次，加溶菌酶终浓度为0.2mg/ml和DNAaseI 50U/ml，37℃，1小时，再在冰上超声。超声后菌液10000rpm 4℃离心10min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析CD23L膜外部分的表达，结果如图4所示，表明在1mM的IPTG诱导下，表达的CD23L膜外部分以包涵体形式存在，未能获得可溶形式。其表达的蛋白分子量大小与预测相符，约31kDa。

3、CD23L膜外部分蛋白的纯化：为了获得纯化的CD23L膜外部分蛋白(sCD23L)，用于制备多克隆抗体，采用变性条件下纯化CD23L蛋白，因为带6×HIS标签的蛋白可在变性条件下纯化具体过程如下：细菌表达的CD23L膜外部分蛋白以包涵体形式存在，包涵体分别用1M、2M和4M尿素各洗涤一次，10000rpm 4℃离心10min，收集沉淀，包涵体达到70％的纯度。沉淀(含包涵体)用8M尿素，100mM的磷酸钠，10mmol/L Tri s-HCl(pH8.0)的溶液溶解。12000rpm 4℃离心30min，去沉淀。上清用Ni-NAT琼脂糖纯化，按说明书操作。收集pH5.9和pH4.9部分洗脱液，12％SDS-PAGE电泳，结果如图5所示，获得大于95％纯度的蛋白。图5中，wash为洗涤的液体；elution pH4.9为收集的pH4.9部分洗脱液，elution pH5.9为收集的pH5.9部分洗脱液。

4、CD23L的多抗制备：纯化的CD23L膜外部分蛋白，用BCA法定量蛋白。进行SDS-PAGE电泳，而后以冷0.1M KCl染色，切下目的条带，液氮反复冻融，碾碎PAGE胶成细粉末，加入等量完全佐剂碾磨，至能通过1ml注射器针头即可。在第一次注射新西兰白兔前，抽取5ml兔血，分离血清，-20℃保存；第一次肌肉注射1-2mg蛋白，2周后加强注射一次，蛋白量减半，用等量不完全佐剂碾磨混匀注射。以后每隔一周加强免疫一次，每次免疫加强后，采血ELISA法测抗体效价。最后一次加强注射后3-4天，心脏采血，分离血清，分装保存。用纯化的sCD23L蛋白包被ELISA板，来检测每次免疫加强后的抗体效价。结果如图6所示，表明通过四次加强免疫后，其抗体效价达1∶64000。此时心脏采血，分离血清，并-20℃储存。

5、表达CD23L的CHO细胞稳定株(CHO-CD23L)建立：设计引物PCR扩增CD23L的ORF区，F2：5- GGA TCC ATG GAC ACC ACC AGG TAC AGC-3(划线部分为BamHI位点)，R2：5- GAA TTCGCA GTT GTG CCT TTT CTC AC-3(划线部分为EcoRI位点)，以pGEM-CD23L为模板，用LA Tag酶(TaKaRa)PCR扩增CD23L的ORF区，PCR条件：94℃，5min；94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min；20次循环；72℃，10min。产物用PCR纯化试剂盒纯化，连接入pGEM-T载体，测序验证后，BamHI和EcoRI双酶切，产物回收后，与同样处理的C端带Myc-His标签的pcDNA3.1A载体连接，得到质粒pcDNA3.1A-CD23L，然后转化JM109感受态细胞，挑选菌落，摇菌，提取质粒，BamHI和EcoRI双酶切鉴定重组子和测序。测序正确的重组子大量提取质粒，并定量。CHO细胞铺六孔板，24小时后，用脂质体Lipofectamine 2000和pcDNA3.1A-CD23L质粒转染CHO细胞，转染后48小时，换含G418(800μg/ml)的DMEM，10％FBS的培养基，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用Myc单抗(invitrogen)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(中山公司)为二抗，Western Blot检测CD23L的表达，表达最高的细胞株扩大培养，液氮保存。

6、CD23L多抗的初步纯化：BL21细菌用PBS洗涤四次，离心收集沉淀，加入四倍体积的-20℃丙酮剧烈混和，冰浴1小时，4℃，10000g离心10min，沉淀用-20℃丙酮重悬，冰浴10min，再次离心去掉上清，把沉淀物转移到一张Saran包装膜上，放于通风橱中使丙酮蒸发，沉淀物干燥后，碾碎成粉末，-20℃储存备用。同时大量培养CHO细胞，收集后用70％乙醇沉淀，PBS洗涤三次，细胞沉淀保存于4℃备用。CD23L多抗兔血清加入1％(W/V)的BL21细菌干粉，混匀，冰上作用30min，4℃，10000g离心10min，收集上清，上清再加入乙醇固定的CHO细胞中，冰上作用30min，10000g离心10min，收集上清，上清用PBS稀释三倍，用rProtein A FF纯化兔IgG，按说明书操作，收集IgG部分，超滤浓缩(10kDa，Millipore)并换用PBS缓冲液。IgG用280nm紫外定量；同样用蛋白A纯化免疫前兔血清IgG。

7、CD23L的多抗特异性鉴定：表达CD23L的CHO稳定株和转染pcDNA3.1A空质粒的CHO细胞，收获细胞，用RIPA细胞裂解液裂解，纯化的CD23L多抗和myc单抗分别为一抗，HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG为二抗，同时用Western Blot检测CD23L的表达。结果如图7所示，表明CD23L多抗和Myc单抗都能在表达CD23L的CHO稳定株细胞裂解液中检测到单一条带，分子量大小一致，约为40kDa，比预测的分子量大(33kDa)，可能与CD23L为糖蛋白有关，与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR都为糖蛋白相似，因其膜外部分有两个N连接的糖化位点。但转染空质粒的CHO细胞未见条带。说明制备的CD23L多抗具有较高的特异性，与Myc单抗特异性相似。

8、间接免疫荧光实验：表达CD23L的CHO稳定株和转染pcDNA3.1A空质粒的CHO细胞铺24孔板，48小时后，-20℃甲醇固定30min，PBS洗涤三次，5％的BSA室温封闭2小时，PBS洗涤一次，加1∶50稀释的CD23L多抗和myc单抗，室温30min，PBS洗涤三次，加FITC标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG(1∶50)，室温30min，PBS洗涤4次，荧光显微镜观察，同时以免疫前兔IgG为阴性对照。结果如图8所示，表明CHO-CD23L稳定株经甲醇固定后，在胞膜完整的状态下，CD23L多抗和用于检测C端融合的标签Myc单抗均成胞膜荧光分布，用免疫前兔IgG检测CHO-CD23L和空质粒转染的CHO细胞均未见荧光，说明CD23L为C端位于胞外的II型膜蛋白。

9、流式细胞仪分析：表达CD23L的CHO稳定株和转染pcDNA3.1A空质粒的CHO细胞，用EDTA消化，PBS洗涤三次，细胞用4％的多聚甲醛固定，流式缓冲液(PBS，pH7.4，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤三次，分别加1∶50稀释的CD23L多抗和myc单抗，室温30min，流式缓冲液洗涤三次，分别加FITC标记的羊抗兔和鼠IgG(1∶50)，室温30min，流式缓冲液洗涤4次，流式细胞仪分析。结果如图9所示，也进一步说明CD23L为C端位于胞外的II型膜蛋白，图9中虚线为CHO/Vector，实线为CHO-CD23L(细胞4％多聚甲醛固定，完整细胞膜)。

10、CD23L在胎肝细胞膜蛋白中的检测：为了研究CD23L在胎肝组织中的表达和其分子大小，首先用双相分离系统提取胎肝总膜蛋白，在还原变性条件下SDS-PAGE电泳，再用CD23L的多抗，进行Western Blot检测。具体过程如下：  8克胎肝组织液氮碾磨，利用双向系统分离膜蛋白，提取膜蛋白，每孔上样50μg总蛋白，12％SDS-PAGE电泳，以CD23L多抗为一抗，Western blot检测，同时以10μg/孔的CHO-CD23L细胞裂解液为阳性对照。结果如图10所示，表明Western Blot同样也检测到一条较特异的条带，分子量约40kD，与CHO-CD23L阳性对照结果相一致，但在胞浆部分未能检测到，说明CD23L为膜蛋白。胎肝总蛋白也未能检测到，可能是含量低的缘故。

11、CD23L的多聚体形式：用非还原变性电泳来初步检测CD23L的聚体形式，具体过程如下：CD23L-CHO细胞用细胞裂解液(20mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2.0mM CaCl₂，1％Triton-X 100，蛋白酶抑制合剂)裂解，非还原性10％SDS-PAGE电泳，以CD23L多抗为一抗，Western blot检测。结果如图11所示，表明可见四条带，分别为160kDa、120kDa，80kDa，40kDa；相对应为四聚体、三聚体，二聚体和单体，这与DC-SIGNR，DC-SIGN形成四聚体相似。但最多的为单体，这与颈部形成coiled-coil结构，而非二硫键形成多聚体有关，因为变性条件下易于解链所致。在60kDa附近的一条带可能为非特异带。此实验提示CD23L可能以四聚体形式存在，

实施例3、CD23L的功能研究

一、CD23L的糖基识别功能

材料

(1)试剂：甘露糖，半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺，岩藻糖，甘露糖-agarose，半乳糖-agarose，N-乙酰葡萄糖胺-agarose，岩藻糖-agarose，Fc单克隆抗体，均购自Sigma公司。分泌型Fc融合表达质粒Signal pIGplus购自R&D systems公司(Abingdon，UK)。

(2)细胞裂解缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0，15mM CaCl₂，1mm MgCl₂，1％TritonX-100，150mM NaCl，蛋白酶抑制合剂(Roche)。

(3)结合缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0，15mMCaCl₂，1mM MgCl₂，0.5％TritonX-100，150mM NaCl。

(4)洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0，25mM EDTA，0.5％Triton X-100，150mM NaCl。

1、可溶性CD23L-Fc融合蛋白表达载体构建：用引物F₂：5′-CGG  AAG CTTAAGGCC TCC ACG GAG CGC-3′，(画线为Hind III酶切位点)，R₂：5′-ACGC  TCT AGATCA GCA GTT GTG CCT TTT CTC-3′(画线为XbaI酶切位点)；以pET-28a-sCD23L(制备方法见实施例2的步骤1)为模板，pfu酶，PCR扩增CD23L膜外部分(55-293位氨基酸残基)。PCR反应条件：94℃，5min变性；94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min；30次循环；72℃，10min。PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化，用HindIII和XbaI，37℃，过夜双酶切。同时，Signal pIGplus质粒也用Hind III和XbaI双酶切。酶切产物纯化后，用T₄DNA连接酶在16℃连接过夜，转染按常规方法制备的JM109感受态细胞，挑选菌落，摇菌，提取质粒，Hind III和XbaI双酶切鉴定重组子，并测序验证，命名为pIG-sCD23L。结果构建了分泌型sCD23L-Fc融合表达载体，测序完全正确，从N端起为：CD33的信号肽，CD23L膜外部分，IgG1 Fc段。此表达载体易于检测(ELISA测IgG)和易于纯化(SPA亲和纯化)。

2、可溶性CD23L-Fc融合蛋白表达：CHO细胞铺六孔板，pIG-sCD23L质粒用Lipofectamine 2000，转染CHO细胞，转染后48小时，换含G418(800μg/ml)的DMEM，10％FBS的培养基，两周后，挑选单个细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用Fc单抗，为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(中山公司)为二抗，WesternBlot检测细胞培养上清液sCD23L的表达和ELISA法测Fc含量，表达最高的细胞株，扩大培养，液氮保存。收集的细胞上清液，12000g，4℃，30min，弃沉淀，上清-70℃保存。制备大量融合蛋白时，用无蛋白的CHO培养基(含G418，GIBICO)替代含血清的DMEM培养基，培养4天，收集上清，ELISA测Fc含量。结果如图12所示，表明检测到分泌型sCD3L-Fc融合蛋白的表达。ELISA测得的含量约为50-100ng/ml。

3、表达CD23L的CHO稳定株细胞培养和裂解：用100mL的培养瓶大量培养，50小时收获细胞，PBS洗涤三次。10⁷细胞用1ml的细胞裂解缓冲液冰上摇30min，再超声5次，每次10秒，间隔30秒。12000g，4℃，30min，收集上清。

4、可溶性CD23L-Fc融合蛋白糖基结合：采用各种糖的亲和柱，各种糖被固定在琼脂糖(agarose)小颗粒上，在钙离子存在的条件下，用sCD23L-Fc融合蛋白，流经各种糖结合柱。如果sCD23L-Fc融合蛋白能与糖基结合，便被固定下来，而未结合的蛋白被洗脱，再用EDTA洗脱被结合的蛋白，TCA沉淀后，Western检测。具体过程如下：甘露糖-琼脂糖，半乳糖-琼脂糖，N-乙酰葡萄糖胺-琼脂糖和岩藻糖-琼脂糖各1ml分别装柱，用结合缓冲液平衡过夜，用5ml洗脱缓冲液洗涤，再用10ml结合缓冲液洗涤。取0.5ml可溶性CD23L-Fc融合蛋白与0.5ml的结合缓冲液混合，上柱。每次用1ml结合缓冲液，洗涤8次，收集洗涤液，命名为W₁-W₈，1ml/管。用洗脱缓冲液每次1ml，洗脱8次，收集洗脱液(E₁-E₈)。洗涤液和洗脱液每管加20μg白蛋白，0.5ml 30％的三氯乙酸(TCA)，冰上沉淀30min。12000g，4℃，30min，收集沉淀，1∶1的丙酮和乙醚洗涤二次，吹干，用40μl的SDS-PAGE上样buffer溶解，12％SDS-PAGE电泳，Western检测。结果如图13所示，说明sCD23L-Fc融合蛋白能结合甘露糖，N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖，而不结合半乳糖，并且对糖基的结合依赖钙离子，与DC-SIGNR，DC-SIGN识别糖基相似。这与生物信息学的推测也一致。

5、CHO稳定表达的CD23L与糖基结合：sCD23L-Fc融合蛋白能与甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖结合，那么在生理状态下，表达在肝和淋巴结窦内皮细胞上的CD23L能否结合上述三种糖基？由于肝和淋巴结窦内皮细胞很难分离，细胞来源困难，因而采用CHO稳定表达的CD23L来模仿，进一步来证实其与糖基结合的可靠性。用上面同样的方法，用0.5ml的CHO-CD23L稳定表达株细胞裂解液上清与0.5ml结合缓冲液混合，上柱，层析，Western Blot检测。结果如图14所示，显示表达在细胞上的CD23L与sCD23L-Fc融合蛋白一样，能结合甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖，而不结合半乳糖，并且其结合依赖钙离子。

二、CD23L与激活的T细胞的黏附

材料

(1)试剂：TPE生物素标记试剂盒(Molecule Probe)；抗体：FITC-anti-humanFc(ab′)₂，Sigma；还原性谷光甘肽，氧化性谷光甘肽，甘露聚糖，甘露糖-琼脂糖，佛波脂(PMA)，PHA，Sigma；BCA法测蛋白试剂盒，PIRCE；超滤管(10kDa)，Millipore。

(2)包涵体复性buffer A：10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2mM CaCl₂，6M尿素，1mM氧化性谷光甘肽，10mm还原性谷光甘肽。

(3)包涵体复性buffer B：10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2mM CaCl₂，4M尿素，1mm氧化性谷光甘肽，10mM还原性谷光甘肽。

(4)包涵体复性buffer C：10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2mM CaCl₂，2M尿素，1mM氧化性谷光甘肽，10mm还原性谷光甘肽。

(5)包涵体复性buffer D：20mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2mM CaCl₂，1M尿素，1mm氧化性谷光甘肽，10mm还原性谷光甘肽。

(6)包涵体复性buffer E：20mm Tris-HCl，pH8.0，150mm NaCl，2mM CaCl₂。

(7)结合缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0，150mm NaCl，2mM CaCl₂，1mm MgCl₂，1％BSA，0.02％NaN₃。

(8)细胞：HL60，K562，U937，THP-1，Jurkat，Hut-78，Molt-4，Raji，Daudi，Namalawa，购于上海细胞库；各种血细胞用RPMI 1640(GIBICO)，10％FBS(天津血研所)，2mM L-谷氨酰胺(Sigma)，100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素的培养基培养(37℃，5％CO₂)。Jurkat，Hut-78，Molt-4用PMA和PHA各1μg/ml，刺激72h，收集细胞。

1、CD23L膜外部分的原核表达纯化：方法同实施例2中的步骤3。

2、原核表达的CD23L膜外部分的包涵体复性：原核表达带His标签的CD23L膜外部分融合蛋白以包涵体的形式存在，做功能研究需要有活性的蛋白。为此，采用Ni-NTA亲和层析的方法，先把sCD23L在变性的条件下，纯化出来，然后逐步降低尿素的含量，使CD23L缓慢复性，最后利用具有活性的sCD23L与甘露糖结合的特点，把有活性的sCD23L蛋白亲和纯化出来，具体过程如下：Ni-NTA纯化的sCD23L蛋白，约10mg，先用10倍体积的包涵体复性buffer A，透析，4℃，过夜；再依次用10倍体积的buffer B透析，4℃，过夜；20倍体积buffer C、D、E透析，4℃，过夜；再过甘露糖-琼脂糖柱，EDTA洗脱，buffer E充分透析，冰冻干燥浓缩，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白分子大小和纯度。结果如图15所示，表明大小31kDa，与预期一致，说明通过上述的方法，得到了可溶性和有活性的sCD23L蛋白。

3、纯化的sCD23L的生物素标记：用TPE生物素标记试剂盒，按操作说明标记sCD23L蛋白，buffer E透析去掉未标记的生物素。

4、sCD23L-Fc蛋白的纯化：按前面的方法用无蛋白的CHO培养基制备大量的sCD23L-Fc融合蛋白，SPA柱纯化，用buffer E超滤浓缩和换缓冲液，ELISA法测Fc含量。

5、Fc蛋白的表达和纯化：Signal pIGplus质粒用Lipofectmine 2000瞬时转染CHO细胞，6小时后，换无蛋白CHO培养液培养7天，收集上清，超滤浓缩，SPA柱纯化，ELISA测定Fc含量。

6、原核表达的sCD23L与血细胞的黏附：先采用生物素标记的sCD23L蛋白与各种血细胞株，用流式的方法，筛选黏附细胞，以不加蛋白组为对照。具体过程如下：各种血细胞2×10⁵细胞，用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入生物素标记的sCD23L蛋白200μl(10μg/ml，结合缓冲液配制)，冰上，60分钟；结合缓冲液离心洗涤三次，加入100μl链亲和素标记的FITC(5μg/ml)，冰上，30分钟。结合缓冲液离心洗涤三次，重悬500μl的结合缓冲液，立即流式细胞仪分析。对照组用结合缓冲液替代蛋白，其它同测定一样。结果如图16、17、18和19所示，图16表明sCD23L与原始髓系细胞HL-60，K562，黏附率测定与对照组无显著区别，与他们不结合；图17表明单核细胞系U937，THP-1，也同样与sCD23L不黏附；图19表明B细胞系Daudi，Namalwa，Raji也均不发生黏附；图18表明Jurkat测定(黏附率35％)与对照(黏附率0.5％)相比，有明显黏附，黏附率约是对照的70倍，说明sCD23L与Jurkat细胞有黏附，Hut-78测定(11.8％)与对照(4.2％)相比，无显著区别，sCD23L与Hut-78无黏附；Molt-4测定(19.7％)与对照(1.5％)相比，黏附率约是对照的10倍，sCD23L能与小部分Molt-4细胞发生黏附。

7、真核表达的sCD23L-Fc融合蛋白与血细胞的黏附：为了进一步确定CD23L与细胞的黏附，用纯化的真核表达的sCD23L-Fc融合蛋白，来与各种血细胞株黏附，具体过程如下：各种血细胞2×10⁵细胞，用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入sCD23L-Fc蛋白200μl(5μg/ml)，冰上，60分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；加50μl FITC-anti-Fc(ab′)2抗体(5μg/ml)，冰上，30分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；细胞重悬于500μl的结合缓冲液中，立即流式细胞仪分析。对照组用Fc蛋白替代sCD23L-Fc融合蛋白，其它同测定一样。结果如图20、21、22和23所示，表明sCD23L-Fc不与HL-60、K562、THP-1、U937和B细胞系：Raji，Daudi和Namalwa发生黏附。而与T细胞系发生不同程度的黏附：Jurkat测定黏附率为40％，对照为4.0％；Molt-4测定为14％，对照为8.5％；Hut-78测定为7.1％，对照为2.1％。说明sCD23L-Fc与一部分Jurkat细胞黏附，与小部分Molt-4细胞黏附，而与Hut-78细胞不黏附，实验重复三次，得出相似结果，此结果也与原核表达的sCD23L相一致。

激活的T细胞与sCD23L-Fc的黏附：静止的T细胞只有部分细胞与sCD23L蛋白黏附，从理论上分析，应该与大部分细胞黏附，其原因可能与其表面配体表达的高低和检测的灵敏度有关，为了探测其配体在哪种状况下表达最高，探索了在各种因素的作用下，sCD23L-Fc与T细胞的黏附，Jurkat，Molt-4细胞分别用1μg/ml的PMA和PHA刺激72h，然后按上面一样测定。发现PMA和PHA刺激条件下，sCD23L-Fc与T细胞的黏附明显增高。结果如图28所示，表明PHA刺激的Jurkat和Molt-4细胞的黏附率分别为84.8％(对照2.0％)，47.3％(对照7.0％)，比未刺激组提高一倍；PMA刺激的Jurkat和Molt-4细胞的黏附率分别为73.8％(对照2.3％)，46.4％(对照1.0％)，比未刺激也提高一倍。说明CD23L的配体在激活的Jurkat细胞高表达，在激活的Molt-4细胞表达显著增高，实验重复三次得出相同结论。CD23L在体内的功能可能是黏附作用，黏附激活的T细胞，这与DC-SIGNR，DC-SIGN黏附静止T细胞，CD23黏附B、T和单核细胞略有不同，都是黏附分子，但分工不同，体现出这一家族中成员的基本特性相似，而具体生理功能却不同，可能在免疫中发挥精细调节功能。

8、EDTA和甘露聚糖的抑制实验：用真核表达的sCD23L-Fc融合蛋白与用PMA刺激的Jurkat T细胞黏附实验按上面操作，但在加蛋白同时，分别加入15mM EDTA和20μg/ml的甘露聚糖，其它同上，来分析sCD23L-Fc融合蛋白与Jurkat细胞的黏附是否依赖钙离子和配体上的糖基。结果如图24和25所示，显示不加EDTA的测定黏附率为75％，加15mM EDTA的黏附率为7.6％，抑制率约90％；不加甘露聚糖测定黏附率为76％，加甘露聚糖黏附率为11.7％，抑制率约85％。实验重复三次，结果如图26所示，表明15mM EDTA的平均抑制率为89％，20μg/ml的甘露聚糖平均抑制率为82％。说明sCD23L-Fc与Jurkat细胞的黏附依赖钙离子，并且与其未知配体的甘露糖类糖链结合，这些结果与上一节CD23L在钙离子存在的条件下，识别甘露糖类糖基相一致。

9、CD23L的多克隆抗体的中和实验：用真核表达的sCD23L-Fc融合蛋白与PMA刺激的Jurkat T细胞的黏附实验按上面操作，但在做以前，先用20μg/ml的CD23L多抗与蛋白在室温下，作用30分钟，再与Jurkat细胞作用，其它同上。结果如图27所示，显示不加CD23L多抗黏附率为89％，加CD23L的多抗(20μg/ml)中和后，黏附率为38％，抑制率为57％。重复三次抑制率为54％(图26)。说明CD23L多抗只能抑制约一半的细胞黏附，可能是多抗由变性抗原制备，而不能完全抑制sCD23L-Fc与Jurkat细胞的黏附。

                           序列表

<160>3

<210>1

<211>1411

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

agtgcgtagg tccagtgaga acaggcgtga aatttatatc tctgcccagg actgggtgcc      60

tgcatcgcca tggacaccac caggtacagc aagtggggcg gcagctccga ggaggtcccc     120

ggagggccct ggggacgctg ggtgcactgg agcaggagac ccctcttctt ggccctggct     180

gtcctggtca ccacagtcct ttgggctgtg attctgagta tcctattgtc caaggcctcc     240

acggagcgcg cggcgctgct tgacggccac gacctgctga ggacaaacgc ctcgaagcag     300

acggcggcgc tgggtgccct gaaggaggag gtcggagact gccacagctg ctgctcgggg     360

acgcaggcgc agctgcagac cacgcgcgcg gagcttgggg aggcgcaggc gaagctgatg     420

gagcaggaga gcgccctgcg ggaactgcgt gagcgcgtga cccagggctt ggctgaagcc     480

ggcaggggcc gtgaggacgt ccgcactgag ctgttccggg cgctggaggc cgtgaggctc     540

cagaacaact cctgcgagcc gtgccccacg tcgtggctgt ccttcgaggg ctcctgctac     600

tttttctctg tgccaaagac gacgtgggcg gcggcgcagg atcactgcgc agatgccagc     660

gcgcacctgg tgatcgttgg gggcctggat gagcagggct tcctcactcg gaacacgcgt     720

ggccgtggtt actggctggg cctgagggct gtgcgccatc tgggcaaggt tcagggctac     780

cagtgggtgg acggagtctc tctcagcttc agccactgga accagggaga gcccaatgac     840

gcttgggggc gcgagaactg tgtcatgatg ctgcacacgg ggctgtggaa cgacgcaccg     900

tgtgacagcg agaaggacgg ctggatctgt gagaaaaggc acaactgctg accccgccca     960

gtgccctgga gccgcgccca ttgcagcatg tcgtatcctg ggggctgctc acctccctgg    1020

ctcctggagc tgattgccaa agagtttttt cttcctcatc caccgctgct gagtctcaga    1080

aacacttggc ccaacatagc cctgtccagc ccagtgcctg ggctctggga cctccatgcc    1140

gacctcatcc taactccact cacgcagacc caacctaacc tccactagct ccaaaatccc    1200

tgctcctgcg tccccgtgat atgcctccac ttctctccct aaccaaggtt aggtgactga    1260

ggactggagc tgtttggttt tctcgcattt tccaccaaac tggaagctgt ttttgcagcc    1320

tgaggaagca tcaataaata tttgagaaat gaatccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                   1411

<210>2

<211>293

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Asp Thr Thr Arg Tyr Ser Lys Trp Gly Gly Ser Ser Glu Glu Val

1                 5                     10                     15

Pro Gly Gly Pro Trp Gly Arg Trp Val His Trp Ser Arg Arg Pro Leu

              20                    25                    30

Phe Leu Ala Leu Ala Val Leu Val Thr Thr Val Leu Trp Ala Val Ile

          35                    40                    45

Leu Ser Ile Leu Leu Ser Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ala Ala Leu Leu

     50                    55                    60

Asp Gly His Asp Leu Leu Arg Thr Asn Ala Ser Lys Gln Thr Ala Ala

65                    70                    75                    80

Leu Gly Ala Leu Lys Glu Glu Val Gly Asp Cys His Ser Cys Cys Ser

                  85                    90                    95

Gly Thr Gln Ala Gln Leu Gln Thr Thr Arg Ala Glu Leu Gly Glu Ala

             100                   105                   110

Gln Ala Lys Leu Met Glu Gln Glu Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Glu

         115                  120                    125

Arg Val Thr Gln Gly Leu Ala Glu Ala Gly Arg Gly Arg Glu Asp Val

    130                  135                    140

Arg Thr Glu Leu Phe Arg Ala Leu Glu Ala Val Arg Leu Gln Asn Asn

145                   150                   155                 160

Ser Cys Glu Pro Cys Pro Thr Ser Trp Leu Ser Phe Glu Gly Ser Cys

                  165                   170                  175

Tyr Phe Phe Ser Val Pro Lys Thr Thr Trp Ala Ala Ala Gln Asp His

             180                   185                   190

Cys Ala Asp Ala Ser Ala His Leu Val Ile Val Gly Gly Leu Asp Glu

         195                  200                    205

Gln Gly Phe Leu Thr Arg Asn Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Trp Leu Gly

     210                   215                   220

Leu Arg Ala Val Arg His Leu Gly Lys Val Gln Gly Tyr Gln Trp Val

225                  230                    235                 240

Asp Gly Val Ser Leu Ser Phe Ser His Trp Asn Gln Gly Glu Pro Asn

                  245                   250                  255

Asp Ala Trp Gly Arg Glu Asn Cys Val Met Met Leu His Thr Gly Leu

             260                   265                   270

Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Ser Glu Lys Asp Gly Trp Ile Cys Glu

         275                   280                   285

Lys Arg His Asn Cys

     290

<210>3

<211>862

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>(11，654，739，742，763，786，848)

<223>n＝a、t、c或g

<400>3

gttgcggaat nccttgagac cattgcttcg gagccagtga tgcgctttca agccgccgga     60

gcaggagagg gccctgtggg aactgtgtga gcgcgtgacc cagggcttgg ctgaagccgg    120

caggggccgt gaggacgtcc gcactgagct gttccgggcg ctggaggccg tgaggctcca    180

gaacaactcc tgcgagccgt gccccacgtc gaggctgtcc ttcgagggct cctgctactt    240

tttctctgtg ccaaagacga cgtgggcggc ggcgcaagat cactgcgcag atgccagcgc    300

gcacctggag atcgatgggg gcctggatga gcagggcttc ctcactcgga acacgcgtgg    360

ccgtggttac tggctgggcc tgagggctgt gcgccatctg ggcaagggtc agggctacca    420

gtgggtggac ggagtctctc tcagcttcag ccactggaac cagggagagc ccaatgacgc    480

ttgggggcgc gagaactgtg tcatgatgct gcacacgggg ctgtggaacg actcaccgtg    540

tgacagcgag aaggacggct ggatctgtga gaaaaagcac aactgctgac ccctgccaga    600

gccctggagc cgcgctcatt gcagcatgta gtatactggg gggctggtca cctnccctgg    660

ctactggagc tgattgccaa agagtttttt cttccttatc caacggtggt tagtctaaga    720

acactggggc caacatagnc cntgtcaggc cagggcatgg ttntgggacc tcatggcgga    780

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Claims (6)

1、一种C型凝集素，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的C型凝集素，其特征在于：所述C型凝集素是序列表中的SEQ ID №：2。

3、一种C型凝集素编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述C型凝集素编码基因是序列表中的SEQ ID №：1。

5、含有权利要求3所述的C型凝集素编码基因的表达载体。

6、含有权利要求3所述的C型凝集素编码基因的细胞系。

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